GENOMICA E FAUNA ALPINA: UN NUOVO APPROCCIO DI INDAGINE E MONITORAGGIO DELLA BIODIVERSITÀ VALDOSTANA RICERCATORE TEAM LEADER: DOTT.SSA VELCA BOTTI WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS IL PROGETTO Intende fornire nuovi strumenti di biologia molecolare per studiare, monitorare, tutelare e valorizzare la BIODIVERSITA’ ANIMALE che caratterizza i territori valdostani Ricchezza Benessere degli ecosistemi WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS BIODIVERSITÀ E PANORAMA LEGISLATIVO * Convenzione sulla Diversità Biologica (CBD) * Convenzione sulle Specie Migratrici appartenenti alla fauna selvatica (CMS - Convenzione di Bonn) * Convenzione sul commercio internazionale delle specie di fauna e flora selvatiche minacciate di estinzione (CITES - Convenzione di Washington) * Convenzione per la Conservazione della vita selvatica e dell’ambiente naturale in Europa (Convenzione di Berna) * Convenzione sulle zone umide di importanza internazionale (Convenzione di Ramsar) * Protocollo relativo alle Aree Specialmente Protette e la Biodiversità in Mediterraneo (Protocollo ASP) * Convenzione per la protezione del mar Mediterraneo (Convenzione di Barcellona) * Accordo internazionale Santuario Pelagos * Trattato Internazionale sulle Risorse fitogenetiche per l'Alimentazione e l'Agricoltura WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS OBIETTIVI DEL PROGETTO Studio della biodiversità della classe Insecta e attraverso l’utilizzo della tecnica del DNA BARCODING (Odonata, Orthoptera, Lepidoptera) Messa a punto di tecniche di DNA FINGERPRINTING per lo studio dell’ecologia di Circaetus gallicus (biancone) Sviluppo di protocolli per l’identificazione specifica di vertebrati (per la LOTTA AL BRACCONAGGIO a partire da porzione carnee e per il MONITORAGGIO della fauna selvatica locale a partire da tracce biologiche) DNA BARCODING Allestimento una banca del DNA della fauna valdostana che possa essere sfruttata per progetti di ricerca futuri WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS IL DNA BARCODING PER INSECTA E VERTEBRATI DNA a supporto dell’identificazione delle specie analisi gene mitocondriale CITOCROMO C OSSIDASI I (COI o cox1) BARCODE FAUNA 650 pb circa del COI vantaggi: buona variabilità interspecifica, bassa variabilità intraspecifica, assenza di introni, limitata esposizione ad eventi di ricombinazione, disponibilità di siti di annealing per primer robusti e universali (Folmer et al. 1994) elaborazione e correzione dei dati grezzi di sequenza sequenziamento estrazione DNA (cycle sequencing) amplificazione DNA (PCR) elettroforesi capillare WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS IL DNA FINGERPRINTING PER IL BIANCONE per valutare la fedeltà dei SINGOLI INDIVIDUI ai siti riproduttivi valdostani Adulto e piccolo al nido primo utilizzo negli anni ‘80, diffusasi rapidamente per l’identificazione di soggetti sospettati di gravi reati tra cui l’omicidio per l’identificazione individuale basata sequenze ripetute di basi che variano da individuo a individuo © Archivio fotografico PNMA su A. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) più comune A. B. ANALISI MICROSATELLITI o STR (Short Tandem Repeat) più recente ricerca di circa 13 loci microsatelliti B. WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS LO STATO ATTUALE DEL PROGETTO WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS LABORATORIO OPERATIVO Un laboratorio operativo costa tempo, denaro e fatica Sistema di qualità OK Reagenti e consumabili OK Strumentazione OK WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS CAMPIONAMENTI E I CAMPIONATORI SELEZIONE • LUOGHI DI CAMPIONAMENTO • SPECIE DA INDAGARE • MODALITÀ DI CAMPIONAMENTO (a secco, buste e contenitori monouso, lontano da fonti di calore) • MODALITÀ DI REGISTRAZIONE DEL CAMPIONE SUL CAMPO E IN LABORATORIO • MODALITÀ DI CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE (-20°C) CAMPIONATORI • • • • • • Dott. Baroni Daniele Dott. Bocca Massimo Dott.ssa Bosio Gianna Dott.ssa Christille Claretta Dott. Marguerettaz Fabio Dott. Salomon – CRAS Oasi di Sant’Alessio (PV) WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS ANALISI MOLECOLARI: ESTRAZIONE DEL DNA CAMPIONE DI PARTENZA PROCEDURA OPERATIVA STANDARD N °POS