Y Sterkers 2014 ( PDF - 3 Mo)

ARN interférence
- RNAi –
dans des modèles mammifères et
ancestraux
Yvon Sterkers
MIVEGEC UMR2724 IRD/CNRS/UM1
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie
MONTPELLIER
L’ARN interférence
I. Historique
II. Mécanisme de l’ARNi
III.L’ARNi in vivo
IV.L’ARNi in vitro : outil de génétique inverse
I. Historique
 Napoli, C., Lemieux, C. and Jorgensen, R. (1990) Introduction of a chimeric
chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous
genes in trans. The Plant Cell 2:279-289.
introduit le gène codant la chalcone synthase, chez le Petunia
=> transgène ET gène endogène ne
s’expriment pas
+ diminution du niveau d’expression
de l’ARNm correspondant
= co-suppression
= Post-Transcriptional Gene
Silencing (PTGS)
I. Historique
 Fire, A., et al. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded
RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391:806-11.
C. elegans :
introduction d’un ARNdb
=> inactivation de la synthèse de la protéine codée par l ’ARN homologue
= Gene silencing
introduction brin ARNsens ou antisens : peu/pas d’effet
introduction fragments d’ARNdb correspondant à des introns ou à des
séquences promotrices
=> Pas de ‘gene silencing’ détectable
introduction de seulement quelques molécules d’ARNdb
sont suffisantes
=> Phénomène d’amplification
I. Historique
 Zamore, P. D., et al. (2000) RNAi : double-stranded RNA directs the ATP-dependent
cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101:25-33.
grands ARNdb fragmentés en ARN de 21 à 23 nts, dans des
lysats embryonnaires de Drosophile
+ ces fragments guident le clivage de l’ARNm
 M. Elbashir, S. et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA
interference in cultured mammalian cells. Nature 411:494-8.
Introduction de petits ARNdb de 21 nts (=siRNA) de
séquence homologue à celle d’un ARN endogène
 dégradation spécifique de l’ARNm, dans différentes lignées
cellulaires de Mammifères.
I. Historique
 Depuis 2001 : augmentation exponentielle du nombre de publications sur l’ARNi
o 1ère définition :
ARN interférence = Inhibition séquence-spécifique de l’expression d’un
gène par dégradation de l’ARNm correspondant, par appariement entre
des petits ARN double-brins dits siRNA et cet ARNm.
o puis élargissement de la notion d’ARNi suite à la découverte d’autres
familles de molécules d’ARNdb
→ inhibition/blocage de la traduction (miRNA)
→ modification des histones et induction de l’hétérochromatine
(inhibition de la transcription)
I. Historique
II. Mécanisme de l’ARNi (siRNA)
1ère étape :
Clivage des ARNdb de longues tailles
en siRNA (21-23 nt)
par l’endonucléase Dicer
Recyclage des complexes siRISC
II. Mécanisme de l’ARNi
2ème étape :
Assemblage du brin guide (brin antisens)
avec le complexe RISC RNA-induced
silencing complex qui contient:
- une protéine de reconnaissance à activité
RNase = Argonaute (Ago)
- une hélicase
complexe siRISC
II. Mécanisme de l’ARNi
3ème étape :
Le brin guide est utilisé comme
matrice pour cibler ARNm
complémentaires
+ clivage des ARNm cibles par Ago
Recyclage des complexes siRISC
II. Mécanisme de l’ARNi
III. L’ARNi in vivo
1. Rôles physiologiques de l’ARN interférence :
 Protection contre les virus à ARNdb
 Prévention de la propagation des éléments transposables
 Régulation de l’expression des gènes
III.1. Rôles physiologiques
2. Organismes réalisant l’ARNi
Comment identifier les organismes réalisant l’ARNi ?
1. Analyse bio-informatique
Étude génomique, BLAST
2. Approche fonctionnelle
inhibition de transcrits endogènes avec grands ARNdb ou siARNs ?
recherche de siARNs
III.2. Organismes réalisant l’ARNi
PROTOZOAIRES :
 Amibe : Entamoeba histolytica
E. histolytica
 Flagellés Trypanosomatidés : Trypanosma brucei
T. brucei
Ne fonctionne pas chez :
 T. cruzi (Flagellé ; Trypanosomatidé) : Dicer,
X
X Argonaute
 Leishmania (Flagellé ; Trypanosomatidé) : Dicer,
X Argonaute
X
 Toxoplasma (Apicomplexe)
 Plasmodium (Apicomplexe)
 Giardia lamblia
III.2. Organismes réalisant l’ARNi
METAZOAIRES :
Parasites :
Schistosoma spp.
Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonicum
Champignons :
Sch. pombe, S. cerevisiae,
Sac. castellii, Neurospora crassa, C. albicans,…
X
Candid albicans
Neurospora crassa
III.1. Organismes réalisant l’ARNi
IV. L’ARNi in vitro :
outil de génétique inverse
1. Introduction des
ARNdb
Nourrir les nématodes avec des bactéries
produisant l’ARN double-brin
C. elegans
Injecter l’ARN double-brin dans une cellule
Tremper le nématode dans une solution contenant
l’ARN double-brin
IV. Outil de génétique inverse
Injecter l’ARN double-brin dans un
embryon/adulte
D. melanogaster
Transfecter avec un vecteur exprimant
l’ARN double-brin (lignées cellulaires)
Souches transgéniques exprimant un gène en
orientation sens et anti-sens
IV. Outil de génétique inverse
Plantes
Transfecter avec un vecteur exprimant l’ARN
double-brin : sur une feuille ou sur des cellules
germinales
Mammifères
Transfecter avec des siRNA (lignées cellulaires)
Transfecter avec un vecteur d’expression possédant un
promoteur ARNpolIII (shRNA)
grands ARNdb chez Mammifères => interféron
IV. Outil de génétique inverse
2. Exemple pratique:
Protocole d’ARNi chez un protozoaire
parasite : T. brucei
IV. 2. RNAi chez T.brucei
Trypanosoma brucei
Responsable de la maladie du
sommeil, chez l’homme
= Trypanosomose humaine africaine
500 000 cas répertoriés ; 70 000 morts/an en Afrique
• Parasitoses transmises par la
mouche tsé-tsé = glossine
IV. 2. RNAi chez T.brucei
Cycle de vie de Trypanosoma brucei
Etapes chez la mouche Tsé-tsé
Dans les glandes salivaires :
Multiplication de la forme épimastigote
Transformation en forme métacyclique
Etapes chez les mammifères
La mouche Tsé-tsé prend
un repas sanguin
Transformation de la forme
métacyclique
en forme sanguine
longue et mince
(trypomastigote
métacyclique)
(slender)
Le parasite
quitte l’intestin
Le parasite se multiplie
dans les fluides corporels
(épimastigote)
La mouche Tsé-tsé
prend un repas sanguin
Dans l’intestin:
Transformation de la forme sanguine
en forme procyclique (multiplication)
(trypomastigote procyclique)
Transformation en forme sanguine
courte et trapue
(stumpy)
TDR Website
Forme procyclique
(insecte)
Forme sanguine
(mammifère)
IV. 2. RNAi chez T.brucei
Introduction des ARNdb?
IV. Outil de génétique inverse
Introduction des ARNdb
Transfecter avec un vecteur exprimant
l’ARN double-brin
T. brucei
Transfecter avec un vecteur exprimant un gène
en orientation sens et anti-sens
IV. Outil de génétique inverse
Types de vecteurs utilisables
sens
Vecteur
d’expression
Vecteur
d’expression
antisens
transfection
transfection
ARN
ARN
sens
ARNdb
antisens
sens
antisens
ARNdb
IV. 2. RNAi chez T.brucei
MAIS
Problème pour les gènes essentiels.
