GTM‐1222 特徴 miRBase から抽出（完全天然RNA） RISCへの取り込み効果UP! 5’ X 3’ 3’ 5’ パッセンジャー鎖のRNAi活性を消失させる修飾（2本鎖構造を維持）成熟miRNAそのものの活性を見ることができます！（パッセンジャー鎖によるOff-target 活性を抑制）申し込み方法 miRBaseの登録番号、miRNA 名称、必要量をお送りくださいガイド鎖・パッセンジャー鎖の合成とアニーリング約1週間※でお手元にお届け ※20nmol, 簡易精製の場合 20 nmol 1セット【申し込み・お問い合わせ先】 ¥30,000（税別）【販売代理店】株式会社ジーンデザイン学術営業部 tel : 072-640-5180 fax : 072-640-5181 e-mail : [email protected] HP : http://www.genedesign.co.jp/ 本製品は、(株)ジーンデザインと(株)サイトパスファインダーの共同研究により得られた成果を基に製品化しております。 GTM‐1222 【miRNA mimic 合成法の選択】 1. ガイド鎖のみ RNAi 活性を発揮する配列修飾の選択２. miRNA mimic による RNAi 活性の濃度依存性ガイド鎖を天然RNA, パッセンジャー鎖に化学修飾を施した二本鎖RNAを複数合成した。レポーターアッセイを実施し, miRNA mimic としての機能を調べた。二本鎖とも天然RNA であるものやいくつかの合成法では, ガイド鎖, パッセンジャー鎖ともに RNAi 活性を示していた（図1. #7‐#10）。ガイド鎖が強い RNAi 活性を示し、パッセンジャー鎖が RNAi 活性を示さないことを指標に miRNA mimic 修飾方法を選択した。１．で修飾方法を選択した、miR‐ 1, miR‐135 mimic について濃度を変えて固相トランスフェクション法にて HeLa 細胞に導入したところ, 濃度依存的に RNAi 活性を示した（図2a）。通常のリポソームトランスフェクション法では, 0.5 nM という低濃度においても RNAi 活性を確認出来た（図2b）。 a) b) 1.25 1.25 Ratio (Firefly/Renilla luciferase) Ratio (Firefly/Renilla luciferase) 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 1.00 1.00 0.75 0.75 0.50 0.50 0 candidates #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 0.25 0.25 0 0 miR‐1 plasmids with Fw target with Rv target without target miR‐135 図2. a) miRNA mimic を濃度を変えて固相トランスフェクション法により HeLa 細胞に導入しレポーターアッセイを実施した。 B) 0.5 nM miRNA mimic をリポソーム法により HeLa 細胞に導入し, レポーターアッセイを実施した。図1. レポーター遺伝子の 3’‐UTR に miRNA のガイド鎖の標的となる配列（Fw target）, パッセンジャー鎖の標的となる配列（Rv target）, もしくは, 標的となる配列がない（without target）プラスミドを用い, レポーターアッセイを実施した。ここでは, 一例として miR‐1 mimic に対するアッセイ結果を示している。ガイド鎖の RNAi 活性が高い miRNA mimic を左から並べている。【 miRNA mimic 導入による細胞生存への影響（ミニスクリーニング）】 32種のmiRNA mimics について、細胞生存への影響を調べた（図3）。固相トランスフェクションプレートに細胞を播種することにより miRNA mimic を導入した（図3a）。細胞死を引き起こすsiRNA をコントロールとして用いることで、トランスフェクション条件を決定した。 A549 細胞では、1% FBS 存在下にて培養した場合に miR‐199a‐5p, miR‐200c‐3p, miR‐16‐5p が生存率を低下させた。これまでに報告されている miRNA が含まれており, 選択した合成法が有効であることを示していると考えられる。 has-miR-1 hsa-let-7a-5p has-135a-5p hsa-miR-141-3p hsa-miR-141-5p hsa-miR-199a-3p hsa-miR-199a-5p hsa-miR-200c-3p hsa-miR-200c-5p hsa-miR-205-3p hsa-miR-205-5p hsa-miR-214-3p hsa-miR-214-5p hsa-miR-98-5p hsa-miR-522-5p hsa-miR-20a-5p hsa-miR-17-5p hsa-miR-93-5p hsa-miR-106b-5p hsa-miR-20b-5p hsa-miR-16-5p hsa-miR-15b-5p hsa-miR-30b-3p hsa-miR-130a-3p hsa-miR-130b-3p hsa-miR-15a-5p hsa-miR-424-5p hsa-miR-25-3p hsa-miR-92a-3p hsa-miR-92b-3p hsa-miR-30a-5p hsa-miR-320a Negative Control 0 Cell Death siRNA Cell Death siRNA 0.5 untreated miRNA 1 Negative Control siRNA Negative Control siRNA b) Relative viability a) 図3. miRNA mimicのA549細胞の生存率への影響を調べた。固相トランスフェクション法（a）により, miRNA mimicを導入後, 1% FBS存在下で培養した（b）。アッセイ実施機関：株式会社サイトパスファインダー