Insetti ESTRAZIONE DEL DNA DA INSETTI, ARTROPODI, ASCARIDI E VERMI PIATTI POS FA 06 Tessuti (pelo, porzioni carnee) ESTRAZIONE DEL DNA DA TESSUTI ANIMALI POS FA 05 Sangue e fluidi corporei ESTRAZIONE DEL DNA SANGUE E FLUIDI CORPOREI POS FA 09 Depositi fecali ESTRAZIONE DEL DNA DA DEPOSITI FECALI POS FA 07 Penne, piume e gusci d’uovo ESTRAZIONE DEL DNA DA PENNE, PIUME E GUSCI D’UOVO POS FA 08 Matrici animali ESTRAZIONE VELOCE DEL DNA DA CAMPIONI DI ORIGINE ANIMALE POS FA 02 step critico nel workflow sperimentale del sequenziamento del DNA! WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS ANALISI MOLECOLARI: ITER ANALISI MOLECOLARI: ITER GLI ODONATI BIOINDICATORI gestione ambientale e valutazione dei cambiamenti a breve e lungo termine 129 CAMPIONI 32 SPECIE ADULTI ESUVIE LARVE (43 segnalate) 74% BIODIVERSITA’ VALDOSTANA per ogni specie: 3 esemplari, luoghi diversi WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ODONATI ANISOTTERO ZIGOTTERI ESUVIA © Archivio fotografico MRSN- Foto Botti Velca WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ODONATI Luoghi del campionamento AREE TUTELATE E AREE UMIDE DELLA VALLE D’AOSTA WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ODONATI © Archivio fotografico MRSN- Foto Marguerettaz Fabio Orthetrum coerulescens WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ODONATI 92 88 88 164 200 • ESTRAZIONI DEL DNA • REAZIONI DI AMPLIFICAZIONI DEL TARGET COI CON SUCCESSO • (+ quantificazione dopo gel di agarosio con GelAnalyzer software) • REAZIONI DI PURIFICAZIONE DELL’AMPLICONE • REAZIONI DI CYCLE SEQUENCING E PURIFICAZIONE DEL PRODOTTO DI CYCLE SEQUENCING • SEQUENZE OTTENUTE (FORWARD E REVERSE) !!! ELABORAZIONE E ANALISI DELLE SEQUENZE WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ODONATI !!! ELABORAZIONE E ANALISI DELLE SEQUENZE .ab1 Sequencing analysis software 6 .SEQ BioEdit software FASTA BLASTn BOLD Systems WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ODONATI SPECIE di ODONATA FAMIGLIA LUOGO DEL CAMPIONAMENTO Aeshna cyanea Aeshnidae Pollein, La Thuile (Colle S. Carlo), Lago di Villa Aeshna grandis Aeshnidae Lago di Loz Aeshna mixta Aeshnidae Les Iles, Quart (stagno vicino a casello autostradale) Aeshna juncea Aeshnidae Riserva Naturale del Marais, Meyes, Parco Mont Avic Anax imperator Aeshnidae Lago di Villa, Aosta (giardinetti Champ- Bartelet) Chalcolestes viridis Lestidae Les Iles Coenagrion hastulatum Coenagrionidae Petosan (La Thuile) Coenagrion puella Coenagrionidae Lago di Villa, Lolair, Bionaz Coenagrion pulchellum Coenagrionidae Lago di Lot, Lolair Cordulegaster bidentata Cordulegastridae Pont Saint Martin, Hône Cordulia aenea Corduliidae Lago di Villa Crocothemis erythraea Libellulidae Lago di Villa, Les Iles Enallagma cyathigerum Coenagrionidae Les Iles, Lago di Lolair Erythromma viridulum Libellulidae Les Iles Ischnura elegans Coenagrionidae Lago di Lot, Lago di Villa e Les Iles Ischnura pumilio Coenagrionidae Les Iles, Lago di Lot, Aosta (giardinetti ChampBartelet), Quart (stagno vicino a casello autostradale) WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ODONATI SPECIE di ODONATA FAMIGLIA LUOGO DEL CAMPIONAMENTO Lestes sponsa Lestidae Lago di Loz, Champlong (Verrayes) Lestes virens Lestidae Riserva naturale del Marais Leucorrhinia dubia Libellulidae Riserva Mont Mars (Lac le long), Parco Mont Avic Libellula depressa Libellulidae Lago di Villa Libellula quadrimaculata Libellulidae Lago di Villa, Stagno di Holay Orthetrum albistylum Libellulidae Les Iles Orthetrum cancellatum Libellulidae Les Iles Orthetrum coerulescens Libellulidae Lago di Villa Platycnemis pennipes Platycnemididae Lago di Villa, Les Iles Somatochlora alpestris Cordulidae Riserva Mont Mars (Lac le long), Comba Thuilette Somatochlora arctica Cordulidae Talweg Val Ferret Sympetrum danae Libellulidae Sympetrum depressiusculum Libellulidae Les Iles, Quart (stagno vicino a casello autostradale) Sympetrum flaveolum Libellulidae Lago di Loz, Champlong (Verrayes) Sympetrum sanguineum Libellulidae Lago di Loz, Riserva naturale del Marais, Teppe Sympetrum striolatum Libellulidae Lago di Villa Meyes, Talweg Val Ferret, Riserva naturale del Marais, Champlong (Verrayes) WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ODONATI IL DNA