Chicken Anti Mouse Pannexin I Code: ANT0034

Product Info Mol Biology
Ver.05/04/2014
Viale Piceno 137/f
61032 Fano PU (IT)
Telephone + 39 (0 )721830605
FAX +39 (0)721837154
e-mail:[email protected]
www.diatheva.com
New Legionella spp. quantitative kit
MBK0058
48 campioni
PN#MBK0058b (ABI Prism® 7500)
PN#MBK0058c (Bio-Rad/MJ Research, Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 6000 Corbett Research, Stratagene 3000p/3005p)
Legionella spp. quantitative kit è progettato e validato in accordo con ISO/TS
12869:2012 e può essere utilizzato per la rilevazione e quantificazione di Legionella
UTILIZZO
spp. mediante Real-Time PCR.
INTRODUZIONE
Il genere Legionella è costituito da più di 50 diverse specie e tra queste
L. pneumophila è la specie più diffusa. Le legionelle sono ubiquitarie negli ambienti
acquatici di varia natura e l’infezione nell’uomo avviene principalmente attraverso
l’inalazione di aerosol contaminati. Tra i metodi più utilizzati per la rilevazione e la
quantificazione di Legionella nelle acque vi è l’esame colturale. Tale protocollo,
presenta tuttavia innumerevoli svantaggi in quanto possono essere necessari fino a
10 giorni per la conferma del risultato. Inoltre, è noto che tale metodo ha una
sensibilità inadeguata [Ballard et al., 2000]. In questo contesto la PCR può offrire
una valida alternativa fornendo un facile, veloce ed accurato sistema per
l’identificazione e la quantificazione.
PRINCIPIO DEL SAGGIO
New Legionella spp. quantitative kit permette la rilevazione e la quantificazione del
DNA genomico isolato a partire da Legionella spp. attraverso l’amplificazione di una
specifica sequenza mediante Real-Time PCR basata sull’utilizzo di sonde marcate al
5’ con un fluoroforo ed al 3’ con un quencher.
Il kit fornisce una miscela pronta all’uso in cui sono presenti tutti i reagenti fatta
eccezione per l’enzima ed il DNA. Nella miscela di amplificazione è presente anche
un controllo interno di amplificazione che consente di poter individuare una
eventuale inibizione della reazione da parte di contaminanti derivati dall’estrazione.
Nel kit è incluso un DNA standard per la preparazione della curva di calibrazione. Il
materiale fornito consente di allestire esperimenti di quantificazione separati. Il DNA
standard viene diluito e le 4 diluizioni che ne derivano rappresentano i 4 punti da
25000 fino a 25 UG amplificati durante il saggio di quantificazione insieme ai
campioni.
SENSIBILITA’
Limite di rilevazione (LOD): 5 U.G.
SPECIFICITA’
Il kit è stato testato su diversi ceppi target e non target elencati di seguito:
Specie
L.
L.
L.
L.
cincinnatiensis
birminghamensis
oakridgensis
micdadei
L. bozemanii
L. bozemanii
L. anisa
CC
Risultato
Origine
Risultato
+
L. sainthelensi
ATCC 35248
+
+
+
+
ATCC 33877
+
CC
+
CC
+
ATCC 35545
+
tucsonensis
wadsworthii
gormanii
maceachernii
pneumophila SG1
pneumophila SG9
ATCC 49180
CC
L.
L.
L.
L.
L.
L.
L.
L.
L.
L.
L.
L.
pneumophila
pneumophila
pneumophila
pneumophila
pneumophila
pneumophila
L.
L.
L.
L.
pneumophila
pneumophila
pneumophila
pneumophila
+
L. cherrii
L. erythra
L. dumoffii
ATCC 35252
+
ATCC 35303
+
ATCC35850
+
L.
L.
L.
L.
L.
L.
