gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
gpt delta ラットを用いた遺伝毒性評価系に関する研究
昭和大学大学院
薬学研究科
川村
臨床毒性学専攻
祐司
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
目次
1. 略語 ............................................................................................................................ 4
2. 要約 ............................................................................................................................ 5
3. 序論 ............................................................................................................................ 7
4. Aristolochic acid の 4 週間反復経口投与における遺伝毒性評価 ............................. 15
4.1 序 ......................................................................................................................................................15
4.2 材料と方法 ......................................................................................................................................15
4.2.1 動物と飼育方法 ......................................................................................................................... 15
4.2.2 被験物質 ..................................................................................................................................... 16
4.2.3 投与と試験方法 ......................................................................................................................... 16
4.2.4 検査項目と採材 ......................................................................................................................... 17
4.2.5 変異頻度の測定 ......................................................................................................................... 19
4.2.6 統計 ............................................................................................................................................. 19
4.3 結果 ..................................................................................................................................................20
4.3.1 Aristolochic acid の腎臓及び肝臓における gpt アッセイ ....................................................... 20
4.3.2 Aristolochic acid の一般毒性評価 .............................................................................................. 20
4.4 考察 ..................................................................................................................................................25
5. Tamoxifen の 3 週間反復経口投与及び 13 週間混餌投与における遺伝毒性評価...... 27
5.1 序 ......................................................................................................................................................27
5.2 材料と方法 ......................................................................................................................................27
5.2.1 動物と飼育方法 ......................................................................................................................... 27
5.2.2 被験物質 ..................................................................................................................................... 28
5.2.3 投与と試験方法 ......................................................................................................................... 28
5.2.4 検査項目と採材 ......................................................................................................................... 28
5.2.5 変異頻度の測定 ......................................................................................................................... 29
5.2.6 統計 ............................................................................................................................................. 30
5.3 結果 ..................................................................................................................................................31
5.3.1 Tamoxifen の肝臓における gpt アッセイ及び Spi－アッセイ ............................................... 31
5.3.2 Tamoxifen の腎臓における gpt アッセイ及び Spi－アッセイ ............................................... 31
5.3.3 Toremifene の肝臓における gpt アッセイ及び Spi－アッセイ ............................................... 31
5.3.4 Toremifene の腎臓における gpt アッセイ及び Spi－アッセイ ............................................... 31
5.3.5 Spi－変異体のスペクトル解析 .................................................................................................. 32
5.3.6 Tamoxifen の一般毒性評価........................................................................................................ 32
5.4 考察 ..................................................................................................................................................40
6. Phenacetin の 26 週間及び 52 週間混餌投与における遺伝毒性評価 ........................ 43
6.1 序 ......................................................................................................................................................43
6.2 材料と方法 ......................................................................................................................................43
6.2.1 動物と飼育方法 ......................................................................................................................... 43
6.2.2 被験物質 ..................................................................................................................................... 43
6.2.3 投与と試験方法 ......................................................................................................................... 43
6.2.4 検査項目と採材 ......................................................................................................................... 44
6.2.5 変異頻度の測定 ......................................................................................................................... 44
6.2.6 統計 ............................................................................................................................................. 45
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6.3 結果 ..................................................................................................................................................46
6.3.1 Phenacetin の腎臓における gpt 及び Spi－の変異頻度 ........................................................... 46
6.3.2 Phenacetin の肝臓における gpt 及び Spi－の変異頻度 ........................................................... 46
6.3.3 gpt 変異体のスペクトル解析 ................................................................................................... 46
6.3.4 Phenacetin の一般毒性評価........................................................................................................ 46
6.4 考察 ..................................................................................................................................................54
7. 総括 .......................................................................................................................... 58
8. 付表 .......................................................................................................................... 61
9. 参考文献 ................................................................................................................... 64
10. 発表論文 ................................................................................................................. 70
11. 謝辞......................................................................................................................... 71
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1. 略語
AUC :
Area under the blood concentration-time curve
ALB :
Albumin
ALT :
Alanine aminotransferase
APNH : Aminophenylnorharman
AST :
Aspartate aminotransferase
CEDR : Center for Drug Evaluation and Research
Cm :
Chloramphenicol
CPK :
Creatine phosphokinase
CYP :
Cytochrome P-450
DNA :
Deoxyribonucleic acid
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid
ENU :
N-Ethyl-N-nitrosourea
gpt :
guanine phosphoribosyltransferase
HCT :
Hematocrit
HE :
Hematoxylin･eosin
HGB :
Hemoglobin
ICH :
International Conference on Harmonisation
MF :
Mutation frequency
NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
OECD : Organisation for Economic Co-operation and Development
PAPS : 3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate
PhIP :
2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine
PCR :
Polymerase chain reaction
RBC :
Red blood cell
SD :
Sprague-Dawley
Spi－:
Sensitive to P2 Interference
S9 :
Supernatant fraction at 9,000×g
T-CHO : Total cholesterol
TG :
Triglyceride
TGR :
Transgenic rodent
TP :
Total protein
UDS :
Unscheduled DNA synthesis
X-gal :
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D- galactopyranoside
6TG :
6-Thioguanine
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2. 要約
遺伝子改変げっ歯類（TGR）を用いた突然変異試験は、癌原性の標的臓器における化合物の評価が
