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5 novembre 2014
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Zootecnia
La metagenomica ruminale
Bianca Castiglioni
Paola Cremonesi
Rumine: microflora e organizzazione.
Nel mondo ci sono oltre 3,5 miliardi di ruminanti (bovini, ovini, caprini e bufalini). Nei ruminanti, l’apparato
digerente è costituito da uno stomaco di grandi dimensioni suddiviso in quattro parti comunicanti: il reticolo,
il rumine, l’omaso e l’abomaso, definiti prestomaci. I
prestomaci sono colonizzati da diversi microrganismi
tra cui batteri, archea, protozoi e funghi che, attraverso
alcuni processi fermentativi anaerobici, consentono
all’animale ospite di utilizzare alimenti che animali monogastrici non riescono a sfruttare. In particolare, la
presenza della microflora ruminale consente all’ospite
di utilizzare fibre – quali cellulosa ed emicellulosa, di
cui sono ricchi gli alimenti di origine vegetale – che sono indigeribili per gli altri mammiferi. L’attività dei microrganismi nelle specie erbivore è dunque indispensabile. I microrganismi alberganti nel tratto digerente infatti:
• consentono l’attacco e la degradazione della parete
della cellula vegetale (fibra), che risulterebbe non digeribile in quanto gli animali non hanno gli enzimi
capaci di attaccare i carboidrati strutturali (emicellulose, cellulosa);
• producono acidi grassi volatili (AGV), dai 2 ai 6
kg/giorno, che successivamente sono assorbiti dalla
mucosa ruminale e vengono utilizzati dall’animale nel
proprio metabolismo;
• sintetizzano proteine a elevato valore biologico;
• sintetizzano vitamine del gruppo B.
L’animale ospite utilizza così sia i prodotti finali del metabolismo microbico sia la biomassa microbica come
fonte proteica ed energetica.
La maggior parte delle popolazioni microbiche che colonizzano il rumine sono strettamente anaerobie, ossia
non utilizzano ossigeno; sono anche presenti specie e
ceppi aerobi facoltativi che hanno il compito di assorbire l’ossigeno che penetra nel rumine con gli alimenti e
quello che filtra dalla parete dell’organo.
All’interno della popolazione microbica l’interazione più
frequente è la sequenzialità, dove un prodotto della
fermentazione di una specie batterica è indispensabile
per la sopravvivenza di una o più specie.
Ci sono più di 200 specie di batteri e più di 20 specie
diverse di protozoi. I batteri sono il gruppo preponderante della micro-popolazione ruminale. Il loro compito
è di colonizzare le particelle di piante ingerite
dall’animale, attaccarle con esoenzimi, solubilizzarle e
fermentarle fino a ottenere acidi grassi volatili; attaccare le proteine alimentari e sintetizzare le vitamine del
gruppo B. I protozoi non hanno un ruolo ben definito
nel quadro delle fermentazioni ruminali: predando i
batteri, accrescono il valore biologico delle proteine che
dal rumine passano alla digestione gastrica; possono
inglobare sia batteri in fase di fermentazione attiva, ma
anche frazioni del contenuto ruminale, favorendo la
fermentazione. I funghi anaerobi presenti nel rumine
possono essere sia parassiti dei protozoi ciliati sia saprofiti dei tessuti vegetali. Questi ultimi giocano un ruolo importante nell’aumentare le disponibilità dei contenuti intracellulari delle cellule vegetali per azione meccanica o enzimatica, anche solubilizzando parte della
lignina (che non sarà digerita comunque). I funghi hanno un ruolo sinergico con i batteri nella produzione del
metano. Tra i microrganismi presenti nel rumine ci sono anche i metanogeni; questi rappresentano una particolare classe di archeobatteri che hanno il compito
principale di rimuovere e utilizzare l’idrogeno molecolare liberato dalle fermentazioni di batteri, protozoi e
funghi. Se da una parte però questo processo favorisce
una migliore resa delle fermentazioni, dall’altra il metano prodotto e liberato dal ruminante rappresenta un
dispendio energetico per l’animale con effetti negativi
sull’ambiente.
L’attività ruminativa impegna l’animale per 11-12 ore al
giorno con un totale di 40 mila atti ruminativi e con una
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produzione di saliva che nei bovini arriva a 180 litri al
giorno. Sul biochimismo del rumine la disponibilità di
fonti bibliografiche è enorme e oggi possiamo dire che è
stato raggiunto un buon livello di consapevolezza riguardo a quanto accade all’interno di questo “contenitore”. Le informazioni risultano anche adeguate riguardo
ai prodotti principali delle fermentazioni ruminali: gli
acidi grassi volatili (acetico, propionico, butirrico); il
metano (CH4) e l’anidride carbonica (CO2); questi ultimi due gas sono prodotti in quantità enormi (dai 500 ai
700 litri al giorno nel bovino) ed eliminati con
l’eruttazione.
