水のはなし • 水道水：品質は様々培養の基礎水道水中の４種の不純物無機物：無機塩、溶存ガス、重金属など（特に、カルシウム、マグネシウム）有機物：環境ホルモン、メタン、洗剤生理活性物質や天然物など微粒子：鉄さび、コロイドなど微生物：細菌類、藻類、バクテリアなど ※何らからの手法を用いて除去する必要あり 1 水の種類 2 水の種類 • 純水：精製されているが、純度は様々。イオン交換水(Deionized water)：イオン交換樹脂を通す。安価で簡便。不純物除去に限界がある。 ○イオンの除去に優れている樹脂の再生が可能（最近はカートリッジ交換） ×樹脂の劣化により水質が低下樹脂表面で微生物が繁殖樹脂の再生が手間再生時に酸・アルカリ廃液を生じる。 • 純水：精製されているが、純度は様々。蒸留水(Distilled water, DW)：蒸留器で蒸留する。 ○水中の不純物を全般に除去できる。 ×精製速度が遅い蒸留環境からの汚染による水質劣化の可能性精製に多量の熱エネルギーと冷却水が必要 3 カブ型フラスコによる（再）蒸留水の作成法 4 水の種類 • 純水：精製されているが、純度は様々。逆浸透水(Reverse osmotic water, RO water)：逆浸透膜をとおすことで不純物を除去する。冷却水蒸留水カブ型フラスコ加熱 5 ○4種の不純物をほぼ除去できる。メンテナンスをほとんど必要としない省エネルギーで運用できる。 ×精製された水の水質が、原水の水質の影響を受ける 6 1 超純水製造装置水の種類 • 超純水(Ultrapure water)：純水をさらに精製したもの再蒸留水(Double distilled water, DDW)：蒸留水を再度蒸留したもの。精製されているが、作成に時間を要す。1980年代までは、培養用として主流。ミリQ水(Milli Q water)：純水を半透膜などを通して、さらに精製したもの。省エネで運用できるため、現在の主流。ミリポア社が開発した採水装置が普及したため、この名で呼ばれている。 7 培地の分類 Advantec社アクエリアスミリポア社MilliQ装置培地の分類 • 固体培地（固形培地） Solid Medium 寒天培地など。微生物用が主。 • 液体培地 Liquid Medium 種々の成分を超純水に溶かした培地。 • 粉末培地 Powder Medium 液体培地を凍結乾燥したもの。超純水に溶かして液体培地として使用する。 • Simple medium 単純（組成）培地無機塩と必要最小限のエネルギー源抗生物質のみを含む培地 • Complex medium 複合培地 Simple Mediumにアミノ酸、ビタミンなど多様な成分を添加した培地 9 • 単純培地の組成（例TYH) 10 培地の分類 NaCl, KCl, KH2PO4, CaCl2, MgSO4, NaHCO３グルコース, ピルビン酸Na, BSA, • Chemically defined medium 完全合成培地精製された化学成分のみから成る培地。組成が明確なので再現性が得やすい。 • Semi-defined medium 半合成培地完全合成培地に血清などを補ったもの。 • Natural medium 天然培地組織抽出液、血清など生体成分を主とする古典的な培地。詳細な成分は不明。ペニシリン, ストレプトマイシン • 複合培地の組成（例TCM199) NaCl, KCl, KH2PO4, CaCl2, MgSO4, NaHCO3 Fe(NO3)3, NaH2PO4, コレステロール, ATP, HEPES, デオキシリボース, グルコース, グルタチオン, グアニン, ヒポキサンチン, 酢酸Na, その他微量元素, ビタミン各種, アミノ酸,抗生物質 8 11 12 2 培地の分類培地開発の考え方 • Serum-supplemented medium 血清添加培地血清成分が添加された合成培地 • Serum-free medium 無血清培地血清成分を含まない合成培地。アルブミンなど完全に精製が困難な物質を含む場合もあり、完全合成培地ではないこともある。１．等張液から始めて、成分の構成、濃度を変化させ、培養成績の最もよいものを検索していく。 → 複数成分による複合効果の検討 SOM (Simplex Optimized Medium) KSOM (Potassium SOM) ２．卵子や胚が存在する場所の生体液（卵胞液、卵管液、子宮液など）の成分を解析し、模倣する。 → 微量成分までの解析情報はない 13 培地の構成 HTF (Human Tubal Fluid) SOF (Synthetic Oviductal Fluid) 14 培地の構成 • 無機塩－等張液 • エネルギー源ピルビン酸卵子形成期から１細胞期までは、必須の要素。