pHEK293 Ultra Expression Vector I

製品コード
研究用
3390
3392
pHEK293 Ultra Expression Vector I
（製品コード 3390）
pHEK293 Ultra Expression Vector II
（製品コード 3392）
説明書
v201402Da
pHEK293 Ultra Expression Vector は、HEK293 系細胞で組換えタンパク質を一過性に高生産することが
できるプラスミドベクターです。本製品を使用することで、従来のサイトメガロウイルス由来プロモー
ターを用いた遺伝子発現と比較して、2 ～ 10 倍量の組換えタンパク質の生産が可能となります。
1 ベクタータイプの pHEK293 Ultra Expression Vector I は、HEK293 系細胞にトランスフェクションして、
簡便に目的遺伝子を高発現させます。
一方、2 ベクタータイプの pHEK293 Ultra Expression Vector II は、添付の pHEK293 Enhancer Vector と共
に HEK293 系細胞にコトランスフェクションして、目的遺伝子を高発現させます。そのため、pHEK293
Ultra Expression Vector II では、目的タンパク質にあわせてトランスフェクションする２種類のプラスミ
ド比率を最適化することで、より効率的な目的タンパク質の生産が可能になります。
注：本製品は HEK293 系細胞での高発現用ベクターです。ヒト以外の哺乳類細胞では本製品の効果が十
分に発揮できないことがあります。
I．製品説明
【 pHEK293 Ultra Expression Vector I 】
pHEK293 Ultra Expression Vector I には、サイトメガロウイルス由来プロモーター
（CMV IE promoter）
、Trans Activation Responsive region（TAR）をコードする配列、
マルチクローニングサイト（MCS）、Internal Ribosome Entry Site（IRES）、Trans
AcTivator（Tat）遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのポリ A シグナ
ル（HSV TK polyA）
が搭載されています（4 ページ図 4）。MCS に目的遺伝子を挿入し、
HEK293 系細胞にトランスフェクションすることで、目的タンパク質を一過性に高
発現することができます。
【 pHEK293 Ultra Expression Vector II 】
pHEK293 Ultra Expression Vector II には、サイトメガロウイルス由来プロモーター
（CMV IE promoter）
、TAR をコードする配列、マルチクローニングサイト（MCS）、
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのポリ A シグナル（HSV TK polyA）が搭載
されています（5 ページ図 5）。さらに、Tat 供給用のプラスミドべクターとして、
pHEK293 Enhancer Vector が添付されています（5 ページ図 6）。pHEK293 Ultra
Expression Vector II の MCS に目的遺伝子を挿入し、HEK293 系細胞に pHEK293
Enhancer Vector とコトランスフェクションすることで、目的タンパク質を一
過性に高発現することができます。なお、コトランスフェクションに使用する
pHEK293 Ultra Expression Vector II と pHEK293 Enhancer Vector の使用比率は目的
タンパク質に応じて最適化することができます。
II．製品内容
pHEK293 Ultra Expression Vector I（製品コード 3390）
1．pHEK293 Ultra Expression Vector I
20 μg（1 μg/μl）
pHEK293 Ultra Expression Vector II（製品コード 3392）
1．pHEK293 Ultra Expression Vector II
20 μg（1 μg/μl）
2．pHEK293 Enhancer Vector
20 μg（1 μg/μl）
III．保存
－ 20℃
（適切に保存し、受け取り後 2 年を目途にご使用ください。）
タカラバイオ（株）http://www.takara-bio.co.jp/
2
製品コード 3390, 3392
IV．原理
本製品は、エイズウイルスゲノム由来の RNA 配列である TAR と、転写活性化因子である
Tat による高発現システム（TAR-Tat 発現システム）を利用しています（図 1）。HIV-LTR か
らの転写活性化は、Tat がウイルス RNA の 5’ 末端に形成される TAR と呼ばれるループ構
造に結合し、RNA polymerase II をリン酸化することで行われます。本製品はこの原理を利
用して、目的タンパク質発現用ベクターと Tat 発現用ベクターの 5’ 側非翻訳領域に TAR