行える。導入遺伝子における突然変異は、遺伝学的に安定で生理的な機能を持たず、投与期間の延長
に応じて蓄積するため、本試験系は特に反復投与での評価に適していると考えられるが、反復投与を
用いた本試験系の報告はほとんどない。そこで腎臓を癌原性の標的とする aristolochic acid 及び
phenacetin、
肝臓を標的とする tamoxifen、
並びに tamoxifen の構造類似体で癌原性を示さない toremifene
について、癌原性試験と同様な用量域で TGR である gpt delta ラットに反復投与した後、遺伝毒性評
価を行い、本試験系が医薬品の評価に活用できるか検証した。
1) Aristolochic acid の評価は経済協力開発機構（OECD）標準プロトコール（28+3 プロトコール）
に従い、F344 系 gpt delta 雄性ラットに 0.3 及び 1 mg/kg の用量で 4 週間反復経口投与し、その 3
日後に腎臓及び肝臓における MF（変異頻度）を測定した。その結果、aristolochic acid は腎臓、
肝臓の両方で用量に応じた gpt （突然変異）MF を増加させた。Aristolochic acid は両臓器で遺伝
毒性を誘発することが示され、OECD 標準プロトコールは十分な検出力を有すると考えられた。
2) Tamoxifen を F344 系 gpt delta 雌性ラットに 20 及び 40 mg/kg の用量で 3 週間反復経口投与し、並
びに 250 ppm（15.4-17.6 mg/kg）及び 500 ppm（30.0-32.9 mg/kg）の混合飼料を 13 週間投与し、
肝臓及び腎臓の MF を測定した。また toremifene は 40 mg/kg の用量で 3 週間反復経口投与した。
その結果、tamoxifen は肝臓で用量に応じて gpt 及び Spi－（欠失）の MF を増加させた。MF 増加
の程度は 13 週混餌投与の方が 3 週反復投与より高く、投与期間の延長による変異の蓄積が確認
された。Tamoxifen は腎臓では MF を増加させず、また toremifene 投与群では両臓器で MF の増
加がみられなかった。Tamoxifen は癌原性の標的臓器に対し特異的に遺伝毒性を誘発することが
示され、反復投与を用いた本試験系は十分な検出力を有すると考えられた。さらに 2 年間癌原性
試験のための 13 週間用量設定試験に、gpt delta ラットを組み込んで実施することで遺伝毒性も
同時に評価できると考えられた。
3) Phenacetin では、SD 系 gpt delta 雌雄ラットに 0.5%の混合飼料を 26 週間及び 52 週間投与し、腎
臓及び肝臓の MF を測定した。その結果、52 週群の雄の腎臓で gpt MF の増加がみられた。一方、
非標的臓器である肝臓においても、26 週及び 52 週群の雌雄で gpt MF の増加、及び 52 週群の雌
雄で Spi－MF の増加がみられた。52 週群の MF は 26 週より高く、投与期間の延長による変異の
蓄積が確認された。Phenacetin は腎臓で弱く、肝臓で強い遺伝毒性を有することが示され、
Phenacetin の遺伝毒性の癌原性誘発機序への寄与は大きくないと考えられた。長期投与による本
試験系は、標的臓器における癌原性と遺伝毒性の関連性の解明に有用であると考えられた。
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以上、aristolochic acid、tamoxifen 及び phenacetin の遺伝毒性を、癌原性試験と同様な用量域で検
出できたことから、TGR 突然変異試験は十分な検出力を有すると考えられた。また、tamoxifen 及び
phenacetin の評価では、反復投与期間の延長により変異が蓄積し検出力が向上したことから、反復投
与で実施することの有用性が確認され、反復投与期間は化合物の特徴に応じて柔軟に設定できること
が示された。本試験系から得られる結果は、化合物投与により誘発される癌原性と遺伝毒性の臓器ご
との関連の検討に有用であると考えられ、gpt delta ラットを用いた TGR 突然変異試験は医薬品の遺
伝毒性評価に十分に活用できると考えられた。
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3. 序論
医薬品の安全性研究では、毒性試験関連のガイドラインに準拠しながら科学的に妥当な試験系を
確立した上で、医薬候補化合物の安全性を適切に評価する必要がある。遺伝毒性試験は、創薬後半か
ら開発初期にかけて実施され、その結果は医薬候補化合物の開発を進める上で重要なデータの一つで
ある。1995 年に発行された医薬品の遺伝毒性試験の標準的組合せに関するガイダンスでは、細菌を
用いる復帰突然変異試験、in vitro ほ乳類培養細胞を用いる染色体異常試験（またはマウスリンフォー
マ Tk 試験）及び in vivo げっ歯類の造血細胞での小核試験の計 3 試験が標準的なパッケージ試験と
して制定された（ICH, 1995）。しかし、上記のガイダンスは、制定から 10 年以上経ち、多くの知見
が蓄積したことにより課題が顕在化し、また新技術も開発されたことから、2011 年に医薬品の遺伝
毒性試験及び解釈に関する S2(R1) ガイダンスとして改訂された（ICH, 2011）。改訂の主な目的は、
高い偽陽性率を示す in vitro ほ乳類培養細胞を用いる試験（Kirkland et al., 2005）への対応と動物愛護
の推進である。S2(R1) ガイダンスでは、遺伝毒性試験の標準的組合せについて２つのオプションを
提示された（Fig. 1）。オプション１では、旧ガイダンスと同様に上記の 3 試験が選択できる（なお、
in vitro ほ乳類培養細胞を用いる試験として in vitro 小核試験も選択可能となった）。一方、オプショ
ン 2 では、高い偽陽性率を示す in vitro ほ乳類培養細胞を用いる試験（Kirkland et al., 2005）を実施す
る代わりに、in vivo 小核試験の評価に加え、第 2 の in vivo 試験を選択できる。通常、in vitro ほ乳類
培養細胞試験の結果が陽性でも、十分な薬物曝露量が得られ、かつ適切な組織で実施された 2 種の
in vivo 試験の結果が陰性の場合は、in vivo では遺伝毒性を示さないと結論される。したがって、初
めから 2 種の in vivo 試験を実施するオプション 2 は、in vitro の陽性結果の追加検討と同等の結果
を得ることができる。また、条件が揃えば in vivo 遺伝毒性評価を反復投与毒性試験に組込むことが
でき、この場合は単独での in vivo 遺伝毒性試験が不要となり、動物愛護の観点を配慮した動物数の
削減につながる。このような背景から in vivo 試験系の重要性がより高まっており、適切な in vivo 試
験系の選択は、製薬企業の安全性研究者にとって重要な研究課題である。理想的な in vivo 試験系と
は、生体で化合物の遺伝毒性を適切に評価でき、かつ反復投与毒性の評価も同時に行え、さらにその
後の癌原性リスクを考察できる試験系と考える。
第 2 の in vivo 試験としては、単細胞ゲル電気泳動（コメット）試験及びアルカリ溶出試験、in vivo
トランスジェニックげっ歯類（TGR）突然変異試験、DNA 共有結合試験又は肝細胞を用いる UDS 試
験が利用可能である（ICH, 2011）。コメット試験及びアルカリ溶出試験は DNA 鎖の切断を検出し、
また UDS 試験は DNA 損傷作用を検出する、いわゆるインディケーター試験であり、迅速かつ簡便
に結果が得られる特徴を有する。一方、TGR 突然変異試験は、全身の細胞にレポーター遺伝子を持
つ動物に被験物質を投与した後、各臓器から抽出したレポーター遺伝子に発現する突然変異を検出す
る（Lambert et al., 2005）。この試験系の特徴は、生体の全臓器における突然変異を観察できること
であり、癌原性の標的臓器における変異の有無を観察することによって、遺伝毒性と癌原性の関連に
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ついて知見を得ることができる。また、TGR 突然変異試験は、被験物質の投与後に一定の時間を経
て固定された変異を検出するため組織傷害の影響を受けにくい特徴を有し、さらに反復投与により変
異が蓄積するため投与日数や評価ポイントには制約が少なく、反復投与での遺伝毒性評価に最も適し
ている試験系と考えられる。第 2 の in vivo 試験を選択する際には、各試験の特徴を考慮し被験物質
の開発ステージや試験目的に合わせて case by case で選択することが望まれるが、TGR 突然変異試験
はその有力候補の一つである。
しかし、S2(R1) ガイダンスには、TGR 突然変異試験の具体的なプロトコール（投与期間、投与用
量及び使用動物数等の試験条件）について記載がない。TGR 突然変異試験では、検出感度の確認及
び投与期間の設定について課題があり、医薬品の評価に汎用されるためにはプロトコールの最適化及
び標準化が必要である。すなわち TGR 突然変異試験は、90 種類の癌原性物質に対し高い陽性検出力
を示したとの報告（Lambert et al., 2005）があるなど、強い遺伝毒性を有する物質のデータは豊富に
あり、十分な検出力を有することが示されている。しかし、比較的弱い遺伝毒性物質については限ら
れた報告に留まっており、検出感度に関する評価は十分ではない。また非癌原性物質のデータも少な
く、癌原性との一致性に関しての情報も不足している。さらに、約 70%の TGR 突然変異試験は、単
回投与や最大 5 日間の短期間の投与で実施されており（Lambert et al., 2005）、反復投与でのデータ
も不足している。なお、投与期間については、OECD 試験ガイドライン 488「トランスジェニックげっ
歯類の体細胞および生殖細胞を用いた遺伝子突然変異試験」が制定され（OECD, 2011）、標準的な
投与期間として 4 週間投与後 3 日目剖検・採材が推奨されているが、実際にこの標準プロトコール
（28+3 プロトコール）で実施された報告はほとんどない。OECD 標準プロトコールの概略を Table 1
に示した。また、癌原性試験では 2 年間の本試験に先立ち、用量設定のための 13 週間投与による予
備試験が行われることが一般的である。癌原性用量設定試験に、TGR を群構成の一部に組込みこと
で、癌原性試験と近い投与条件における遺伝毒性評価が可能となる。これに関しては制限事項が比較
的少なく、TGR を用いた癌原性用量設定試験の実施は十分可能と考えられる。さらに、癌原性と遺
伝毒性の関連を調べるためには、癌原性試験と同様の用量を用いた長期投与での遺伝毒性評価が有用
と考えるが、13 週間を超える様な長期投与で遺伝毒性評価を行った報告はほとんどない。TGR 突然
変異試験は長期投与における評価も可能であると考えられ、それにより癌原性の標的臓器における遺
伝毒性と癌原性の因果関係をより直接的に明らかにできることが期待される。以上の点を踏まえ、本
研究においては、反復投与を用いて比較的弱い遺伝毒性物質の評価を行い、TGR 突然変異試験の検
出感度を確認し、医薬品の評価に活用できるか検証することとした。
TGR として、MutaTM マウス（Myhr, 1991）、Big BlueR マウス及びラット(Dycaico et al., 1994)、gpt delta
マウス（Nohmi et al., 1996）及び gpt delta ラット（Hayashi et al., 2003）が使用可能である。本研究で
は、医薬品の一般毒性試験への組み込みを考慮し、マウスではなくラットを選択することとした。
F344 系 Big BlueR ラットは、β-galactosidase をコードする lacZ 遺伝子の抑制遺伝子である lac I を導
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入した動物である。変異体（lac I－）の検出は、λファージにパッケージングした評価臓器の DNA
を大腸菌に感染させた後、X-Gal プレートを用いて青色に発色する変異体プラークを計数する。この
色調で変異体を見分ける手法は煩雑なため、λファージのプラーク形成に関与する遺伝子の cII を用
いて突然変異体をポジティブセレクションで検出する簡略法も開発されている（Jakubczak et al.,
1996）。しかし、lacZ のコード領域が約 3 000 塩基もあるため変異部位の同定は容易ではなく、また
欠失変異を検出しにくい特徴を有する。
この欠点を改良するために、著者の所属する研究室（Meiji Seika ファルマ株式会社 医薬研究所
安全性研究室）において、gpt delta ラットが開発された（Hayashi et al., 2003）。gpt delta ラットによ
る突然変異試験法の概要をFig. 2に示した。gpt delta ラットには大腸菌 gpt 遺伝子及びλファージの
red/gam 遺伝子をレポーターとしたλEG10 ファージベクターが、4 番染色体に 5～10 コピー挿入され
ている。λEG10 の遺伝子構成をFig. 3に示した。化合物の投与後に各臓器から DNA を抽出し、in vitro
パッケージング法によりλEG10 ファージを回収し、これを大腸菌に感染させ、レポーター遺伝子に
発現した変異を検索する。gpt delta ラットは、2 種類のポジティブセレクション法を用いて、突然変
異と欠失変異を選択的に検出する特徴を有する。すなわち、突然変異（塩基置換とフレームシフト）
は、大腸菌 gpt 遺伝子をレポーターに用いた gpt アッセイにより検出する。培地に添加された
6-thioguanine（6TG）は gpt 遺伝子がコードする guanine phosphoribosyltransferase によって DNA に取
り込まれることで毒性を発現するため、gpt が不活化した変異体のみが寒天培地にコロニーを作る。
λEG10 ファージベクターには gpt と chloramphenicol（Cm）耐性遺伝子を含むプラスミド DNA が組
み込まれており、回収したλEG10 ファージを Cre 組換え酵素を発現する宿主大腸菌に感染させると、
lox 配列に挟まれた領域が切り出されてマルチコピーのプラスミドとして保持される。6TG と Cm を
含む寒天培地で生育する gpt 変異体コロニーの数を、Cm のみを含む寒天培地で生育した形質転換コ
ロニーの総数で除して突然変異頻度（MF）を算出する。gpt 遺伝子は 456 bps であり、シークエンス
解析は容易である。また、欠失変異は、λファージの red/gam 遺伝子をレポーターに用いた Spi－アッ
セイにより検出する。Spi とは sensitive to P2 interference の略であり、λファージが P2 ファージ溶原
菌に対して溶菌プラークを作れないこと（Spi+）に対して、red と gam 両遺伝子が不活化した変異
ファージは P2 ファージ溶原菌にも溶菌プラークを作る（Spi－）という性質を利用して、Spi－変異体
プラークを検出する。非溶原菌に感染させると全てのファージがプラークを作るので、これと比較し
て Spi－変異頻度を算出する。2 つの遺伝子のそれぞれに独立して突然変異が起こる確率は低いため、
2 つの遺伝子が同時に不活化することは、両遺伝子を含む領域に欠失変異が起こったことを意味する。
red と gam は隣接しており連続して転写、翻訳されるため、上流側の gam 遺伝子内のフレームシフト
変異は red の正常な翻訳を妨げ、Spi－変異として検出される（Nohmi et al., 1999）。Spi－アッセイで
検出可能な欠失サイズは 1 bp～約 10 kbs である。さらに gpt delta ラットは、本邦のブリーダーで生
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産されているため入手が容易であり、F344 系（Toyoda-Hokaiwado, 2010）、SD 系（Hayashi et al., 2003）
の両系統を使用できるため、本研究では gpt delta ラットを選択することとした。
被験物質の選定にあたっては、ラットでの癌原性が公知であり、比較的軽度な遺伝毒性を有する
aristolochic acid（Arlt et al., 2002; Mengs et al., 1982）、tamoxifen（Phillips, 2001）及び phenacetin（Flora,
1985; Isaka et al., 1979）を選択した。加えて、ラットで癌原性を示さない tamoxifen の構造類似体であ
る toremifene（Kangas, 1990）を比較対照物質として選択した。これらの構造式をFig. 4に示した。な
お、TGR 突然変異試験の反復投与における有用性を示すことに着眼したため、aristolochic acid は 4
週間、tamoxifen は 3 週間及び 13 週間、toremifene は 3 週間、並びに phenacetin は 26 週及び 52 週間
と様々な投与期間を設定した。本研究では、上記の被験物質の遺伝毒性を反復投与により評価するこ
とで、gpt delta ラットを用いた TGR 突然変異試験の遺伝毒性の検出力及び特異性、並びにその結果
から得られる癌原性と遺伝毒性の関連について確認し、gpt delta ラットが医薬品の遺伝毒性評価に活
用できるか検証することとした。
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Fig. 1 Summary of ICH S2 (R1) Guideline on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.
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Fig. 2 Mutation Assays Using gpt delta Transgenic Rats.
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Fig. 3 Structure of λEG10.
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Table 1 Summary of the standard protocol in OECD Test Guideline 488 “Transgenic Rodent
Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays.”
投与期間
1 日 1 回 4 週間反復投与
試料の採材時期
最終投与 3 日後に試料採取
動物数
1 群 5 匹以上
性別
通常、雄
投与用量
3 用量以上、最高用量は最大耐量
組織・臓器の選択
被験物質の投与経路、毒性学的所見、発がん標的等の考察に基
づいて決定する。
Fig. 4 Chemical structures of aristolochic acid, tamoxifen, toremifene and phenacetin.