Una delle principali difficoltà riscontrate dai ricercatori
in questi anni di studi è data dal fatto che solo una piccolissima parte di tutte le specie microbiche presenti nel
tratto digerente dei ruminanti può essere coltivata in
laboratorio. Questo ha limitato le indagini sia su alcuni
meccanismi di interazione tra ospite e microflora ruminale e sul contributo che la dieta può dare nel determinare la composizione del microbiota ruminale sia sull'effetto che il "fenotipo ruminale" ha in termini di emissioni di gas ed efficienza digestiva.
parallelo massivo di molecole di Dna amplificate in modo clonale o di singole molecole di Dna separate spazialmente in una cella a flusso (flow cell). Gli effetti di
questi nuovi metodi di analisi, in studi di biodiversità
microbica, ha permesso di ottenere l’accesso a informazioni enormemente maggiori di quelle ottenibili in precedenza. Le applicazioni possibili sono innumerevoli e
comprendono la caratterizzazione delle comunità microbiche umane a fini clinici e lo studio di popolazioni
microbiche ambientali al fine di identificare geni (e specie codificanti) utili per scopi commerciali quali la produzione di biocarburanti o di altri composti a carattere
farmaceutico, agrochimico o enzimatico e per bioremediation [2, 3] o creare un profilo di specie sconosciute.
Mentre il genoma di un individuo umano è statico, il
“metagenoma” microbico è dinamico e fluttuante. Per
studi tassonomici volti a identificare i generi batterici di
una comunità microbica, per esempio quella presente
nel fluido ruminale, e la loro abbondanza relativa è stato sviluppato un approccio Ngs differente basato sul sequenziamento di regioni variabili di Rna ribosomale 16S
(16S-rRNA).
Questa applicazione può essere condotta con piattaforme a minore throughput pur fornendo un notevole livello di informazione sulla biodiversità del campione
analizzato.
La metagenomica
In questi ultimi anni, lo sviluppo delle scienze "omiche"
(genomica, trascrittomica, metabolomica) e di strumentazione ad alta efficienza (Next generation sequencing,
high throughput) ha permesso di avviare studi di sequenziamento di genomi di intere comunità microbiche
(metagenomica) direttamente nel loro ambiente naturale, evitando così il problema del prelevamento e della
coltivazione in laboratorio. La maggior parte di questi
organismi, infatti, sono di difficile coltivazione a causa
delle loro particolari esigenze (temperature elevatissime, pressioni pari a quella dei fondali oceanici, alte
concentrazioni saline, ecc.). Dal momento che non si
possono coltivare queste forme di vita, occorre un prelievo nei siti in cui crescono attivamente, tra cui anche il
rumine.
Le tecnologie di nuova generazione per il sequenziamento del Dna consentono di ottenere velocità e throughput elevati, rendendo possibile il completamento in
alcune settimane di analisi (con un sequenziamento base sarebbero occorsi anni). Oggi sono disponibili in
commercio diverse piattaforme Ngs (Roche/454 Life
Sciences; Illumina/Solexa; SOLID, Applied Biosystem)
[1]. Tutte le piattaforme Ngs disponibili presentano una
caratteristica tecnologica comune: il sequenziamento
Applicazioni
Negli ultimi 4-5 anni, grazie alle metodiche Ngs è stato
possibile verificare e studiare molti aspetti e meccanismi presenti nel rumine non solo della specie bovina ma
anche degli ovi-caprini e dei bufalini [4].
Tra gli argomenti maggiormente studiati ci sono:
• l’interazione tra la variazione di pH del comparto ruminale, la somministrazione della dieta e le comunità
microbiche presenti nel rumine; da alcune ricerche è
emerso un significativo effetto della relativa abbondanza di alcune specie tra cui Fibrobacter succinogenes e Ruminococcus albus quattro ore dopo la somministrazione della dieta rispetto a due ore prima della somministrazione;
• la distribuzione di alcuni genera come Prevotella e
Treponema nella frazione “solida” del fluido ruminale, con un ruolo preponderante nella degradazione
della componente cellulosica, e di Paludibacter e Succiniclasticum nella frazione “liquida”; la possibilità di
discriminare tra le specie maggiormente presenti nella frazione “solida” o “liquida” del fluido ruminale
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può aiutare a comprendere meglio alcuni ruoli funzionali di specie non coltivabili;
• i cambiamenti del microbiota ruminale durante il periodo di transizione compreso tra la fine della gravidanza e l’inizio della lattazione, periodo in cui la
composizione della dieta viene modificata in base alle
necessità nutrizionali dell’animale e si ha una rapida
mobilizzazione delle riserve per provvedere all’energia necessaria alla produzione di latte;
• il rapporto foraggio: concentrati nella dieta, i loro effetti sulla microflora ruminale e la successiva sintesi
di acidi grassi. Molti studi hanno portato alla conclusione che un aumento di foraggi nella dieta a discapito di concentrati favorisce lo sviluppo di una microflora specifica, tra cui le Prevotalleceae, che porta a
una maggiore sintesi di propionato con una riduzione
nella produzione di metano;
• l’aggiunta di supplemento lipidico alla dieta e l’effetto
di questo supplemento sul metabolismo dell’animale
e la sintesi degli acidi grassi nel latte.
