生物化学 講義 第17章、第18章 担当 中村崇裕（植物分子機能学研究分野） 平成25年度 講義予定 12/19（金） 第１７章前半 1/ 9 （金） 第１７章後半 1/13 (火） 第１８章前半 1/30 (金） 第１８章後半 酸化的リン酸化 復習 解糖系とクエン酸サイクルで生じ た還元力（NADH, FADH2) から、生体のエネルギー通貨 (ATP)を作る NADH, FADH2 生体膜の両側へのプロトン 勾配の形成 （電子伝達系） プロトンの流れを駆動力とした ATPの合成 （酸化的リン酸化） 復習 NADH, FADH2から、電子伝達系へ電子が 渡される。すなわち、これら物質が酸化され、 NAD+, FADとなる。 電子は、電子伝達系の４種の酵素複合体 上の酸化還元中心を通り、最終的にO2を H2Oに還元する。 この過程で、ミトコンドリアの内膜外にプロ トンがくみ出され、膜の内外にプロトン濃度 勾配が出来る。 この電気化学勾配の自由エネルギーを使 って、ADPとPiからATPを合成する。（この 過程で、エネルギー勾配は解消される） 解糖系とクエン酸サイクルで生じ た還元力（NADH, FADH2) から、生体のエネルギー通貨 (ATP)を作る NADH, FADH2 生体膜の両側へのプロトン 勾配の形成 （電子伝達系） プロトンの流れを駆動力とした ATPの合成 （酸化的リン酸化） まとめ ・ NADHからO2への電子伝達で、ATP2.5分子をつくる自由エネルギーが得られる。 マトリックスから膜間部へのH+の汲み出し ・ 複合体I〜IVの流れと、それぞれの役割は？ 複合体I : NADHデヒドロゲナーゼやNADH-CoQ レダクターゼとも呼ばれる。複合体IはNADH の2つの水素と電子をCoQに渡す(プロトンワイ ヤ)。 複合体2:コハク酸-補酵素Qオキシドレダクターゼ 。コハク酸からCoQに電子を渡す 複合体III: シトクロムbc1複合体やCoQ-シトクロム cレダクターゼとも呼ばれる。複合体Ⅲは還元 型CoQからシトクロムcへの電子の受け渡し をする（Qサイクル）。 複合体IV：シトクロムcオキシダーゼ。シトクロムc から複合体IVに渡された電子は，電子伝達 系の最終受容体である酸素(O2)に渡され， 水が生じる(O2の電子還元)。 復習 酸化的リン酸化：電子伝達系が形成した生体膜のH+勾配を用いた ATP合成 ATP合成酵素（ATPシンターゼ、複合体V）が触媒 複合体I〜IVへの電子伝達で遊離する自由エネルギーを ATP合成酵素が利用可能な形で保存されること = エネルギー共役 化学浸透説： Peter Mitchellが提唱したエネルギー共役の機構 (1978年 ノーベル化学賞） 電子伝達の自由エネルギー：マトリクスから膜間部への H＋汲み出しにより 電気化学的H＋勾配として蓄えられる ATPの合成：このH＋の濃度勾配の電気化学的ポテンシャルを利用 して、ATPを合成 I III IV V Figure 14-11 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010) 化学浸透説： Peter Mitchellが提唱したエネルギー共役の機構 (1978年 ノーベル化学賞） 当初のアイデア(1950年代)：酸化的リン酸化 においても、解糖系と同じように高エネルギー 中間体がATP合成に関わると考えられていた。 → 発見出来ず 解糖系でのATP合成 STEP 7 ホスホグリセリン酸キナーゼ 1,3-ビスホスホグリセリン酸 3-ホスホグリセリン酸 STEP 10 ピルビン酸キナーゼ ホスホエノール ピルビン酸 ピルビン酸 化学浸透説： Peter Mitchellが提唱したエネルギー共役の機構 1961年。ATP合成のエネルギーは、電子伝達 系によって形成される電気化学的プロトン勾 配である、という説を発表。 → 不評 化学浸透説で説明可能な実験事実 ・酸化的リン酸化によるATP合成には無傷のミトコンドリアが必要 ・ミトコンドリア内膜は、H＋、OH-、K＋、Cl-を通さない → これらの拡散により電気化学的勾配が消失することは無い ・電子伝達系によってミトコンドリアマトリクスからH＋が汲み出され る ことによって、内膜を隔てた電気化学勾配が生じる （実際測定されている） ・内膜の電気化学勾配を消失させる薬剤は電子伝達系を妨げない が ATP合成を阻害する 電気化学的勾配を消失させる薬剤（脱共役剤） 2,4-dinitrophenol(DNP), アンモニア, 等 ・ミトコンドリア内膜の外側の酸性度を高くすると、ATP合成が上昇 化学浸透説： Peter Mitchellが提唱したエネルギー共役の機構 (1978年 ノーベル化学賞） 1974年。 