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4. Aristolochic acid の 4 週間反復経口投与における遺伝毒性評価
4.1 序
OECD 試験ガイドライン 488（OECD, 2011）では、TGR 突然変異試験の標準プロトコール（28+3 プ
ロトコール）として 4 週間反復投与後、3 日後の臓器の採材が推奨されている（Table 1）。しかし、
OECD 標準プロトコールに従い実施された報告はほとんどないことから、本章では OECD 標準プロ
トコールに従い試験を実施した場合の TGR 突然変異試験の検出力について検討することとした。被
験物質としては、他の遺伝毒性試験の結果との比較を考慮し、遺伝毒性の情報が十分にある
aristolochic acid を選択した。Aristolochic acid は、ウマノスズクサ属 Aristolochia およびカンアオイ属
Asarum の植物などに含まれ、ハーブ（ベルギー）、関木通・健康食品（日本）、漢方「龍胆瀉肝丸
（リュウタンシャカンガン）」として使用されていた（Kite et al., 2002）。しかし、ヒトで重篤な腎
障害を誘発したとの報告があり（Kite et al., 2002）、現在は各国の当局から使用に関して注意喚起が
なされている。本化合物は、in vitro と in vivo の両方で遺伝毒性を示し（Arlt et al., 2002, Schmeiser et
al., 2009, Zhang et al., 2004）、またラットでは腎臓で癌原性を誘発する（Mengs et al., 1982）。本章で
は、F344 系雄性 gpt delta ラットに aristolochic acid を 4 週間反復経口投与し、投与 3 日後に臓器を採
材し、腎臓（癌原性の標的臓器）及び肝臓（癌原性の非標的臓器）における遺伝毒性を評価した。
4.2 材料と方法
4.2.1 動物と飼育方法
雄性 SD gpt delta ラットと野生型の雌性 F344 ラットを交配し、
ヘテロ型の F1 ラットを作成した。
次に雄 F1 ラット（ヘテロ型）を野生型の雌性 F344 ラットを交配した。15 回以上のバッククロスを
行った後、F344 gpt delta ラットとして得た（Toyoda-Hokaiwado, 2010）。F344 gpt delta ラットは日本
エスエルシー株式会社から購入した。
雄性 F344 gpt delta ラットは 7 週齢で入荷し、1 週間の検疫馴化を行った後、試験に使用した。動物
はステンレス製金網ケージ（1 匹/ケージ）で飼育し、ガンマ線照射滅菌済みの固型飼料 CRF-1 飼料
（オリエンタル酵母工業株式会社）及び塩素濃度 2 ppm 前後に調整した水道水を自由摂取させた。飼
育室（Meiji Seika ファルマ株式会社医薬研究所 9 号館 53 室）は、温度を 23 ± 2°C、湿度を 55 ± 10%、
照明は 7-19 時に設定した。動物の識別は、動物番号の油性フェルトペンによる尾部への記入とケー
ジラベル及び標識カードの掲示により行った。群分けは、投与開始前日に全動物の体重を測定し、体
重層別法を用いて振り分けた。
本試験は Meiji Seika ファルマ株式会社「動物実験管理に関する指針」に従って実施し、動物実験
管理委員会で承認された方法で実施した（C150-135）。また、組換え DNA 実験指針（平成 14 年 1
月 31 日文部科学省公示第 5 号）における組換え動物の飼育管理方法並びに Meiji Seika ファルマ株式
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
会社遺伝子組換え委員会で承認された方法（C149-21）に従い、作業者の安全の確保、動物の物理的
封じ込め等に注意して実施した。
4.2.2 被験物質
Aristolochic acid（CAS#313-67-7, purity 98%, 8-methoxy-6-nitrophenanthro-(3,4-D)-1,3- dioxolo5-carboxylic acid, aristolochic acid-I）はシグマアルドリッチジャパン株式会社から購入し、使用時まで
遮光、室温及び気密容器で保管した。Aristolochic acid は、注射用水（大塚蒸留水、株式会社大塚製
薬工業）を用いて、0.03、0.1 及び 0.3 mg/mL の濃度に溶解し、投与液とした。陽性対照物質として
使用した N-ethyl-N-nitrosourea（ENU; CAS#759-73-9）はナカライテスク株式会社から購入し、遮光、
冷蔵
（1-8℃）
及び気密容器で保管した。
ENU は、生理食塩液
（株式会社大塚製薬工業）
を用いて 5 mg/mL
の濃度に溶解し、投与液とした。なお、投与液は用時調製した。
4.2.3 投与と試験方法
OECD 標準プロトコール（OECD, 2011）に従い、4 週間反復投与し、3 日後（試験 31 日目）に剖
検及び採材を行う試験スケジュールを設定した（28+3 プロトコール）。Aristolochic acid の投与液を
胃ゾンデ及びディスポーザブルシリンジを用いて 1 日 1 回の 4 週間反復強制経口投与した。gpt アッ
セイの試験方法の確認のため、陽性対照物質として ENU 群を設定した。ENU は投与液を注射針及び
ディスポーザブルシリンジを用いて 1 日 1 回の 5 日間反復腹腔内投与した
（試験 1 日目に投与開始）
。
いずれも投与容量は 10 mL/kg とし、投与液量は直近の体重から算出した。群構成は以下に示した
（Table 2）。Big BlueR ラットを用いた aristolochic acid の 0.1、1 及び 10 mg/kg/day の 12 週間反復経
口投与試験では、
1 mg/kg 以上で腎臓及び肝臓の MF が上昇している（Chen et al., 2006; Mei et al., 2006）
。
そこで、本試験では 4 週間投与においても MF の増加がみられると推定される 1 mg/kg/day を中用量
として設定し、公比 3 で低用量及び高用量である 0.3 及び 3 mg/kg/day を設定した。ENU は、Lambert
の報告（2005）において MF の増加がみられた 50 mg/kg/day を設定した。
Table 2 Groups
群
試験群
1
2
3
4
5
Control
AA-0.3
AA-1
AA-3
ENU
投与量
(mg/kg)
0
0.3
1
3
50
投与液濃度
（mg/mL）
0
0.03
0.1
0.3
5
投与容量
（mL/kg）
10
10
10
10
10
投与
経路
経口
経口
経口
経口
腹腔
投与
期間
4週間
4週間
4週間
4週間
5日間
剖検・
雌雄 匹数 動物番号
採材
試験31日 ♂
5 01-05
試験31日 ♂
5 11-15
試験31日 ♂
5 21-25
試験31日 ♂
5 31-35
試験31日 ♂
5 51-55
AA: Aristolochic acid、ENU: N -Ethyl- N -nitrosourea
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
4.2.4 検査項目と採材
1) 一般状態観察：群分け時及び投与期間中は毎日 1 回、並びに剖検前に一般状態観察を行った。
2) 体重測定：群分け時、投与期間中は週 1 回、並びに剖検日に体重測定を行った。
3) 摂餌量測定：週に 1 回の頻度で測定した。前日の給餌量及び翌日の残餌量を測定し、その差に
より 1 日摂餌量を算出した。
4) 血液検査：試験 31 日目に、control 群及び aristolochic acid 群について Table 3 に示した項目の血
液検査を実施した。採血はペントバルビタールナトリウム麻酔下で後大静脈から行った。
EDTA・3K で抗凝固処理した血液は血液学的検査に、クエン酸ナトリウムで抗凝固処理して得
られた血漿は凝固系検査に、ヘパリンナトリウムで抗凝固処理して得られた血漿は生化学検査
に用いた。
5) 剖検、採材及び病理組織学的検査：Control 群及び aristolochic acid 群は、採血終了後にペント
バルビタールナトリウム麻酔下で腋窩動・静脈の切断により放血死させた後に剖検を行った。
ENU 群は、ペントバルビタールナトリウム麻酔下で腋窩動・静脈の切断により放血死させた。
その後、肝臓及び腎臓を採材し、重量を測定した。臓器の一部を液体窒素で急速冷凍し、-80℃
のディープ・フリーザーで保存した。残りの臓器は 10%中性緩衝ホルマリン液で固定した後、
常法に従いヘマトキシリン・エオジン（HE）染色標本を作製し光学顕微鏡下で観察した。
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Table 3 Parameters in hematology and blood chemistry
Specimen Item of measurement
White blood cell
Red blood cell
Hemoglobin
Hematocrit
Mean corpuscular volume
Mean corpuscular hemoglobin
Mean corpuscular hemoglobin
Blood
concentration
Platelet
Lymphocyte
Monocyte
Neutrophilic leukocyte
Eosinophilic leukocyte
Basophilic leukocyte
Reticulocyte
Prothrombin time
Plasma
Activated partial thromboplastin
time
Lactate dehydrogenase
Aspartate aminotransferase
Alanine aminotransferase
Alkaline phosphatase
Creatine phosphokinase
Blood urea nitrogen
Creatinine
Calcium
Plasma
Glucose
Triglyceride
Total cholesterol
Total protein
Albumin
Sodium
Potassium
Chloride
Albumin/globulin ratio
Abbreviation
WBC
RBC
HGB
HCT
MCV
MCH
Method
Flow Cytometry
Electric Resistance Detection
SLS-Hemoglobin
RBC Pulse Height Detection
Apparatus
Calculation
MCHC
PLT
LYMPH
MONO
NEUT
EO
BASO
RET
PT
Electric Resistance Detection
Flow Cytometry
Recombinant tissue factor
APTT
Ellagic acid
LDH
AST
ALT
ALP
CPK
BUN
CRE
Ca
GLU
TG
T-CHO
TP
ALB
Na
K
Cl
A/G
JSCC*
JSCC*
JSCC*
JSCC*
JSCC*
Urease・GLDH
Creatininase･HMMPS
MXB
Hexokinase・G-6-PDH
GPO･HMMPS
Cholesterol oxidase･HMMPS
Biuret
BCG
Sysmex
XT2000iV
Flow Cytometry
Sysmex
CA-530
TOSHIBA
TBA-120FR
Ion -selective electrode
Calculation
*：Modified reagent based on recommendation of JSCC (Japanese Society for Clinical Chemistry)
Abbreviations：SLS; sodium lauryl sulfate, GLDH; glutamate dehydrogenase, HMMPS;
N-(3-sulfopropyl)-3-methoxy-5-methylaniline , MXB; methyl xyenol blue, GPO; glycerophosphate oxidase,
BCG; bromcresol green.
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4.2.5 変異頻度の測定
gpt アッセイは能美らの方法（2000）に従い実施した。凍結保存した臓器から RecoverEaseTM DNA
Isolation Kit（Agilent Technologies）を用いて長鎖ゲノム DNA を抽出し、transpack® Lambda Packaging
Extract (Agilent Technologies)を用いて、トランスジーンであるλEG10 レポーター遺伝子をλファージ
として回収した。回収したλEG10 ファージを E.coli YG6020 に感染させ培養した。gpt 変異体は、6TG
及び Cm を含む培地で上記の E.coli YG6020 を培養し、6TG 及び Cm 耐性コロニーをポジティブセレ
クションとして計数することで検出した。また、Titer （Survival）数は、3000 倍に希釈したλEG10
ファージを E.coli YG6020 に感染させ、Cm 含有培地で培養した後、コロニーとして計数した。得ら
れた Titer 数から Cm 耐性コロニー数を算出し、6TG･Cm 耐性コロニー数と Cm 耐性コロニー数から
突然変異頻度（MF）を算出した。
詳細な試験方法は、URL（http://www.nihs.go.jp/dgm/dgm3/gpt401ja.pdf）を参照した。
Cm 耐性コロニー数＝Titer 数（平均値）×3000
MF（×10－6）＝6TG･Cm 耐性コロニー数 / Cm 耐性コロニー数
なお、gpt アッセイは先ず中用量の 1 mg/kg/day で実施した後に、MF の増加の程度を考慮し高用量
又は低用量のどちらかの 1 用量を追加で実施することとした。
4.2.6 統計
MF、体重、血液検査値及び臓器重量（絶対・相対）について、群ごとに平均値及び標準偏差を算
出した。
Aristolochic acid 投与群の MF に対する検定は、
control 群を対照として Steel’s test で実施した。
ENU 群の MF に対する検定は、control 群を対照として Welch's t-test で実施した。Aristolochic acid 投
与群の体重、血液検査値及び臓器重量に対する検定は、control 群を対照として Dunnett’s multiple test
で実施した。解析には生物実験データ統計解析システム（EXSAS version 7.5.0. CAC エクシケア株式
会社）を使用した。
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4.3 結果
4.3.1 Aristolochic acid の腎臓及び肝臓における gpt アッセイ
結果をFig. 5に示した。
Aristolochic acid 投与群の腎臓における gpt MF 値の平均（Mean±SD）は、0.3 mg/kg 及び 1 mg/kg
群でそれぞれ 5.15 ± 2.31 及び 9.55 ± 3.19 (× 10－6)であり、control 群の 1.38 ± 1.41 (× 10－6)と比較して
3.7 倍と 6.9 倍であり、用量に応じて増加傾向がみられ、1 mg/kg 群で有意差がみられた。Aristolochic
acid 投与群の肝臓における gpt MF 値の平均（Mean±SD）は、0.3 mg/kg 及び 1 mg/kg 群でそれぞれ
17.6 ± 9.9 及び 29.2 ± 30.4 (×10－6)であり、control 群の 3.15 ± 3.02(×10－6)と比較して 5.6 倍と 9.3 倍
であり、用量に応じた有意な増加がみられた。なお、aristolochic acid の 1 mg/kg 群で肝臓、腎臓とも
に有意な MF の増加が認められたことから、3 mg/kg 群の gpt アッセイは実施しなかった。
また、ENU 群の MF は、99.4 ± 34.3(× 10－6)であり、control 群と比較して 32 倍と有意に増加した（Fig.
6）。
4.3.2 Aristolochic acid の一般毒性評価
結果の要約をTable 4に示した。
Aristolochic acid を 0.3 及び 1 mg/kg の用量で 4 週間反復経口投与した後、3 日間休薬し、血液検査
及び肝臓、腎臓、胃及び小腸の病理検査を実施した。投与期間中、死亡、一般状態、体重推移及び血
液学的検査において、
本化合物投与による異常はみられなかった。血液生化学的検査では、
1 mg/kg/day
群で ALT の上昇がみられた。剖検及び臓器重量測定では異常はみられなかった。病理組織学的検査
では、0.3 mg/kg 以上の群で腎臓にごく軽度から軽度の尿細管の好塩基性変化（Fig. 7）、肝臓にごく
軽度の単核細胞浸潤（Fig. 8）がみられた。以上から、aristolochic acid を 4 週間反復経口投与し 3 日
後の毒性評価では、0.3 mg/kg 以上の投与群で腎臓及び肝臓にごく軽度から軽度な変化が生じること
が明らかになった。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 5 gpt mutant frequencies in the kidney and liver of gpt delta rats treated with aristolochic
acid. Values represent mean +/- SD. *: p<0.05, ***：p<0.001 compared to the control
group (Steel’s test).
Fig. 6 gpt mutant frequency of ENU-treated gpt delta rats (n=5) in liver. Values represent
mean +/- SD. §§：p<0.01 compared to the control group（Welch's t-test).
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Table 4 Summary of toxicity data in gpt delta rats treated with aristolochic acid.
Vehicle control
Aristolochic acid (mg/kg/day)
Dosing volume
(Purified water)
0.3
1
Number of animals
5
5
5
Number of deaths
0
0
0
Clinical signs
No abnormal signs
No abnormal signs
No abnormal signs
Body weight
―
―
Food consumption
―
―
Hematology
―
―
Blood biochemistry a
ALT (IU/L): 37 ± 3
ALT: 41 ± 4
ALT: 52 ± 5*
Autopsy
No remarkable changes
No remarkable changes
No remarkable changes
―
―
Mononuclear cell infiltration in the liver
(± : 2/5 rats)
Mononuclear cell infiltration in the liver
(± : 3/5 rats)
Basophilic change in the renal tubules
(± : 4/5 rats)
Basophilic change in the renal tubules
(± : 3/5 rats, ＋:1/5 rat)
Organ weights
Histopathology
No remarkable changes
― : No significant differneces compared with the control.
a
: The parameter having the significant difference compared with the control was described.
The Value presents mean ± SD. * : p<0.05 compared with the control （Dunnett).
