新発売！ TM PrimeFlow RNA Assay フローサイトメトリー　mRNA 検出試薬製品概要 eBioscience/Affymetrix 社の「PrimeFlow RNA Assay」は、全く新しい in situ Hybridization 法で、独自のプローブ設計と branched DNA 法によるシグナル増幅により、数百万のシングルセルにおける RNA とタンパク質の検出が可能です。PrimeFlow RNA Assay は、フローサイトメトリーに対応した高感度 in situ Hybridization 試薬で、3 種類の蛍光色素により最大 3 遺伝子を同時に検出します。キットは、専用の 1.5 mL チューブを使用して浮遊細胞（1 サンプルあたり 1-5 x 10^6 個）の染色に使用しやすいパッケージです。 Target Probe と bDNA の構造プローブタイプと蛍光チャネルの選択検出遺伝子の発現量 Low Medium to High Medium to High Probe Type/ 蛍光ラベル FlowCytometer レーザー蛍光チャネル Type 1 / Alexa Fluor 647 Type 4 / Alexa Fluor 488 Type 6 / Alexa Fluor 750 633 488 633 APC, AF647,eFluor 660 FITC,AF488 APC-Cy7,AF750,APC-eFluor 780 特長 • 感染細胞におけるウイルス RNA の検出 • シングルセルレベルで遺伝子の異種性 • 細胞サブセットにおけるノンコーディング RNA の検出 (heterogeneity) の観察 • 抗体が利用できない場合、mRNA の発現レベルを解析 • 同じ細胞で RNA とタンパク質の両方の変動比較データ例 Granzyme B RNA vs CD8 Protein vs CD8 Protein vs RNA RNA vs CD8 Protein vs CD8 Protein vs RNA Ki-67 mRNA Alexa Fluor 488 ® 488 CD8 PE-eFluor ® 610 GrzB Pr otein PE-Cyanine7 GrzB Pr otein PE-Cyanine7 750 ® GrzB mRNA Alexa Fluor CD8 PE-eFluor ® 610 CD8 PE-eFluor ® 610 ® Ki-67 Pr otein eFluor® 450 Ki-67 mRNA Alexa Fluor ® Ki-67 Pr otein eFluor® 450 488 Unstimulated: CD8 PE-eFluor ® 610 GrzB mRNA Alexa Fluor ® 750 ® 750 CD8 PE-eFluor ® 610 Ki-67 mRNA Alexa Fluor GrzB Pr otein PE-Cyanine7 GrzB Pr otein PE-Cyanine7 750 ® GrzB mRNA Alexa Fluor CD8 PE-eFluor ® 610 Ki-67 Pr otein eFluor® 450 Ki-67 mRNA Alexa Fluor ® Ki-67 Pr otein eFluor® 450 488 2-day Anti-CD3/CD28 stimulated: CD8 PE-eFluor ® 610 CD8 PE-eFluor ® 610 GrzB mRNA Alexa Fluor PrimeFlow RNA Assay C57Bl/6 マウスの脾臓細胞を未刺激 ( 上段 ) または刺激 (2 日間、 Anti-Mouse CD3 及び CD28 Functional Grade Purified antibodies (cat. no. 16-0031 及び cat. no. 16-0281)) ( 下段）し、 Protein Transport Inhibitor Cocktail (cat. no. 00-4980) 存在下で 3 時間培養後、 PrimeFlow RNA Assay (cat. no. 88-18001) を使用し、解析まで行いました。PrimeFlow RNA Assay キットのバッファーを使用し、細胞の固定・膜透過処理を行った後、Anti-Mouse CD8a PE-eFluorR 610 (cat. no. 61-0081)、Anti-Mouse Ki-67 eFluorR 450 (cat. no. 48-5698)、AntiMouse Granzyme B PE-Cyanine7 (cat. no. 25-8898) で細胞内染色しました。その後、Type 6 Mouse Granzyme B Alexa FluorR 750 (cat. no. VB6-16522)、Type 4 Mouse Ki-67 Alexa FluorR488 (cat. no. VB4-16518)、Type 1 Mouse β -actin Alexa FluorR 647 (cat. no. VB1-10350) プローブをハイブリしました。