Efraim Racker & Wlather Stoeckenius 化学浸透説に基づいた人為的なATP合成を 実験的に証明 バクテリオロドプシン、牛心筋mt由来 ATP合成酵素、人工小胞を利用 電子伝達によるプロトン勾配の形成 電子伝達によるH＋汲み出しにより生じた電気化学勾配： プロトン駆動力 (proton motive force, pmf) と呼ばれる プロトン汲み出しに伴う自由エネルギー変化（ΔG)： 化学成分（H＋の濃度差）と、電気的成分（電位差）の２成分 ΔG = 2.3RT[pH(in)-pH(out)] + ZFΔΨ Ｒ 気体定数 Z プロトンの電荷 F: ファラデー定数 ΔΨ：膜電位 電子伝達によるプロトン勾配の形成 電子伝達によるH＋汲み出しにより生じた電気化学勾配： プロトン駆動力 (proton motive force, pmf) と呼ばれる プロトン汲み出しに伴う自由エネルギー変化（ΔG)： 化学成分（H＋の濃度差）と、電気的成分（電位差）の２成分 ΔG = 2.3RT[pH(in)-pH(out)] + ZFΔΨ = 20.5 kJ/mol pH(in)＞pH(out)なので、 プロトン汲み出しは濃度勾配に逆ら う吸エルゴン反応 濃度勾配解消は発エルゴン反応 電子伝達によるプロトン勾配の形成 ATPの合成には、40〜50 kJ/molのエネルギーが必要： H＋２個以上（実測では３個程度）の移動が、ATP合成に必要 ΔG = 2.3RT[pH(in)-pH(out)] + ZFΔΨ = 20.5 kJ/mol ATPシンターゼ （ATP合成酵素) 別名 ・H＋輸送ATPシンターゼ ・プロトンポンプATPシンターゼ ・F0F1−ATPアーゼ （もっとも昔からの名前） ＜発見の経緯＞ ミトコンドリア中のATP分解酵素 (ATPase)の探索 画分１ (Fraction 1)に含まれる 酵素が精製され、F1−ATPアーゼ と名付けられる。 この酵素が、膜成分と複合体を つくることが判り、膜成分（膜貫通 複合体）を、F０と呼ぶこととなった。 後に、この酵素がATP合成酵素の本体と判明。 ミトコンドリア クリステの 電子顕微鏡像 （ネガテイブ染色） ATPシンターゼ （ATP合成酵素) 別名 ・H＋輸送ATPシンターゼ ・プロトンポンプATPシンターゼ ・F0F1−ATPアーゼ （もっとも昔からの名前） ミトコンドリアクリステの電子顕微鏡像 （ネガテイブ染色） クライオ電顕像 ATPシンターゼ （ATP合成酵素) 別名 ・H＋輸送ATPシンターゼ ・プロトンポンプATPシンターゼ ・F0F1−ATPアーゼ （もっとも昔からの名前） 牛心筋mtF1-ATP合成酵素 クライオ電顕像 ATPシンターゼ （ATP合成酵素) ・F0F1−ATPアーゼ F1のサブユニット構成 α3、β3、γ、δ、ε δはここら辺 3440アミノ酸(371 kDa)、高さ80Å、幅100Å の回転楕円形 α、βは構造が類似し輪に並ぶので、F1は疑 3回対称構造 ATPを触媒するのはβサブユニット εはここら辺 牛心筋mtF1-ATP合成酵素 α：赤, β：黄色, γ：青 ATPシンターゼ （ATP合成酵素) ・F0F1−ATPアーゼ F1のサブユニット構成 電子密度図 δεはここら辺 表面電荷 赤と青は、プラスとマイ ナスの荷電部位を示す。 牛心筋mtF1-ATP合成酵素 α：赤, β：黄色, γ：青 ATPシンターゼ （ATP合成酵素) ・F0F1−ATPアーゼ （もっとも昔からの名前） F0のサブユニット構成 + 機能不明のサブユニット a3、b2、c9-12 Cサブユニット、2つのヘリックスからなり 、互いが会合してリングをつくって膜に 埋まる。 bサブユニット aサブユニット 酵母F0F1−ATPアーゼのx線構造 ATPシンターゼ （ATP合成酵素) ・F0F1−ATPアーゼ （もっとも昔からの名前） F0のサブユニット構成 + 機能不明のサブユニット a3、b2、c9-12 Cサブユニット、2つのヘリックスからなり 、互いが会合してリングをつくって膜に 埋まる。 bサブユニット aサブユニット PDB: 1c17, 1e79 ATP合成の３段階 １. F0部分によるH＋の輸送 ２． F１がATPのリン酸無水結合の生成を触媒 ３. H＋濃度勾配の解消とATP合成の共役 F１部分の結合変化機構（結合・コンフォーメーション変化機構） 前提：F１部分のαβαβαβの6サブユニットは３状態の異なるαβプロトマーからなる 1. ADPとPiが、L(loose)部位に結合する 2. プロトン輸送の自由エネルギーにより、L部位はATP合成触媒部位（T(tight)部位）に移動 同時に、T部位はO(open)部位へ、O部位はL部位に移動、変換される。 