をコードする配列を付加しています。これにより、Tat タンパク質の効率的な発現が可能
となり、目的タンパク質の発現量を大幅に向上させることができます（図 2、図 3：特許
出願中）。なお、TAR 配列は非翻訳領域に位置していますので、原理上、目的タンパク質
のアミノ酸配列への影響はありません。
TAR
CyclinT1
Tat
CTD
P P
P P
CDK9
5’
p-TEFb
Ultra Elongation of
Transcript
RNA
Polymerase II
HIV-1 LTR
図 1．TAR-Tat 発現システムの原理
POI
POI
POI
POI
POI
POI
Tat
POI
POI
POI
POI : Protein of Interest
GOI : Gene of Interest
POI
POI
POI
Tat
Tat
Tat
Tat
Tat
Tat
䝍䞁䝟䜽㉁Ⓨ⌧ྥୖ
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
㼙㻾㻺㻭㌿෗ಁ㐍
T
A
R
CMV IE
GOI
IRES
Tat
HSV-TK
polyA
pHEK293 Ultra Expression Vector I
䠄┠ⓗ䝍䞁䝟䜽㉁䛚䜘䜃㼀㼍㼠Ⓨ⌧⏝䝧䜽䝍䞊䠅
図 2．pHEK293 Ultra Expression Vector I を用いた目的タンパク質の発現
POI : Protein of Interest
GOI : Gene of Interest
POI
POI
POI
POI
POI
POI
POI
POI
POI
POI
Tat
Tat
POI
Tat
Tat
Tat
POI
Tat
Tat
䝍䞁䝟䜽㉁Ⓨ⌧ྥୖ
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
CMV IE
T
A
R
GOI
㼙㻾㻺㻭㌿෗ಁ㐍
HSV-TK
polyA
pHEK293 Ultra Expression Vector II
䠄┠ⓗ䝍䞁䝟䜽㉁Ⓨ⌧⏝䝧䜽䝍䞊䠅
CMV IE
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
T
A
R
Tat
HSV-TK
polyA
pHEK293 Enhancer Vector
䠄㼀㼍㼠Ⓨ⌧⏝䝧䜽䝍䞊䠅
図 3．pHEK293 Ultra Expression Vector II を用いた目的タンパク質の発現
タカラバイオ（株）http://www.takara-bio.co.jp/
3
製品コード 3390, 3392
V．プラスミドマップ
Eco R I (2)
CMV IE
promoter
Eco R I (582)
pUC
ori
Sma I (803)
TAR
Xho l (807)
Bam H I (813)
Xba l (819)
MCS
pHEK293 Ultra
Expression Vector I
(4,520 bp)
Sal l (825)
Pst I (835)
Sph l (841)
IRES
Tat
Ampr
HSV TK polyA
図 4．pHEK293 Ultra Expression Vector I のベクターマップ
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4
製品コード 3390, 3392
Eco R I (2)
CMV IE
promoter
Eco R I (582)
pUC
ori
Sma I (803)
Xho l (807)
Bam H I (813)
Xba l (819)
Sal l (825)
Pst I (835)
Sph l (841)
Hin d III (843)
TAR
pHEK293 Ultra MCS
Expression Vector II
(3,678 bp)
HSV TK polyA
Ampr
図 5．pHEK293 Ultra Expression Vector II のベクターマップ
CMV IE
promoter
pUC
ori
TAR
pHEK293 Enhancer
Vector
(3,951 bp)
Tat
HSV TK polyA
Ampr
図 6．pHEK293 Enhancer Vector のベクターマップ
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5
製品コード 3390, 3392
VI．使用方法
培養条件は使用する細胞種や目的タンパク質によって異なるため、目的タンパク質に応じ
た培養条件の検討が必要です。以下に一般的な使用例を示します。
VI-1．目的遺伝子の挿入
pHEK293 Ultra Expression Vector I または pHEK293 Ultra Expression Vector II のマルチク
ローニングサイトに目的遺伝子の ORF を挿入してください。アンピシリン耐性遺伝子が
搭載されているため、組換え大腸菌を選択できます。クローニングには In-Fusion® HD
Cloning Kit（製品コード 639648 など）も使用できます。このキットを用いると、PCR 産
物をどのような直鎖状ベクターにも容易にクローニングすることができます。また、この