ATCC 35849
+
ATCC33342
+
ATCC 35250
+
ATCC 33623
+
ATCC 49751
+
ATCC 33484
+
ATCC 35299
+
feleii
gormanii
hackeliae
jordanis
lansingensis
longbeachae
Specie
CC
ATCC 35292
L. parisiensis
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Origine
Limite di quantificazione (LOQ): 25 U.G.
ATCC 33342
+
ATCC 35300
+
ATCC 33152
+
na
+
SG7
ATCC 33823
+
subsp. fraserii SG5
ATCC 33216
+
subsp. pneumophila SG2
ATCC 33154
+
subsp. pneumophila SG3
ATCC 33155
+
subsp. pneumophila SG10
ATCC 43283
+
subsp. pneumophila SG1
ATCC 33153
+
subsp. pneumophila SG6
ATCC 33215
+
subsp. pneumophila SG8
ATCC 35096
+
subsp. pneumophila SG12
ATCC 43290
+
subsp. pneumophila SG14
ATCC 43703
+
CONTENUTO DEL KIT
Specie
Origine
Risultato
Aeromonas hydrophila subsp hydrophila
ATCC 7966
-
Alcaligenes faecalis subsp. faecalis
ATCC8750
-
Bacillus subtilis
ATCC6633
-
Burkholderia cepacia
ATCC17770
-
Clostridium spp.
ATCC25772
-
Enterobacter aerogenes
ATCC13048
-
Escherichia coli
ATCC25927
-
Flavobacterium spp.
ATCC15997
-
Klebsiella oxytoca
L. monocytogenes
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeroginosa
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas putida
ATCC8724
-
ATCC9525
-
Ceppo di collezione
-
ATCC10145
-
ATCC13525
-
ATCC17514
-
Serratia marcescens
ATCC14756
-
Strenotrophomonas maltophila
ATCC19374
-
Multiplex PCR Master Mix : 4 x 640μl
DNA Polymerase (5U/μl): 30μl (175U)
DNAse free water: 9 x 2000μl
Standard DNA: 4 x 4μl
MATERIALE NON FORNITO NEL KIT
Guanti
Pipette
Puntali sterili con filtro
Tubi sterili da 1.5 e 0.2ml
Vortex
Centrifuga
CONSERVAZIONE
Conservare la Multiplex PCR master mix, la DNA polimerasi e lo standard DNA a 20°C, al riparo dalla luce. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento
poiché potrebbero causare una riduzione delle performances del kit. In caso, si
consiglia di aliquotare i reagenti e comunque di non effettuare più di due
scongelamenti di ogni reagente.
PRECAUZIONI GENERALI
UTILIZZO DI PIPETTE DI PRECISIONE PERFETTAMENTE CALIBRATE
Mantenere aree separate per l’estrazione/preparazione di campioni e standard
dall’ area per l’allestimento della Real-Time PCR;
Utilizzare puntali con filtro;
Conservare campioni, standard e amplificati in un area separata dagli altri
reagenti del kit;
Sia i campioni che i reagenti devono essere perfettamente scongelati e
vortexati alcuni secondi prima dell’utilizzo.
PROTOCOLLO
1.1 PREPARAZIONE DNA
1.2 PREPARAZIONE CURVA STANDARD
Per l’isolamento del DNA utilizzare Legionella spp. DNA Extraction kit Diatheva,
Cod. MBK0052 secondo le indicazioni fornite dalla casa produttrice.
Il DNA così ottenuto può essere immediatamente utilizzato per l’amplificazione.
Il kit fornisce lo Sandard DNA e l’acqua da utilizzare per le diluizioni che
consentono di ottenere gli standard da STD1 (25000UG) ad STD4 (25UG).
