GPC-光散乱法による 高分子特性解析昭光サイエンティフィック（株）理化学機器事業本部発表内容   GPC（SEC）法の概要とその問題点   静的光散乱法の概要   GPC-光散乱システムの構成   アプリケーションの紹介   粘度検出器の紹介代表的な高分子の分子量測定法方法型平均分子量有効な測定分子量範囲膜浸透圧絶対法 Mn 104∼106 蒸気圧浸透法絶対法 Mn ＜105 NMR 絶対法 Mn ＜105 光散乱絶対法 Mw X線小角散乱絶対法 Mw 102∼106 沈降平衡絶対法 Mw,Mz 102∼106 固有粘度相対法 Mv 102∼5 107 GPC 相対法 Mn,Mw,Mz 102∼5 106 103∼5 107 高分子学会編新高分子実験学高分子実験の基礎‐分子特性解析‐（共立出版）より一部抜粋 GPC（SEC）法とは排除排除限界容量時間排除限界分子量：100,000 排除限界分子量：4,000,000 分子量分布測定の手順 ● ● ● M W ● ● ● ● Elution volume Elution volume ● ● ● ● ● ● Elution volume 分子量既知の標準品で較正曲線を作る。分子量未知の試料を測定する。作成した較正曲線で分子量の計算をする。 GPC法の問題点   標準試料との相対比較法であり、標準試料と構造の異なる試料に対しての分子量測定精度を期待できない。   GPCカラム内の充填ゲルとの相互作用（吸着、排除）がある試料に対して適応しない。多角度光散乱検出器の紹介 Multi Angle Light Scattering;MALS GPCに接続可能な光散乱検出器   多角度光散乱検出器（Wyatt Technology社製） 18角度、8角度、3角度検出器がある。オプションで粘度検出器も追加可能   2角度式光散乱検出器（Precision Detectors社製） 90°と15°の2角度検出器   トリプル検出器（Viscotek社製） 90°＋15°光散乱検出器、粘度検出器、RI検出器の組み合わせ   低角度光散乱検出器；LALLS（東ソー製他）低角度1点の検出器、現在は販売されていない。   フロー式動的光散乱測定器（Malvern社製他）粒子径測定のみで、分子量は測定できない光散乱分子に光があたると、分子には振動双極子が誘起される。光の波長と同じ電磁波（光）を放射=光散乱静的光散乱測定（分子量） incident beam scattered light 重い粒子も軽い粒子も同じ波長で振動する溶液中では分極率は屈折率増分（dn/dc）の2乗に比例濃度→0、測定角度→0の外挿点で散乱強度 ∝（濃度）（分子量）（dn/dc）２静的光散乱測定（分子量）蛋白質が会合するとした場合のシュミレーション（dn/dcが変化しないと仮定する）分子量1万×10個濃度1mg/mL 散乱強度 1V モノマー分子量2万×5個濃度1mg/mL 散乱強度濃度検出器は応答量変わらないダイマー２V 分子量10万×1個濃度1mg/mL 散乱強度濃度検出器は応答量変わらない会合体 1０V 静的光散乱測定（分子サイズ）散乱光の干渉作用分子ｻｲｽﾞ小分子ｻｲｽﾞ大散乱点が１つ散乱点が複数ﾚｰｻﾞｰ光弱各角度の散乱強度が同じ強角度により散乱強度が違ってくる静的光散乱測定（分子サイズ）散乱光の干渉作用微小ｻｲｽﾞ分子 Rg ＜10nm 等方散乱非等方散乱巨大ｻｲｽﾞ分子 Rg ＞10nm Rg：根平均慣性回転半径静的光散乱法理論式 K ∗c 1 = + 2 A2c R(θ ) MP(θ ) K ：光学定数＝4π2（dn/dc)2 n02／Naλ04 n0 ：溶媒の屈折率、Na：アボガドロ数 λ0：真空中の入射光の波長 R（θ）：過剰還元散乱強度 C ：試料濃度 M ：重量平均分子量 A2 ：第二ビリアル係数 P（θ）：分子内干渉因子 P（θ）-１＝１＋1/3k2＜S2＞＋O（k4） k＝（4π/（λ0/n0））sinθ/2 角度を0°に近似すると・・・ P(0°) → 1 K ∗c 1 = 2 A2 c + R (0 ) M 濃度を0に近似すると・・・C→0 K ∗c 16π 2 n02 2 1 2 ⎛ θ ⎞ = rg sin ⎜ ⎟ + 2 R(θ ) 3Mλ0 ⎝ 2 ⎠ M Zimm plot: Zero angle: K ∗c 1 = 2 A2 c + R(0 ) M K ∗c 2 ⎛ θ ⎞ Plot vs. sin ⎜ ⎟ + kc R(θ ) ⎝ 2 ⎠ Zero concentration: K ∗c 16π 2 n02 2 1 2 ⎛ θ ⎞ = r sin + ⎜ ⎟ g 2 R(θ ) 3Mλ0 ⎝ 2 ⎠ M A2 from initial slope ! GPC-MALS測定では、光散乱測定時には非常に希薄濃度状態を検出している。 