14-Microarray e imaging

PROTEIN ARRAYS
“ANALITICI”
analisi del livello di
espressione delle proteine
(PROTEIN PROFILING).
FUNZIONALI
analisi di attività-funzione di
proteine purificate e ancorate
sul supporto solido
ANALISI DI INTERAZIONE:
9 Le molecole “esca” (anticorpi,
proteine,
acidi
nucleici,
carboidrati,
peptidi,
piccoli
composti
organici,
farmaci)
vengono
immobilizzate
(“stampate”) sui microarray
9 Estratti
cellulari
(o
altri
campioni biologici) opportunamente
marcati (es. sonde fluorescenti)
vengono incubati con gli array
9 Le proteine legate vengono
“individuate” con opportuni sistemi
di analisi
9 Interi PROTEOMI possono essere immobilizzati su opportune
superfici (vetro); sui chip così prodotti può essere eseguito uno
screening per l’interazione con proteine ed altre molecole.
9 E’ possibile individuare specifici DOMINI di interazione
9 E’ possibile valutare la DINAMICA delle interazioni mediante
analisi con risonanza plasmonica di superficie
9 E’ possibile valutare le CARTATTERISTICHE dell’interazione
(es. mediante studi di inibizione).
I protein arrays possono essere analizzati
con vari metodi:
¾ Fluorescenza; Chemiluminescenza; Radioattività
¾ Spettrometria di massa SELDI
(surface-enhanced laser desorption/ionization)
¾ risonanza plasmonica di superficie
(SPR)
¾ microscopio a forza atomica
(AFM)
METODI
“LABEL-FREE”
FLUORESCENZA (e CHEMILUMINESCENZA)
Semplice, sicuro, sensibilità elevata, risoluzione elevata.
Compatibile con i comuni scanner per microarray.
9 I fluorofori (proteine o piccole molecole marcate con sonde
fluresecenti) possono essere legati direttamente sul chip ed
analizzati.
9 Il protein array viene esposto ad una proteina marcata con un tag
specifico (ad es. biotina). Successivamente si valuta l’avvenuto legame
trattando il chip con una una fase di affinità (streptavidina) marcata
con una sonda fluorescente .
Chemiluminescenza
Fluorescenza
AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE:
ROLLING CIRCLE AMPLIFICATION (RCA)
SENSIBILE (≤ fentomoli)
QUANTITATIVO (ampia linearità di risposta)
RIPRODUCIBILE
Metodo messo a punto per seguire la secrezione nel tempo
di citochine, da parte di cellule umane trattate con LPS o
TNFα (Schweitzer et.al, Nat Biotechnol., 2002)
PROCEDURA
1. Stampatura del chip con anticorpi monoclonali diretti verso
38 diverse citochine;
2. Applicazione del campione
PROTEIN CAPTURE
3. Lavaggio del chip
4. Introduzione anticorpi policlonali biotinilati, diretti verso le
citochine
5. Lavaggio del chip
6. Introduzione anticorpi anti-biotina, leganti l’estremità 5’ di
un oligonucleotide primer
7. Lavaggio del chip
8. AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE
8. AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE
Si
aggiungono
un
DNA
circolare a doppio filamento,
DNA polimerasi e nucleotidi.
Dopo
45
neutro…)
Circle
min
di
(37°C,
RCA
pH
(Rolling
Amplification)
si
ottiene un lungo filamento di
DNA
a
singola
elica,
che
rimane legato all’anti-biotina.
RIVELAZIONE:
Ibridazione con un
oligonucleotide
complementare e
fluorescente (E).
Metodi che utilizzano fluorofori per
marcare le proteine
N
A
V
N
A
SV
TA
TA
I
G
G
• Metodi sensibili.
• Possono essere utilizzati i “lettori” per DNA array.
• Basso consumo di reagenti
• Rapida interpretazione dei risultati
I
G
G
- possono causare cambiamenti conformazionali e
quindi perdita di attività biologica
- le varie proteine del campione possono essere
marcate in modo non omogeneo
METODI LABEL FREE
Spettrometria di massa SELDI:
- metodo rapido, conveniente
- perdita campione dopo l’analisi; proteine saldamente legate al
supporto non sono rilevabili
SPR (risonanza plasmonica di superficie):
- fenomeno ottico che permette di monitorare in tempo reale le
interazioni tra biomolecole.
- permette la caratterizzazione delle interazioni (kass, kdiss)
AFM:
- monitoraggio cambiamenti topologici e spessore della superficie del
protein array, utile combinarlo col metodo SPR
BIACORE e SPR
Il BIACORE è un biosensore che utilizza il fenomeno ottico della
Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR) per monitorare in
tempo
reale
interazioni
tra
biomolecole.