Système INDUCTIBLE :
Tet opérateur
Vecteur
d’expression
+ souche exprimant TetR
IV. 2. RNAi chez T.brucei
Système inductible
Répresseur
= TetR
ADN
Séquence d’intérêt
Opérateur Tet
ADN
Tet
ADN
Opérateur Tet
Séquence d’intérêt
ADN
ARN double brin
IV. 2. RNAi chez T.brucei
Vecteur utilisé
IV. 2. RNAi chez T.brucei
Souche utilisée : Tb427.29-13
T7RNAP
pLew13
NEO
+
TETR
pLew29
HYG
T7
exprime :
• le répresseur Tet sous contrôle du promoteur T7
• la T7 RNA polymérase
• les gènes de résistance à l’hygromycine et à la néomycine
IV. 2. RNAi chez T.brucei
Etapes du protocole
Transfection de T. brucei (électroporation)
Sélection des trypanosomes recombinants (Neo/Hyg)
Ajout de tétracycline  INDUCTION de l’ARNi
Observation du phénotype induit
(courbe de croissance, observation microscopique,…)
Vérification de l’inhibition de l’expression du gène
(Western blot, Northern blot, RT-PCR,…)
IV. 2. RNAi chez T.brucei
ARNi versus inactivation/remplacement d’un gène
Tet opérateur
+
Gène X
remplacement
1 étape
(1 gène de résistance)
3 étapes (3 gènes de résistance)
IV. 2. RNAi chez T.brucei
Inhibition de l’expression par ARNi
 ARNi non réalisable chez Leishmania
 ARNi réalisable chez T. brucei
IV. 3. RNAi chez T.brucei
Inhibition de l’expression par ARNi
 ARNi non réalisable chez Leishmania
 L. major et T. brucei très proches phylogénétiquement
cf. forte synténie
Leishmania
Chromosome 33
T. brucei
Chromosome 2
T. brucei
Chromosome 11
Rupture de synténie
 ARNi réalisable chez T. brucei
IV. 3. RNAi chez T.brucei
3. Exemple de l’étude des MCAKs
chez les trypanosomatidés
P. Dubessay, C. Blaineau, P. Bastien, L. Tasse, J. Van Dijk, L. Crobu, M. Pagès
Cell cycle-dependent expression regulation by the proteasome pathway
and characterization of the nuclear targeting signal of a Leishmania
major Kin-13 kinesin. Mol. Microbiol. 2006; 59: 1162–1174
Blaineau C, Tessier M, Dubessay P, Tasse L, Crobu L, Pagès M, Bastien P. A
novel microtubule-depolymerizing kinesin involved in length control of a
eukaryotic flagellum. Curr Biol. 2007;17(9):778-82.
IV. 3. RNAi chez T.brucei
Etude des MCAKs chez les trypanosomatidés
MCAKs = Mitotic Centromere-Associated Kinesins
Kinésines qui hydrolysent les microtubules (métaphase,
anaphase).
5/6 chez les Trypanosomatidés (1 chez l’homme!!)
IV. 3. RNAi chez T.brucei
3. Exemple de l’étude des MCAKs
chez les trypanosomatidés
P. Dubessay, C. Blaineau, P. Bastien, L. Tasse, J. Van Dijk, L. Crobu, M. Pagès
Cell cycle-dependent expression regulation by the proteasome pathway
and characterization of the nuclear targeting signal of a Leishmania
major Kin-13 kinesin. Mol. Microbiol. 2006; 59: 1162–1174
Blaineau C, Tessier M, Dubessay P, Tasse L, Crobu L, Pagès M, Bastien P. A
novel microtubule-depolymerizing kinesin involved in length control of a
eukaryotic flagellum. Curr Biol. 2007;17(9):778-82.
IV. 3. RNAi chez T.brucei
LmjF13.1610
Localisation intracellulaire chez Leishmania major:
13.1610-GFPn
DAPI
IV. 3. RNAi chez T.brucei
ARN interférence ciblant l’orthologue de LmjF13.1610 : Tb11.02.0790
3N1K
3N1K
7N2K
7N2K
4N2K
4N2K
6N1K
0N1K
0N1K
4N2K
6N1K
4N2K
4N1K
4N1K
IV. 3. RNAi chez T.brucei
ADN
PFR
5N1K
0N1K
IV. 3. RNAi chez T.brucei
PFR
ADN
IV. 3. RNAi chez T.brucei
3. Exemple de l’étude des MCAKs
chez les Trypanosomatidés
P. Dubessay, C. Blaineau, P. Bastien, L. Tasse, J. Van Dijk, L. Crobu, M. Pagès
Cell cycle-dependent expression regulation by the proteasome pathway
and characterization of the nuclear targeting signal of a Leishmania
major Kin-13 kinesin. Mol. Microbiol. 2006; 59: 1162–1174
Blaineau C, Tessier M, Dubessay P, Tasse L, Crobu L, Pagès M, Bastien P. A
novel microtubule-depolymerizing kinesin involved in length control of a
eukaryotic flagellum. Curr Biol. 2007;17(9):778-82.
IV. 3. RNAi chez T.brucei
 LmjF13.0130
Localisation intracellulaire chez Leishmania major:
GFP
13.0130-GFPc
K
N
K
N
nf
nf
Localisation préférentielle aux 2 extrémités du flagelle
IV. 3. RNAi chez T.brucei
Effet de la surexpression de LmjF13.0130 chez Leishmania major:
LmjF13.0130-GFPc
Induction d’un phénotype « flagelle court »
+ modification de la morphologie
IV. 3. RNAi chez T.brucei
ARN interférence ciblant l’orthologue de LmjF13.0130
chez T. brucei : Tb11.02.2260
30%
Non-induit
25%
Induit
20%
15%
10%
5%
0%
µm
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Longueur du flagelle
Augmentation de la longueur du flagelle.