Grade in histopathology : ± : Very slight, ＋ : Slight
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
A
B
Fig. 7 Histopathological changes of gpt delta rat kidney treated with 1 mg/kg aristolochic acid
(B) compared with control (A). Basophilic change (arrow) in the renal tubules was
observed in the rats treated with aristolochic acid.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
A
B
Fig. 8 Histopathological changes of gpt delta rat liver treated with 1 mg/kg aristolochic acid
(B) compared with control (A). Mononuclear cell infiltration (arrow) in the liver was
observed in the rats treated with aristolochic acid.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
4.4 考察
本章では、F344 系雄性 gpt delta ラットに aristolochic acid を 4 週間反復経口投与し、その 3 日後に
採材した腎臓及び肝臓における遺伝毒性を評価した。その結果、癌原性の標的臓器である腎臓の
gptMF は、control 群に対し 0.3 及び 1 mg/kg/day 群でそれぞれ 3.7 倍及び 6.9 倍に増加した（Fig. 5）。
gpt delta ラットと同様に TGR アッセイ用に開発された Big BlueR ラットを用いた aristolochic acid の
12 週間反復経口投与における遺伝毒性評価では、腎臓における cII MF は 0.1 及び 1 mg/kg/day の用
量で control 群のそれぞれ 3 倍及び 8 倍に増加したと報告されている（Mei et al., 2006）。この比較か
ら、aristolochic acid の遺伝毒性評価において、gpt delta ラットの 4 週間反復投与は、Big BlueR ラッ
トの 12 週間反復投与とほぼ同等の検出力を示したと考えられる。
Aristolochic acid のラットを用いた 2 年間癌原性試験は 0.1、1.0 及び 10 mg/kg/day の用量で実施さ
れており（Meng, et al., 1982）、0.1 mg/kg/day 以上で腎臓の腺腫及び腎盂の過形成、10 mg/kg/day で
腎盂の上皮性悪性腫瘍が観察された。gpt delta ラットでは、癌原性の発現用量と同じ用量域において
腎臓の突然変異を検出することができた。Arlt らの検討（Arlt et al., 2002）において、aristolochic acid
による DNA 損傷（DNA 付加体形成）が腎臓における腫瘍誘発の原因の一つであると結論されてお
り、突然変異が癌原性誘発の要因の一つである可能性が考えられた。Aristolochic acid が DNA 損傷を
誘発する際の代謝活性化機序をFig. 9に示した（Arlt et al., 2002）。
一方、本研究では aristolochic acid の癌原性の非標的臓器の肝臓においても gpt MF の増加がみられ
た（Fig. 5）。しかし、肝臓における MF の増加は Big BlueR ラットにおいても認められており（Mei
et al., 2006）、aristolochic acid は肝臓においても遺伝毒性を有すると結論付けられた。Arlt らによる
と、aristolochic acid の腎臓における発癌のプロセスには、遺伝毒性に加え腎臓傷害による細胞増殖も
重要と考えられている（Arlt et al., 2002）。Aristolochic acid のラット癌原性試験では肝臓における毒
性所見はみられておらず、aristolochic acid が肝臓に傷害を与えないことが、肝臓で発癌を誘発しない
原因であると推察された。本研究においても、遺伝毒性評価と同時に aristolochic acid の一般毒性評
価を行ったが、肝臓に傷害を示唆する明らかな変化は認められなかった（Table 4）。すなわち、血液
生化学検査では 1 mg/kg/day 群で軽度な ALT の上昇がみられ、病理組織学的検査でも 0.3 mg/kg/day
以上の群で肝臓に単核細胞の浸潤が観察されたが（Fig. 8）、その程度は極めて弱く、肝臓の変化の
毒性学的意義は低いと考えられた。また、0.3 mg/kg/day 以上の群で腎臓の尿細管に塩基性変化が軽度
に観察され（Fig. 7）、これは傷害後の再生像と考えられた。3 日間の休薬後の毒性評価ではあるが、
本研究では腎臓に対し軽度な組織傷害性の変化が生じたと考えられた。Aristolochic acid のラット癌
原性試験においては、1 mg/kg/day の 9 ヶ月間投与後から腫瘍が発生しており（Meng et al., 1982）、
投与期間の延長することにより傷害性の程度が増強していくものと推察された。この様に、gpt delta
ラットを用いて 4 週間反復投与毒性試験を行った場合、一般毒性評価に加え遺伝毒性も同時に検討で
きることも、gpt delta ラットを用いた突然変異試験の有用な点と考えられた。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
しかし、通常の 4 週間反復投与毒性試験では最終投与の翌日に剖検を行うため、OECD 標準プロト
コール（28+3 プロトコール）と剖検・採材のタイミングが異なる。TGR 突然変異試験においては、
肝臓などの分裂の遅い臓器では最終投与から 3 日間程度の発現時間を置く方が望ましいと考えられ
る（OECD, 2011）。一方、一般毒性評価では最終投与翌日に血液検査及び剖検を行うことが、動物
を用いた慢性毒性試験の期間についてのガイドライン（S4）において規定されており（ICH, 1998）、
動物が休薬で回復する前に毒性変化を検査する必要がある。そこで、遺伝毒性評価を組み込む際は、
一般毒性も適切に評価できる様に、4 週間反復の翌日剖検（28+1 プロトコール）又は 1 ヵ月反復投
与の翌日剖検（30+1 プロトコール）を提案する。28+1 プロトコール、30+1 プロトコールともに投
与期間、発現時間ともに OECD 標準プロトコール（28+3 プロトコール）と大きな違いなく、遺伝毒
性の検出力は大きく変わらないと推察される。TGR 突然変異試験を一般毒性試験に組み込む際は、
柔軟な試験期間の設定が必要と考えられた。
以上から、
aristolochic acid の腎臓及び肝臓における遺伝毒性を感度良く検出できたことから、
OECD
標準プロトコール（28+3 プロトコール）による gpt delta ラットを用いた突然変異試験は、十分な検
出力を有すると考えられた。
なお、本章の研究内容は、Genes Environment 誌に掲載された（Kawamura et al., 2012）。
Fig. 9 Mechanism for the metabolic activation of aristolochic acid.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
5. Tamoxifen の 3 週間反復経口投与及び 13 週間混餌投与における遺伝毒性評価
5.1 序
本章では、4 週間程度の反復投与に加え、より長期である 13 週間反復投与試験における TGR 突然
変異試験の検出力及び特異性について検討した。化合物の選定に当たっては、癌原性が公知であり、
さらに他の試験系による遺伝毒性結果と比較可能であることを考慮し、tamoxifen を選択した。
Tamoxifen は、抗エストロゲン作用を有する乳がん治療薬として広く使用されているが（Jordan, 1992）、
ラット癌原性試験において肝臓に腫瘍を発生させることが知られている（Greaves et al., 2002）。また、
tamoxifen の構造類似体としてラットで癌原性を示さない toremifene（Karlsson et al., 1996）を比較対
照物質として設定した。Tamoxifen は Big BlueR ラットを用いた突然変異試験では、3 週間反復経口投
与で MF を約 2 倍程度上昇させるが（Chen et al., 2002; Gamboa da Costa et al., 2002）、肝臓中の薬物
代謝酵素により代謝活性化された後、DNA を修飾することが遺伝毒性の誘発機序として考えられて
いる（Shibutani et al., 2001）。すなわち、tamoxifen のアルキル側鎖のα位が CYP により水酸化を受
け、次に sulfotransferase により硫酸抱合を受け、反応性代謝物であるα-hydroxy-tamoxifen sulfate に
代謝活性化される（Fig. 10; Gamboa da Costa et al., 2007）。一方、癌原性を示さない toremifene は、α
位ではなく 4 位が水酸化を受け、硫酸抱合による反応性代謝物を産生しないため、遺伝毒性も誘発し
ないと考察されている（Fig. 11; Gamboa da Costa et al., 2007）。
投与スケジュールとしては、Big BlueR ラットとの比較を行える様に 3 週間反復経口投与を設定し
た。さらに、2 年間癌原性試験に先立ち、用量設定のために 13 週間反復投与試験が実施されること
が一般的であることから、本試験系を癌原性試験の予備試験に組み込むことの妥当性を検討するため、
tamoxifen については 13 週間反復投与群も設定した。
5.2 材料と方法
5.2.1 動物と飼育方法
Tamoxifen 及び toremifene の薬理作用が抗エストロゲン作用であることから、本試験では雌の F344
gpt delta ラットを選択した。動物の購入先、由来、特徴、飼育条件、識別方法及び群分け方法は前章
（4.2.1）と同様であるが、混餌投与群には固形飼料ではなく CRF-1 粉末飼料（オリエンタル酵母工
業株式会社）を自由摂取させた。
本試験は、前章（4.2.1）と同様に Meiji Seika ファルマ株式会社における動物実験管理委員会で承
認された方法 （C149-114）、並びに遺伝子組換え委員会で承認された方法（C149-21）に従い、作業
者の安全の確保、動物の物理的封じ込め等に注意して実施した。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
5.2.2 被験物質
Tamoxifen citrate （CAS#54965-24-1、purity 98%）及び toremifene citrate （CAS# 89778-27-8, purity
98%）は和光純薬工業株式会社から購入し、使用時まで遮光、室温及び気密容器で保管した。Tamoxifen
は tricaprylin （和光純薬工業株式会社）を用いて 20 及び 40 mg/mL の濃度、toremifene も tricaprylin を
用いて 40 mg/mL の濃度の懸濁液を調製し、投与液とした。投与液は用時調製した。混合粉末飼料は、
粉末飼料 CRF-1 に、tamoxifen を 250 ppm （250 µg/g）及び 500 ppm（500 µg/g）の濃度になるように
混合し調製した。
5.2.3 投与と試験方法
Tamoxifen は 20 及び 40 mg/kg/day の用量で、toremifene は 40 mg/kg/day の用量で胃ゾンデ及びディ
スポーザブルシリンジを用いて 1 日 1 回の 3 週間反復強制経口投与を行った。いずれも投与容量は
10 mL/kg とし、投与液量は最新の体重から算出した。さらに tamoxifen は 250 及び 500 ppm の混合飼
料をステンレス製粉末給餌器に入れ自由摂取させ、13 週間混餌投与を行った。給餌器及び混合飼料
は週 1 回の頻度で交換し、さらに週 1 回追加給餌を行った。群構成は以下に示した（Table 5）。実際
の摂餌量と体重から換算した tamoxifen の 13 週間混餌投与における投与量は、250 ppm で 15.4～17.6
mg/kg/day、500 ppm で 30.0～32.9 mg/kg/day と推定され、3 週間反復経口投与の 20 及び 40 mg/kg と
比較してそれぞれほぼ同程度の 1 日あたりの投与量であった。
Table 5 Groups
混餌
投与
強制
経口
試験群
投与用量
（mg/kg）
混合飼料濃度
(ppm)
投与期間
(week)
匹数
動物番号
対照群(CRF-1)
-
0
13
5
01-05
Tamoxifen-250 ppm
-
250
13
5
11-15
Tamoxifen-500 ppm
-
500
13
5
21-25
対照群(Tricaprylin)
0
-
3
5
101-105
Tamoxifen-20 mg/kg
20
-
3
5
111-115
Tamoxifen-40 mg/kg
40
-
3
5
121-125
Toremifene-40 mg/kg
40
-
3
5
201-205
5.2.4 検査項目と採材
1) 一般状態観察、体重測定及び摂餌量測定は、前章（4.2.4）と同様な方法で行った。
2) 血液検査：混餌投与群について 13 週投与後の翌日に、前章（4.2.4）と同様な方法で行った。
3) 病理検査：強制投与群は最終投与の 10 週間後、混餌投与群は 13 週投与後の翌日に、前章（4.2.4）
と同様な方法により剖検を行った。肝臓、腎臓、脾臓、卵巣及び子宮の採材及び凍結保存を行
い、混餌投与群についてのみ病理組織学的検査を実施した。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
5.2.5 変異頻度の測定
1) gpt アッセイ：gpt アッセイは前章（4.2.5）と同様な方法を用いて実施した。
2) Spi－アッセイ：Spi－アッセイは能美らの方法（2000）に従い実施した。gpt アッセイと同様な
方法で回収したλEG10 ファージを E.coli XL-1 Blue MRA と E.coli XL-1 Blue MRA (P2)溶原菌に
感染させ培養し、Spi－変異体は、E.coli XL-1 Blue MRA (P2)溶原菌のプラークを計数すること
により検出した。また、Titer （Survival）数は、3000 倍に希釈したλEG10 ファージを E.coli XL-1
Blue MRA に感染させ培養した後、プラークを計数した。得られた Titer 数から DNA 回収数を
算出し、Spi－変異プラーク数及び DNA 回収数から Spi－MF を算出した。
詳細な試験方法は、URL（http://www.nihs.go.jp/dgm/dgm3/spiassay2.1.htm）を参照した。
DNA 回収数＝Titer 数（平均値）×3000
Spi－ MF（×10－6）＝Spi－変異プラーク数 / DNA 回収数
3) Spi－変異スペクトルの解析：3 週間経口群の Spi－変異体の全てについて、001 及び 002 プライ
マーを用いて PCR を行った。この PCR 産物（約 5 kb）を電気泳動し、バンドの有無とバンド
サイズを確認した。約 5 kb の PCR 産物について、403 及び sA をシークエンスプライマーとし
3’及び 5’の両側からシークエンス反応を行い、gam 遺伝子（534 bps）の領域について解析した。
また、約 2～4.5 kb の PCR 産物については、001 及び 002 をシークエンスプライマーとし 3’及
び 5’の両側からシークエンス反応を行い、redA、redB 及び gam 遺伝子の exon 領域を含む遺伝
子（4754 bps）について解析した。これらの遺伝子構成をFig. 12に示した。変異型は 4 つのク
ラス（deletion：欠失、insertion：挿入、transition：プリン塩基内又はピリミジン塩基内の 1 塩
基対置換、transversion：プリン・ピリミジン塩基間の 1 塩基対置換）に分類した。なお、lambda
EG10 の DNA 配列は以下のサイトを参照した。
http://www.nihs.go.jp/dgm/dgm3/gptdeltainfo.html.