BARCODING riconosce direttamente su BOLD Systems 21/26 specie, 4 su 26 sono in corso di valutazione ESUVIE NEGATIVE AL SEQUENZIAMENTO: DNA rilasciato dalla libellula durante lo sfarfallamento è insufficiente per essere rilevato al sequenziamento Platycnemis pennipes dà aspecifici all’amplificazione del BARCODE: mutazioni nel sito di appaiamento dei primer BARCODE COI (Folmer et al. 1994) WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS IL BIANCONE (CIRCAETUS GALLICUS) VULNERABILE (VU) – Lista Rossa IUCN N° individui maturi < a 1000 (Brichetti & Fracasso 2003, Petretti 2008) minacciato da uccisioni illegali, declino delle popolazioni di rettili di cui si ciba e dalla sottrazione degli ambienti utili alla caccia 3 sangue intero 1 resti di borra 119 penne 130 campioni 6 Sterco 1 frammento d’uovo WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS IL BIANCONE ANNO (CIRCAETUS GALLICUS) N° e TIPOLOGIA CAMPIONE SITI DI PROVENIENZA Issogne Nord, Jovencan, Morgex, 2014 49 penne, 1 frammento d’uovo, 4 sterco, 1 resti di borra Fénis, Pontey, Chambave, Saint Vincent Issogne, Jovencan, Arvier, Pollein, 2013 54 penne + 2 sterco Saint-Vincent, Donnas 2012 1 penna Issogne 2007 1 penna Issogne 2006 8 penne Issogne 2005 6 penne Issogne WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS IL BIANCONE PRELIEVO SANGUE INTERO (CIRCAETUS GALLICUS) SANGUE INTERO DNA BIANCONE © Archivio fotografico MRSN- Foto Botti Velca Analisi Next Generation Sequencing - individuazione nel biancone di loci microsatelliti - sviluppo di un protocollo per l’identificazione individuale CRAS Oasi Sant’Alessio (PV) Gel di agarosio 1%, marker GeneRuler 1Kb, corsa 1 h, 120V) WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ORTOTTERI poco studiati dal punto di vista genetico e poco «barcodati» problemi di classificazione: molteplici caratteristiche numerose sottodistinzioni morfologiche es. genere Glyptobothrus ha come unici caratteri diagnostici il lobo e le carene del pronoto (angolose) pertanto una determinazione genetica può risultare fondamentale. 113 CAMPIONI 38 SPECIE ADULTI (73 segnalate) © Archivio fotografico MRSN- Foto Baroni Daniele 52% BIODIVERSITA’ VALDOSTANA WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GLI ORTOTTERI © Archivio fotografico MRSN- Foto Baroni Daniele © Archivio fotografico MRSN- Foto Baroni Daniele WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS I LEPIDOTTERI Collezione museale con specie non diagnosticate o dubbie 52 CAMPIONI © Archivio fotografico MRSN 2 ADULTI ZAMPE COLLEZIONE MUSEO 2013 © Archivio fotografico MRSN WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS I LEPIDOTTERI Esemplari dalla difficoltosa diagnosi morfologica FAMIGLIA Hesperiidae Hesperiidae Hesperiidae Lycaenidae Nymphalidae Nymphalidae Pieridae Pieridae Pieridae GENERE INDICAZIONI PER IL DNA BARCODING da confermare esemplari diagnosticati come Carcharodus Carcharodus alceaee e altri a cui non è stata attribuita la specie Pyrgus da confermare esemplari a cui non è stata attribuita la specie Thymelicus da confermare esemplari a cui non è stata attribuita la specie da confermare esemplari diagnosticati come Polyommatus Polyommatus bellargus, come Polyommatus daphnis, Polyommatus icarus e altri a cui non è stata attribuita la specie da confermare esemplari diagnosticati come Coenonympha Coenonympha arcania Hipparchia da confermare Hipparchia fagi da confermare esemplari diagnosticati come Colias alfacariensis Colias e come Colias hyales Leptidea da confermare Leptidea sinapsis o reali da confermare esemplari diagnosticati come Pieris (Pontia) Pieris edusa, Pieris manni, Pieris rapae, Pyeris alphacariensis, Pyeris bryoniae, Pyeris napi WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS VERTEBRATI DI INTERESSE REGIONALE Durante l’autunno 2014 la struttura FLORA, FAUNA, CACCIA E PESCA del DIPARTIMENTO RISORSE NATURALI E CORPO FORESTALE (Assessorato Agricoltura e Risorse Naturali) fornirà porzioni carnee per la validazione del DNA barcoding sulle seguenti specie: Capra ibex Cervus elaphus Rupicapra rupicapra Lepus timidus WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GRAZIE PER L’ATTENZIONE! WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
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