IV. 3. RNAi chez T.brucei
4. Banque d’ARNi chez T. brucei
http://trypanofan.path.cam.ac.uk
Création d’une banque d’ARNi chez T. brucei
5. Points chauds
Choix de la séquence cible / Effets off-target:
20 nt ne devant pas se retrouver ailleurs dans le génome
Conclusion
 ARNi
= actuellement un outils puissants de génomique
fonctionnelle
 Facilités chez les protozoaires parasites :
TRES SPECIFIQUE, rapide et inductible:
• insertion de grands ARN double-brins
• très peu d’effets hors-cibles
CRISPR system discovery
CRISPR system discovery
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs):
small RNAs for adaptive defense and regulation in bacteria and archaea
: Nuclease
Adaptation
Protection
Genome editing in P. falciparum using the Cas/CRISPR system
• Genome manipulation is a key to unraveling malaria pathogenesis and drugresistance causality
• Novel tools for precise parasite-genome “surgery” are needed to overcome
existing shortcomings
• For example, P. falciparum gene knock out strategies are still very time
consuming (2-6 months)
Mehdi Ghorbal and Jose-Juan Lopez-Rubio
Scherf’s lab Institut Pasteur
Classical strategy to knockout genes in P. falciparum
yFCU
Homology Box A hDHFR
Homology Box B
Step1: selection for episomes
(drug selectable marker)
3-6 weeks
Genomic target
locus
Disrupted locus
Homology Box A
Gene of interest
Homology Box B
Step2: counter selection with
negative selectable marker to
select for integration
Homology Box A
hDHFR
Homology Box B
CRISPR system as genome editing tool: the basics
What do we need?
1) Cas protein
2) RNA expressed by pol III polymerase
3) DNA donor to be used as template to
repair the DSB provoked by Cas
CRISPR system as genome editing tool: the strategy
gene disruption
AERES evaluation March 2014
BIHP-CNRS URA2581 Institut Pasteur, Paris
CRISPR system as genome editing tool: the strategy
gene disruption
Transient expression
of sgRNA and Cas9
sgRNA:Cas9 provokes
a DSB at the target locus
AERES evaluation March 2014
BIHP-CNRS URA2581 Institut Pasteur, Paris
CRISPR system as genome editing tool: the strategy
gene disruption
Transient expression
of sgRNA and Cas9
DSB repaired using
provided donor DNA
Selection for WR-resistant
parasites
Easy and highly efficient
Two chromosomal loci between 8-21 days depending on the transfection method
Compared to classical methods 2-6 months even 18 months
CRISPR system as genome editing tool: the strategy
single nucleotide substitution marker free
Continuous expression
of sgRNA and Cas9
CRISPR system as genome editing tool: the strategy
single nucleotide substitution marker free
Continuous expression
of sgRNA and Cas9
Target locus is repetitively cleaved
and therefore lethal for the cell
unless…
CRISPR system as genome editing tool: the strategy
single nucleotide substitution marker free
Continuous expression
of sgRNA and Cas9
Desired mutation
Shield mutation
Target locus is repetitively cleaved
and therefore lethal for the cell
unless…
is repaired by HR using the provided donor DNA
carrying the mutation
CRISPR system as genome editing tool: the strategy
single nucleotide substitution marker free
Continuous expression
of sgRNA and Cas9
Desired mutation
Shield mutation (silent
modification that abolishes
locus recognition by Cas9
Target locus is repetitively cleaved
and therefore lethal for the cell
unless…
is repaired by HR using the provided donor DNA
carrying the mutation
CRISPR system as genome editing tool: the strategy
single nucleotide substitution marker free
Once parasites
appear carrying the
modified locus,
drug selection to
keep the plasmids
is not necessary
The recovered parasites underwent locus modification
without integration of drug selectable marker
MIVEGEC UMR2724 IRD/CNRS/UM1
Equipe MebFEA
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie
Patrick Bastien
Michel Pagès
Gilles Merlin
Laurence Lachaud
Yvon Sterkers
Yves Balard
Lucien Crobu
Michèle Lefebvre
Diane-Ethna Mbang-Benet
Nada Kuk
Jose-Juan Lopez-Rubio
Mehdi Ghorbal
Christelle Morelle
Lauriane Sollélis
Dimple Rananaware
Rachel Jendrowiak
D’après Olivia Mercier Touzet
Jose-Juan Lopez-Rubio