（プライマー配列）
001（F）：ctctcctttgatgcgaatgccagc
002（R）：ggagtaattatgcggaacagaatcatgc
403（F）：gccgacacgttcagccagcttcc
sA（R）：ccacttttattggcgatgaaaagatgtttc
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
5.2.6 統計
体重、血液検査値、臓器重量（絶対・相対）及び MF について、群ごとに平均値及び標準偏差を算
出した。検定は対照群に対し Type O 型検定(＊)を実施した。
＊）Bartlett 検定により等分散性を評価（危険率 p:0.05）し、等分散（p≧0.05）であれば対照群と
の Dunnett type 多重比較検定（危険率 p:0.05）を行った。非等分散（p＜0.05）になった場合は、それ
ぞれのデータを対数変換して、対照群との Dunnett type 多重比較検定（危険率 p:0.05）を行った。解
析には生物実験データ統計解析システム（EXSAS version 7.5.0. CAC エクシケア株式会社）を使用し
た。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
5.3 結果
5.3.1 Tamoxifen の肝臓における gpt アッセイ及び Spi－アッセイ
結果をFig. 13に示した。
Tamoxifen の 3 週間経口投与群の gpt MF（Mean±SD）は、20 mg/kg 及び 40 mg/kg でそれぞれ 44.7
±7.7 及び 81.0±9.4 (× 10－6)であり、control 群の 6.21±0.52 (× 10－6)と比較して 7.2 倍及び 13 倍と用
量に応じた有意な増加がみられた。Tamoxifen の 13 週間混餌群の gpt MF は、250 ppm 及び 500 ppm
でそれぞれ 77.3±9.9 及び 175±34 (× 10－6)であり、control 群の 5.84±1.01 (× 10－6)と比較して 13 倍及び
30 倍と用量に応じた有意な増加がみられた。
同様に、tamoxifen の 3 週間経口投与群の Spi－MF は、20 mg/kg 及び 40 mg/kg でそれぞれ 11.8±1.1
及び 22.8±5.4 (×10－6)であり、control 群の 2.14±0.90 (×10－6)と比較して 5.5 倍及び 11 倍と用量に
応じた有意な増加がみられた。Tamoxifen の 13 週間混餌群の Spi－ MF は、250 ppm 及び 500 ppm で
それぞれ 29.9±5.1 及び 45.1±5.0 (×10－6)であり、control 群の 1.00±0.46 (×10－6)と比較して 30 倍及
び 45 倍と用量に応じた有意な増加がみられた。
5.3.2 Tamoxifen の腎臓における gpt アッセイ及び Spi－アッセイ
結果をFig. 14に示した。
Tamoxifen の 3 週間経口投与群及び 13 週間混餌群の腎臓における gpt MF は、control 群と比較して
有意な差はみられなかった。同様に、tamoxifen の 3 週間経口投与群及び 13 週間混餌群の腎臓におけ
る Spi－の MF は、control 群と比較して有意な差はみられなかった。
5.3.3 Toremifene の肝臓における gpt アッセイ及び Spi－アッセイ
結果をFig. 13に示した。
Toremifene の 3 週間経口投与群の肝臓における gpt MF 及び Spi－MF は、control 群と比較して有意
な差はみられなかった。
5.3.4 Toremifene の腎臓における gpt アッセイ及び Spi－アッセイ
結果をFig. 14に示した。
Toremifene の 3 週間経口投与群の腎臓における gpt MF 及び Spi－MF は、control 群の値と比較して
有意な差はみられなかった。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
5.3.5 Spi－変異体のスペクトル解析
3 週間経口投与群における Spi－変異体の多くは約 5 kbps として回収されたが、一部の Spi－変異体
では大きな欠失（約 2～4.5 kbps）がみられた。また、PCR が進まない Spi－変異体も一部観察され、
001 又は 002 のプライマー領域に変異があったためと推察された。回収できた全ての PCR 産物を用
い、gam 遺伝子領域、又は redA、redB 及び gam 遺伝子の exon 領域について DNA シークエンス解析
を行った結果（Fig. 15; Appendix 1）、1 bp の欠失の頻度は 20 mg/kg 群で 66.7％、40 mg/kg 群で 60.0％
であり、最も頻度が高かった。その他、2 bps 以上の欠失、transition、transversion、挿入などの変異
も観察された。
5.3.6 Tamoxifen の一般毒性評価
13 週間混餌投与群の結果の概要をTable 6に示した。
Tamoxifen の投与期間中、死亡及び一般状態の異常はみられなかった。250 及び 500 ppm 群におい
て体重の増加抑制がみられ、投与期間を通じて対照群と比較して約 2 割程度低く推移した（Fig. 16）。
摂餌量も 250 及び 500 ppm 群で投与期間を通じて対照群の約 6～8 割程度に減少した（Fig. 17）。血
液学的検査において、250 ppm、500 ppm 群ともに RBC、HGB 及び HCT の減少がみられ、血液生化
学的検査においては TG、T-CHO、TP 及び ALB の低下がみられた。500 ppm 群では AST の上昇もみ
られた。剖検では異常はみられなかった。臓器重量測定では、250 及び 500 ppm 群で子宮の絶対及び
相対重量が減少した。病理組織学的検査では、250 及び 500 ppm 群で子宮内膜の萎縮、閉鎖卵胞数の
増加及び黄体数の減少がみられた。なお、肝臓及び腎臓において傷害性の変化はみられなかった。
以上、tamoxifen の 13 週間混餌投与により体重の増加抑制を伴う摂餌量の減少、軽度な貧血傾向及
び脂質、タンパク質関連の血液生化学的検査項目に低下がみられ、また生殖器への影響がみられた。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 10 Mechanism for the metabolic activation of tamoxifen in liver.
Fig. 11 Metabolic route of toremifene in liver.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 12 Gene map ofλEG10 for sequencing Spi－mutant.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 13 Mutant frequencies in the liver of gpt delta rats treated with tamoxifen or toremifene in oral repeated doses for 3 weeks or 13 weeks. Values
represent mean +/- SD (n=5). *: p<0.01 compared to the control group (Dunnett).
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 14 Mutant frequencies in the kidney of gpt delta rats treated with tamoxifen or toremifene in oral repeated doses for 3 weeks or 13 weeks. Values
represent mean +/- SD (n=5).
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 15 Classification of Spi- Mutations in the liver of gpt delta rats treated with tamoxifen in oral repeated doses for 3 weeks.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Table 6 Summary of toxicity data in gpt delta rats treated with tamoxifen for 13 weeks.
Vehicle control
Tamoxifen (Doses were estimated from amount of food consumed and body weights)
Dosing volume
(tricaprylin)
250 (15.4-17.6 mg/kg/day)
500 (30.0-32.9 mg/kg/day)
Number of animals
5
5
5
Nember of deaths
0
0
0
Clinical signs
No abnormal signs
No abnormal signs
No abnormal signs
Reductions in body weight gain
Reductions in body weight gain
Decrease
Decrease
Red blood cell （×10 cells/mL）: 8.19 ± 0.25
Red blood cell: 7.56 ± 0.15 ***
Red blood cell: 7.35 ± 0.16 ***
Hemoglobin (g/dL): 15.1 ± 0.5
Hemoglobin: 14.1 ± 0.3 **
Hemoglobin: 13.3 ± 0.2 ***
Hematocrit (%): 42.4 ± 2.2
Hematocrit: 39.5 ± 0.7 *
Hematocrit: 37.7 ± 0.8 ***
Triglyceride (mg/dL): 98 ± 28
Triglyceride: 34 ± 10 ***
Triglyceride: 36 ± 8 ***
Total cholesterol (mg/dL): 90 ± 4
Total cholesterol: 35 ± 4 ***
Total cholesterol: 33 ± 3 ***
Total protein (g/dL): 6.2 ± 0.2
Total protein: 5.2 ± 0.1 ***
Total protein: 4.8 ± 0.1 ***
Albumin (g/dL): 4.2 ± 0.2
Albumin: 3.5 ± 0.1 ***
Albumin: 3.3 ± 0.1 ***
AST (IU/L): 88 ± 15
AST: 71 ± 4
AST: 139 ± 12 ***
No remarkable changes
No remarkable changes
No remarkable changes
Uterus: 0.57 ± 0.11
Uterus: 0.21± 0.02 ***
Uterus: 0.21 ± 0.04 ***
Uterus: 0.27 ± 0.07
Uterus: 0.13 ± 0.01 ***
Uterus: 0.13 ± 0.02 ***
Liver : ―
Liver : ―
Body weight
Food consumption
Hematology
a)
Blood biochemistry
6
a)
Autopsy
Organ weights (absolute, g)
Organ weights (relative, %)
Histopathology
a)
a)
Kidney : ―
Kidney : ―
Uterus : Atrophy of the endometrium (+ : 5/5)
Uterus : Atrophy of the endometrium (+ : 5/5)
Ovaries : Increase in number of atretic follicles (+ : 5/5)
Ovaries : Increase in number of atretic follicles (+ : 5/5)
Decrease in number of corpus luteum (+ : 5/5)
Decrease in number of corpus luteum (+ : 5/5)
No remarkable changes
― : No significant differences compared with the control.
a
: The parameters having the significant difference compared with the control were described.
Values present mean ± SD. *p < 0.05 **p < 0.01 ***p < 0.001 compared with the control (Dunnett).
Histopathologic grade: + : Slight
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 16 Body weights in gpt delta rats treated with tamoxifen for 13 weeks. Values represent
mean +/- SD (n=5). *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001 compared to the control group
(Dunnett).
Fig. 17 Food consumptions in gpt delta rats treated with tamoxifen for 13 weeks. Values
represent mean +/- SD (n=5). *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001 compared to the
control group (Dunnett).