際に使用するコンピテントセルには相同性組換えの起こりにくい E. coli HST08 Premium
Competent Cells（製品コード 9128）の使用を推奨します。
得られた組換えクローンより、トランスフェクションに適したグレードのプラスミドを
調製してください。プラスミドの調製には、NucleoBond Xtra Midi/Midi Plus（製品コード
740410.10/740412.10 など）の使用を推奨します。
pHEK293 Ultra Expression Vector I および pHEK293 Ultra Expression Vector II の配列情報は、
タカラバイオウェブカタログからダウンロードできます。
注：目的遺伝子配列（cDNA あるいは遺伝子断片）は ATG 開始コドンと終始コドンを含む
配列で挿入してください。
VI-2．細胞へのトランスフェクション
Trans IT-293 Transfection Reagent（製品コード MIR2700）などの市販のトランスフェクショ
ン試薬を用いて、構築したプラスミドを HEK293 系細胞へトランスフェクションします。
トランスフェクション方法やプラスミド使用量は、各トランスフェクション試薬のプロト
コールに準じて実施してください。
【 pHEK293 Ultra Expression Vector II を使用する場合】
pHEK293 Ultra Expression Vector II を使用する場合は、さらに pHEK293 Enhancer Vector
をコトランスフェクションする必要があります。これらのベクターの使用比率は、目
的タンパク質の生産効率に応じて最適化することができますが、通常は、pHEK293
Ultra Expression Vector II：pHEK293 Enhancer Vector ＝ 5：1（重量比）で使用するこ
とをお勧めします。
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6
製品コード 3390, 3392
VII．実施例
VII-1．蛍光タンパク質（AcGFP1）の発現
VII-1-1．接着性 HEK293T 細胞
あらかじめ 12 ウエル細胞培養用プレートに培養しておいた HEK293T/17 細胞に、
Trans IT-293 Transfection Reagent を使用して、キットのプロトコールに従ってト
ランスフェクションを行った。各実験で使用したプラスミドを表 1 に示した。
VII-1-2．浮遊性 HEK293 細胞
あらかじめ 125 ml 三角フラスコに培養しておいた浮遊性 HEK293 細胞（FreeStyle
293-F cells、Life Technologies 社製）に、キットのプロトコールに従ってトランス
フェクションを行った。各実験で使用したプラスミドを表 1 に示した。
表1
AcGFP1 発現ベクター
細胞
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
接着性
HEK293T 細胞
浮遊性
HEK293 細胞
プラスミドの種類
pBApo-CMV/AcGFP1
Vector I/AcGFP1
Vector II/AcGFP1
Vector II/AcGFP1
A 社 Vector/AcGFP1
pBApo-CMV/AcGFP1
Vector I/AcGFP1
Vector II/AcGFP1
Vector II/AcGFP1
A 社 Vector/AcGFP1
プラスミド量
（μg）
1
1
1
1
1
30
30
30
30
30
pHEK293 Enhancer
Vector
プラスミド量
（μg）
0.008
0.2
0.24
6
-
pBApo-CMV：pBApo-CMV DNA（製品コード 3242）
Vector I
：pHEK293 Ultra Expression Vector I
Vector II
：pHEK293 Ultra Expression Vector II
A 社 Vector ：A 社タンパク質高発現ベクター
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7
製品コード 3390, 3392
VII-1-3. トランフェクションから２日後、顕微鏡観察（接着性 HEK293T 細胞のみ）および
フローサイトメーターで蛍光強度の観察を行った。結果を図 7 及び図 8 に示し
た。本製品を用いることで一般的な CMV プロモーターを利用した発現ベクター
（pBApo-CMV DNA）と比較して 5 ～ 11 倍、A 社製高発現ベクターと比較して
2 ～ 7 倍の蛍光強度の増加が認められた。
1
2
3
4
5
12.0
12.0
8.0
8.0
相対値
相対値
図 7．蛍光顕微鏡画像
4.0
0.0
1
2
3
4
4.0
0.0
5
接着細胞（293T/17）
6
7
8
9
10
浮遊細胞（FreeStyle 293-F Cells）
図 8．AcGFP 陽性細胞の蛍光強度
[ 接着性 HEK293T 細胞 ]
1． pBApo-CMV/AcGFP1（1 μg）
2． Vector I/AcGFP1（1 μg）
