CREAZIONE DELLA BANCA DEL GERMOPLASMA DELLA VALLE D‘AOSTA, CON IL SUPPORTO DELLA CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI SPECIE VEGETALI DI INTERESSE REGIONALE RICERCATORE TEAM LEADER: FABIO GUGLIELMO WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS INTRODUZIONE: DEFINIZIONE E FINALITÀ BANCA DEL GERMOPLASMA Struttura per la conservazione ex situ a lungo termine di specie vegetali Crioconservazione di materiale in grado di dare origine a nuovi individui Reintroduzione e recupero di habitat Ricerca biologia – ecologia specie Risposta attiva a perdita di biodiversità WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS INTRODUZIONE LEGISLAZIONE CONSERVAZIONE SPECIE – PANORAMA NAZIONALE ED INTERNAZIONALE Piano Nazionale sulla Biodiversità (DM 97/568) A livello mondiale: • 1700 Banche del germoplasma • Millenium Seed Bank dei Kew Gardens di Londra • Numerose reti internazionali (ENSCONET) A livello italiano: • 20 banche (fino al 2014 non presente in VDA) • Rete nazionale (RIBES) WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS INTRODUZIONE FASI OPERATIVE BANCA DEL GERMOPLASMA Pianificazione e Raccolta Preparazione Conservazione Verifica • Sopralluogo stazioni prelievo e raccolta dati • Selezione popolazioni da campionare • Campionamento semi maturi (<20% semi disponibili) • Pulizia e controllo maturità semi • Test germinabilità iniziale • Deidratazione (15-20% UR – 15-20°C) • Impacchettamento • Crioconservazione (-20°C): collezione di base e collezione attiva • Verifica germinabilità iniziale • Verifica vitalità lotti • Rigenerazione e duplicazione WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS INTRODUZIONE PIANIFICAZIONE E RACCOLTA: PUNTI CRITICI Individuazione e identificazione specie su base morfologica Piante ad uno stadio giovanile DNA barcoding Plasticità fenotipica Specie criptiche Strategia di campionamento Biologia specie Più popolazionipiù individui Campioni non rappresentativi delle risorse genetiche disponibili DNA genotyping Accessioni ridondanti WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS INTRODUZIONE DNA BARCODING Hebert et al. 2003: strumento di identificazione specifica Analisi di una corta porzione di DNA con bassa variabilità intraspecifica ed alta variabilità interspecifica Etichetta per l’identificazione Strumento rapido, accurato ed automatizzabile Universale Qualità della sequenza Potere di discriminazione Animali: marker mitocondriale CO1 Piante: combinazione di due marker plastidiali (CBOL 2009) + altri marker supplementari WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS INTRODUZIONE DNA GENOTYPING Strumento di identificazione sub-specifica Analisi di porzioni ipervariabili Loci microsatellite o SSR (Simple Sequence Repeats): • motivi ripetuti in tandem (1-6 nucleotidi); • porzioni fiancheggianti relativamente conservate Analisi della lunghezza dei loci (o N. repeats) = Locus (act): A: 20 repeats ≠ B: 22 repeats Tecnologia Next Generation Sequencing: individuazione loci STR più semplice e meno costosa WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS OBIETTIVI Valutare l’efficienza di differenti DNA barcode per l’identificazione di specie vegetali spontanee da conservare ex situ Valutare la diversità genetica intra e inter popolazioni di alcune delle specie vegetali da conservare ex situ tramite marker SSR Prove preliminari per l’allestimento della banca del germoplasma vegetale della Valle d’Aosta WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI SELEZIONE DELLE SPECIE VEGETALI Criterio di rarità e vulnerabilità LR 45 del 07/12/2009 (All. A) Lista Rossa e Nera della flora vascolare della Valle d’Aosta (Poggio et al. 2010) Libro Rosso delle Piante d’Italia (Conti et al. 1992) Direttiva 92/43/CEE «Habitat» Convenzione di Berna (1979) Convenzione di Washington (1973) 23 specie DNA Barcoding e prove di conservazione ex situ WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI SELEZIONE DELLE SPECIE VEGETALI 5 specie DNA Genotyping WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI INDIVIDUAZIONE STAZIONI DI PRELIEVO E CAMPIONAMENTI Dati bibliografici, Database FLORA Coordinate UTM di ciascuna stazione 47 stazioni 18 comuni Procedura operativa standard Campionatori: Laura Poggio Claretta Christille Isabella Vanacore Falco Nicola Gérard Pierluigi Guglielmo WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI INDIVIDUAZIONE STAZIONI DI PRELIEVO E CAMPIONAMENTI Almeno 3 individui a stazione WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI ESTRAZIONE DEL DNA WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI PROVE DNA BARCODING: MARKER SAGGIATI 1. rbcL (600 bp): RUBISCO Marker plastidiali Facilmente amplificabile e sequenziabile Qualità sequenze elevata Basso potere discriminatorio 2. matK (900 bp): Maturasi K Elevato potere discriminatorio Qualità sequenze elevata Non sempre amplificabile 3. trnH-psbA (300 - 1100 bp): Spaziatore intergenico Elevato potere discriminatorio Qualità sequenze bassa Difficile allineamento 4. ITS (500 - 900 bp): Spaziatori interni trascritti Marker nucleare Elevato potere discriminatorio Possibilità copie paraloghe Possibilità contaminazione fungina WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI PROVE DNA BARCODING: FASI OPERATIVE Polymerase Chain Reaction (PCR) Elettroforesi su gel di agarosio Purificazione prodotti PCR Cycle sequencing Purificazione prodotti Elettroforesi a capillari Editing sequenze WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI PROVE DNA BARCODING: VALUTAZIONE EFFICIENZA Prodotti PCR su gel dopo elettroforesi Qualità amplificazione PCR Barcode universale? Elettroferogramma forward e reverse Qualità della sequenza Barcode accurato? Efficienza di discriminazione Barcode specifico? WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI PROVE DNA GENOTYPING: MARCATORI STR TRAMITE NGS 200 Mbp di sequenze a specie Ricerca 30 loci STR e disegno primer Selezione 10-15 loci STR polimorfici WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI PROVE DNA GENOTYPING – STRATEGIA DI CAMPIONAMENTO A B C 4 4 Analisi loci SSR A B 4 4 A B 4 4 A B 4 4 C Pochi individui in tutte le popolazioni C Tanti individui da una popolazione C Tanti individui da tutte le popolazioni WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS MATERIALI E METODI PROVE DI CONSERVAZIONE EX SITU Prove preliminari di conservazione ex situ Allestimento banca Campionamenti (<20% semi disponibili) Pulizia semi (setacci, pennelli, stereomicroscopio) Prove deidratazione (3,5%-6,5% UR) Impacchettamento e crioconservazione Prove di germinazione iniziale WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS RISULTATI CAMPIONAMENTI Specie vegetale Aethionema thomasianum Anemone narcissiflora Astragalus alopecurus Carex atrofusca Carex otrubae Cladium mariscus Coincya richeri Cypripedium calceolus Dactylorhiza cruenta Epipactis palustris Fritillaria orientalis Gladiolus palustris Iris sibirica Matteuccia struthiopteris Potentilla multifida Potentilla palustris Potentilla pensylvanica Salvia aethiopis Schoenus ferrugineus Trifolium saxatile Typha minima Utricularia australis Veronica allionii Alyssum montanum Astragalus onobrychis Astragalus sp. Epipactis atrorubens Tulipa australis Utricularia minor Totale Campioni raccolti 26 5 15 3 0 3 6 16 6 56 0 0 0 0 3 4 25 5 6 3 3 9 3 6 7 3 2 2 1 218 Stazioni indagate 3 1 4 1 0 1 2 3 2 6 2 2 2 0 2 1 3 1 2 1 1 3 1 2 1 1 1 1 1 51 Specie non più ritrovate… estinte in VDA? Banca del germoplasma Specie ritrovate!!! WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS RISULTATI PROVE DNA BARCODING Estrazione DNA: PCR: 155 campioni 155 (rbcL e matK) 21 specie 79 (trnH-psbA e ITS) Sequenziamento: 456 sequenze Qualità amplificazione PCR S. aethiopis: problemi di estrazione 160 155 153 155 154 rbcL-matK~ 99% 140 U. australis C. atrofusca 120 100 79 80 71 C. mariscus S. ferrugineus 79 trnH-ITS~ 90-91% 72 40 Campioni sottoposti a PCR 20 Esito positivo 60 0 rbcL matK trnH-psbA ITS WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS RISULTATI PROVE DNA BARCODING Qualità sequenze 60 53 53 54 54 49 37 40 rbcL-matK~ 100% 47 45 50 30 20 Campioni sottoposti a PCR ITS~ 96% Sequenza ok trnH-ITS~ 76% 10 0 rbcL matK trnH-psbA ITS trnH-psbA: problema mononucleotide repeats WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS RISULTATI PROVE DNA BARCODING Efficienza discriminazione Dati preliminari matK E. atrorubens E. palustris rbcL E. atrorubens E. palustris NO variabilità! WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS RISULTATI PROVE DNA GENOTYPING E PROVE DI CONSERVAZIONE EX SITU Allestimento librerie genomiche Allestimento Banca del germoplasma e campionamenti WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS PROSPETTIVE RICERCHE COMPLEMENTARI E/O PARALLELE Specie selezionate DNA Barcoding campioni erbario MRSN Briofite (specie protette) Progetto tirocinio: Prove di DNA barcoding e di conservazione ex siti di Leontopodium alpinum WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS GRAZIE PER L’ATTENZIONE WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
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