Studi continui sulla relazione tra il microbiota ruminale, i metaboliti e la dieta dell’ospite consentiranno di
comprendere meglio la funzionalità del rumine e
l’interazione di questo “complesso sistema” con la salute dell’animale e le emissioni di metano.
studiare la diversità delle comunità microbiche presenti
in campioni di rumine ottenuti da una vasta gamma di
specie e razze di ruminanti, allevati con diversi sistemi
di gestione aziendale e con differenti diete. Il progetto è
maggiormente focalizzato sullo studio di quei campioni
provenienti dai ruminanti tipicamente allevati, quali
bovini, ovini e caprini; tuttavia, sono studiati anche
campioni provenienti da ruminanti selvatici, camelidi e
marsupiali.
Hungate 1000, a catalogue of reference genomes from
the rumen microbiome è un progetto che ha il compito
di produrre un “catalogo” di genomi di riferimento da
batteri ruminali coltivati e archeobatteri metanogeni,
insieme con colture rappresentative di funghi ruminali
anaerobi e protozoi ciliati. L'idea del progetto è nata durante un convegno del Rmg Network sopra citato, tenutosi in Nuova Zelanda nel febbraio 2011, dove è emersa
la necessità di avere dei genomi di riferimento dei microrganismi ruminali. Infatti, nella banche dati pubbliche sono disponibili le sequenze genomiche solo di un
piccolo numero di batteri ruminali e di archeobatteri
metanogeni e ancora meno sono le informazioni disponibili sui funghi ruminali anaerobici e sui protozoi ciliati. Il progetto è supportato, oltre che dal governo della
Nuova Zelanda, anche dal Department of Energy Joint
genome institute (Doe Jgi) americano.
Le informazioni raccolte nel corso del progetto sui genomi di riferimento saranno utilizzati per sostenere gli
sforzi internazionali per la messa a punto di strategie
che consentano la mitigazione delle emissioni di metano da parte degli allevamenti e per avviare nuovi progetti di ricerca genomica finalizzati alla comprensione
della funzione ruminale al fine di trovare un equilibrio
tra le produzioni animali e le emissioni di gas serra.
RuminOmics è un altro progetto, finanziato dalla
Commissione europea con il bando FP7-KBBE, che integra conoscenze in zootecnia, nutrizione e fisiologia
animale, microbiologia, genetica, genomica animale e
microbica per incrementare l’efficienza produttiva e ridurre gli effetti ambientali degli allevamenti di bovini
da latte. Il progetto monitorerà 1000 vacche in lattazione, utilizzando su larga scala tecnologie “omiche” per
comprendere le interazioni tra animale, dieta e microbiota ruminale e intestinale e come queste interazioni
influenzino la produzione di gas serra e l’efficienza di
utilizzo della razione.
Il progetto mira inoltre a fornire strumenti tecnici e le
basi di bioinformatica per l'analisi rapida di fenotipi e
Progetti internazionali
Viste le ricadute della composizione della microflora
ruminale sulle emissioni di gas serra da parte degli allevamenti e sulla qualità delle produzioni animali, sono
stati finanziati numerosi progetti a livello internazionale per lo studio del metagenoma ruminale. Qui di seguito se ne descrivono i principali.
The rumen microbial genomics network (Rmg
network), finanziato nel 2011 dal governo della Nuova
Zelanda, è un network di ricerca a livello mondiale il cui
scopo è lo sviluppo di linee guida e protocolli comuni
per uno studio del metagenoma ruminale finalizzato alla messa a punto di strategie per la mitigazione delle
emissioni di metano. Gli sforzi delle ricerche sono focalizzati quindi sulla generazione di una base di dati che
fornisca gli strumenti per caratterizzare il rapporto tra
la composizione del microbioma ruminale (o di parti del
microbioma ruminale) e la bioconversione efficiente
della razione alimentare.
Il Global rumen census è un progetto internazionale
guidato da AgResearch, una delle organizzazioni di ricerca principali della Nuova Zelanda, che ha lo scopo di
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dei microbiomi e creare una banca pubblica di dati di
metagenomica.
Riferimenti bibliografici e sitografici
[1] Karl V. et al., 2010. Next-generation sequencing:
dalla ricerca di base alla diagnostica. Biochimica
clinica, 34, 4.
[2] Jaenicke S. et al., 2011. Comparative and joint
analysis of two metagenomic datasets from a biogas
fermenter obtained by 454-pyrosequencing. PLoS One,
6 (1), e14519.
[3] Schloss P. D., Handelsman J., 2003. Biotechnological prospects from metagenomics. Current opinion in
biotechnology, 14 (3), 303-310.
[4] McCann J. C. et al., 2014. High –throughput methods redefine the rumen microbiome and its relationship
with nutrition and metabolism. Journal bioinformatics
and biology insights, 8, 109-125.
http:// faostat.fao.org/
www.rmgnetwork.org.nz
www.globalrumencensus.org.nz
www.hungate1000.org.nz
www.ruminomics.eu
Bianca Castiglioni è ricercatrice all’Istituto di Biologia e biotecnologia agraria, Lodi.
Paola Cremonesi è ricercatrice all’Istituto di Biologia e biotecnologia agraria, Lodi.
www.intersezioni.eu
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