その後も、取り込みは低下しない。乳酸２細胞期以降の胚で利用可能グルコース８細胞以降の胚で利用可能。ピルビン酸に対しての取り込み量は、増加する。胚の発育ステージでエネルギー要求が異なるので、異なる培地組成を検討する。 15 浸透圧 • 保護物質高分子の成分が利用される。ウシ血清アルブミン（BSA) ポリビニルピロリドン（PVP) ポリビニルアルコール（PVA) など • 抗生物質ペニシリンGカリウム硫酸ストレプトマイシン 16 浸透圧の計算法 • オスモル (Osmole) 一定量の溶液の中で自由に動く粒子のモル数。 • 容量オスモル濃度１リットルの溶液中の溶質のオスモル数 Osm オスモル mOsm ミリオスモル生体液の浸透圧は、280～300mOsm 1. 電解質の場合個々の物質の濃度に解離したイオン数をかけたもの。 2. 非電解質の場合個々の物質の濃度に１をかけたもの。 3. 上記をすべて合計する。 17 （例）NaCl 150mM、CaCl2 3mM、Glc 5mMの溶液浸透圧＝150×2＋3×3＋5×1＝314 mOsm 18 3 培養環境 • 温度原則的に、動物の体温に近い温度に設定実験動物 37℃ 家畜 39℃ • 気相 5％CO2含有空気が最もよく用いられる。生体内の酸素分圧（約8％）に合わせて、5％CO2、 5％O2、90％N2の混合ガスも使用される体外胚生産技術（In vitro production, IVP) 19 体外受精とは用語（卵子、初期胚から見た過程） • 体外発育（In vitro growth, IVG）小さな卵母細胞をフルサイズまで成長 • 体外成熟（In vitro maturation, IVM）卵母細胞を第二減数分裂中期まで成熟 • 体外受精（In vitro fertilization, IVF）受精能獲得した精子で受精させる • 体外培養（In vitro culture, IVC）受精卵を移植可能なステージまで培養する ※すべてをまとめて → IVGMFC 20 • 卵子と精子を体外の培養下で受精させる技術。 • 受精卵は、子宮に移植して産子を得ることができる。 • マウス、ヒトを始め、多くの哺乳動物で体外受精が可能となっている。 • 希少動物保護にも応用可能 21 22 体外受精の意義 ①経済価値の高い動物の有効利用経腟採卵（OPU）法による反復採卵 ②屠体卵巣の有効利用と低コストな胚生産 ③生殖補助医療への応用 ④研究手段ｰ核移植・遺伝子導入等 ⑤希少動物保護・遺伝子資源保存エドワーズ博士 23 24 4 体外受精の問題点 ① 移植胚の死滅 ② 過大子（ウシ・ヒツジ） ③ 倫理的側面生命の人為的支配生殖医療における余剰胚の扱いなど実体顕微鏡（透過照明装置付）26 倒立顕微鏡 25 培養ディッシュ卵子操作用マイクロピペット（株）東海ヒットホットプレート 28 微小滴培養法（Microdrop culture)の準備炭酸ガス培養装置（「マウス胚の操作マニュアル（第3版）」Ｎａｇｙ他近代出版 2005) 29 作成したシャーレは、炭酸ガス培養装置内で平衡させる 30 5 体外胚生産（IVP)の過程体外発育第一次卵母細胞（原始卵胞）体外発育（IVG) 精巣上体精子射出精子卵胞内卵子（未成熟）体外成熟（IVM) 排卵卵子 • 原始卵胞内にある発育開始前の卵母細胞や、第一次卵胞以降の発育途上の卵母細胞を、体外培養下で発育させることを、体外発育（IVG)と呼ぶ。 • 一部の動物種では発育途上の卵母細胞の体外発育に成功しているが、原始卵胞の培養は、まだ研究段階である。前培養成熟卵子受精能獲得精子体外受精（IVF) 受精卵移植（ET) 産子体外培養（IVC) 移植可能な初期胚 31 体外発育法 32 体外発育法 ① 器官培養法器官培養用ディッシュ、培養用インサートを利用。卵巣を丸ごと培養する。 ② 卵母細胞－顆粒膜細胞複合体培養法 ③ 卵胞の組織培養法 ④ ゲル包埋培養法コラーゲンゲルやアルギン酸ゲルに包埋 ⑤ 開放型培養法コラーゲンコートした培養プレート器官培養用ディッシュ 33 34 35 36 6 培地 • 基礎培地は、組織培養用の複合培地 TCM199、Waymouth など • 血清添加 • 種々の添加剤 PVP、エストラジオール-17β など開放型培養 37 包埋培養 38 Hirao (2012) J Reprod Dev 58:167 成熟培養卵子の準備 • 卵管卵子(排卵卵子）の採取 • 卵胞卵子の採取と体外成熟精子の準備 • 精巣上体精子または射出精子の採取と受精能獲得処理 ①雌性生殖道内 ②血清含有培地 ③完全合成培地 • 体外成熟卵の問題点活性化を起こしやすい活性化した卵が断片化(Fragmentation)を起こしやすい前核形成能が低い受精後の発生が悪い細胞質成熟が不十分？！ 