Procedere con la preparazione degli standard in un’area separata come di seguito
descritto:
Preparazione delle diluizioni seriali per ottenere gli standard:
1)
2)
3)
4)
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Prelevare una delle aliquote di DNAse free water (2000μl) da utilizzare per la
diluizione degli standard e disporre 4 tubi da 1.5 ml in serie da STD 1 _25000
UG fino al tubo STD 4 _25 UG;
Aliquotare 998.7μl di DNAse free water nel tubo nominato STD 1 _25000 UG
e 90μl nei restanti 3 tubi nominati STD 2 _2500 UG, STD 3 _250 UG e STD 4
_25 UG;
Scongelare e vortexare il tubo contenente lo Standard DNA 10’’;
Pipettare 1.3μl dello Standard DNA nella provetta contenente 998.7μl di
DNAse free water, nominata STD 1 _25000 UG;
5)
6)
Vortexare 20”;
Cambiare puntale e pipettare 10μl dal tubo STD 1 _25000 UG nel tubo STD 2
_2500 UG;
Vortexare 20”;
Ripetere gli steps 6 e 7 per completare anche la preparazione STD 3 _250 UG
e STD 4 _25 UG.
7)
8)
Standard
U.G.
STD1
25000
STD2
2500
STD3
250
STD4
25
N.B. Gli standard una volta diluiti non sono stabili per un lungo periodo, si consiglia
di prepararli immediatamente prima dell’uso e di utilizzare solo diluizioni fresche.
Diluizioni non fresche possono essere utilizzate solo come standard qualitativi della
reazione (controllo positivo).
1.3 ALLESTIMENTO DELLA REAL-TIME PCR
Scongelare al riparo dalla luce i componenti (Multiplex PCR master mix e
DNAase free water), vortexare la Multiplex PCR master mix per 15” e
centrifugare brevemente.
PCR Legionella mix
In un tubo sterile da 1.5ml preparare la miscela di amplificazione necessaria
per il numero di campioni che si desidera analizzare più un controllo negativo
(NTC) e gli standard (STD) seguendo lo schema di seguito riportato:
per 1 campione*
per 6 campioni + curva std
+ 1 NTC
PCR mix
19.8μl mix + 0.2μl DNA
336.6μl mix + 3.4μl DNA
Polymerase
Polymerase
* Per l’analisi di più di un campione, occorre semplicemente moltiplicare i volumi di
mix e di DNA Polymerase per il numero di campioni che si desidera testare
considerando anche di processare 1 NTC e di dover allestire la curva standard.
Vortexare per 15” la vial in cui è stata allestita la miscela per l’amplificazione e
centrifugare brevemente;
Aliquotare 20μl della miscela preparata come sopra indicato nei tubi da 0.2ml,
o in alternativa nella piastra predisposta per l’ esperimento;
Aggiungere 5μl di DNAse free water nell’ NTC;
In un’area separata, aggiungere 5μl dei campioni di DNA che si desidera
testare, preparati come indicato nella sessione 1.1, nei tubi corrispondenti in
cui è stata aliquotata la miscela per l’amplificazione;
Aggiungere 5μl di ciascuna delle diluizioni degli standard, preparate come
descritto nella sessione 1.2, nei corrispondenti tubi o pozzetti contenenti 20μl
della miscela di amplificazione. Il volume finale di ogni reazione è pari a 25μl.
Nota: si consiglia di amplificare gli standard da STD1 a STD3 in duplicato e lo
STD4 in triplicato.
1.4 CONDIZIONI DI AMPLIFICAZIONE
Il kit è stato ottimizzato con il termociclatore Rotor-Gene Q. Strumenti diversi da
questo potrebbero richiedere modifiche delle condizioni indicate. In questo caso si
prega di contattare il servizio tecnico di Diatheva s.r.l.
