アプリケーションノート Countess II FL 自動セルカウンターサイトスピン 4 ® EVOS イメージングシステム Arcturus XT™ LCM システム ® レーザーマイクロダイセクションを用いたサイトスピン塗抹標本からのシングルセル回収大滝真作 1、鈴木千恵 2、荻上伸子 3、白神博 3 （ 1 サーモフィッシャーサイエンティフィックアナトロミカルパソロジー部、2 サーモフィッシャーサイエンティフィックカスタマーサポート本部 3 サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社）要約近年、シングルセル解析が注目されている。浮遊細胞の塗抹標本をサイトスピンで作成し、レーザーマイクロダイセクションでシングルセルを回収した例を紹介する。イントロダクションこれまで浮遊細胞サンプルに対し、サイトスピンを用いて塗抹標本を作成した後、顕微鏡観察を行うことが長年行われてきた。しかし、この場合、顕微鏡観察が目的となるので、この標本より細胞を回収し、更なる実験が行われることは希であった。レーザーマイクロダイセクションは組織標本からレーザーを用いて細胞を回収する技術である。サイトスピンで作成した標本から、レーザーマイクロダイセクションにて自由に細胞を回収することができれば細胞研究の幅が広がることが期待できる。本アプリケーションノートではサイトスピンで調整した塗抹標本からレーザーマイクロダイセクションを用いてシングルセルを回収した例を紹介する。方法及び実験材料最適サイトスピン条件の検討ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株である Jurkat 細胞を培養し、Countess® II FL 自動セルカウンターで細胞数を計測した。この細胞液を使用し、サイトスピン 4 を用いて細胞塗抹標本を作成した。標本作製にはシングルサイトスライドバックサークル、コートタイプ（ThermoFisher Scientific, 5991056）と EZ シングルホワイトサイトフューネルス（ThermoFisher Scientific, A78710003）を用いた。サイトスピンは 1000 rpm、Acceleration を mid で 5 分間行った。出来上がった標本は室温にて風乾し、 EVOS® XL Imaging System を用いて顕微鏡観察を行った。その結果、1.0 × 10 4 細胞を使用した場合には適度に細胞が散在していたため、この条件でシングルセルのレーザーマイクロダイセクションを実施することとした（図 1）。 1.0 × 104 細胞 400 µm 2.0 × 104 細胞 400 µm 3.0 × 104 細胞 400 µm 細胞数測定サイトスピン顕微鏡観察 Countess® II FL Cell Counter Cytospin™ 4 Cytocentrifuge EVOS® XL Imaging System レーザーマイクロダイセクション Arcturus XT ™ LCM System 図 1. 各細胞数によるサイトスピン標本の細胞密集度の違いシングルセルの分離には 1.0 × 10 4 の Jurkat 細胞をサイトスピンするのが適当と思われた。レーザーマイクロダイセクション ① 1 細胞回収前マイクロダイセクション用の PEN Membrane Glass Slides（LCM0522）をスライドグラスとして用い、 EZ シングルホワイトサイトフューネルス（ThermoFisher Scientific, A78710003）にセットした。そして 1.0 ×104 の Jurkat 細胞を 1000 rpm, 5 分間、Acceleration を mid でサイトスピンした。出来上がった細胞標本を用いて ArcturusXT ™ LCM System でレーザーマイクロダイセクションを行った。細胞のキャプチャーには CapSure® HS LCM Cap（LCM0214）を用いた。その結果、CapSure® HS LCM Cap 上に Jurkat 細胞のシングルセルを回収することに成功した（図 2）。 ② レーザー照射後 100 µm 100 µm ③ CapSure ® に回収された 1 細胞 ④ 1 細胞回収後考察今回の実験ではサイトスピンを用いて Jurkat 細胞の塗抹標本を作成し、そこからレーザーマイクロダイセクションでシングルセルを回収した。この手法は血液、髄液、尿などの臨床サンプルにも適応できると期待される。また、近年、血中を循環している Circulating Tumor Cell（CTC）が注目されているおり、 CTC の塗抹標本もサイトスピンで行われている（参考文献）。本手法を用いれば CTC を顕微鏡観察下でシングルセルとして回収することも可能であると期待される。 100 µm 100 µm 図 2. レーザーマイクロダイセクションによるシングルセルの回収マイクロダイセクションで回収したシングルセルを矢印で示した。レーザーマイクロダイセクションを用いれば、スライドグラス上に塗抹した細胞標本よりシングルセルを回収することができる。近年、次世代シーケンサなどの遺伝子解析装置が進歩しており、シングルセル解析の需要が高まっている。サイトスピンとレーザーマイクロダイセクションを組み合わせれば、体液サンプル中のシングルセルの解析が更に進むと期待される。本アプリケーションノートが皆様の研究の一助となれば幸いである。参考文献 Igawa, S. et al,: Circulating tumor cells as a prognostic factor in patients with small cell lung cancer. Oncology Letters 7: 1469-1473, 2014 Ordering information 製品名サイズ製品番号 1式 AMQAX1000 1式 A78300003 ® Countess II FL 自動セルカウンター ™ Cytospin 4 Cytocentrifuge EVOS XL, NO OBJ/ AU CORD XT ™ Arcturus AME3300 本体のみ * ® IR & UV レーザーベーシックシステム ™ 1式 ARCTURUSXT-B Cytospin 4 Cytocentrifuge 消耗品シングルサイトスライドバックサークル、コートタイプ 100 枚 5991056 EZ シングルホワイトサイトフューネルス Arcturus XT ™ 40 個 IR & UV レーザーベーシックシステム消耗品 Membrane Glass Slides A78710003 50 枚 ® CapSure HS LCM Cap LCM0522 32 キャップ LCM0214 * ご使用には別途対物レンズ等のアクセサリーが必要になります。最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の“製品価格と在庫の検索”でご確認いただけます。研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。標準販売条件はこちらをご覧ください。 www.lifetechnologies.com/TC For Research Use only. Not for use in diagnostic procedures. © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. Printed in Japan. ARK006-A1502IH サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 テクニカルサポートオーダーサポート営業部 0120-477-392 [email protected] TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9584 TEL：03-6832-9300 FAX：03-6832-9580 facebook.com/LifeTechnologiesJapan www.lifetechnologies.com @LifetechJPN 販売店