rms radius from initial slope ! MALS測定実測例ポリスチレンMw=8,000,000g/mol 15角度測定例 Y軸切片=1/Mw 青点=散乱強度の逆数初期勾配∝Rg 散乱強度の測定角度変化∝分子ｻｲｽﾞ（RMS半径＝慣性回転半径＝Rg） MALS（DAWN HELEOS）の検出部フローセルの周りに18個の検出器を設置検出フォトダイオード laser 高角度 θ 低角度 GPC-MALSシステムの構成 SEC-MALS MALSのﾃﾞｰﾀ取り込み・全検出器同時に1∼8 ﾎﾟｲﾝﾄ / secで取り込み・各ｽﾗｲｽ毎、分子量（Mw）RMS半径（Rg）測定・ｽﾗｲｽﾃﾞｰﾀ例 Ve:12.342（mL） Mw:7.3E+6 (g/mol) Rg:165.5 (nm) ・ MALS 3Dﾌﾟﾛｯﾄ 736ｽﾗｲｽ測定角度 23°∼ 147° 全15角度 3D Plot - stdpst7s 散乱強度ｽﾗｲｽﾃﾞｰﾀ溶出容量 17 16 15 14 13 高角度 12 11 10 9 8 7 6 5 4 測定角度 3 低角度屈折率増分（dn/dc） dn/dcとは… 試料濃度による屈折率の増分空気光 ① 溶媒 ② 試料溶媒入射光の角度が濃度に比例するＣ=０Ｃ=１Ｃ=２ ③ 温度 ④ 波長一定の条件下では変化しない物理量 Mw>2000では分子量にほとんど依存しない dn/dc値の測定方法   専用の示差屈折率計を使用する。（最適な測定法）   GPCカラムからのサンプル回収率を100%と仮定し、dn/dc既知の物質を用いて校正した RI検出器より得られたピーク面積値とサンプル注入量からdn/dc値を見積もる。（簡易的に求める方法ではあるが、様々な問題点あり）示差屈折率検出器 Optilab rEX 機能  dn/dc測定が可能  絶対屈折率測定が可能  HPLC用RI検出器として使用可能特長  光源波長の選択が可能（LED交換）  （633、658、690nm etc.）  温調範囲；4∼50℃  ワイドダイナミックレンジ dn/dc測定実際例 Pullulan48K in 50mM NaNO3 Set Concentrations 0.50 OPTILAB 信号強度 Adjusted Output (volts) 0.40 C=0.25% 0.30 C=0.20% 0.20 C=0.15% C=0.10% 0.10 C=0.05% 0.00 -0.10 0 5 10 Time (minutes) 測定時間第５回 M A L S 研究会談話会 15 20 dn/dc測定実際例 Pullulan48K in 50mM NaNO3 4.00x10 dn/dc Curve -4 n dn 3.00x10 - 4 2.00x10 - 4 1.00x10 - 4 dn/c (mL/g) dn/dc (mL/g) 0.00 1.55x10 - 1 1.50x10 - 1 1.45x10 - 1 1.40x10 - 1 1.35x10 - 1 1.30x10 - 1 0.0 5.0x 10- 4 1.0x 10- 3 1.5x 10- 3 Conc entration (g/mL) 試料濃度 (g/mL) K no wn C al ib ra ti on c on st an t (1 /v ol ts ): 1 .1 88 8e -0 3 d n/ dc ( mL /g ) : 0 .1 42 5 ± 0. 00 02 2.0x 10- 3 2.5x 10- 3 各種ポリスチレンの測定サンプル１．