39 成熟培養 40 成熟培養 • 核の成熟未成熟卵母細胞（第1減数分裂前期） → 成熟卵子（第2減数分裂中期） • 細胞質の成熟還元型グルタチオン（GSH)量の増加卵成熟促進因子( Maturation Promoting Factor : MPF)活性の増大 • 細胞質の成熟のための添加物エネルギー源（グルコースなど）アミノ酸（システインなど）性腺刺激ホルモン（FSH,LH）血清蛋白質（BSA）・卵胞液など還元型グルタチオン（GSH) 成長因子（EGFなど） 41 42 7 成熟培養 • 卵丘細胞の膨化卵子－卵丘細胞間のギャップ結合閉鎖卵核胞期減数分裂再開抑制因子（cAMPなど）の移動が途絶減数分裂の再開卵母細胞の成熟第二減数分裂中期 43 44 過剰排卵処置実験動物では、過剰排卵処置により、多数の卵子を排卵させて、卵管膨大部から採取する。マウスの例： PMSG 5～7.5単位を腹腔内投与 40～48時間 hCG 5～7.5単位を腹腔内投与 14～17時間 12時間後に排卵開始屠殺して、卵管膨大部から採卵する。 IVM過程で見られるブタ卵丘ー卵子複合体の膨化 45 体外受精用培地 • • • • BO液 KRB KRP TYH Brakett and Oliphant Krebs-Ringer Bicarbonate Solution Krebs-Ringer Phosphate Solution Toyoda, Yokoyama and Hoshi (KRBの一種）教科書表3.1 • TCM199 Tissue Culture Medium 199 • SOF Synthetic Ovuductal Fluid その他多数 47 46 TYHの組成 mg／l NaCl 6976 KCl ２～３ヶ月 356 162 KH2 PO4 １週間 251 CaCl2 ・2H2 O １日 MgSO4 ・7H2 O 293 2106 NaHCO3 グルコース 1000 ピルビン酸Na 110 BSA 4000 ペニシリンGカリウム 75 硫酸ストレプトマイシン 50 浸透圧 mM 119.37 4.78 1.19 1.71 1.19 25.07 5.56 1 314.89 48 8 精巣上体精子の採取精巣上体尾部の外側の管が太くなっている部分を切開し、内部の精子液を押し出して採取する。精子液は、シャーレの培養液に導入し、培養装置で前培養を行う。 49 マウス排卵卵子の採取必要に応じて、精子濃度を検査する。切開部位 50 「マウス胚の操作マニュアル(第三版）近代出版（2005）精子の前培養 • 受精能獲得を誘起するための培養受精能獲得が完了したかどうかの判定が難しい。超活性化運動の出現人工膣による射出精子の採取 ※ウシの体外受精では、凍結保存した精子を用いることが多い。 51 誘起物質としてイオノフォアやカフェインを添加することもある。 52 雌性前核雄性前核 53 前核期のマウス受精卵 54 9 媒精後6時間媒精4日目 55 媒精翌日媒精3日目媒精5日目割球の分裂は、初回のみ24時間かかるが、その後は、およそ12時間ごとに起こる 56 発生培養用培地の開発胚発生の停止ゲノム活性化時期に、体外胚発生が停止する現象 • マウス・ラット・ハムスター２細胞期 • ブタ４細胞期 • ウシ８～１６細胞期これらの停止を回避するため、実験動物ではEDTAなどのキレート剤を添加する。また、ウシでは体細胞との共培養を行う。 • 発生停止をもたらす因子ハムスターリン酸・グルコースラットリン酸 57 ウシグルコース発生培養用培地の開発（1）1970年代～1980年代組織培養用培地エネルギー源と蛋白源を添加体外での発育遅延・発生停止代謝抑制・生存性低下最適条件ではなかった 58 発生培養用培地の開発（2）1980年代末～1990年代初組織培養用培地（複合培地）体細胞との共培養（3）1990年代～現在完全合成培地や半合成培地への移行培養環境に含まれる未知成分の除去と本当に必要とされる成分の特定を行うため形態的に良好・卵割率上昇胚盤胞形成率と妊娠率上昇本当に最適条件？ 