Permette
la
determinazione di costanti cinetiche, misurando separatamente e
direttamente le costanti di associazione e di dissociazione.
La tecnologia BIA misura la concentrazione di
biomolecole in stretta prossimità di una
superficie appositamente preparata.
La risposta è indipendente dalla natura delle biomolecole e non
richiede marcatura dei reagenti!
I componenti essenziali del sistema analitico BIACORE sono:
9biosensore
(sensor
chip)
su
cui
viene
covalentemente uno dei due analiti e
immobilizzato
dove ha luogo
l’interazione;
9 il sistema ottico responsabile della generazione e della
registrazione del segnale;
9 un sistema integrato di pompe capaci di controllare il flusso
e quindi il trasporto del campione sulla superficie del sensore.
Biacore terminology
• Ligand: the interactant immobilized on the sensor surface
The ligand can be immobilized directly to the sensor surface,
or indirectly via an immobilized capturing molecule
• Analyte: the interactant in free solution
analyte
analyte
ligand
ligand
capturing
molecule
PROCEDURA:
• Il ligando viene immobilizzato covalentemente sulla
superficie del CHIP (sensor chip);
• Se ne segue l'interazione con l’analita (in soluzione)
in condizioni di flusso continuo.
L'analisi BIA segue in tempo reale la
formazione e la dissociazione di complessi
biomolecolari sulla superficie del sensor chip
nel momento in cui tali interazioni avvengono.
Sensor Chips
Quantitative measurements of the binding interaction between one or more
molecules are dependent on the immobilization of a target molecule to the
sensor chip surface.
Binding partners to the target can be captured from a complex mixture, in
most cases, without prior purification (for example, clinical material, cell
culture media) as they pass over the chip. Interactions between proteins,
nucleic acids, lipids, carbohydrates and even whole cells can be studied.
The sensor chip consists of a glass surface, coated with a thin layer of gold.
This forms the basis for a range of specialized surfaces designed to optimize
the binding of a variety of molecules.
In the most widely used sensor chip, the gold surface is modified with a
carboxymethylated dextran layer. This dextran hydrogel layer forms a
hydrophilic environment for attached biomolecules, preserving them in a nondenatured state. A range of other derivatized surfaces is also available to
enable various immobilization chemistries
Biacore offers a range of Sensor Chips
Sensor Chip CM5 – for applications from basic research to quality control
Sensor Chip SA – for capture of biotinylated peptides, proteins and DNA
Sensor Chip NTA – for capture of ligands via metal chelation
Sensor Chip HPA – for membrane biochemistry and the study of membrane
associated receptors in a near native environment
Pioneer Chips – as tools for users’ novel applications in terms of chemistry or
binding specificity.
Sensor Chips
CM5 (carboxy methyl dextran)
Interactions involving all types of biomolecules such as proteins, lipids,
carbohydrates, and nucleic acids can be studied.
Studies can also be made of reagents ranging in size from small organic molecules,
e.g. drug candidates, to large molecular assemblies, such as membrane receptors
embedded in lipid bilayer vesicles or even whole cells.
Amine coupling
O
O
O
OH
C
N
EDC/NHS
O
C
O
ligand
ligand
NH2
NH
C
O
Amine coupling: most common method of coupling. Surface is activated with a 1:1
mixture of NHS:EDC, to give reactive sucinimide esters. The ligand (in a buffer giving a
+ charge) is passed over the surface and the esters react spontaneously with amino groups.
Any free amine group can react with the surface.
Amine Coupling Sensogram
Thiol coupling
ligand
N
O
N
ligand
NH
PDEA
EDC/NHS
C
O
S
S
O
O
OH
S
S
C
O
C
O
SH
NH
C
O
Thiol coupling: an active disulfide moiety can be introduced either on the dextran matrix
or on the ligand molecule. 2-(2-pyrdinyldithio) ethaneamine (PDEA) can be used to
introduce the actice di-sulfide group.
Sensor Chips
SA (streptavidin)
Sensor Chip SA is designed to bind biotinylated molecules.
Streptavidin-biotin coupling provides an alternative to other ligand coupling methods e.g.
covalent amine or thiol coupling, and is particularly valuable for applications in molecular biology
where immobilization of nucleic acids through a 5'-biotin moiety is often the most practical
approach.
Sensor Chip
NTA
Sensor Chip NTA is designed to bind histidine-tagged molecules.
Attachment of ligands via histidine-tags provides a valuable and convenient
methodological interface between BIA analysis and other laboratory
techniques that rely on His-tags, e.g. chelating chromatography.