National Institute of Standards and Technology;NIST（米国） 多分散ポリスチレン標準 SRM-706a Mw=285,000（保証値）２. Polymer Standard Service社（ドイツ）ポリスチレン標準 8-star, Mn=45,500 one arm GPC-MALS測定条件カラム：Shodex GPC KF-806L（昭和電工製）溶離液：トルエン流速：1.0mL/min 光散乱：DAWN HELEOS（Wyatt Technology社製） RI検出器：Optilab rEX（Wyatt Technology社製）分子量vs.溶出時間 SRM706a 測定値 SRM706a 8-Star Mw＝2.896×105 Mw＝3.854×105 8-Star 参考値 SRM706a Mw＝2.85×105 8-Star＊ Mw＝3.64×105 8-StarのMw値は、Mn=45,500（one arm)×8 とした計算値回転半径vs.溶出時間 SRM706a 8-Star 測定値 SRM-706a 8-Star Rz=27.9nm Rz=15.6nm 参考値 SRM-706a Rz=27.8nm コンフォメーションプロット（logMw vs.log〈rg〉 SRM706a；傾き0.62 8-Star；傾き0.55 SRM706a GPC測定 1 1.0 6.5 6.0 5.5 0.5 mV 4.5 4.0 0.0 3.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 minutes 9.0 9.5 10.0 測定結果 Mn＝103,015 Mw＝292,369 10.5 Log M 5.0 較正曲線作成に使用したPS標準（8点） Mw= 3,053,000 956,000 483,000 189,300 60,450 30,300 10,050 3,790 11.0 保証値 Mw＝285,000 8-StarポリスチレンのGPC測定 1 1.0 6.5 6.0 0.5 5.5 mV 0.0 4.5 4.0 -0.5 3.5 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 Log M 5.0 較正曲線作成に使用したPS標準（8点） Mw= 3,053,000 956,000 483,000 189,300 60,450 30,300 10,050 3,790 11.0 minutes 測定値 Mn＝187,511 Mw＝254,115 参考値 M＝364,000 GPC-MALS-粘度検出器への展開       固有粘度[η]の測定 GPCの検出器として使用 MALSとの組み合わせによりMark-Howink-Sakurada Plotを容易に作成可能粘度検出器測定原理 •  4 Capillary Bridge ηsp = 4ΔP / ( IP − 2ΔP )   比粘度ηsp ηsp = η /η0 − 1   固有粘度[η] [η ] = lim ηsp / c c→0 Mark-Houwink-Sakurada equation [η] = KM α log [η] = logK + α log M ·Rod-like polymer → > 1.0 ·Random coil polymer → 0.5 – 0.7 ·Spherical molecule → < 0.5 北海道大学工学研究科生物機能高分子専攻佐藤敏文准教授よりご提供 Mark-Houwink-Sakurada plots Z� Figure. Mark-Houwink plots in DMF at 25 oC of ��poly-1 (hyperbranched) and poly-3(linear). Satoh, T. Kakuchi, T. et al�Macromolecules, 40(26), 9313-9321(2007) 北海道大学工学研究科生物機能高分子専攻佐藤敏文准教授よりご提供まとめ GPC-光散乱法は・・・   構造の影響や、サンプルとカラム充填剤との相互作用の影響を受けず真の分子量分布、分子サイズ分布を測定可能である。   分岐度、形状情報を得られる。粘度検出器を付加することにより、その範囲はさらに広がる。