利用可能な抗体が制限される場合、mRNA 発現で解析ができますフローサイトメトリーは、複数の測定項目を数百万の細胞で観察でき、また 1 細胞あたり細胞表面及び細胞内タンパク質の両方を直接検出できるヘテロな細胞集団研究の為のゴールドスタンダードです。しかしながら、歴史的にフローサイトメトリーは、測定項目への抗体の有用性、適応性による制限がありました。ノンコーディング RNA、ウイルスの転写物、ユニークなモデル生物等のターゲットや抗体開発が困難なターゲットは、フローサイトメリーを利用できず、細胞サブセットに対する影響を解析する為に核酸・タンパク質等多くの別々の実験が必要でした。フローサイトメトリー用の抗体が存在しない場合でも PrimeFlow　RNA は特異的なターゲットの RNA を検出することにより、フローサイトメトリーでターゲットの遺伝子発現を検出することができます。 PrimeFlow RNA Assay の感度及び特異性 PrimeFlow RNA Assay の感度評価を、同社 Affymetrix/Panomics のマルチプレックスのアッセイ試薬 QuantiGene Plex Assay と行いました。Fugure1A に示されるように、すべての細胞タイプの中で U937 細胞中の GAPDH が、最も高い蛍光値を示し、QuantiGene Plex assay の結果と一致しました。同様に U937 細胞で HMBS が最も低い蛍光値を示し、QuantiGene Plex assay の結果と一致しました。S/N 比は、No Probe をコントロールとし算出しました (Fugure1B)。次に正常ヒトリンパ球及び単球において同じ遺伝子の発現を評価しました (Fugure1C)。U937 細胞は単球系細胞株ですが、プライマリーの単球と U937 細胞の間で顕著な違いがありました。 HMBS は、完全にヒトプライマリーの単球で検出できませんでしたが、GAPDH, B2M は単球で最も高い発現を示しました。ヒトプライマリーのリンパ球ではさらに GAPDH が低く、B2M は高レベルでした。これらのデータは、遺伝子発現が同じプライマリーセルタイプ由来の細胞株でさえ変化することから、興味のある細胞における遺伝子発現レベルの理解が重要であることを強く示しています。さらに、QuantiGene Plex のデータに基づくと U937 細胞での HMBS の mRNA 発現は 5-10 コピーであることが知られており、PrimeFlowRNA Assay は 5-10 コピー程度からの遺伝子発現を検出することができる十分に最適化されたシステムであることが示唆されます。 Figure 1B Figure 1AU937 PPIB GAPDH Count Count B2M B2M PPIB No Probe GAPDH HMBS No ProbeB2M HMBS PPIB B2M GAPDH PPIB GAPDH 140.00 140.00 Alexa Fluor ® 647 Alexa Fluor ® 647 Figure 1C Lymphocytes Monocytes Alexa Fluor ® 647 Alexa Fluor ® 647 Count Monocytes Count Count Count Lymphocytes 100.00 80.00 80.00 60.00 60.00 40.00 40.00 20.00 0 No Probe dapB No ProbeHMBS dapB B2M HMBS PPIB B2M GAPDH PPIB GAPDH Alexa Fluor ® 647 Alexa Fluor ® 647 100.00 20.00 122.4 120.00 120.00 Signal-to-noise ratio HMBS No probe HMBS Signal-to-noise ratio U937 No probe 1.00 No Probe 122.4 68.9 56.1 68.9 56.1 1.0 3.6 No Probe HMBS 3.6 HMBS B2M B2M PPIB PPIB GAPDH GAPDH QuantiGene Plex と PrimeFlow RNA の直行性のバリデーション U937 細胞 (Figure 1A, 1B) 又は、正常ヒト末梢血 (Figure 1C) を、 PrimeFlow RNA Assay のプロトコルに従い、各遺伝子について Type 1 Positive Control Alexa Fluor 647 のプローブを使用しハイブリしました。S/N 比はポジティブコントロール遺伝子の MFI と No Probe のコントロールの MFI の比から算出しました。高い特異性 bDNA テクノロジーは、オリゴヌクレオチドペアーを使用し高い特異性を実現します。2 つのターゲットオリゴヌクレオチド（左のオリゴヌクレオチド及び右のヌクレオチド）が隣り合ってターゲットの遺伝子に特異的に結合した時だけ、シグナルが検出されるデザインになっています。アッセイの特異性を証明する為、左のオリゴヌクレオチド単独及び右のオリゴヌクレオチド単独のヒト GAPDH のプローブを、ヒトの U937 細胞で左右のオリゴヌクレオチドプローブと比較しました。蛍光シグナルは、プローブ検出され、U937 細胞での GAPDH の高発現と一致しました。