Insidie analitiche ed errori di interpretazione in immunometria Lucia Belloni SSD Autoimmunità, Allergologia e Biotecnologie Innovative Dipartimento di Diagnostica per Immagini e Medicina di Laboratorio Azienda Ospedaliera "Arcispedale Santa Maria Nuova" IRCCS Reggio Emilia XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 “The effect of a substance present in the sample p that alters the correct value of the result, usually expressed as concentration or activity, for an analyte.” Interference with Clinical Laboratory Analyses. Kroll MH and Elin RJ. Clin Chem 1994; 40/11:1996-2005 XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Fattori esogeni Emolisi Ittero Turbidità provette di p prelievo Additivi nelle p Farmaci Contaminazione da carry over Fattori endogeni Effetto gancio Proteine leganti Effetto matrice Sostanze cross reagenti Autoanticorpi i i antii analita li Anticorpi eterofili XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Interferences in Immunoassay Jill Tate, Greg Ward Abstract Substances that alter the measurable concentration of the analyte or alter antibody binding can potentially result in immunoassay interference. Interfering, endogenous substances that are natural, polyreactive antibodies or autoantibodies (heterophiles), or human anti-animal antibodies together with other unsuspected binding proteins that are unique to the i di id l can interfere individual, i t f with ith the th reaction ti b t between analyte and reagent antibodies in immunoassay. Clin Biochem Rev Vol 25 May 2004 XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Interference in immunoassays: avoiding erroneous results Immunoassay Reliability (2004) James Miller XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Ab di cattura A Ag Ab marcato t XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 10000 Segnale 1000 100 Intervallo di concentrazioni coperto dalla curva di calibrazione 10 1 1 10 102 103 104 106 105 [Ag] XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Dosaggio qualitativo di hCG Classic lateral flow strip Signal VS Concentration (hook effect) XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 L’albumina può interferire a causa della forte concentrazione e della capacità legante Le proteine di legame (SHBG, TBG, CBG…) legano specificamente l’analita Il lisozima può interferire instaurando un ponte fra Ab di cattura e Ab di segnale I fattori reumatoidi sono autoanticorpi che possono bloccare il sito di legame dell’Ab di reazione Le proteine del complemento si legano agli Ab di reazione ostacolando il legame con l’analita XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 impedimento sterico al legame dell’Ag sup pporto solido Ag complemento o fattore complemento o fattore reumatoide Ab marcato Ab marcato Ab di cattura XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 L reazione La i A Ab è influenzata Ag-Ab i fl d numerosii fattori da f i presenti nel mezzo nel quale ha luogo, come pH, forza ionica e le concentrazioni in sali, lipidi e proteine. Questi parametri variano chiaramente a seconda del liquido biologico sul quale è effettuato il dosaggio. L’effetto di questi fattori sul risultato costituisce quello che viene correntemente definito “effetto matrice”. XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 L’effetto L effetto matrice è dovuto ad una significativa differenza di composizione chimica fra il diluente degli standard e i campioni incogniti. incogniti Così un dosaggio messo a punto per il siero o il pl m dovrà plasma do à essere e e e rivalidato i lid to se e sii tratta t tt di utilizzarlo tili lo per altri liquidi biologici (urine, liquido cefalo- rachidiano, hidi saliva, li li idi da liquidi d aspirati, i ti surnatanti t ti da d colture cellulari, liquidi di dialisi o ultra filtrati). XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 La reazione di dosaggio può essere perturbata da sostanze strutturalmente simili all’Ag da dosare, in grado di impegnare i siti anticorpali. Si parla in questo caso di interferenze specifiche. XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Il problema bl analitico liti più iù f frequentemente t t l legato t all’anticorpo è un difetto di specificità. L’ ff tt sulla L’effetto ll misura i d ll’ dell’analita lit dipenderà di d à dalle d ll costanti t ti di affinità dell’Ab sia nei riguardi dell’analita che della sostanza i interferente, f nonché hé d ll dalle concentrazioni i i reciproche delle due forme molecolari nel campione in esame. XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Analita Molecole che possono causare reazione crociata CORT (plasma o siero) 11-desossicortisolo, 21-desossicortisolo, prednisolone, metilprednisolone, prednisone metabolizzato a prednisolone CORT (urine) Corticoidi, metaboliti del CORT coniugati o non coniugati T3 Acido triiodotetracetico, diclofenac TESTO Diidrotestosterone, DHEA-S 17 α-OH PROGE Solfato del 17 OH pregnenolone (periodo neonatale) ALDO Glucuronide del tetraidroaldosterone (insufficienza renale) E2 E1 (trattamento ormonale sostitutivo) PROGE Diidroprogesterone (trattamento orale con PROGE micronizzato) Digossina Spironolattone XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 