ARN interférence - RNAi – dans des modèles mammifères et ancestraux Yvon Sterkers MIVEGEC UMR2724 IRD/CNRS/UM1 Laboratoire de Parasitologie-Mycologie MONTPELLIER L’ARN interférence I. Historique II. Mécanisme de l’ARNi III.L’ARNi in vivo IV.L’ARNi in vitro : outil de génétique inverse I. Historique Napoli, C., Lemieux, C. and Jorgensen, R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. The Plant Cell 2:279-289. introduit le gène codant la chalcone synthase, chez le Petunia => transgène ET gène endogène ne s’expriment pas + diminution du niveau d’expression de l’ARNm correspondant = co-suppression = Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) I. Historique Fire, A., et al. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391:806-11. C. elegans : introduction d’un ARNdb => inactivation de la synthèse de la protéine codée par l ’ARN homologue = Gene silencing introduction brin ARNsens ou antisens : peu/pas d’effet introduction fragments d’ARNdb correspondant à des introns ou à des séquences promotrices => Pas de ‘gene silencing’ détectable introduction de seulement quelques molécules d’ARNdb sont suffisantes => Phénomène d’amplification I. Historique Zamore, P. D., et al. (2000) RNAi : double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101:25-33. grands ARNdb fragmentés en ARN de 21 à 23 nts, dans des lysats embryonnaires de Drosophile + ces fragments guident le clivage de l’ARNm M. Elbashir, S. et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411:494-8. Introduction de petits ARNdb de 21 nts (=siRNA) de séquence homologue à celle d’un ARN endogène dégradation spécifique de l’ARNm, dans différentes lignées cellulaires de Mammifères. I. Historique Depuis 2001 : augmentation exponentielle du nombre de publications sur l’ARNi o 1ère définition : ARN interférence = Inhibition séquence-spécifique de l’expression d’un gène par dégradation de l’ARNm correspondant, par appariement entre des petits ARN double-brins dits siRNA et cet ARNm. o puis élargissement de la notion d’ARNi suite à la découverte d’autres familles de molécules d’ARNdb → inhibition/blocage de la traduction (miRNA) → modification des histones et induction de l’hétérochromatine (inhibition de la transcription) I. Historique II. Mécanisme de l’ARNi (siRNA) 1ère étape : Clivage des ARNdb de longues tailles en siRNA (21-23 nt) par l’endonucléase Dicer Recyclage des complexes siRISC II. Mécanisme de l’ARNi 2ème étape : Assemblage du brin guide (brin antisens) avec le complexe RISC RNA-induced silencing complex qui contient: - une protéine de reconnaissance à activité RNase = Argonaute (Ago) - une hélicase complexe siRISC II. Mécanisme de l’ARNi 3ème étape : Le brin guide est utilisé comme matrice pour cibler ARNm complémentaires + clivage des ARNm cibles par Ago Recyclage des complexes siRISC II. Mécanisme de l’ARNi III. L’ARNi in vivo 1. Rôles physiologiques de l’ARN interférence : Protection contre les virus à ARNdb Prévention de la propagation des éléments transposables Régulation de l’expression des gènes III.1. Rôles physiologiques 2. Organismes réalisant l’ARNi Comment identifier les organismes réalisant l’ARNi ? 1. Analyse bio-informatique Étude génomique, BLAST 2. Approche fonctionnelle inhibition de transcrits endogènes avec grands ARNdb ou siARNs ? recherche de siARNs III.2. Organismes réalisant l’ARNi PROTOZOAIRES : Amibe : Entamoeba histolytica E. histolytica Flagellés Trypanosomatidés : Trypanosma brucei T. brucei Ne fonctionne pas chez : T. cruzi (Flagellé ; Trypanosomatidé) : Dicer, X X Argonaute Leishmania (Flagellé ; Trypanosomatidé) : Dicer, X Argonaute X Toxoplasma (Apicomplexe) Plasmodium (Apicomplexe) Giardia lamblia III.2. Organismes réalisant l’ARNi METAZOAIRES : Parasites : Schistosoma spp. Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonicum Champignons : Sch. pombe, S. cerevisiae, Sac. castellii, Neurospora crassa, C. albicans,… X Candid albicans Neurospora crassa III.1. Organismes réalisant l’ARNi IV. L’ARNi in vitro : outil de génétique inverse 1. Introduction des ARNdb Nourrir les nématodes avec des bactéries produisant l’ARN double-brin C. elegans Injecter l’ARN double-brin dans une cellule Tremper le nématode dans une solution contenant l’ARN double-brin IV. Outil de génétique inverse Injecter l’ARN double-brin dans un embryon/adulte D. melanogaster Transfecter avec un vecteur exprimant l’ARN double-brin (lignées cellulaires) Souches transgéniques exprimant un gène en orientation sens et anti-sens IV. Outil de génétique inverse Plantes Transfecter avec un vecteur exprimant l’ARN double-brin : sur une feuille ou sur des cellules germinales Mammifères Transfecter avec des siRNA (lignées cellulaires) Transfecter avec un vecteur d’expression possédant un promoteur ARNpolIII (shRNA) grands ARNdb chez Mammifères => interféron IV. Outil de génétique inverse 2. Exemple pratique: Protocole d’ARNi chez un protozoaire parasite : T. brucei IV. 2. RNAi chez T.brucei Trypanosoma brucei Responsable de la maladie du sommeil, chez l’homme = Trypanosomose humaine africaine 500 000 cas répertoriés ; 70 000 morts/an en Afrique • Parasitoses transmises par la mouche tsé-tsé = glossine IV. 2. RNAi chez T.brucei Cycle de vie de Trypanosoma brucei Etapes chez la mouche Tsé-tsé Dans les glandes salivaires : Multiplication de la forme épimastigote Transformation en forme métacyclique Etapes chez les mammifères La mouche Tsé-tsé prend un repas sanguin Transformation de la forme métacyclique en forme sanguine longue et mince (trypomastigote métacyclique) (slender) Le parasite quitte l’intestin Le parasite se multiplie dans les fluides corporels (épimastigote) La mouche Tsé-tsé prend un repas sanguin Dans l’intestin: Transformation de la forme sanguine en forme procyclique (multiplication) (trypomastigote procyclique) Transformation en forme sanguine courte et trapue (stumpy) TDR Website Forme procyclique (insecte) Forme sanguine (mammifère) IV. 2. RNAi chez T.brucei Introduction des ARNdb? IV. Outil de génétique inverse Introduction des ARNdb Transfecter avec un vecteur exprimant l’ARN double-brin T. brucei Transfecter avec un vecteur exprimant un gène en orientation sens et anti-sens IV. Outil de génétique inverse Types de vecteurs utilisables sens Vecteur d’expression Vecteur d’expression antisens transfection transfection ARN ARN sens ARNdb antisens sens antisens ARNdb IV. 2. RNAi chez T.brucei MAIS Problème pour les gènes essentiels. Système INDUCTIBLE : Tet opérateur Vecteur d’expression + souche exprimant TetR IV. 2. RNAi chez T.brucei Système inductible Répresseur = TetR ADN Séquence d’intérêt Opérateur Tet ADN Tet ADN Opérateur Tet Séquence d’intérêt ADN ARN double brin IV. 2. RNAi chez T.brucei Vecteur utilisé IV. 2. RNAi chez T.brucei Souche utilisée : Tb427.29-13 T7RNAP pLew13 NEO + TETR pLew29 HYG T7 exprime : • le répresseur Tet sous contrôle du promoteur T7 • la T7 RNA polymérase • les gènes de résistance à l’hygromycine et à la néomycine IV. 2. RNAi chez T.brucei Etapes du protocole Transfection de T. brucei (électroporation) Sélection des trypanosomes recombinants (Neo/Hyg) Ajout de tétracycline INDUCTION de l’ARNi Observation du phénotype induit (courbe de croissance, observation microscopique,…) Vérification de l’inhibition de l’expression du gène (Western blot, Northern blot, RT-PCR,…) IV. 2. RNAi chez T.brucei ARNi versus inactivation/remplacement d’un gène Tet opérateur + Gène X remplacement 1 étape (1 gène de résistance) 