LABORATORIODITECNICHECELLULARIEMOLECOLARIAPPLICATE2014 Esperienzadifisiopatologia(Prof.AdrianoAngelucci) ProtocollodelsaggiodiAdesione PARTEI 1‐Rivestirepiastrada24pozzetticoncollagene(1ug/ml)efibronectina(1ug/ml) 2‐Incubarea37°Cper1oraoppurea4°Cper12ore 3‐Duelavaggiconsoluzione0,1%BSAinterrenodicoltura 4‐Incubareconsoluzione0,5%BSAinterrenodicolturaper60minuti 5‐Lavaggioconsoluzione0,1%BSAinterrenodicoltura 6‐preparazionecelluledaseminare: 6a‐togliereilterrenodicoltura 6b‐lavarecontamponePBS 6c‐aggiungeretripsina/EDTA(1ml/25cm2) 6d‐incubarea37°Cpermassimo5minuti 6e‐recuperarelecelluleeneutralizzareconterrenocompleto 6f‐centrifugarea300gper5minuti 6g‐risospenderein2mlditerrenoecaricare8ulnellacamerettadiBurker 6h‐contarealmicroscopioeaggiustarealladensitàdi5x105 /ml 7‐aggiungereunugualvolumedisospensionecellulareneipozzetti(200‐500ul) 8‐incubareper30minutia37°C 9‐agitareleggermentelapiastraperfacilitareildistaccodellecelluledebolmenteadese 10‐Lavareconsoluzione0,1%BSAinterrenodicolturaper3volte 11‐Fissareconparaformaldeideal4%per10minutiatemperaturaambiente 12‐sostituirelaparaformaldeideconPBS 13‐conservarea4°C 1 LABORATORIODITECNICHECELLULARIEMOLECOLARIAPPLICATE2014 Esperienzadifisiopatologia(Prof.AdrianoAngelucci) ProtocollodelsaggiodiAdesione PARTEII 14‐TogliereilPBSdallepiastre 15‐Aggiungerelasoluzionedicolorazione(volume200‐500ul)eincubareper10minuti atemperaturaambiente. 16‐Lavarealmeno6volteconacquadirubinettofacendoattenzioneanonfarstaccarele cellule (lavareconacquapulitafinoaquandononvièpiùcolorazionedisottofondo) 17‐Dopol’ultimolavaggiolasciarasciugarelapiastracapovoltasucartaassorbente 18‐Aggiungereunvolumeugualedisoluzionedisolubilizzazioneperpozzetto. 18‐Diluireinmanieraappropriataconsoluzionedisolubilizzazioneeleggereallo spettrofotometro(tra540e600nm) 19‐Calcolarelapercentualerelativadicelluleprendendounpuntosperimentalecome riferimento (fissatocome100%) SOLUZIONI Soluzionedicolorazione‐CrystalViolet12mMinunasoluzioneal20%dimetanoloin acqua Soluzionedisolubilizzazione‐ 1%SDSinunasoluzioneal50%inmetanoloinacqua 2 Procedurradicontadivitalità àconTrypaanblue 1‐Centrifu ugareereccuperareilp pelletcellu ulare 2‐Risospeendereinu unpiccolov volumediteerrenocom mpleto(1‐5 5ml) 3‐Prelevaare500uld disospensio one 4‐Aggiunggereunugu ualvolume ediTrypan Blue(0,4% %) 5‐Riempirrelecamerredelvetrino(5‐10ull) 6‐Osservaarealmicro oscopioadingrandim mento20x 7‐Calcolarreilnumerrodicellule esecondollespecifichedelvetrin nodicontaa Camerad dicontadiBurker:Volumedellaaconta(qu uadratodellimitatodatrelinee parallele)= =0,1x 1mm2=0,1 1mm3 =>F Fattoredicconversionee=104(0,1 1mm3 =0,1u ul=10‐4 ml)) Modalitàd diconta(pu untineri=ccelluledaccontare,pun ntichiari= celluledannoncontare) Concentraz C zionecellulevive=A*C C*D(n°diccellule/mlssospension nedipartennza) Concentraz C zionecellulemorte=B*C*D(n°diicellule/mlsospensio onediparteenza) A=mediad A dellecelluleevive(suallmeno3qu uadrati) B=mediad B dellecelluleemorte(colorateinbllu,sualmenotrequad drati) C=fattored C didiluizion ne(2nelcassosisiadilluito1:1co ontrypanblue) D=fattored D diconversiione(10.00 00nelcasoodellacam meradiBurrker) 3 CrystalVio C olet Il I Crystal V Violet legaa il DNA in i manieraa proporziionale alla quantità di DNA rendendo r possibilequ p uindilasuaaquantifica azione.L’u sodelCrysstalVioletè èstatoquinndiproposstoanche perlaquan p ntificazionee del nume ero di cellu ule in una coltura, a patto che la coltura sia pura e e che non siconfrontino linee cellulari diiverse o pu untisperim mentali connquantità di d mitosi troppo t diveersa. Il Cry ystalViolett può esserre usato qu uindiper dosaggicol d lorimetrici tenendo peròpresen p ntechenon npuòdiscriminaretraacelluleviv veemorte.. TrypanBlu T ue Il I Trypan B Blue (Blu beenzamina, Blu B naftilam mmina, Blu Niagara) è stato sinteetizzato aglii inizi del novecento n ccome derivaato del tolu uene, e devve il suo no ome alla proprietà di eessere tossico per il parassitatri p panosoma((analoghide eltrypanblu uesonoattu ualmenteusa aticomeageentifarmaco ologici). Il I Trypan B Blue viene comunemen c nte usato neella colorazzione vitale con un m etodo defin nito come colorazione c per esclusiione. Infattii, le membrrane cellulaari sono normalmente impermeab bili a tale colorante,m c mentrelecellulemorte,siaapoptotiichecheneccrotiche,siccoloranodibblu(senzap possibilità didistinzion d ne). 4
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