3. T部位でATPが合成される。 O部位からはATPが放出される。 T部位において、ADP ＋ Pi ⇄ ATP は、平衡関係 プロトン輸送によるエネルギーは、主に T→O変換に使われる 自由エネルギーとATP合成の共役のメカニズム 触媒活性をもつα3β3集合体が回転することで結合・変化が駆動される（by Boyer） γサブユニットのN末端ヘリッ クスがどこを向くかで、α3β3 の触媒部位のコンフォメーシ ョン（T, L, O）が決まる。 固定したα3β3の中で回転するγサブユニッ トはカムシャフトの働きでプロトン流入によ る回転エネルギーをF1触媒部位のコンフォ メーション変化に共役させる 自由エネルギーとATP合成の共役のメカニズム 触媒活性をもつα3β3集合体が回転することで結合・変化が駆動される（by Boyer） 左はADPの結合を助ける 段階の構造（L)を、右は ATPを解放する段階の開い た構造(O)（PDB, 1e79) 回転エンジンとして働くF0F1ATPアーゼ Aサブユニットとcリングの間の親水チャネル(入り口）にプロトンが入り、cサブユニット と結合。 Cサブユニットが回転を開始。 空席のCサブユニットにプロトンが流入。 一回転して、親水チャネル(出口)に到達するとプロトンが内部に放出。 F1F0ATPアーゼは1回転し、3ATPを合成。 Cサブユニットの構造変化 脱プロトン型 プロトン型 F１部分の３種のプロトマーの変換機構 ・F１部分は回転する（自然界最小のモーター） 逆反応を使った解析(ATPを添加） （ATPの加水分解に依存した F１部分の回転の解析： 大阪大学 二井ら、１９９０年代） Figure 18-27a F0F1−ATP合成酵素の反応機構のまとめ ATP合成の３段階 １. F０部分によるH＋の輸送 ２． F１がATPのリン酸無水 結合の生成を触媒 ３. H＋濃度勾配の解消と ATP合成の共役 P/O比 基質の酸化とATPの合成量の比 理論値 NADH → 3 FADH2→ 2 TMPD → 1 (テトラメチル-p-フェニレンジアミン；直接電子１個を複合体IVに渡す人工化合物） 酵母：cサブユニット10本：10個の電子で１回転→３分子のATP (矛盾無し） FADH2 P/O比 基質の酸化とATPの合成量の比 理論値 NADH → 3 FADH2→ 2 TMPD → 1 (テトラメチル-p-フェニレンジアミン；直接電子１個を複合体IVに渡す人工化合物） 酵母：cサブユニット10本：10個の電子で１回転→３分子のATP (矛盾無し） 実際は、プロトンの膜からの流出、マトリクスへのPi輸送等でプロ トン濃度勾配は解消される。 Pi輸送に１個のプロトンが必要な ため、おおよそ４個のプロトンで１分子のATPが合成される。 実測値は NADH: 約2.5 FADH2: 約1.5 TMPD：１ FADH 2 １分子のグルコースが完全に酸化される場合に 生成するATPの分子数は？ 解糖系 単糖から2分子のATP、２分子のピルビン酸と２分子のNADHが生成する。 ピルビン酸デヒドロゲナーゼ １分子のピルビン酸から、１分子のNADHと１分子のアセチルCoAが生成する。 クエン酸サイクル １分子のアセチルCoAから、3分子のNADHと 1分子のFADH2、１分子のGTP が生成する。 従って、１分子のグルコースから、10分子のNADHと2分子のFADH2、 2分子のATPと2分子のGTPが生成する。 P/O 比を NADH: 2.5 FADH2: 1.5 とすると 2.5 x 10 + 1.5 x 2 + 2 + 2 = 32 （分子のATP) 脱共役：プロトン移動とATP合成が共役しない状態 脱共役性物質で引き起こされる（例えば、2,4-DNP) 生理条件では、電子伝 達とATPを脱共役して 電気化学的H+勾配を 解消させると熱を発生 する。 Figure 18-28 リスの冬眠と体温維持 秋：ドングリ，クルミ等をいっぱい食べる ↓ ドングリのデンプン質，クルミの脂質 ↓ トリアシルグリセロールの合成、脂肪組織に蓄積 ↓ 冬眠開始 . 