DHEA ELISA - IBL international

Istruzioni per l’Uso
DHEA ELISA
Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione diagnostica in vitro
quantitativa di DHEA nel siero umano.
RE52221
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
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www.IBL-International.com
DHEA ELISA (RE52221)
1.
USO PREVISTO
Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione
Dehydroepiandrosterone (DHEA) nel siero umano.
2.
ITALIANO
diagnostica
in
vitro
quantitativa
di
SOMMARIO E SPIEGAZIONI
Deidroepiandrosterone (DHEA; androstenolone; il 3b-idrossi-5-androsten-17-one) è uno steroide C19
prodotto nella corteccia surrenale e, in misura minore, nelle gonadi. Il DHEA funge da precursore della
sintesi del testosterone e dell’estrogeno. Data la presenza di un gruppo 17-oxo (piuttosto che un idrossile), il
DHEA svolge una funzione androgenica relativamente debole, che è stata stimata ~10 % di quella del
testosterone. Tuttavia nei neonati, nei bambini peripubertali e nelle donne adulte, i livelli di DHEA circolante
possono essere di molte volte superiori rispetto alle concentrazioni di testosterone e si può verificare una
rapida conversione in androgeni (androstenedione and testosterone) ed estrogeni a livello del tessuto
periferico. Inoltre, il DHEA ha un’affinità relativamente bassa con la globulina legante l’ormone sessuale.
Questi fattori possono aumentare la biopotenza fisiologica del DHEA.
Il ruolo fisiologico del DHEA non è ancora stato definito in modo del tutto esauriente. Si è riportata una
molteplicità di effetti in vitro, che comprende effetti antiproliferativi in diverse linee cellulari ed effetti sul
metabolismo cellulare mediato da enzimi. Studi in vivo suggeriscono che il DHEA può danneggiare il
metabolismo del colesterolo e dei lipidi, la sensibilità e la secrezione d’insulina e le funzioni immunitarie. In
casi di schizofrenia e di obesità si sono constatati livelli anormali di DHEA. La somministrazione terapeutica
di DHEA è stata proposta per varie condizioni, obesità e patologie cardiovascolari comprese.
I livelli di DHEA nel siero sono relativamente alti nel feto e nel neonato, bassi durante l’infanzia ed
aumentano nel corso della pubertà. Livelli aumentati di DHEA durante l’adrenarca possono contribuire alla
crescita di caratteri sessuali secondari (peli) I livelli del DHEA nel siero diminuiscono progressivamente dopo
il terzo decennio di vita. Durante il ciclo mestruale o la gravidanza non si verificano modificazioni consistenti
del DHEA nel siero; tuttavia, nelle donne in pre-menopausa, la parità può abbassare i livelli di DHEA nel
siero.
Il DHEA, se paragonato al suo coniugato solfato, il DHEA-S, ha un rapido tasso di clearance metabolica.
Per questo motivo i livelli di DHEA nel siero sono da 100 a 1000 volte più bassi dei livelli di DHEA-S. Inoltre,
i livelli di DHEA nel siero presentano una variazione diurna significativa in dipendenza dall’ormone
adrenocorticotropo (ACTH). I livelli di DHEA nel siero aumentano in risposta alla somministrazione di ACTH
esogeno.
La misurazione del DHEA nel siero è un utile marcatore della sintesi adrenale androgena. Livelli bassi in
modo anomalo possono verificarsi in caso di ipoadrenalismo e livelli elevati si verificano in molteplici
condizioni, che comprendono adenoma e carcinoma adrenale virilizzante, deficienze nella 21 idrossilasi e
nella 3b-idrossisteroide deidrogenasi e in alcuni casi d’irsutismo femminile. Poiché le gonadi producono
pochissimo DHEA, la misurazione dei livelli dello stesso può essere d’aiuto nella localizzazione di una fonte
androgena in condizioni virilizzanti.
3.
PRINCIPIO DEL TEST
Il DHEA ELISA è un test immunoenzimatico assorbente su fase solida (ELISA) basato sul principio di
competizione.
I pozzetti sono rivestiti con un anticorpo policlonal diretto contro un unico sito antigenico della molecola
DHEA. DHEA endogeno presente nel campione e una quantità fissa di DHEA coniugato con perossidasi di
rafano competono per i siti di legame sugli anticorpi che rivestono i pozzetti. Dopo l’incubazione il coniugato
non legato è eliminato attraverso lavaggi.