3 étapes (3 gènes de résistance) IV. 2. RNAi chez T.brucei Inhibition de l’expression par ARNi ARNi non réalisable chez Leishmania ARNi réalisable chez T. brucei IV. 3. RNAi chez T.brucei Inhibition de l’expression par ARNi ARNi non réalisable chez Leishmania L. major et T. brucei très proches phylogénétiquement cf. forte synténie Leishmania Chromosome 33 T. brucei Chromosome 2 T. brucei Chromosome 11 Rupture de synténie ARNi réalisable chez T. brucei IV. 3. RNAi chez T.brucei 3. Exemple de l’étude des MCAKs chez les trypanosomatidés P. Dubessay, C. Blaineau, P. Bastien, L. Tasse, J. Van Dijk, L. Crobu, M. Pagès Cell cycle-dependent expression regulation by the proteasome pathway and characterization of the nuclear targeting signal of a Leishmania major Kin-13 kinesin. Mol. Microbiol. 2006; 59: 1162–1174 Blaineau C, Tessier M, Dubessay P, Tasse L, Crobu L, Pagès M, Bastien P. A novel microtubule-depolymerizing kinesin involved in length control of a eukaryotic flagellum. Curr Biol. 2007;17(9):778-82. IV. 3. RNAi chez T.brucei Etude des MCAKs chez les trypanosomatidés MCAKs = Mitotic Centromere-Associated Kinesins Kinésines qui hydrolysent les microtubules (métaphase, anaphase). 5/6 chez les Trypanosomatidés (1 chez l’homme!!) IV. 3. RNAi chez T.brucei 3. Exemple de l’étude des MCAKs chez les trypanosomatidés P. Dubessay, C. Blaineau, P. Bastien, L. Tasse, J. Van Dijk, L. Crobu, M. Pagès Cell cycle-dependent expression regulation by the proteasome pathway and characterization of the nuclear targeting signal of a Leishmania major Kin-13 kinesin. Mol. Microbiol. 2006; 59: 1162–1174 Blaineau C, Tessier M, Dubessay P, Tasse L, Crobu L, Pagès M, Bastien P. A novel microtubule-depolymerizing kinesin involved in length control of a eukaryotic flagellum. Curr Biol. 2007;17(9):778-82. IV. 3. RNAi chez T.brucei LmjF13.1610 Localisation intracellulaire chez Leishmania major: 13.1610-GFPn DAPI IV. 3. RNAi chez T.brucei ARN interférence ciblant l’orthologue de LmjF13.1610 : Tb11.02.0790 3N1K 3N1K 7N2K 7N2K 4N2K 4N2K 6N1K 0N1K 0N1K 4N2K 6N1K 4N2K 4N1K 4N1K IV. 3. RNAi chez T.brucei ADN PFR 5N1K 0N1K IV. 3. RNAi chez T.brucei PFR ADN IV. 3. RNAi chez T.brucei 3. Exemple de l’étude des MCAKs chez les Trypanosomatidés P. Dubessay, C. Blaineau, P. Bastien, L. Tasse, J. Van Dijk, L. Crobu, M. Pagès Cell cycle-dependent expression regulation by the proteasome pathway and characterization of the nuclear targeting signal of a Leishmania major Kin-13 kinesin. Mol. Microbiol. 2006; 59: 1162–1174 Blaineau C, Tessier M, Dubessay P, Tasse L, Crobu L, Pagès M, Bastien P. A novel microtubule-depolymerizing kinesin involved in length control of a eukaryotic flagellum. Curr Biol. 2007;17(9):778-82. IV. 3. RNAi chez T.brucei LmjF13.0130 Localisation intracellulaire chez Leishmania major: GFP 13.0130-GFPc K N K N nf nf Localisation préférentielle aux 2 extrémités du flagelle IV. 3. RNAi chez T.brucei Effet de la surexpression de LmjF13.0130 chez Leishmania major: LmjF13.0130-GFPc Induction d’un phénotype « flagelle court » + modification de la morphologie IV. 3. RNAi chez T.brucei ARN interférence ciblant l’orthologue de LmjF13.0130 chez T. brucei : Tb11.02.2260 30% Non-induit 25% Induit 20% 15% 10% 5% 0% µm 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Longueur du flagelle Augmentation de la longueur du flagelle. IV. 3. RNAi chez T.brucei 4. Banque d’ARNi chez T. brucei http://trypanofan.path.cam.ac.uk Création d’une banque d’ARNi chez T. brucei 5. Points chauds Choix de la séquence cible / Effets off-target: 20 nt ne devant pas se retrouver ailleurs dans le génome Conclusion ARNi = actuellement un outils puissants de génomique fonctionnelle Facilités chez les protozoaires parasites : TRES