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
5.4 考察
本章では、F344 系雌性 gpt delta ラットに tamoxifen を 3 週間経口反復及び 13 週間混餌投与し、肝
臓及び腎臓における遺伝毒性を評価した。また tamoxifen と類似構造を有する toremifene についても
3 週間経口反復における遺伝毒性評価を行った。その結果、tamoxifen は癌原性の標的臓器である肝
臓において gpt MF 及び Spi－MF の両方を増加させたが（Fig. 13）、非標的臓器の腎臓では MF を増
加させなかった（Fig. 14）。また tamoxifen による MF 増加の程度は 13 週反復群の方が 3 週反復より
高かった。一方、非癌原性物質の toremifene は肝臓、腎臓ともに gpt MF 及び Spi－MF を増加させな
かった（Fig. 13; Fig. 14）。
Big BlueR ラットを用いた TGR 突然変異試験では、tamoxifen の 20 mg/kg/day の 3 週間反復腹腔内
投与で、肝臓における cII 及び lacI MF は control と比較してそれぞれ約 1.4 倍及び約 3.2 倍の上昇が
みられた（Chen et al., 2002; Gamboa de Costa et al., 2002）。また、Big Blue R ラットにおける 6 週間反
復経口投与では、tamoxifen の 20 mg/kg/day で肝臓の cII MF は 3.2 倍に増加した（Davies et al., 1997）。
本検討では 20 mg/kg/day の 3 週間反復投与において肝臓の gpt MF が 7.1 倍に増加したことから、gpt
delta ラットは Big BlueR ラットと同等以上の検出感度を有することが示唆された。
摂餌量と体重から換算した tamoxifen 投与量は、250 ppm で 15.4～17.6 mg/kg/day、500 ppm で 30～
32.9 mg/kg/day と推定され、3 週間反復経口投与の 20 及び 40 mg/kg とそれぞれほぼ同程度の 1 日あ
たりの投与量であることから、投与方法は異なるものの投与期間の延長による影響に関する知見が得
られると考えられた。Tamoxifen の 13 週間混餌投与の総投与量は、250 ppm で 1401-1602 mg/kg 及び
500 ppm で 2730-2994 mg/kg であり、3 週間反復投与の総投与量（20 mg/kg 群: 420 mg/kg、40 mg/kg
群: 840 mg/kg）と比較してともに 3.5 倍であった。3 週反復投与の 20 mg/kg の gpt MF は control 群の
7.1 倍の増加であったことに対し、13 週混餌投与の 250 ppm 群の gpt MF は control 群の 13.2 倍に増加
したことから、tamoxifen の総投与量ないし投与期間の延長と MF には関連があると考えられた。
一方、Thybaud ら（2003）によると、28 日以上の投与期間では、初期に固定された変異の clonal
expansion による MF の増加が起こるため、長期投与の意義は低いとの報告がある。しかし、tamoxifen
の 3 週間反復後、10 週間後に採材した肝臓の Spi－変異スペクトル解析では、同一の個体における同
一の Spi－変異型は、同定した変異クローンの総数に対し 13%以下であったことから（Appendix 1）、
少なくとも 13 週間は clonal expansion の影響は少なく、実質的な変異が投与量及び投与期間に応じて
増加したと考えられた。一般にげっ歯類を用いた 2 年間癌原性試験に先立ち、用量設定のために 13
週間投与による予備試験が実施される。従って、TGR 突然変異試験を、癌原性試験の 13 週間用量設
定試験に組込んで実施した場合、clonal expansion による変異頻度のかさ上げを問題とせずに遺伝毒性
評価を行えると考えられた。
Tamoxifen のラット癌原性試験では、5、20 及び 35 mg / kg /day の用量において肝臓に上皮性悪性
腫瘍及び腺腫の誘発が認められたが、腎臓では腫瘍はみられなかった（Greaves et al., 1993）。本研究
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
においても、癌原性試験と同じ用量の 20 mg/kg/day の肝臓で MF の増加が認められたが、腎臓では
MF の増加はみられず、遺伝毒性の結果は臓器特異性の観点でも癌原性試験の結果と一致した。なお、
細菌を用いた復帰突然変異試験などの in vitro 試験では、tamoxifen の陰性結果が報告されている
（Gupta et al., 1999）。Tamoxifen は肝臓中の薬物代謝酵素により代謝活性化された後、DNA を修飾
する（Shibutani et al., 2001）。すなわち、tamoxifen のアルキル側鎖のα位が CYP により水酸化を受
け、次に sulfotransferase により硫酸抱合を受け、反応性代謝物であるα-hydroxy-tamoxifen sulfate に
代謝活性化される（Fig. 10; Gamboa da Costa et al., 2007）。In vitro 遺伝毒性試験は、代謝活性化系と
して肝 S9/NADPH 産生系を加えた条件で実施するため化合物は酸化的な代謝を受けるものの、
sulfotransferase の補酵素である 3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate（PAPS）がほとんど存在しない
ため硫酸抱合を受けないと推察された。一方、TGR 突然変異試験では生体の薬物代謝系を臓器ごと
に反映できるため、in vitro では検出できない tamoxifen の遺伝毒性を標的臓器で検出できたと考えら
れた。また、癌原性も示さない toremifene（Karlsson et al., 1996）は肝臓、腎臓ともに MF を増加させ
なかった。Toremifene は、α位ではなく 4 位が水酸化を受けるが、その後に硫酸抱合を受けず、反応
性代謝物を産生しないと考察されている（Fig. 11; Gamboa da Costa et al., 2007）。
gpt delta ラットを用いた本試験系は、gpt アッセイによる突然変異に加え、Spi－アッセイによる欠
失も検出でき、多様な遺伝子変異を評価できることも特徴の 1 つである。Big Blue R ラットを用いた
tamoxifen の評価では、G:C→T:A の transversion 型の塩基対置換が主要な変異として同定され、1 又
は 2 塩基の挿入や 2 塩基の欠失は極めて低い頻度でのみ検出された（Chen et al., 2002; Davies et al.,
1997）。一方、gpt delta ラットでは Spi－アッセイにより tamoxifen 投与による欠失を高頻度で検出で
きた。すなわち、Spi－変異スペクトル解析では、tamoxifen 投与で誘発される主要な変異は G:C の 1
塩基対の欠失であり、
次に 2 塩基対又はそれ以上の塩基対の欠失及び 1 塩基対の挿入が多かった
（Fig.
15; Appendix 1）。gpt delta マウスを用いた研究では、X 線（Nohmi et al., 1999）、紫外線 B（Horiguchi
et al., 2001）又は γ 線（Masumura et al., 2002）の照射後の Spi－アッセイでは 1000 塩基を超える様な
大きな欠失が誘発され、2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine（PhIP） 及び
Aminophenylnorharman（APNH）の様な化合物の投与では、1 塩基の欠失が誘発されたとの報告があ
る（Kanki et al., 2005）。Tamoxifen は、PhIP や APNH と同様に短い塩基の変異を高頻度で誘発する
特徴を示した。さらに興味深いことに、tamoxifen 投与群のラット肝臓の Spi－変異体において 7 種類
の塩基置換型の変異も同定された（Appendix 1）。当初、gam 遺伝子と red 遺伝子（redB 遺伝子及び
redA 遺伝子）の不活性化により発現する Spi－変異が、gam 遺伝子の塩基対置換により誘発されたの
か原因不明であった。しかし、対応するアミノ酸配列を確認すると、gam 遺伝子の 176 番目の塩基置
換を除き全ての塩基置換型の変異体は終止コドンを作成していた。同様に 1 塩基挿入型の 5 つ変異体
も終止コドンとなっていた。gam 遺伝子の本来の終止コドンと redB 遺伝子の開始コドンとの間隔は
わずか 5 塩基であるため（Nohmi et al., 1999）、gam 遺伝子とその下流にある red 遺伝子の翻訳はリ
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
ンクしていると推察される。従って、塩基置換及び 1 塩基挿入の変異で作成された終止コドンは、gam
遺伝子の翻訳を終了させるとともに red 遺伝子の翻訳開始を妨害し、gam 遺伝子及び red 遺伝子の両
方を機能的に不活性化したと考えられた。一方、gam 遺伝子の 171 番目の transition は終止コドンを
作成していないが、本変異体は 283 番目の-1 塩基フレームシフトを有している。この-1 塩基フレー
ムシフトは、他の位置での-1 塩基フレームシフトと同様に、redB 遺伝子の 13 及び 14 番目のアミノ
酸位置で翻訳を停止させ、gam タンパク質の合成に影響を与える（Nohmi et al., 1999）。以上から、
Spi－アッセイは、gam 遺伝子及び red 遺伝子の大きい欠失を検出するだけでなく、フレームシフト、
挿入及び塩基対置換など様々な変異型を検出できることが示された。
gpt delta ラットでは、遺伝毒性評価に加え、同一の試験及び動物を用いて一般毒性評価も同時に行
える大きな利点がある。Tamoxifen の 13 週間混餌投与群の一般毒性評価（Table 6）では、体重及び
摂餌量がみられ（Fig. 16; Fig. 17）、また栄養不足と関連したと考えられる血漿中のタンパク質及び
脂質の減少が認められた。病理組織学的検査では、本薬の薬理作用である抗エストロゲン作用と関連
する子宮内膜の萎縮、閉鎖卵胞数の増加及び黄体数の減少がみられた。なお、軽度な ALT の増加が
みられたが、病理組織学的検査では異常は観察されなかったことから、肝臓において組織傷害性がほ
とんど生じなかったと考えられた。
以上の結果から、tamoxifen の遺伝毒性は癌原性の標的臓器である肝臓で検出され、非標的臓器の
腎臓では検出されなかったことから、TGR 突然変異試験は感受性、臓器特異性の両方において優れ
た試験系であることが示された。また本試験系を癌原性試験の 13 週間用量設定試験試験に組み込む
ことで、癌原性試験と同様な用量で遺伝毒性評価が行え、遺伝毒性と癌原性の関連をより明確にでき
ることが期待される。
なお、本章の研究内容は、Toxicology 誌に掲載された（Kawamura et al., 2013）。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
6. Phenacetin の 26 週間及び 52 週間混餌投与における遺伝毒性評価
6.1 序
本章では、26 週間及び 52 週間とより長期の投与期間を設定し、TGR 突然変異試験の結果と癌原性
との関連について検討した。化合物の選定に当たっては、癌原性が公知である phenacetin を選択した。
すなわち、Phenacetin は解熱鎮痛薬として 1980 年代まで広く使われていたが、不適正な長期使用で
重篤な腎障害が発生したため現在では使用されておらず、動物の実験データからヒトにおいても癌原
性物質と推察されている（NTP, 2011）。Phenacetin は、ラット 2 年間癌原性試験においても腎臓に腫
瘍を発生させる（Johansson, 1981）。Phenacetin の遺伝毒性については、in vitro 試験では陽性との報
告はあるが（De Flora et al., 1985）、in vivo 試験で遺伝毒性を評価した報告は最長で 2 週間反復投与
であり（Asanami et.al., 1995）、長期投与による報告はない。そこで phenacetin を 26 週間及び 52 週
間混餌投与し、癌原性標的臓器である腎臓と、標的臓器でない肝臓における遺伝毒性の評価を行った。
6.2 材料と方法
6.2.1 動物と飼育方法
本検討では、phenacetin の癌原性試験（Johansson, 1981）と同様の系統である Sprague-Dawley（SD）
系の雌雄 gpt delta ラットを選択した。SD 系 gpt delta ラットは日本エスエルシー株式会社から購入し
た。動物の飼育、標識および群分けは、前章と同様な方法（4.2.1）で行い、混餌投与による試験のた
め CRF-1 粉末飼料を自由摂取させた。本試験は、前章（4.2.1）と同様に、Meiji Seika ファルマ株式
会社における「動物実験管理委員会で承認された方法（C146-025）及び遺伝子組換え委員会で承認さ
れた方法（C142-44）に従い、作業者の安全の確保、動物の物理的封じ込め等に注意して実施した。
6.2.2 被験物質
Phenacetin（CAS# 62-44-2、purity 98%）は和光純薬工業株式会社から購入し、使用時まで遮光、室
温及び気密容器で保管した。混合粉末飼料は、粉末飼料 CRF-1 に、phenacetin を 0.5%の濃度になる
ように混合し調製した。
6.2.3 投与と試験方法
Phenacetin は 0.5%の混合飼料をステンレス製粉末給餌器に入れ自由摂取させることで、26 及び 52
週間混餌投与を行った。給餌器及び混合飼料は週 1 回の頻度で交換し、さらに週 1 回追加給餌を行っ
た。群構成は以下に示した（Table 7）。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Table 7 Groups
投与期間
26週間
52週間
試験群および濃度
動物数（匹）
動物番号
対照、0％
♂3、♀4
♂1～3、♀11～14
Phenacetin、0.5％
♂7、♀9
♂4～10、♀15～23
対照、0％
♂3、♀5
♂101～103、♀110～114
Phenacetin、0.5％
♂6、♀9
♂104～109、♀115～123
6.2.4 検査項目と採材
1) 一般状態観察、体重測定及び摂餌量測定は、前章と同様の方法（4.2.4）で実施した。
2) 血液検査：26 週及び 52 週投与終了後の翌日に、前章と同様の方法（4.2.4）を用いて血液検査
を実施した。
3) 病理検査：26 週及び 52 週投与終了後の翌日に、前章（4.2.4）と同様な方法により剖検を行っ
た。脾臓、大腿骨の骨髄、肝臓、腎臓および膀胱の採材及び凍結保存を行い、これらの臓器に
ついて病理組織学的検査を実施した。
6.2.5 変異頻度の測定
1) gpt アッセイ及び Spi－アッセイ：前章（4.2.5及び5.2.5）と同様な方法で実施した。
2) gpt 変異スペクトルの解析：変異体の gpt 遺伝子について primer 1 及び primer 2 を用いて PCR
を用いて増幅した。この PCR 産物を電気泳動しバンドの確認を行った。バンドが確認された
PCR 産物について primer 1 をシークエンスプライマーとし、gpt 遺伝子の exon 領域を解析し変
異部位を同定した。gpt 変異型は 4 つのクラス（transition：プリン塩基内又はピリミジン塩基内
の 1 塩基対置換、transversion：プリン・ピリミジン塩基間の 1 塩基対置換、deletion：欠失、
insertion：挿入）に分類した。なお、λEG10 及び gpt 部位の DNA 配列は以下のサイトを参照
した。
http://www.nihs.go.jp/dgm/dgm3/gptdeltainfo.html.