対照的に、左のオリゴヌクレオチド単独及び右のオリゴヌクレオチド単独の場合、No Probe コントロールと同様、シグナルは検出されませんでした。さらに、ネガティブコントロールプローブ（枯草菌由来のバクテリア遺伝子 DapB）では特異的なシグナルは検出されませんでした。 Figure 3 Figure 4 Label Probe Label Probe U937 800 Count Amplifier Amplifier Pre-amplifier Pre-Ampl ifi GAPDH Left + Right GAPDH Left Oligos Only GAPDH Right Oligos Only dapB No Probe 600 400 200 RNA RNA Left Olig o Left Oligo 0 10 0 RightOligo Olig o Right 10 1 10 2 10 3 10 4 Fluorescent signal Figure 5 1200 1200 PrimeFlow RNA Assay の特異性の証明 MFI MFI 1000 1000 800 800 左右のオリゴヌクレオチドペアー及びシグナル増幅試薬、Pre- 600 600 amplifier, Amplifier, Lable Probes を含むプローブセットデザ 400 400 インの図 (Figure 3)。U937 細胞における GAPDH RNA 発現の 200 200 フローサイトメトリーヒストグラムのデータ (Figure 4). Mean 00 No Probe Oligos Only GAPDH Left Oligos Only GAPDH Right GAPDH Left Oligos Only +Right Oligos Fluorescent Intensity (MFI) をベースにした異なるプローブセッ DapB トでの GAPDH シグナルの定量値 (Figure 5)。アッセイチャネルの感度 PrimeFlow RNA Assay は、3 つの異なる蛍光色素を使って、1 細胞中 3 つの異なるターゲットの RNA を検出することができますが、各蛍光色素の感度は異なります。3 つの RNA 検出チャネルの相対的な感度を理解する為に、 U937 細胞中の同じ遺伝子の発現レベルを 3 つのプローブ Type で評価しました。Human B2M probe sets：Type 1 (Alexa Fluor 647), Type 4 (Alexa Fluor 488), Type 6 (Alexa Fluor 750) がヒト U937 細胞中の B2M RNA ターゲットを検出するのに使用しました（Figure6）。No Probe コントロールと比較し S/N 比を算出し、Type 6 (Alexa Fluor Human B2M mRNA relative sensitivity (%) 750) プローブへの相対的な感度を評価しました。Figure6、7 で示されるように、Type 1 (Alexa Fluor 647) は最 600% 58.1 も高い感度を示しました。この為、発現レベルが低い又は発現レベルが分からない遺伝子を検出する際は、Type 1 500% 400% Type 6 (Alexa Fluor 750) のプローブは同程度の感度で、プローブを推奨しています。Type 4 (Alexa Fluor 488) 及び 300% 発現が中から高レベルの遺伝子の検出する際に、お薦めしています。マウス脾臓細胞における beta-actin の発現を 200% 評価したとき同様の感度が見られました。マルチカラーのフローサイトメーターでの結果は、測定機能、検出器の 13.4 10.7 100% 感度、装置の設定及びコンペンセーションに依存し、最善の結果を得るためには、それらを最適化する必要があります。 600% Type 1 AF647 Type 4 AF488 Type 6 AF750 AF=Alexa Fluor® Figure 7 58.1 500% Alexa Fluor® 647 Alexa Fluor® 488 Alexa Fluor® 750 300% 200% 13.4 100% Count Count 400% Count Human B2M mRNA relative sensitivity (%) Figure 6 0% 10.7 0% Type 1 AF647 Type 4 AF488 Type 6 AF750 ACTB mRNA AF=Alexa Fluor® アッセイチャンネルの感度評価各チャネルの感度を評価する為に、U937 Type のAlexa B2MFluor プローブをハイブリしました。各バー上の数値は S/N 比を示し、解析には総生 ® Alexa Fluor® 647 Alexa細胞に対して、各 Fluor® 488 750 Count Count 総生細胞を使用しました (Figure 7)。 ACTB mRNA Count 細胞を使用しました (Figure 6)。マウス脾臓細胞に対して、各 Type の beta-Actin (Actb) プローブをハイブリしました。アッセイは 3 回行い、解析には