Attachment via a His-tag has also the advantage of orienting the ligand
molecules in a homogeneous way and allowing the attachment to be carried
out without significantly changing the pH or ionic strength during the
coupling procedure.
• La SPR è un fenomeno che avviene all’interfaccia fra 2 mezzi con diverso indice di
rifrazione.
• Il rapporto fra i 2 indici di rifrazione, definisce un valore di angolo di incidenza, oltre il
quale non si ha più rifrazione della luce e si osserva la totale riflessione interna.
• Solo una componente elettromagnetica penetra per una breve distanza nel mezzo a più
basso indice di rifrazione
ONDA EVANESCENTE
Il segnale SPR è generato (ad uno
specifico
angolo
di
incidenza)
Light source
Polarizer
Detection unit
dall’interazione dell’onda evanescente
Ex,z
Glass prism
con gli elettroni delocalizzati sulla
superficie
di
un
sottile
strato
metallico (oro), posto all’interfaccia
fra i due mezzi. Questi elettroni,
detti anche PLASMONI, vengono così
eccitati e coinvolti in un’oscillazione
risonante collettiva
kx
kz
Θ
Gold d = 50 nm
ksp
εg
ε(ω)
εa
δz = 200nm z
Evanescent wave
x
QUINDI:
Quando l’interfaccia tra i due mezzi è rivestito da un film metallico e la radiazione
è monocromatica e polarizzata, ad un determinato angolo di incidenza detto angolo
di risonanza (θSPR) parte dell’energia della radiazione incidente viene ceduta agli
elettroni liberi del film metallico (ORO).
In corrispondenza dell’angolo di risonanza ci sarà il
minimo dell’intensità luminosa della radiazione riflessa.
…la posizione dell’angolo di risonanza dipende
da vari fattori:
1. proprietà del metallo (oro);
2. lunghezza d’onda radiazione incidente;
3. indice rifrazione vetro (uno dei due mezzi);
4. indice rifrazione soluzione acquosa a contatto col metallo
(l’altro mezzo)
modificato dai fenomeni che
avvengono sulla superficie del
metallo
se vengono mantenuti costanti
tutti gli altri parametri
9 proprietà metallo;
9 λ radiazione incidente;
9 Indice Rifrazione Vetro.
la posizione di θSPR varierà solo
in base all’Indice di Rifrazione
della soluzione
nel caso dei protein arrays, in base alle
interazioni tra le proteine immobilizzate
sul chip ricoperto di oro e il campione da
analizzare.
soluzione
contenente l’analita
PROTEINE
ORO
VETRO
riportando in funzione del tempo il valore di θSPR si ottiene
un sensogramma (grazie a un fotorilevatore ottico)
Il SENSOR CHIP
Vetrino ricoperto da un
lato di un sottile strato
in oro al quale è legata
covalentemente
una
matrice; la matrice è ciò
che
permette
alle
biomolecole di poter
essere
immobilizzate
sulla
superficie
del
sensore.
La matrice di destrano è covalentemente legata allo strato sottile
d’oro attraverso uno strato di collegamento intermedio. La matrice
di destrano si estende per circa 100 nm fuori dalla superficie del
sensore e fornisce un ambiente idrofilico nel quale avvengono le
interazioni.
Le informazioni che si possono ottenere da un’analisi BIACORE
sono:
9specificità di legame fra due molecole;
9concentrazione di molecole attive all’interno di un campione;
9affinità di legame;
9cinetica d’interazione;
9indagine di fenomeni di cooperatività come l’allosterismo;
9identificazione di ligandi.
Vantaggi della tecnologia analitica BIA:
9 svolgimento dell’analisi in tempo reale;
9 possibilità di automatizzare il sistema per compiere più analisi
consecutive;
9 eliminazione in molti casi delle procedure di purificazione del
campione;
9 possibilità di rigenerare il chip dopo ogni analisi (si possono fare
una serie di analisi consecutive utilizzando sempre lo stesso chip);
9 riproducibilità;
9 velocità di analisi;
9 accuratezza
(possibilità
per
l’operatore
di
controllare
il
microflusso all’interno della cella così da regolare il tempo di
permanenza e la concentrazione del campione sulla superficie del
chip).
TISSUE MICROARRAY
Tessuti specifici (needle biopsies) sono stati adesi su microarray e
su di essi sono stati eseguiti screening con DNA, RNA, proteine.
E’ possibile allestire anche centinaia di microarray “identici” da un
unico prelievo bioptico.
Applicabile anche:
MASS IMAGING
IMS (Imaging-Mass-Spectrometry)
Analisi mediante MALDI di intere sezioni di tessuto.
Linea di ricerca che si affianca all’istologia e all’immunoistochimica.