La quantità della perossidasi legata è inversamente proporzionale alla concentrazione di DHEA nel
campione Dopo l’aggiunta della soluzione substrato l’intensità del colore sviluppato è proporzionale alla
concentrazione di DHEA nel campione del paziente.
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4.
ITALIANO
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale.
2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi
di aver compreso tutte le indicazioni.
3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento
della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme
al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore.
4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i
reagenti scaduti.
5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in
lattice e occhiali protettivi se necessario.
6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed
occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di
sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore.
7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi
secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato.
8. Il personale delle pulizie dev’essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle
procedure da adottare.
9. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle.
10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e
HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in
maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi.
5.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 °C. Non esporre a luce
solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e
dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente.
La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso
riposta a 2–8 °C.
6.
PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Siero
Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l’integrità del campione di
sangue dal momento del prelievo al momento dell’esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati,
itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro
interno.
Conservazione:
Stabilità:
7.
2-8°C
4 giorni
≤ -20°C (Aliquote)
3 mesi
Non esporre alla luce solare diretta e al calore.
Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento.
MATERIALE FORNITO
Quantità
Simbolo
1 x 12 x 8
MTP
1 x 6 x 1 mL
CAL A-F
1 x 2 x 1 mL
CONTROL 1+2
1 x 13 mL
ENZCONJ
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Componente
Micropiastra
Strisce separabili.
Rivestito con anti-DHEA anticorpo (policlonale, coniglio).
Standard A-F
0; 0.37; 1.1; 3.3; 10.0; 30.0 ng/mL
Pronto/a all’uso. Contiene: DHEA, Siero umano, stabilizzatori.
Controllo 1+2
Pronto/a all’uso. Contiene: DHEA, basso e elevato, Siero umano,
stabilizzatori.
Per le concentrazioni esatte vedere le etichette sulle provette o il
certificato di Controllo Qualità.
Coniugato Enzimatico
Pronto/a all’uso. Contiene: DHEA coniugato a HRP, stabilizzatori.
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Quantità
1 x 100 mL
1 x 15 mL
1 x 15 mL
8.
ITALIANO
Simbolo
Componente
Tampone Lavaggio Concentrato (10x)
WASHBUF CONC
Contiene: tampone fosfato, Tween.
Soluzione Substrato TMB
TMB SUBS
Pronto/a all’uso. Contiene: TMB, Tampone, stabilizzatori.
Soluzione Stop TMB
TMB STOP
Pronto/a all’uso. 1 M H2SO4.
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
1.
2.
3.
4.
5.
Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 20; 100; 250 µL
Vortex mixer
Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti
Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico
Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm
(lunghezza d’onda di riferimento 600-650 nm)
6. Acqua bidistillata o deionizzata
7. Carta assorbente, puntali per pipette e timer
9.
NOTE PER LA PROCEDURA
1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati.
Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento
dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate.
2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti
siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai
campioni e ai componenti del kit (18-25 °C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e
campione prima dell’uso. Non creare schiuma durante il mescolamento.
3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per
ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non
utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti.
4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento.
5. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un’appropriata distribuzione sulla piastra.
6. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso
ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le
soluzioni in tutti i pozzetti.
7. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a
risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far
asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e
aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti
siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti.
8. L’umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l’involucro finché non ha raggiunto la temperatura
ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell’involucro con il disseccante.
10.
ISTRUZIONI PRE-TEST
10.1. Preparazione di componenti concentrati
Diluire /
dissolvere
Componente
100 mL
WASHBUF CONC
fino a
1000 mL
Diluente
Rapporto
Note
Conservazione
Stabilità
acqua
bidist.
1:10
Mescolare
energicamente.
2-8 °C
4 settimane
10.2. Diluizione dei Campioni
I campioni sospettati di avere una concentrazione superiore a quella dello standard con concentrazione più
alta devono essere diluiti con Standard A. Per ottenere risultati corretti moltiplicare i valori misurati per il
fattore di diluizione.
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PROCEDURA DEL TEST
Pipettare rispettivamente 20 µL di Standard, Controllo e campioni nei rispettivi pozzetti.
Pipettare in ogni pozzetto 100 µL di Coniugato Enzimatico.
Mescolare bene per 10 secondi.