SPECIFIQUE, rapide et inductible: • insertion de grands ARN double-brins • très peu d’effets hors-cibles CRISPR system discovery CRISPR system discovery Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): small RNAs for adaptive defense and regulation in bacteria and archaea : Nuclease Adaptation Protection Genome editing in P. falciparum using the Cas/CRISPR system • Genome manipulation is a key to unraveling malaria pathogenesis and drugresistance causality • Novel tools for precise parasite-genome “surgery” are needed to overcome existing shortcomings • For example, P. falciparum gene knock out strategies are still very time consuming (2-6 months) Mehdi Ghorbal and Jose-Juan Lopez-Rubio Scherf’s lab Institut Pasteur Classical strategy to knockout genes in P. falciparum yFCU Homology Box A hDHFR Homology Box B Step1: selection for episomes (drug selectable marker) 3-6 weeks Genomic target locus Disrupted locus Homology Box A Gene of interest Homology Box B Step2: counter selection with negative selectable marker to select for integration Homology Box A hDHFR Homology Box B CRISPR system as genome editing tool: the basics What do we need? 1) Cas protein 2) RNA expressed by pol III polymerase 3) DNA donor to be used as template to repair the DSB provoked by Cas CRISPR system as genome editing tool: the strategy gene disruption AERES evaluation March 2014 BIHP-CNRS URA2581 Institut Pasteur, Paris CRISPR system as genome editing tool: the strategy gene disruption Transient expression of sgRNA and Cas9 sgRNA:Cas9 provokes a DSB at the target locus AERES evaluation March 2014 BIHP-CNRS URA2581 Institut Pasteur, Paris CRISPR system as genome editing tool: the strategy gene disruption Transient expression of sgRNA and Cas9 DSB repaired using provided donor DNA Selection for WR-resistant parasites Easy and highly efficient Two chromosomal loci between 8-21 days depending on the transfection method Compared to classical methods 2-6 months even 18 months CRISPR system as genome editing tool: the strategy single nucleotide substitution marker free Continuous expression of sgRNA and Cas9 CRISPR system as genome editing tool: the strategy single nucleotide substitution marker free Continuous expression of sgRNA and Cas9 Target locus is repetitively cleaved and therefore lethal for the cell unless… CRISPR system as genome editing tool: the strategy single nucleotide substitution marker free Continuous expression of sgRNA and Cas9 Desired mutation Shield mutation Target locus is repetitively cleaved and therefore lethal for the cell unless… is repaired by HR using the provided donor DNA carrying the mutation CRISPR system as genome editing tool: the strategy single nucleotide substitution marker free Continuous expression of sgRNA and Cas9 Desired mutation Shield mutation (silent modification that abolishes locus recognition by Cas9 Target locus is repetitively cleaved and therefore lethal for the cell unless… is repaired by HR using the provided donor DNA carrying the mutation CRISPR system as genome editing tool: the strategy single nucleotide substitution marker free Once parasites appear carrying the modified locus, drug selection to keep the plasmids is not necessary The recovered parasites underwent locus modification without integration of drug selectable marker MIVEGEC UMR2724 IRD/CNRS/UM1 Equipe MebFEA Laboratoire de Parasitologie-Mycologie Patrick Bastien Michel Pagès Gilles Merlin Laurence Lachaud Yvon Sterkers Yves Balard Lucien Crobu Michèle Lefebvre Diane-Ethna Mbang-Benet Nada Kuk Jose-Juan Lopez-Rubio Mehdi Ghorbal Christelle Morelle Lauriane Sollélis Dimple Rananaware Rachel Jendrowiak D’après Olivia Mercier Touzet Jose-Juan Lopez-Rubio
© Copyright 2024 Paperzz