3． Vector II/AcGFP1（1 μg）＋ Enhancer Vector（0.008 μg）
4． Vector II/AcGFP1（1 μg）＋ Enhancer Vector（0.2 μg）
5． A 社 Vector/AcGFP1（1 μg）
[ 浮遊性 HEK293 細胞 ]
6． pBApo-CMV/AcGFP1（30 μg）
7． Vector I/AcGFP1（30 μg）
8． Vector II/AcGFP1（30 μg）＋ Enhancer Vector（0.24 μg）
9． Vector II/AcGFP1（30 μg）＋ Enhancer Vector（6 μg）
10．A 社 Vector/AcGFP1（30 μg）
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8
製品コード 3390, 3392
VII-2．顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）の発現
VII-2-1. 接着性 HEK293T 細胞
あらかじめ 12 ウエル細胞培養用プレートに培養しておいた HEK293T/17 細胞に、
Trans IT-293 Transfection Reagent を使用して、キットのプロトコールに従ってト
ランスフェクションを行った。各実験で使用したプラスミドを表 2 に示した。
VII-2-2. 浮遊性 HEK293 細胞
あらかじめ 125 ml 三角フラスコに培養しておいた浮遊性 HEK293 細胞（FreeStyle
293-F cells、Life Technologies 社製）に、キットのプロトコールに従ってトランス
フェクションを行った。各実験で使用したプラスミドを表 2 に示した。
表2
細胞
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
接着性
HEK293T 細胞
浮遊性
HEK293 細胞
pHEK293 Enhancer
Vector
プラスミド量
プラスミド量
（μg）
（μg）
1
1
1
0.008
1
0.2
G-CSF 発現ベクター
プラスミドの種類
pBApo-CMV/G-CSF
Vector I/G-CSF
Vector II/G-CSF
Vector II/G-CSF
Negative Control
pBApo-CMV/G-CSF
Vector I/G-CSF
Vector II/G-CSF
Vector II/G-CSF
Negative Control
30
30
30
30
-
0.24
6
-
VII-2-3. トランスフェクションから 2、5、7 日後に培養上清を回収し、Human G-CSF
Assay Kit（製品コード 27131-96well）を用いて G-CSF 定量を行った。結果を図 9
に示した。
本製品を使用することで、一般的な CMV プロモーターを利用した発現ベクター
（pBApo-CMV DNA）と比較して、3 ～ 5 倍の G-CSF 発現量の向上が認められた。
15
G-CSF（μg/ml）
G-CSF（μg/ml）
15
1
10
2
3
5
4
5
0
6
10
7
8
9
5
10
0
0
2
4
6
8 （日）
0
接着細胞（293T/17）
2
4
6
8 （日）
浮遊細胞（FreeStyle 293-F Cells）
図 9．G-CSF の定量
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9
製品コード 3390, 3392
VII-3．マウス抗ヒト IgG 抗体の生成
VII-3-1. 接着性 HEK293T 細胞
あらかじめ 12 ウエル細胞培養用プレートに培養しておいた HEK293T/17 細胞に、
Trans IT-293 Transfection Reagent を使用して、キットのプロトコールに従ってト
ランスフェクションを行った。各実験で使用したプラスミドを表 3 に示した。
VII-3-2. 浮遊性 HEK293 細胞
あらかじめ 125 ml 三角フラスコに培養しておいた浮遊性 HEK293 細胞（FreeStyle
293-F cells、Life Technologies 社製）に、キットのプロトコールに従ってトランス
フェクションを行った。各実験で使用したプラスミドを表 3 に示した。
表3
pHEK293 Enhancer
Vector
プラスミド
プラスミド
プラスミド
プラスミド
プラスミド量
の種類
量（μg）
の種類
量（μg）
（μg）
pBApo-CMV/HC
0.5
pBApo-CMV/LC
0.5
Vector II/HC
0.5
Vector II/LC
0.5
0.008
Vector II/HC
0.5
Vector II/LC
0.5
0.2
Negative Control
Negative Control
pBApo-CMV/HC
15
pBApo-CMV/LC
15
Vector II/HC
15
Vector II/LC
15
0.24
Vector II/HC
15
Vector II/LC
15
6
Negative Control
Negative Control
重鎖発現ベクター