Programmare il termociclatore come segue, con volume finale di reazione pari a
25μl:
STEP
Initial denaturation
Denaturation
Annealing-extension
TEMPERATURA
95°C
95°C
60°C
TEMPO
10min
20 sec
60sec
CICLI
1X
40X cicli*
*45 cicli per strumenti con blocco Peltier es. Applied Biosystems 7500
La fluorescenza deve essere rilevata durante la fase di annealing–extension nel
canale di lettura per il green (FAM; ex 495nm-em 520nm) e nel canale per lo yellow
(VIC;ex 538nm-em 554nm). Negli strumenti che lo consentono, impostare
l’ottimizzazione del gain nei canali di acquisizione Green e Yellow in posizione 1
(NTC).
NOTA: per gli strumenti che lo richiedono (es. Applied Biosystems)
impostare il ROX come passive reference
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1.5 ANALISI DEI RISULTATI
L’analisi dei risultati deve essere eseguita con il programma in dotazione secondo le
raccomandazioni fornite dalla casa produttrice dello strumento. In alcuni casi è
possibile che il programma fornisca automaticamente l’impostazione della baseline.
In questo caso si suggerisce di verificare tali impostazioni. Per una corretta
definizione del threshold è necessario selezionare un valore ben distinto dal
backgroung dopo la fase di crescita lineare.
La quantificazione del DNA di Legionella spp. viene estrapolata a partire dalla retta
di calibrazione che si ottiene dai valori di Ct ai quali escono gli standard e dalle
relative quantità (STD1–25000 U.G.; STD2-2500 U.G.; STD3–250 U.G.; STD4–25
U.G.). Tale retta dovrebbe avere un’efficienza compresa tra 85 e 110% con valori di
R2 prossimi a 1.
Rotor-Gene Q
Su Rotor-Gene Q per l’analisi dell’amplificazione di Legionella si consiglia di
impostare un valore di threshold compreso tra 0.01 e 0.1. In genere tale
impostazione (se corretta) permette di ottenere per lo STD1-25000 U.G. un valore
di Ct compreso tra 15.0 e 18.0, valore ottimizzato su Rotor-Gene 6000 series e
Rotor-Gene Q. Mentre per l’analisi del controllo interno di amplificazione di consiglia
un valore compreso tra 0.05 e 0.08.
NOTA: In fase di analisi per questi strumenti occorre valutare la
possibilità di procedere con l’analisi selezionando o meno l’opzione slope
correct.
Canale Green: Legionella
y = -3,42 x + 32,61
Efficienza= 94%
R2= 0.998
25000UG 2500UG 250UG 25 UG
Canale Yellow: Controllo
Standard
25000 U.G.
2500 U.G.
250 U.G.
25 U.G.
Ct
17.1±1.2
20.5±1.2
23.8±1.2
27.5±1.2
Fig. 1 Profilo di amplificazione, ottenuto
attraverso l’amplificazione di 25000 fino a
25 U.G. di Legionella mediante Rotor-Gene
Q.
ABI PRISM 7500
Su ABI PRISM 7500 per l’analisi dell’amplificazione di Legionella si consiglia di
impostare un valore di threshold compreso tra 0.01 e 0.1. In genere tale
impostazione (se corretta) permette di ottenere per lo STD1- 25000 U.G. un valore
di Ct compreso tra 17.0 e 20.0. Mentre per l’analisi del Controllo Interno di
amplificazione di consiglia un valore compreso tra 0.01 e 0.05.
Canale Green: Legionella
25000UG 2500UG 250UG 25 UG
Canale Yellow: Controllo
y = -3,52 x + 33,57
Efficienza= 92%
R2= 0.998
Standard
25000 U.G.
2500 U.G.
250 U.G.
25 U.G.
Ct
18.9±1.2
22.3±1.2
25.8±1.2
29.5±1.2
Fig. 2 Profilo di amplificazione, ottenuto
attraverso l’amplificazione di 25000 fino a
25 U.G. di Legionella mediante ABI 7500.
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1.6 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Controllo negativo (NTC): non deve essere osservata amplificazione entro il 40
ciclo;
Campioni:
• Le curve di amplificazione per Legionella dovrebbero essere visualizzate in forma
logaritmica. In questa modalità deve poter essere identificata una fase di crescita
lineare (indice di una buona efficienza di reazione).