anticorpo antigene antigene marcato Cross reagente XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 molecola interferente molecola interferente XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Nel siero di certi soggetti possono essere presenti autoanticorpi diretti contro ll’analita analita. Essi possono essere associati a una patologia autoimmune (per esempio anti-Tg in corso di patologia tireoidea, anti-insulina anti insulina in fase prediabetica…), oppure indotti da un trattamento (antip ) oppure pp presenti senza p insulina,, anti-GH,, anti-eritropoietina…) eziologia conosciuta (anti-PRL, anti-troponine, anti-PTH…). In questi casi l’analita è presente nel siero sia in forma libera che in forma legata, o aggregata, quest’ultima denominata forma macro (per esempio macroprolattina). Il loro insieme costituisce la forma totale. XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Anticorpi anti: Tireoglobulina Prolattina Insulina Troponine T3 T4, T3, T4 TSH Ormone somatotropo Paratormone Gonadotropine ipofisarie XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Il tracciante (Ag marcato) che si lega normalmente all’Ab di reazione i può ò ugualmente l i impegnarsi i con eventuali li autoanticorpi, i i il che determina una diminuzione della formazione di immunocomplessi. Nella maggioranza dei casi, in particolare nei dosaggi nei quali l’Ab di reazione è fissato su una fase solida, la tappa di separazione tra le frazioni libera e legata trattiene unicamente la frazione di tracciante legata agli Ab di dosaggio e l’interferenza risulta positiva perché parte del tracciante può essere impegnato i t dagli d li autoanticorpi t ti i e quindi i di non legarsi l i alla ll fase f solida, così diminuendo il segnale relativo al legato ed inducendo, sulla curva decrescente di taratura,, una sovrastima della misura. XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 La coppia di Ab riconosce l’analita libero ma anche, almeno lmeno in parte, p te l’analita l’ n lit legato. leg to In effetti, effetti da d un n lato l to gli epitopi riconosciuti dagli Ab di dosaggio possono essere di diversi i dagli d li epitopi it i occupati ti dagli d li autoanticorpi. t ti i Inoltre, I lt se l’affinità degli Ab di dosaggio è superiore a quella degli autoanticorpi, t ti i può ò aver luogo l un processo di spiazzamento i t di questi ultimi dai siti di legame, rendendo libero l’analita per l la reazione con dell’analisi è l’ b l’Ab quindi d di d dosaggio. spesso Ill intermedio risultato i l fra concentrazione libera e la concentrazione totale. XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 la Certi sieri contengono Ab anti-immunoglobuline animali Questi Ab sono in grado di legarsi agli Ab di animali. reazione impiegati negli immunodosaggi. Essi possono essere diretti contro il frammento Fc delle immunoglobuline ma anche contro le regioni più variabili, frammenti Fab. Fab antigene Gli Ab eterofili appartengono anticorpi umani anti‐idiotipo spesso alle classi IgG, IgG IgA, IgA IgM e raramente alla classe IgE. anticorpi umani anti‐isotipo p XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 L’agente immunogeno responsabile della presenza di tali Ab è generalmente conosciuto. Questi Ab si ritrovano per esempio in pazienti sottoposti a vaccinazioni a base di prodotti d’origine animale o che abbiano subito un procedimento immunoterapeutico o una immunoscintigrafia con Ab monoclonali murini, o in quei soggetti che per loro professione o modo di vivere entrano frequentemente in stretto contratto con animali. XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Quando l’immunogeno è un Ab monoclonale di topo utilizzato in un percorso diagnostico o terapeutico, si parla di HAMA. Tali Ab possono persistere nel sangue per parecchi mesi dopo l’esposizione alle immunoglobuline animale. XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 di (a) (b) Interferenza p positiva anticorpo antigene antigene marcato anticorpi eterofili XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 anticorpi eterofili Interferenza positiva XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 anticorpi eterofili Interferenza negativa XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 • anti-avidina anti avidina o streptavidina, streptavidina • anti-coniugati, • anti-fluorescina, anti-fase fase solida • anti XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 in assenza di interferenze … XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 interferenze con effetto positivo: A B C XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 interferenze con effetto negativo: D E F XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 G Test precedenti del paziente incongrui con l'attuale Condizioni cliniche particolari (se note) affezioni renali o epatiche, artrite reumatoide gravidanza, reumatoide, gravidanza neonati… neonati Set di test combinati incongruenti fra loro ((es. T3-T4-TSH,, E2-P-LH-FSH,, ecc)) Relazione con il clinico richiedente XX Ligand Assay – Bologna, 24-26 novembre 2014 Te lo dicevo, dicevo Francesca! Succede solo quando tua madre entra nella stanza..
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