Real-Time Quantitative PCR t(14;18) (Bcl2/IgH-MBR) per la diagnosi ed il monitoraggio del linfoma a cellule follicolari QUANT-BCL2/IgH™ Cat. n.1.006 Il linfoma a cellule follicolari (FLC) è il più comune tra i linfomi non-Hodgkin (NHL), essendo presente nel 25-30% di tutte le NHL dell’adulto. In più del 80% dei casi di FCL, le cellule tumorali presentano la traslocazione t(14;18) che risulta dalla giustapposizione del gene Bcl2, localizzato sul cromosoma 18, sulla regione di congiunzione (JH) dei geni delle catene pesanti delle immunoglobuline, sul cromosoma 14. Inoltre, la traslocazione BCL2 è presente nel 30% dei linfomi a grandi cellule B diffuso.(DLBCL). Come conseguenza di questo riarrangiamento, il gene BCL2 subisce il controllo della sequenza regolatoria eµ IgH delle IgH, con conseguente iperespressione della proteina anti apoptotica Bcl2 nelle cellule del linfoma. I riarrangiamenti BCL2/IgH legati a specifichi breakpoints BCL2, nella maggior parte dei casi avvengono nella regione major breakpoint (MBR), che comprende circa il 70% di tutti i breakpoints sul cromosoma 18. Questa regione è stata identificata in un segmento di 300 bp localizzato a monte della regione 3’ non tradotta (3’ UTR) dell’esone 3 del gene BCL2. Il breakpoint sul cromosoma 14 può essere localizzato in qualsiasi regione consensus del frammento JH del locus IgH. La valutazione quantitativa delle cellule BCL2/IgH+ nei campioni di tessuto (sangue periferico, midollo osseo, linfonodi, biopsie o altri tessuti) da pazienti con FCL e/o DLBCL, fornisce un utile strumento per: I) diagnosi molecolare II) monitoraggio della malattia minima residua (MRD) III) precoce valutazione dell’efficacia terapeutica di un trattamento, inclusa chemioterapia, immunoterapia, chemio-immunoterapia, terapia ad alte dosi e radioterapia, IV) monitoraggio della contaminazione da cellule tumorali nel midollo osseo o cellule staminali periferiche raccolte per terapia ad alte dosi con liberazione emopoietica autologa. Molto recentemente, è stato dimostrato da un’analisi multivariata che i livelli assoluti di cellule BCL2/IgH+ nel midollo osseo di pazienti con prima diagnosi di FCL, erano i migliori indicatori della risposta clinica e molecolare in seguito alla terapia con CHOP e Rituximab. Da questo punto di vista, la quantizzazione assoluta delle cellule BCL2/IgH+ mediante Real-time PCR alla diagnosi fornisce un importante nuovo strumento per prevedere la risposta al trattamento e l’evoluzione clinica a lungo termine in pazienti con FCL. Dato che i livelli costitutivi di BCL2 nelle cellule tumorali di DLBCL hanno mostrato una correlazione con la prognosi e la resistenza alla chemioterapia, la quantizzazione di cellule BCL2/IgH+ nei campioni di linfonodi può essere usata anche come indicatore prognostico nelle NHL t(14;18) aggressive a cellule B. Infine, la valutazione quantitativa delle cellule BCL2/IgH+ può fornire un valore di cut-off in grado di discriminare le quantità di cloni positivi t(14;18) trovati in pazienti con linfoma da quelli presenti in soggetti sani. Il kit QUANT-BCL2/IgH permette la quantificazione delle cellule t(14;18)+ in campioni di tessuto (sangue periferico, linfonodi, biopsie di altri tessuti) da pazienti con linfoma follicolare. Principio del metodo: a) estrazione del DNA genomico; b) amplificazione Real-time con probe con due marcatori; c) rivelazione con un sistema Real Time PCR compatibile con la tecnologia Taqman. Applicabilità: su DNA estratto da sangue periferico, midollo osseo, cellule di linfonodi o altri tessuti. Numero di Test: 24 campioni da eseguire in duplicato (o 132 reazioni), curve standard e controlli. CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI L’uso di una curva standard di quantità note sia del gene endogeno di riferimento (Albumina) che delle copie riarrangiate di BCL2/IgH (DoHH2 DNA), consente il calcolo, in ciascun campione, del rapporto tra le copie geniche specifiche BCL2/IgH e il DNA di riferimento (Albumina). In basso sono mostrati i risultati relativi alle curve di amplificazione BCL2/IgH e alle curve standard (diluizioni Albumina e BCL2/IgH). Amplification Plots CD ROM 700 MB Software per Residual Disease (MRD) STANDARD DILUTIONS St1-MBR 9x105 copies/2µl - Alb 9x104 copie/2µl St2-MBR 9x104 copies/2µl - Alb 9x103 copie/2µl St3-MBR 9x103 copies/2µl - Alb 9x102 copie/2µl St4-MBR 9x102 copies/2µl - Alb 9x101 copie/2µl St5-MBR 9x101 copies/2µl - Alb 9x100 copie/2µl St6-MBR 9x100 copies/2µl REAL-TIME PCR 10X Albumina (Primers/FAM-TAMRA probe) 10X BCL2/IgH (Primers/FAM-TAMRA probe) Master Mix 2X H2O DNase/RNase-free Standard Curve RT -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C +4°C -20°C Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato. Materiali Richiesti: provette da 1,5 ml e da 15 ml in polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili con barriera antiaerosol; Provette da PCR con tappo ottico. Reagenti richiesti non compresi nel kit: Per l'estrazione del DNA si consiglia di utilizzare il seguente kit: • Kit Estrazione DNA - cat. n. 101 Strumenti richiesti: centrifuga con rotore ad angolo fisso per provette da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante con adattatori per provette da 15 ml (1.500 x g); Set di pipette pre-PCR e post-PCR (0.5 – 20 µl, 10 – 100 µl, 20 – 200 µl, 200 – 1000 µl); Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica con alimentatore; Transilluminatore UV; Apparato fotografico. Strumento Real-time PCR. Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere sterili, DNase/RNase free e monouso. STANDA RD DILUTIONS - rearrenged gene BCL2/IgH M BR St.1 - St.6 (Eff. =97.7%): Y = -3.33 * LOG(X) + 40.15 STANDA RD DILUTIONS - Control gene Albu min St.1 - St.5 (Eff. = 92.8%): Y = -3.05* LOG(X) + 35.42 I risultati sono espressi contemporaneamente come stima diretta delle copie di BCL2/IgH-MBR, copie BCL2/IgH-MBR normalizzate con l’albumina e numero assoluto di cellule BCL2/IgH-positive/105 cellule normali. I calcoli sono eseguiti automaticamente dal software dedicato allegato. BIBLIOGRAFIA The non-Hodgkin’s lymphoma classification. Blood, (1997) 89: 3909-3918 Liu Y et al. PNAS (1994) 91: 8910-8914 Cleary ML et al. J.of Exp Med (1986) 164: 315-320 Aster JC et al. Am J Pathol (2002) 160: 759-763. Tsimberidou AM et al. Leukemia & Lymphoma (2002) 43: 1589-1598 Galimberti S et al. Bone Marrow Transplant. (2003) 32:57-63. Rambaldi A et al. Blood (2005) 105: 3428-3433. Gascoyne RD et al. Blood (1997) 90:244-51. Mounier N et al. Blood (2003) 101:4279-84
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