Possibili risultati:
N u.g./PCR well
Risultato u.g./L
Commento
N<1
< LDqPCR F
Legionella non rilevata
V
1 < N < LQqPCR
< LQqPCR F
Legionella rilevata al di sotto del
V
limite di quantificazione
N > LQqPCR
NF
Legionella rilevata e quantificata
V
N>C
> CF
Legionella rilevata al di sopra del
V
limite di quantificazione
F, fattore conversione u.g./well a u.g./L (= 20); V, vol campione filtrato in litri; C,
valore max del range di calibrazione.
E’ necessario considerare un fattore di diluizione pari a 20 qual’ora si utilizzi 5 l di
DNA purificato. Il valore del fattore di diluizione deriva dai vari step di
purificazione. Per esempio: 200ml di campione di acqua viene filtrato e purificato
utilizzando New Legionella DNA Extraction Kit (code MK0052), 5 l del estratto
sono poi amplificati in Real-Time PCR. Il risultato calcolato per interpolazione con
la curva di calibrazione costruita dagli standard è pari a 100 U.G/reazione. Per
una precisa quantificazione del campione riferita ad 1 litro (norme UNI), è
necessario riferirsi alla seguente equazione:
n° di copie genomiche x 20 (fattore di diluizione)
Volume filtrato (l)
Nell’esempio: (100 x 20)/0,2l = 10000 unità genomiche di Legionella per litro di
campione.
N.B. tenere conto di eventuale diluizione del DNA estratto
Se per un campione non c’è amplificazione di Legionella mentre il controllo
interno si amplifica, allora in questo caso è possibile dire che il campione
analizzato non contiene DNA di Legionella.
Se, come nel caso sopra, non c’è amplificazione di Legionella ed il controllo non
amplifica o presenta comunque un andamento anomalo, in questo caso
potrebbe trattarsi di inibizione è quindi opportuno ripetere l’analisi utilizzando lo
stesso campione dopo averlo diluito o, se necessario, ripetere l’estrazione.
nello standard STD1 si deve osservare amplificazione di Legionella,
mentre il Ct del controllo interno nel canale dello Yellow potrà risultare
superiore a quello del controllo negativo o addirittura non amplificarsi
(a causa della competizione con il target specifico di Legionella).
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI
Osservazione
Nessuna amplificazione dei
campioni o degli standard o
del controllo
Possibile causa
Possibile
errore
nella
programmazione del termociclatore
Errore di pipettamento
Possibile degradazione dei reagenti
Nessuna amplificazione del controllo
Possibili soluzioni
Ripetere la reazione con le corrette
impostazioni
Verifica delle pipette e ripetizione del test
Verificare la corretta conservazione dei
reagenti
Possibile inibizione della reazione di PCR.
Ripetere la purificazione del campione.
Amplificazione nell’ NTC
È dovuta ad una contaminazione
della reazione
Accurata pulizia dei locali
Il campione è positivo ma il
suo Ct è inferiore a quello
dello standard STD1
La concentrazione dei
testati è troppo elevata
campioni
Ripetere il test dopo aver diluito il
campione
Il Ct del campione è superiore
a quello dello standard STD4
La concentrazione dei
testati è troppo bassa
campioni
Il campione potrebbe essere poco
contaminato con Legionella spp., in
alternativa potrebbero esserci stati
problemi durante la fase di estrazione, in
questo caso ripetere l’estrazione.
BIBLIOGRAFIA
Ballard, A. L., Fry, N. K., Chan, L., Surman, S. B., Lee, J. V., Harrison, T. G. & Towner, K. J. (2000). Detection of Legionella
pneumophila using a real-time PCR hybridization assay. J Clin Microbiol 38, 4215–4218.
ISO TS 12869:2012 Water quality — Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by
concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qPCR).
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