59 60 10 共培養系共培養系（2）Feeder細胞の機能 ①胚刺激因子 (Embryotrophic factor) の放出 ②阻害因子・毒性因子の除去 ③イオン・グルコース濃度を下げる ④発生停止の解除 ← 成長因子の放出 ⑤活性酸素の毒性除去（1）代表的な共培養細胞（Feeder細胞）初代培養細胞：卵管上皮細胞、卵丘細胞、顆粒層細胞、子宮上皮細胞など株化細胞： BRL(Buffalo Rat Liver) cellなど Vero cell 61 共培養系 62 無血清培地へ（3）Feeder細胞用培地 TCM199、MenezoB2、Ham’s F10 など＋蛋白源（血清、BSAなど）＋エネルギー源（グルコース、ピルビン酸、乳酸）（4）条件付け培地（馴化培地） Feeder細胞を一定期間培養した培地（1）血清の悪影響 ①コンパクション阻害 ②胚の死細胞数増加 ③内細胞塊の核凝縮増加 ④過大子、妊娠期間延長、難産、新生子死増加 ⑤ウィルス、マイコプラズマ汚染の危険性 ⑥再現性の問題 63 無血清培地へ 64 無血清培地へ（2）半合成培地基礎培地：SOF、CR1aa、CR2、CZB HECM、KSOM、G1 などさまざまな単純培地が基礎培地として用いられる。半合成培地の添加物必須・非必須アミノ酸－重要因子成長因子－発生補助グルタチオン・SOD・タウリンー活性酸素除去システアミン・βメルカプトエタノール－胚発生増強、細胞内グルタチオン増加 EDTA －活性酸素抑制、金属イオン除去コエンザイムQ10 －抗酸化剤 65 66 11 Sequential culture media 無血清培地へ（3）完全合成培地の利点 ①体外胚生産 (IVP) システムの標準化を可能にする ②研究室（ラボ）間でのばらつきが少なくなる ③病原体の侵入を防止できる ④胚発生に必要な物質を正確に知ることができる胚の栄養要求性の違い（ピルビン酸利用→グルコース利用）グルコースは初期の胚発生に悪影響初期胚培養の前半と後半で成分の異なる培養液を用いる2液性の培地のこと。ヒト、マウスで利用。 67 68 表１．初期胚発生のための培地組成（単位:mM)* 成分 KSOM CZB WM HTF G1 G2 SOF TYH NaCl 95.00 82.00 88.00 101.60 85.16 85.16 107.70 119.37 KCl 2.50 4.86 4.78 4.69 5.50 5.50 7.16 4.78 CaCl2 1.71 1.71 2.04 1.80 1.80 1.71 1.71 乳酸Ca 1.71 MgSO4 0.20 1.18 1.19 0.20 1.00 1.00 1.19 MgCl2 - － 0.49 NaH2PO4 0.50 0.50 KH2PO4 0.35 1.17 1.19 0.37 1.19 1.19 乳酸Na 10.00 30.10 21.60 21.40 10.50 5.87 3.30 ピルビン酸Na 0.20 0.26 0.25 0.33 0.32 0.10 0.33 1.00 グルコース 0.20 5.56 2.78 0.50 3.15 1.50 5.56 グルタミン 1.00 1.00 1.00 1.00 タウリン 0.10 － NaHCO3 25.00 25.00 22.60 25.00 25.00 25.00 25.00 25.07 EDTA 0.01 0.10 0.01 －血清アルブミン 1mg/ml 5mg/ml 3mg/ml # 2mg/ml 2mg/ml 32mg/ml 4mg/ml アミノ酸 ## ## ## 文献番号 1 2 3 4 5 5 6 7 *抗生物質およびフェノールレッドを除く # 血清を５％加える、## 表２参照 References: 1) Lawitts JA & Biggers JD, 1993; 2) Chatot CL et al, 1989; 3) Whitten WK, 1971; 4) Quinn P, 1985; 5) Gardner DK & Lane M, 1997; 6) Tervit HR et al, 1972; 69 7) Toyoda Y, Yokoyama M & Hoshi T, 1971 胚移植胚移植（ET ： EMBRYO TRANSFER） 70 胚移植 • 体外受精や顕微授精（後述）で作出された受精卵は、2細胞期程度の発生初期の場合は、個体の卵管へ、桑実胚や胚盤胞まで体外発生させた胚の場合は、子宮へ移植する。家畜では、子宮内移植を行うことが多い。ただし、開腹手術による移植の場合は、発生初期の胚を卵管に移植することもある。 71 • 移植に際しては、胚の発育ステージとレシピエント（受卵）個体の発情周期を同期化させる。許容範囲は、前後1日程度と考えられており、大きくずれると受胎率が低下する。体外における胚発生の考え方 ① 体外環境に長く置くことは好ましくない。早期に卵管に戻すべきである。 ② 胚の発生能力を見極めるために、胚盤胞まで発生した胚だけを移植することで、受胎率が向上する。 72 12