細胞
1
2
3
4
5
6
7
8
接着性
HEK293T
細胞
浮遊性
HEK293
細胞
軽鎖発現ベクター
HC：Heavy Chain、LC：Light Chain
VII-3-3. トランスフェクションから 2、5、7、9 日後に培養上清を回収し、Mouse IgG EIA
Kit（製品コード MK137）
による Mouse IgG の定量を行った。結果を図 10 に示した。
本製品を使用することで一般的な CMV プロモーターを利用した発現ベクター
（pBApo-CMV DNA）
と比較して、
5 ～ 7 倍の Mouse IgG 発現量の向上が認められた。
16
1
12
2
8
3
4
0
4
Mouse IgG（μg/ml）
Mouse IgG（μg/ml）
16
6
8
2
4
6
8
10（日）
7
4
0
0
5
12
8
0
2
4
6
8
10 （日）
浮遊細胞（FreeStyle 293-F Cells）
接着細胞（293T/17）
図 10．Mouse IgG の定量
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10
製品コード 3390, 3392
VIII．関連製品
In-Fusion® HD Cloning Kit（製品コード 639633 ～ 639650）
E. coli HST08 Premium Competent Cells（製品コード 9128）
Trans IT-293（製品コード MIR2700/MIR2704/MIR2705/MIR2706）
pBApo Vector シリーズ（製品コード 3240-3244）
NucleoBond Xtra Midi/Midi Plus（製品コード 740410.10/.50/.100/740412.10/.50）
IX．使用上の注意
・本製品は、研究用試薬です｡ヒト、動物への医療、臨床診断には使用しないようご注意
ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
・本製品の使用には遺伝子工学と細胞培養に関する基本的な技術が必要です。
・タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の
製造に使用することは禁止されています。
・本製品、その構成部分またはその誘導体、ならびにこれらで製造されたものを第三者に
譲渡（無料配布、販売）することはできません。
・ In-Fusion は Clontech Laboratories, Inc. の登録商標です。その他、本説明書に記載され
ている会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みもしくは未登録の商標
であり、これらは各所有者に帰属します。
・本製品の使用によって生じたいかなる事故、損害についても、弊社では責任を負いかね
ますので、ご了承の上ご使用ください。
NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE
[M86] TAR-Tat Expression System
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Not-For-Profit Entities: Orders may be placed in the normal manner by contacting your local
representative or Takara Customer Service. Any and all uses of this product will be subject to
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which can be found below. As a condition of sale of this product to you, and prior to using this product,
you must agree to the provisions described in the DOCUMENT. Use of this product other than granted
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http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFFiles/TARTat.pdf
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For license information, please contact a licensing representative by e-mail at bio-licensing@takara-bio.
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製品コード 3390, 3392
v201402Da

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