Identificare le proteine in quella che è la loro naturale
distribuzione nei tessuti.
Il risultato dell’analisi è una serie di picchi (corrispondenti a determinati
valori m/z); per ogni valore di peso molecolare trovato, viene ricostruita
un’immagine (mappa di peso molecolare) che ne evidenzia la distribuzione e
l’intensità.
Come si può ottenere un’immagine dai dati m/z?
L’imaging di tessuti permette di ottenere una rappresentazione del valore
m/z del campione nelle 2 dimensioni dello spazio.
Il processo di ricostruzione dell’immagine può quindi essere paragonato a
quello delle macchine fotografiche digitali in cui ogni immagine è composta
da insieme ordinato di migliaia di pixel ed ogni pixel è composto da diversi
canali di colore.
Nel MALDI il campione ricoperto di matrice e seccato è messo all’interno
della sorgente in modo da esporre l’area di interesse alla luce laser che
produce un insieme ordinato di “pixel” ognuno dei quali ha associato un suo
spettro di massa. Sommando tutti gli ioni di ogni spettro si ottiene
l’immagine totale.
Imaging e Profiling
Section frozen
on cryostat
Section on
MALDI plate
Profiling: analisi di profili proteici (spettri
ottenuti in un determinato range di PM) in
alcune aree del tessuto.
Questi esperimenti vengono di solito
effettuati quando si intende fare un confronto
tra gruppi (tumore vs sano; trattato vs
controllo) in sezioni relativamente omogenee.
Imaging: analisi dell’intero tessuto mediante
un ordinato numero di spots in cui gli spettri
vengono acquisiti ad intervalli che determinano
la risoluzione dell’immagine.*
Si creano mappe 2D di intensità ionica o
immagini plottando le intensità di ogni segnale
ottenuto in funzione delle sue coordinate x,y.
*Nota: il raggio laser ha in genere un diametro di 50µm, quindi non si può scendere
al di sotto di questa risoluzione……
Per la messa a punto della tecnica venne stampato su di un target l’impronta ©, col colorante
Comassie Brilliant Blue (PM = 831). Come matrice venne utilizzato l’acido α-cianoidrossicinamminico che venne applicato come un film sottile mediante un nebulizzatore
elettrico.
L’immagine in B è stata ottenuta registrando tutti gli spettri ottenuti muovendo il target
(diametro del laser ~25µm; diametro dell’area irradiata ~500µm) e registrando i segnali a
m/z=832.
Per un rapporto Segnale/Rumore >2
S/N<2
circolo pieno
circolo vuoto
I dati vengono poi elaborati da un programma dedicato (SigmaPlot), ottenendo l’immagine (A).
Preparazione dei campioni
I profili e le immagini possono essere ottenute da sottili sezioni tagliate con un
criostato. In genere si usano sezioni di 10-100 µm che vengono tagliate a -20°C
e poi poste su un vetrino conduttivo (ha un lato trattato con metalli).
Le sezioni vengono fatte seccare e poi la matrice è applicata come gocce
singole (profiling) o come uno strato omogeneo (imaging).
Per applicare uno strato il più possibile omogeneo ed impedire la diluizione delle
proteine del tessuto nella matrice le sezioni vengono prima disidratate con
etanolo e poi la matrice è applicata con un nebulizzatore od un elettrospray. Il
processo deve essere ripetuto per più volte (matrice/essiccamento/matrice)
applicando poca matrice per volta (spruzzata da una distanza precisa) in modo
da non estrarre le proteine dal tessuto.
Matrici più usate:
Acido sinapinico; Acido diidrossibenzoico; Acido α-ciano-idrossicinnaminico
I primi lavori sono stati condotti in parallelo ad analisi microscopiche
per confermare la validità del metodo…..
Analisi di cellule epiteliali:
Cellule di mucosa della bocca sono
state colorate con blu di metilene
microscopio a fluorescenza.
Le stesse cellule state analizzate
mediante
MALDI:
un
picco
principale a m/z 7605 (PM =
7604Da).
IDENTIFICAZIONE:
analisi MS/MS su digerito triptico.
frammento di IB-1 (basic proline
rich peptide)
Analisi di sezioni di cervello di topo:
Sezioni di 12 µm sono state colorate con emetossilina/eosina; si distingue: la
corteccia cerebrale, il corpo calloso e lo striato.
Un’altra sezione è stata analizzata al MALDI con una risoluzione di 50 µm.
Le immagini derivano dalla somma di più di 20000 spettri. Le mappe sono
state ottenute seguendo i 5 segnali (m/z) prevalenti: il segnale a m/z 18412 è
prevalente nel corpo calloso, il segnale a 6720 è prevalente nello striato

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