Incubare 60 min a TA (18-25°C).
Eliminare la soluzione d’incubazione. Lavare la piastra 3 x con 250 µL di Tampone Lavaggio diluito.
Rimuovere l’eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta.
Pipettare 100 µL di TMB Soluzione Substrato in ogni pozzetto.
Incubare 30 min a TA (18-25°C).
Fermare la reazione substrato aggiungendo 100 µL di Soluzione Stop TMB in ogni pozzetto.
Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. Il colore passa da blu a giallo.
Misurare la densità ottica con un fotometro a 450 nm (Lunghezza d’onda di riferimento: 600 -650 nm)
15 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop.
12.
CONTROLLO DI QUALITA’
I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l’uso. L’utente deve
inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli
utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche
di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e
il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni
laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi
di controllo qualità periodici.
In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di
conservazione, pipette, strumenti, condizioni d’incubazione e metodi di lavaggio.
13.
CALCOLO DEI RISULTATI
La DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione
(asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si
ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log.
Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei
duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile).
La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard.
I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel
paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati.
Conversione:
DHEA (ng/mL) x 3.467 = nmol/L
Tipica Curva di Calibrazione
(Esempio. Non usare per il calcolo!)
Standard
A
B
C
D
E
F
Version 2014-09
DHEA
(ng/mL)
0.0
0.37
1.10
3.30
10.0
30.0
DOMedia
2.715
2.141
1.633
1.068
0.586
0.291
DO/DOmax
(%)
100
79
60
39
22
11
4/5
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14.
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VALORI ATTESI
I soli risultati non dovrebbero essere l’unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere
correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici.
Soggetti apparentemente sani mostrano i seguenti valori:
DHEA
Uomini
Donne
n
100
100
Mediano (ng/mL)
2.30
2.05
95% percentile (ng/mL)
0.52 – 5.18
0.36 – 7.82
totale Intervallo (ng/mL)
0.06 – 13.37
0.06 – 12.21
Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento.
15.
LIMITI DELLA PROCEDURA
I seguenti componenti del sostanze non hanno effetto significativo sui risultati del test fino ai livelli di
concentrazione riportati in tabella (+/- 20%).
Emoglobina
Bilirubina
Trigliceridi
16.
5 mg/mL
3 mg/mL
46 mg/mL
NaN3
Thimerosal
ProClin 300
0.10 %
0.01 %
0.10 %
PERFORMANCE
Sostanza
Specificità Analitica
(Reattività Crociate)
Sensibilità Analitica
(Limite di Rilevazione)
Sensibilità Funzionale
Precisione
Intra-Saggio
Inter-Saggio
Linearità
Recupero (n=5)
Metodo di Paragone
verso LCMS
17.
Reattività Crociate (%)
0.287
0.194
0.072
0.010
0.008
0.006
0.006
0.003
17α-OH-Pregnenolone
Androstenedione
Pregnenolone
11-Desossi-Cortisolo
DHEA-S
Corticosterone
19-Nortestosterone
Testosterone
Estrone
0.03 ng/mL
0.13 ng/mL
Intervallo (ng/mL)
0.61 – 10.59
0.88 – 10.55
Intervallo (ng/mL)
0.5 – 13.1
Media (%)
103
Cross-reattività di altre
sostanze esaminate
≤ 0.001 %
0.002
Media (Zero-Standard) - 2SD
Media Conc. < 20 % CV
CV (%)
n
3.9 – 7.6
20
5.1 – 10.4
10
Diluizioni Seriali fino a
Intervallo (%)
1:8
86 - 119
Intervallo (%)
% Recupero dopo i picchi
(Concentrazione aggiunto 0.5-10 ng/mL)
92 - 116
IBL-Assay = 0.96 x LCMS +0.22
r = 0.99; n = 70
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
1. Thomas Lothar; Labor und Diagnose: Indikation und Bewertung von Laborbefunden für die
medizinische Diagnostik, 8. Auflage, 2012
2. Tietz, N.W. Textbook of Clinical Chemistry. Saunders, 1986.
Version 2014-09
5/5
Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
IBL International GmbH
Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany
IBL International Corp.
194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
+ 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11
[email protected]
http://www.IBL-International.com
+1 (416) 645 -1703 Fax: -1704
[email protected]
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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These
cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
Symbols Version 3.5 / 2012-01-20

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