冬眠中は… ↓ 脂肪組織の脂質を分解 ↓ 脂質由来のアセチルCoA ↓ クエン酸サイクル ↓ 電子伝達系 ↓ 脱共役蛋白質の存在する ミトコンドリア ↓ ATPが合成されず、 そのエネルギーは熱となる 褐色脂肪組織ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化 のホルモンによる脱共役 ・ ノルアドレナリン(1)がcAMP生成を促進(2)。 PKAの活性化(3)、ホルモン感受性リパーゼを 活性化(4)、トリアシルグリセロールを加水分解 し(5)、生じる遊離脂肪酸が、プリンヌクレオチド によるUCP1（脱共役タンパク質；テルモゲニン、 サーモゲニン）の阻害を解除(6)。 UCP1を通って、プロトンがマトリクスに流入し、 基質の酸化と熱発生が進行。 UCP: 脂肪などの貯蔵代謝燃料の分解を促す 肥満治療の標的。 Box 18-4 figure 2 脱共役その２ ザゼンソウ（サトイモ科） こん棒上の構造物（付属体）を発達しつつある 花頂につくる。この付属体のミトコンドリアは自 由エネルギーを熱として放出し、組織の温度を 外部より10〜25℃上昇させ、周囲の熱を溶かす。 また、腐肉臭のような匂いを発し、昆虫による受 粉率を高める。 18・3 酸化的リン酸化、まとめ ・ 化学浸透説の概念 ・ ATP合成酵素のF1、Fo成分の働き。プロトンの流れとATP合成 ・ 解糖系から酸化的リン酸までのATP生産数、P/O比 ・ 脱共役の存在、利用例。 I III IV V Figure 14-11 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010) 18・4 酸化的代謝の制御 活性化 阻害 18・4 酸化的代謝の制御 活性化 阻害 IF1: ATPシンターゼの調節（pHで活性 調節、ATPシンターゼの逆反応を防ぐ） 18・4B 好気的代謝の欠点 嫌気的解糖 C6H1206(グルコース）+2ADP+2Pi → 2乳酸 + 2H+ + 2H2O + 2ATP 好気的グルコース代謝 C6H1206+ 32ADP + 32Pi + 6 O2 → 6CO2 + 38H2O + 32ATP But, O2の部分還元による活性酸素種の発生 O2 + e- → O2・- （スーパーオキシドラジカル） O2・- + H2O2 → O2 + OH- + ・OH （ヒドロキシラジカル） ミトコンドリアの酸化的損傷 → パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチン トン病などの神経変性疾患、老化など。 酸化防止対策： SOD（スーパーオキシドジスムターゼ）、カタラーゼ、グルタチオ ンペルオキシターゼ、植物由来のアスコルビン酸、α-トコフェロール、など 細胞内共生によるミトコンドリアと葉緑体の誕生 細胞内共生説：1967年にリン・マーギュリスが提唱し た、真核生物細胞の起源を説明する仮 説 原核生物 植物 色素体 藍色細菌 ミトコンドリア α-紅色細菌 動物 菌類 古細菌 ミトコンドリアと原核微生物（細菌）の電子伝達系の比較 ミトコンドリアの起源 太古の嫌気 性真核生物 初期の好気性 真核細胞 細胞 内膜 核 細胞膜 / 好気性原核微生物 複合体I 複合体II ミトコンドリア 好気性 原核微生物 真核細胞に 由来する膜 複合体III ミトコンドリア 複合体IV 細胞内共生に伴う遺伝情報の移動� 藍色細菌� (3000遺伝子)� 核� 蛋白質� （2万遺伝子）� 遺伝情報� 葉緑体� (100 遺伝子)� ミトコンドリア� (50 遺伝子）� 細胞内共生に伴う遺伝情報の移動� オルガネラゲノムの縮退進化 � 藍色細菌� (3000遺伝子)� 核� （2万遺伝子）� 蛋白質� 遺伝情報� 葉緑体� (100 遺伝子)� 核� 液胞� ネナシカズラ、寄生植物 ミトコンドリア� 色素体ゲノムには、光合成 � 関連の遺伝子は含まれて いない。 25498遺伝子� (50 遺伝子） 125 Mb� ミトコンドリアの縮退進化� Mitochondria hydrogenosome mitosome ゲノム + ± - クエン酸回路 + ± - 呼吸鎖複合体 + ± - シトクロムc + ± - ATP合成酵素 + ± - 鉄硫黄クラスター形成 + + + 嫌気性生物 (一部の繊毛虫、パラ バサリア類、菌類など) Trichomonas vaginalis 嫌気性生物 (Entamoeba histolytica 赤痢アメーバ, Giardia intestinalis) Giardia intestinalis 生物化学 講義 第17章、第18章 2/6 試験日
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