（プライマー配列）
Primer 1：TGTTTGAGAATACCACTTTATCC
Primer 2：CTTGCGGGATATCAACAACATAG
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
6.2.6 統計
体重、血液検査値、臓器重量（絶対・相対）及び MF について、群ごとに平均値及び標準偏差を算
出した。検定は対照群に対し Type F 型検定(＊)を実施した。
＊）Bartlett 検定により等分散性を評価（危険率 p:0.05）し、等分散（p≧0.05）であれば対照群と
の Student’s t 検定（危険率 p:0.05）を行った。非等分散（p＜0.05）になった場合は、対照群との
Aspin-Welch’s t 検定（危険率 p:0.05）を行った。解析には生物実験データ統計解析システム（EXSAS
version 8.0 CAC エクシケア株式会社）を使用した。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
6.3 結果
6.3.1 Phenacetin の腎臓における gpt 及び Spi－の変異頻度
結果をFig. 18に示した。
Phenacetin の 26 週投与群では、雌雄ともに、gpt MF 及び Spi− MF は control 群と比較して有意な増
加はみられなかった。Phenacetin の 52 週投与群において、雄の gpt MF（Mean±SD）は 6.41±2.48 (×
10－6)であり control 群と比較して 3.5 倍であり有意な増加がみられたが、雌の gpt MF では有意な差は
みられなかった。また 52 週投与群の Spi－変異頻度は、雌雄ともに、control 群と比較して有意な増加
はみられなかった。
6.3.2 Phenacetin の肝臓における gpt 及び Spi－の変異頻度
結果をFig. 19に示した。
Phenacetin の 26 週投与群の gpt MF（Mean±SD）は、雄及び雌でそれぞれ 25.4±10.8 (×10－6)及び
11.4±4.9 (×10－6)であり、control 群と比較してそれぞれ 12 倍、雌で 4.3 倍と有意に増加した。52 週投
与群の gpt MF は、雄及び雌でそれぞれ 44.6±24.0（×10－6）及び 24.0±12.2 (×10－6)であり、control
群と比較してそれぞれ 18 倍、雌で 5.0 倍と有意に増加した。
26 週投与群の Spi－MF は、雌雄ともに control 群と比較して有意な増加はみられなかった。52 週投
与群の Spi－MF は、雄及び雌でそれぞれ 10.0±3.9 (×10－6)及び 7.10±2.43 (×10－6)であり、control 群
と比較してそれぞれ 5.8 倍、雌で 2.3 倍と有意に増加した。
6.3.3 gpt 変異体のスペクトル解析
結果をFig. 20、Fig. 21、Appendix 2及びAppendix 3に示した。
Phenacetin 投与群では、腎臓、肝臓ともに G:C→A:T transition 型の 1 塩基置換の突然変異が最も多
かった。特に Phenacetin 投与群の肝臓では、gptDNA 配列の 26 番目及び 416 番目に位置における上
記の突然変異の頻度が高かった。
6.3.4 Phenacetin の一般毒性評価
結果の要約をTable 8及びTable 9に示した。
投与期間中、26 週、52 週投与群ともに死亡はみられず、一般状態変化の異常もみられなかった。
また、phenacetin 投与群の体重推移、摂餌量、血液生化学的検査及び臓器重量において、control 群と
比較して異常はみられなかった。血液学的検査では、26 週投与群の雌で白血球数及び好中球数が有
意に減少したが、52 週投与群では認められず、毒性学的意義は低いと判断された。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
52 週投与群の病理組織学的検査では、雌雄ともに腎臓で慢性腎炎がみられたが、control 群でも同
様な変化が観察され、加齢による影響と推察された。また、phenacetin 投与群の多くの動物で肝臓の
胆管増生及び脾臓の黄褐色色素の沈着がみられたが、control 群でも同様な変化が観察されたため毒
性学的意義は低いと考えられた。なお、52 週投与群で明らかな毒性変化がみられなかったため、26
週投与群の病理組織学的検査は実施しなかった。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 18 Mutant frequencies in the kidney of gpt delta rats given dietary administration of phenacetin for 26 and 52 weeks. Values represent mean +/SD (n=3-9). *: p<0.05 compared to the control group (Student’s t-test).
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 19 Mutant frequencies in the liver of gpt delta rats given dietary administration of phenacetin for 26 and 52 weeks. Values represent mean +/- SD
(n=3-9). **: p<0.01 compared to the control group (Student t-test). ## p<0.01, ### p<0.001: compared to the control group (Aspin-Welch
t-test).
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 20 Classification of the independent gpt mutations in the kidney of gpt delta rats administered dietrary phenacetin for 26 and 52 weeks.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 21 Classification of the independent gpt mutations in the liver of gpt delta rats administered dietrary phenacetin for 26 and 52 weeks.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Table 8 Summary of toxicity data in gpt delta rats treated with phenacetin for 26 weeks.
Control
Phenacetin (Doses were estimated from the amounts of food consumed and body weights)
Dosing volume
0 mg/kg/day
0 mg/kg/day
209 mg/kg/day (182-251 mg/kg/day)
263 mg/kg/day (234-296 mg/kg/day)
Male
Female
Male
Female
Number of animals
3
4
7
9
Nember of deaths
0
0
0
0
No abnormal signs
No abnormal signs
No abnormal signs
No abnormal signs
Body weight
―
―
Food consumption
―
―
Gender
Clinical signs
Hematology
White blood cells
（×106 cells/mL）
6.34 ± 1.72
5.28 ± 1.80
7.87 ± 2.61
4.17 ± 1.14**
Neutrophilic
leukocytes
（×106 cells/mL）
1.46 ± 0.41
1.87 ± 0.90
4.43± 2.00
1.28 ± 0.72*
―
―
No remarkable changes
No remarkable changes
―
―
No data
No data
a)
Blood biochemistry
Autopsy
No remarkable changes
No remarkable changes
Organ weight
Histopathology
No data
No data
― : No significant differneces compared with the control.
a
: The parameters having the significant difference compared with the control were described.
Values present mean ± SD. *p < 0.05 **p < 0.01 compared with control (Student t test).
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Table 9 Summary of toxicity data in gpt delta rats treated with phenacetin for 52 weeks.
Control
Phenacetin (Doses were estimated from the amounts of food consumed and body weights)
Dosing volume
0 mg/kg/day
0 mg/kg/day
202 mg/kg/day (168-261 mg/kg/day)
246 mg/kg/day (215-302 mg/kg/day)
Gender
Male
Female
Male
Female
Number of animals
3
5
6
9
Nember of deaths
0
0
0
0
Clinical signs
No abnormal signs
No abnormal signs
No abnormal signs
No abnormal signs
Body weight
―
―
Food consumption
―
―
Hematology
―
―
Blood biochemistry
―
―
No remarkable changes
No remarkable changes
Autopsy
No remarkable changes
No remarkable changes
―
Organ weight
Kidney : chronic nephropathy (+/-: 3)
Kidney : chronic nephropathy (+/-: 4, +: 1)
Kidney : chronic nephropathy
―
Kidney : chronic nephropathy (+/-: 7, ++: 2)
(+/-: 2, +: 2, ++: 2)
Liver : hepatocyte focal necrosis (+: 1),
Liver : hepatocyte focal necrosis (+/-: 1, +: 2),
Liver : hepatocyte focal necrosis (+/-: 1),
Liver : hepatocyte focal necrosis (+: 1),
bile duct proliferation (+/-: 3, +: 2, ++: 1)
bile duct proliferation (+/-: 2, +: 1, ++: 4)
Histopathology
bile duct proliferation (+/-: 2, +: 1)
bile duct proliferation (+: 5)
Urinary bladder: no remarkable changes
Urinary bladder: no remarkable changes
Urinary bladder: no remarkable changes
Urinary bladder: no remarkable changes
Spleen : yellow-brown pigment deposition
Spleen : yellow-brown pigment deposition
Spleen : yellow-brown pigment deposition
Spleen : yellow-brown pigment deposition
(+/-: 1, +: 2)
(+: 2, ++: 3)
(+/-: 1, +: 2, ++: 3)
(+/-: 1, +: 3, ++: 5)
― : No significant differneces compared with the control
Grade in histopathology : +/- slight, + mild, ++ moderate (Number of rats showed histopathological changes).
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
6.4 考察
本章では、SD 系雌雄 gpt delta ラットに phenacetin を 26 週間及び 52 週間混餌投与し、癌原性の標
的臓器である腎臓と、標的臓器でない肝臓における遺伝毒性評価を行った。その結果、phenacetin の
52 週間投与群の雄の腎臓で gpt MF の増加がみられた（Fig. 18）。しかし、52 週間投与群の雌及び
26 週間投与群の雌雄では、gpt MF の増加はみられなかった（Fig. 18）。一方、肝臓では 26 及び 52
週間投与群の雌雄で gpt MF の増加が認められ、さらに肝臓では 52 週間投与群の雌雄で Spi－MF の増
加も認められた（Fig. 19）。
Phenacetin は解熱鎮痛薬として 1980 年代まで広く使われていたが、不適正な長期使用で重篤な腎
障害が発生したため現在では使用されておらず、動物の実験データからヒトにおいても癌原性物質と
推察されている（NTP, 2011）。ラット癌原性試験では、2.5% phenacetin 含有飼料を 18 ヶ月摂取させ
た際、腎盂と膀胱に上皮性悪性腫瘍が発現し、その出現頻度は雄の方が雌より高いとの報告がある
（Isaka et al., 1979）。別の癌原性試験では、0.535% phenacetin 含有飼料を 117 週間摂取させた際、雄
で腎盂癌がみられたが、雌では腎盂に癌原性がみられなかったと報告されている（Johansson and
Angervall, 1976）。本研究においても、腎臓では gpt MF の増加は雄のみで認められており、性差にお
いて癌原性と遺伝毒性の結果が一致した。Phenacetin の癌原性誘発の機序については 2 つの仮説があ
る（Stewart, 1999）。一つは遺伝毒性が癌原性の誘発に寄与する説、もう一つは腎盂傷害が細胞増殖
を促し発癌を誘発する説である。Phenacetin を長期にわたって大量に摂取した患者では、腎障害が誘
発されたとの報告が多数あり（Grimlund, 1963; Carro-Ciampi, 1978; Inglis, 1966）、それらの患者の多
くで腎乳頭壊死を伴う乳頭癌も観察されている（Johansson, 1974）。さらに疫学調査では、phenacetin
に誘発される腎乳頭壊死と腎盂癌は関連性がみられたとの報告もある（Stewart, 1999）。これらの報
告から、
phenacetin 長期摂取による腎盂傷害が癌原性の誘発における重要な要因であると考えられた。
一方、本研究では、52 週投与群にいても、腎臓に炎症や過形成を含む毒性学的に意義のある病理組
織学的な異常は観察されなかった（Table 9）。
Phenacetin の 0.5%粉末飼料をラットに与えた際、体重と摂餌量から計算した投与量は、雄及び雌
でそれぞれ 202 及び 246 mg/kg/day であった。臨床推奨最大用量は 2.4ｇ/day であり
（Bergman, 1998）、
体重を 60 kg とした場合、ヒトの体重あたりの投与量は 40 mg/kg/day である。本試験の gpt delta ラッ
トにおける phenacetin の投与量は、臨床最大用量の 5-6 倍に相当する。また曝露量のラットとヒトの
相対比（rat AUC at 0.5% in diet / human AUC at 40 mg/kg）は 7 及び 15 であり（Bergman, 1998）
、曝露
量の観点からも gpt delta ラットの phenacetin 投与量は臨床用量よりも高いと考えられた。一方、変
換係数を用いて体表面積当たりの投与量を計算した場合（CDER, 2005）
、phenacetin の臨床最大用量
