ダイズ共存細菌の群集構造解析における LNA-PCR クランプ技術ダイズ共存細菌の群集構造解析における LNA-PCR クランプ技術 ○池永誠・田淵雅和１）・日髙栄作・境雅夫１）１） ○池永誠・田淵雅和（鹿児島大農・・日髙栄作・境雅夫鹿児島大院農）（鹿児島大農・１）鹿児島大院農）【目的】化した。ミトコンドリアに特異的な LNA オリゴととも植物に共存する細菌が, 植物の生育に対して重要な【目的】植物に共存する細菌が, 植物の生育に対してに, 設計した LNA オリゴを加えてを行い, 効果的 LNA オリゴとともに, 設計した LNAPCR オリゴを加えて PCR 影響を及ぼしている事は古くから知られており, 植物重要な影響を及ぼしている事は古くから知られており, な LNA オリゴの濃度を検討した。次に, DGGE 法で LNA を行い, 効果的な LNA オリゴの濃度を検討した。次に, 共存細菌の機能を微生物資材として農業利用するため植物共存細菌の機能を微生物資材として農業利用するオリゴの有無およびダイズ各部位における群集構造の DGGE 法で LNA オリゴの有無およびダイズ各部位におけには, 群集構造解析法の確立が不可欠である。しかし, ためには, 群集構造解析法の確立が不可欠である。し異同を解析した。る群集構造の異同を解析した。植物試料から抽出した DNA を用いて細菌用プライマーかし, 植物試料から抽出した DNA を用いて細菌用プラ【結果および考察】で PCR 増幅を行った場合, 植物オルガネラ（ミトコンイマーで PCR 増幅を行った場合, 植物オルガネラ（ミオルガネラのSSUオルガネラのSSU rRNA遺伝子のPCR増幅を抑制するた【結果および考察】 rRNA遺伝子のPCR増ドリアおよびプラスチド）の SSU rRNA 遺伝子が過剰にトコンドリアおよびプラスチド）の SSU rRNA 遺伝子がめの効果的な濃度を検討したところ, 種子と葉につい幅を抑制するための効果的な濃度を検討したところ, 増幅され, 共存細菌の群集構造が過小評価される重大過剰に増幅され, 共存細菌の群集構造が過小評価されては1.0µM以上, 茎については3.0µM以上, 根について種子と葉については1.0µM以上, 茎については3.0µM以な問題が存在する。以前の支部会では, 植物オルガネる重大な問題が存在する。以前の支部会では, 植物オは4.0µMで, オルガネラ遺伝子の増幅を抑制し, 共存細上, 根については4.0µMで, オルガネラ遺伝子の増幅をラのSSU rRNA遺伝子に特異的な配列を持つロックド核ルガネラのSSU rRNA遺伝子に特異的な配列を持つロッ菌の遺伝子を選択的にPCR増幅する事ができた。次に, 抑制し, 共存細菌の遺伝子を選択的にPCR増幅する事が酸含有オリゴヌクレオチド（LNA オリゴ）をプライマクド核酸含有オリゴヌクレオチド（LNA オリゴ）をプ DGGE法を用いてダイズ各部位に生息する共存細菌の群できた。次に, DGGE法を用いてダイズ各部位に生息するーと競合する位置に設計し, オルガネラ遺伝子の PCR ライマーと競合する位置に設計し, オルガネラ遺伝子集構造解析を行った。その結果, LNAオリゴ使用しない共存細菌の群集構造解析を行った。その結果, LNAオリ増幅を抑制する事によって, 植物共存細菌の SSU rRNA の PCR 増幅を抑制する事によって, 植物共存細菌の従来のDGGE法では検出されなかった新たなバンドが, ゴ使用しない従来のDGGE法では検出されなかった新た遺伝子を選択的に増幅する PCR クランプ技術について SSU rRNA 遺伝子を選択的に増幅する PCR クランプ技術 LNAオリゴを使用する事で複数検出され, 新たに設計しなバンドが, LNAオリゴを使用する事で複数検出され, 報告した。しかしながら, 設計した設計した LNA オリゴにおいについて報告した。しかしながら, LNA オリたLNAオリゴの有効性が示された(図1)。また, 各部位に新たに設計したLNAオリゴの有効性が示された(図1)。まて, プラスチドに特異的な配列は 2 つに大別されるたゴにおいて, プラスチドに特異的な配列は 2 つに大別おける群集構造を比較したところ, 共通するバンドがた, 各部位における群集構造を比較したところ, 共通め, ダイズなどの共存細菌の群集構造を解析する際は, されるため, ダイズなどの共存細菌の群集構造を解析多かったものの, 各部位に特異的なバンドも認められ, するバンドが多かったものの, 各部位に特異的なバン新たな LNA オリゴの設計が必要となる。今回は新たにする際は, 新たな LNA オリゴの設計が必要となる。今これらのバンドに由来する共存細菌が, 植物の生長にドも認められ,これらのバンドに由来する共存細菌が, プラスチドに特異的な LNA オリゴを設計したので, そ回は新たにプラスチドに特異的な LNA オリゴを設計し関与している可能性が示唆された。植物の生長に関与している可能性が示唆された。れを使用して共存細菌の遺伝子を選択的に PCR 増幅し, たので, それを使用して共存細菌の遺伝子を選択的に群集構造した時の結果について報告する。 PCR 増幅し, 群集構造した時の結果について報告する。【材料および方法】供試試料にはダイズ（フクユタカ）を用いた。芽出【材料および方法】供試試料にはダイズ（フクユタカ）し後, 約 3 週間ポット栽培を野外で行い, 約 20 本の幼を用いた。芽出し後, 約 3 週間ポット栽培を野外で行個体から葉, 茎および根を採取した。ダイズ種子も供い, 約 20 本の幼個体から葉, 茎および根を採取した。試試料として用いた。種子, 葉, 茎および根の表面をダイズ種子も供試試料として用いた。種子, 葉, 茎お洗浄後, 磨り潰してから磨り潰してから DNA を抽出した。プラスチドよび根の表面を洗浄後, DNA を抽出しに特異的なLNAオリゴは, た。プラスチドに特異的なプラスチドおよび細菌のSSU LNA オリゴは, プラスチド rRNA 遺伝子を, および細菌の SSUプライマーとともにアライメントし， rRNA 遺伝子を, プライマーとともにプライマーのアニーリング部位と数塩基競合させる一アライメントし、プライマーのアニーリング部位と数方, 3′末端の伸長側にシフトした位置においてプラス塩基競合させる一方, 3′末端の伸長側にシフトした位チドに特異的な DNA を LNA に置換して設計した。また, 置においてプラスチドに特異的な DNA を LNA に置換し LNA オリゴから伸長が生じないように 3′末端をリン酸て設計した。また, LNA オリゴから伸長が生じないよう図 1.ダイズ各部位における共存細菌群の DGGE パターに 3′末端をリン酸化した。ミトコンドリアに特異的なン. Ｍ;オルガネラマーカー, －;LNA 無, ＋;LNA 有 ─ 57 ─ p053-064cs6.indd 57 2014/07/31 8:58:28