は 37 を掛けて 1480 mg/m2 となり、本試験における雄ラット投与量は 6 を掛けて 1476 mg/m2 となっ
。体表面積で比較した場合、ラットにおける phenacetin の投与量は、臨床最大
た（雌は 1212 mg/m2）
用量とほぼ同程度であった。これらのことから、本試験はヒトにおけるリスクを予測するために適し
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
た用量で実施されたと考えられた。
Phenacetin は腎臓において gpt MF を軽度に増加させたことから、
本化合物は弱い遺伝毒性物質であると判断された。しかし、phenacetin は癌原性の標的である腎盂に
対し特異的に遺伝毒性を誘発している可能性があることから、腎乳頭に加えて腎皮質を含む腎臓の一
部分を用いて平均的な MF を測定した本試験では、MF を低く見積もっているかも知れない（詳細は
後述する）
。従って、ヒトにおいても phenacetin は遺伝毒性リスクを有する可能性があると考えられ
た。また、腎臓癌の発現過程において遺伝毒性が一部で関連していると推察され、phenacetin を大量
摂取した患者でみられた腎臓癌は、遺伝毒性と腎乳頭傷害の複合作用で発現した可能性が示唆された。
一方、本研究においては、癌原性の非標的臓器の肝臓においても MF の増加がみられたことから、
phenacetin は肝臓に対しても遺伝毒性物質であると判断された。一方、単回投与で実施された他の in
vivo 遺伝毒性試験では、
肝臓において DNA 断片化
（De Flora, 1985）及び小核増加
（Takasawa et al., 2010）
は認められなかった。よって、phenacetin の肝臓における遺伝毒性を検出するためには反復投与が必
要であると考えられた。Phenacetin の細菌を用いる復帰突然変異試験では、ハムスター肝 S9 の存在
下で変異原性がみられたが、ラット肝 S9 の存在下では変異原性が認められなかった（Flora, 1985）。
Phenacetin は、in vitro 代謝活性化系では、N-水酸化と脱アセチル化を経て、反応性代謝物である
N-hydroxyphenetidine 及び p-nitrosophenetole に代謝される（Fig. 22; Nohmi et al., 1983）
。N-水酸化、脱
アセチル化ともにハムスターの方がラットより活性が高いが、特に脱アセチル化活性がハムスターで
顕著に高いことから、復帰突然変異試験でみられる種差は脱アセチル化の段階にあると結論されてい
る（Nohmi et al., 1984）。本研究では肝臓において MF の増加がみられたことから、in vivo ではラット
においても phenacatin は代謝活性化され、DNA を傷害したと考えられた。実際にラットに phenacetin
を経口投与した際、代謝活性化を示唆する酸化的ストレス関連の遺伝子群が発現した報告もある
（Leone et al., 2014）
。その一方で、phenacetin のハムスター腎 S9 存在下では復帰突然変異を誘発しな
かった（Flora, 1985）。この結果は phenacetin の代謝活性化能は、肝臓の方が腎臓より高いことが示唆
され、本研究においても MF の増加は肝臓の方が腎臓より明らかに高かった。しかし、臓器の細胞分
布を考慮した場合、本試験では腎盂の細胞（毒性標的部位）だけでなく、他の大部分の腎細胞（非標
的部位）も含めた遺伝毒性評価を行っており、phenacetin の腎盂における遺伝毒性を低く見積もって
いる可能性もある。なお、aristolochilic acid においても同様な現象が観察されており、gpt delta ラッ
トを用いた 28 日間反復投与では、腎臓（癌原性の標的臓器）よりも肝臓（非標的臓器）で強く MF
の増加が認められた（4 章; Kawamura et al, 2012）
。この 2 化合物の結果から、gpt delta ラットを用い
た突然変異試験において、腎臓よりも肝臓でより効率的に代謝活性化される化合物の評価では、肝臓
でより高感度で遺伝毒性を検出すると考えられた。しかし、phenacetin は肝臓で癌原性を示さないに
も関わらず、強い遺伝毒性を肝臓で発現させたことから、phenacetin の癌原性の誘発機序には遺伝毒
性よりも、細胞増殖等の他の要因が重要であると考えられた。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Phenacetin の 52 週間投与群の雄の腎臓における gpt MF は control の 3.5 倍に増加したが、26 週間
投与では MF の増加はみられなかった（Fig. 18）。また、52 週間投与群の雄の肝臓における gpt MF
は control 群の 18 倍に増加したことに対し、26 週間投与群の雄の肝臓の gpt MF は control 群の 12 倍
であった（Fig. 19）。これらの結果から、phenacetin の総投与量及び投与期間の延長は、MF の増加
の程度と関連があることが示唆された。5 章でも考察したが、Thybaud ら（2003）によると、28 日以
上の投与期間では、初期に固定された変異の clonal expansion による変異頻度の増加が起こるため、
長期投与の意義は低いとの報告がある。しかし、本研究では 52 週間の反復投与群の変異体を解析し
た結果、同一の動物における同一の gpt 変異型は、同定された変異クローンの総数に対し 10%以下で
あったことから（Appendix 2; Appendix 3）、少なくても 52 週間までは総投与量及び投与期間に応じ
て実質的な変異は増加するものと考えられた。Phenacetin 投与による腎臓と肝臓の主な変異型は、グ
アニンの塩基対置換型である G:C→A:T であった（Fig. 20; Fig. 21）。肝臓における変異のホットスポッ
トは gpt 遺伝子の 26 及び 416 番目にあり、いずれも tryptophan (TGG) から stop codon (TAG)に変異
していた（Appendix 3）。腎臓では変異体の解析数が少ないこともあり、ホットスポットは明らかで
はなかった（Appendix 2）。52 週間の反復投与で clonal expansion と判断される変異が少なかったこ
とから、TGR 突然変異試験を他の反復投与毒性試験に組込んだ場合、少なくても 52 週間までの期間
であれば clonal expansion による変異頻度のかさ上げを問題とせずに、遺伝毒性を評価できると考え
られた。
本研究結果から、phenacetin は癌原性の標的臓器の腎臓で弱い遺伝毒性を有し、非標的臓器の肝臓
でも遺伝毒性を有することが示された。gpt delta ラットを用いた反復投与から得られる試験結果は、
化合物で誘発される癌原性と遺伝毒性の臓器ごとの関連を明らかにするために有用であると考えら
れた。
なお、本章の研究内容は、Toxicology 誌に掲載された（Kawamura et al., 2014）。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Fig. 22 Mechanism for the metabolic activation of phenacetin in liver.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
7. 総括
遺伝子改変げっ歯類（TGR）を用いた突然変異試験は、癌原性の標的臓器における化合物の評価が
行える。導入遺伝子における突然変異は、遺伝学的に安定で生理的な機能を持たず、投与期間の延長
に応じて蓄積するため、本試験系は特に反復投与での評価に適していると考えられるが、反復投与を
用いた本試験系の報告はほとんどない。そこで腎臓を癌原性の標的とする aristolochic acid 及び
phenacetin、
肝臓を標的とする tamoxifen、
並びに tamoxifen の構造類似体で癌原性を示さない toremifene
について、TGR である gpt delta ラットを用いて反復投与をよる遺伝毒性評価を行い、本試験系が医
薬品の評価に活用できるか検証した。
1) Aristolochic acid の評価は OECD 標準プロトコール
（28+3 プロトコール）
に従い、F344 系 gpt delta
雄性ラットに 0.3 及び 1 mg/kg の用量で 4 週間反復経口投与し、その 3 日後に腎臓及び肝臓に
おける MF（変異頻度）を測定した。その結果、aristolochic acid は腎臓、肝臓の両方で用量に
応じて gpt MF を増加させた。本試験系は、2 年間の癌原性試験と同じ用量域（0.1、1.0 及び 10
mg/kg/day）において、aristolochic acid の腎臓における遺伝毒性を検出できたことから、十分な
検出感度を有すると考えられた。一方、本試験では癌原性の非標的臓器である肝臓でも遺伝毒
性が認められた。Aristolochic acid の腎臓における発癌のプロセスには、遺伝毒性に加え腎臓傷
害による細胞増殖も重要と考えられている。Aristolochic acid のラット癌原性試験では、傷害性
変化が腎臓ではみられるが、肝臓ではみられておらず、aristolochic acid が肝臓に傷害を与えな
いことが、肝臓で発癌を誘発しない原因の一つである可能性が考えられた。
これらの結果から、Aristolochic acid は両臓器で遺伝毒性を誘発することが示され、OECD 標
準プロトコールは十分な検出力を有すると考えられた。
2) Tamoxifen を F344 系 gpt delta 雌性ラットに 20 及び 40 mg/kg の用量で 3 週間反復経口投与し、
並びに 250 ppm（15.4-17.6 mg/kg）及び 500 ppm（30.0-32.9 mg/kg）の tamoxifen 混合飼料を 13
週間投与し、肝臓及び腎臓の MF を測定した。また toremifene は 40 mg/kg の用量で 3 週間反復
経口投与した。その結果、tamoxifen は肝臓で用量に応じて gpt 及び Spi－（欠失）の MF を増加
させた。Tamoxifen は腎臓では MF を増加させず、また toremifene 投与群では両臓器で MF の
増加がみられなかった。Tamoxifen のラット癌原性試験では、5、20 及び 35 mg / kg /day の用量
において肝臓に癌原性がみられたが、腎臓では認められていない。本試験系は、癌原性試験と
同じ用量の 20 mg/kg/day において肝臓の遺伝毒性を特異的に検出することができた。
肝臓の MF 増加の程度は 13 週混餌投与の方が 3 週反復投与より高く、投与期間の延長によ
る変異の蓄積が確認された。初期に固定された変異の clonal expansion による MF の増加が起こ
るため、長期投与の意義は低い懸念もあった。しかし、本研究では、Spi－変異スペクトル解析
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
の結果、少なくとも 13 週間までは clonal expansion の影響が少なく、実質的な変異が投与期間
に応じて増加することが示された。Spi－変異スペクトル解析では、tamoxifen 投与で誘発される
主要な変異は G:C の 1 塩基対欠失であり、次に 2 塩基対又はそれ以上の数の塩基対の欠失、及
び 1 塩基対の挿入も認められた。gpt アッセイによる突然変異に加え、Spi－アッセイによりフ
レームシフト及び挿入など様々な変異型を検出できる gpt delta ラットの特徴が確認された。
Tamoxifen の癌原性の標的臓器に対する遺伝毒性を特異的に検出できたことから、反復投与
を用いた本試験系は十分な検出力を有すると考えられた。さらに、2 年間癌原性試験のための
13 週間用量設定試験に、gpt delta ラットを組み込んで実施することで遺伝毒性も同時に評価で
きると考えられた。
3) Phenacetin を SD 系 gpt delta 雌雄ラットに 0.5%の混合飼料を 26 週間及び 52 週間投与し、腎臓
及び肝臓の MF を測定した。その結果、52 週群の雄の腎臓で gpt MF の増加がみられた。一方、
非標的臓器である肝臓においても、26 週及び 52 週群の雌雄で gpt MF の増加、及び 52 週群の
雌雄で Spi－MF の増加がみられた。0.5%混餌投与で実施された phenacetin の癌原性試験は、腎
臓で癌原性がみられたが、肝臓ではみられていない。本研究では、phenacetin は腎臓で弱く、
肝臓で強い遺伝毒性を示したことから、phenacetin の遺伝毒性の癌原性誘発機序への寄与は大
きくないと考えられた。
腎臓、肝臓ともに 52 週群の MF は 26 週より高く、投与期間の延長による変異の蓄積が確認
された。gpt 変異スペクトル解析の結果、52 週間投与においても clonal expansion の影響が少な
く、実質的な変異が投与期間に応じて増加することが示された。また、phenacetin 投与による
腎臓と肝臓の主な変異型は、グアニンの塩基対置換型の G:C→A:T であった。さらに肝臓にお
ける変異のホットスポットは gpt 遺伝子の 26 及び 416 番目にあり、いずれも tryptophan (TGG)
から stop codon (TAG)に変異していた。
これらの結果から、phenacetin は腎臓で弱く、肝臓で強く、遺伝毒性を誘発することが示さ
れ、長期投与による本試験系は、標的臓器における癌原性と遺伝毒性の関連性の解明に有用で
あると考えられた。
本研究では、aristolochic acid、tamoxifen 及び phenacetin の遺伝毒性を、癌原性試験と同様な
用量域で検出できたことから、TGR 突然変異試験は十分な検出力を示すと考えられた。また、
tamoxifen 及び phenacetin の評価では、投与期間の延長により変異が蓄積し検出力が向上したこ
とから、反復投与で実施することの有用性が確認され、反復投与の期間は化合物の特徴に応じ
て柔軟に設定できると考えられた。また、評価する臓器は化合物の動態的、毒性学的特徴に応
じて選択可能である。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
本試験系は遺伝毒性と同時に一般毒性の評価が可能であることから、他の毒性試験への gpt
delta ラットの組込みを提案する。第一に、医薬候補化合物の臨床試験前に実施される 4 週間反
復投与毒性試験に gpt delta ラットを群構成の一部に組み込んだ場合、動物愛護に配慮した動物
数の削減につながるだけでなく、遺伝毒性リスクをより精度良く検討できると考えられる。こ
れにより、遺伝毒性が原因となって癌原性を誘発する医薬候補化合物の開発を早期に回避でき
る可能性がある。第二に、一般にげっ歯類を用いた 2 年間癌原性試験に先立ち、用量設定のた
めに 13 週間反復投与による予備試験が実施されるが、群構成の一部として gpt delta ラットの組
込みんだ場合、癌原性試験と近い用量において、臓器ごとに癌原性と遺伝毒性の関連を明確に
できると考えられる。げっ歯類を用いた癌原性試験は開発後期に実施されるが、万一、医薬候
補化合物の投与で動物に腫瘍が発生した場合、その発生機序を明らかにしてヒトのリスクを予
見しなければならない（ICH; 1997）。医薬候補化合物が遺伝毒性を有さない十分な証拠がある
場合、臨床曝露量との安全域を考察できる可能性もあるが、遺伝毒性を有する場合は閾値の設
定は困難であり、ヒトに対して癌原性リスクがあるものと見なされる（ICH; 1997）。この場合、
医薬品としての開発は困難であり、それまで費やした膨大な開発費と時間が無駄となり、新薬
を期待していた患者と製薬企業に与えるダメージは大きい。gpt delta ラットを用いた 13 週間用
量設定試験では、癌原性試験の前に主要臓器の遺伝毒性を評価することに加え、全ての臓器を
採材、凍結保存しておけば、癌原性試験で何らかの臓器に腫瘍が発生した場合に、その標的臓
器に対する遺伝毒性を評価することができる。この評価結果は、遺伝毒性と癌原性の関連を解
明することとなり、医薬開発を継続するか否かの決定的な判断材料となると考えられた。
以上、反復投与を用いた TGR 突然変異試験は十分な遺伝毒性の検出力を有することが確認
され、本試験系から得られる結果は、化合物投与により誘発される癌原性と遺伝毒性の臓器ご
との関連性の検討に有用であると考えられた。gpt delta ラットは医薬品の遺伝毒性評価に十分
に活用できると考えられ、本試験系を利用することで遺伝毒性リスクのある医薬候補化合物の
開発を早期に回避することができ、効率的な医薬開発が期待される。
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
8. 付表
Appendix 1 Classification of Spi- Mutations in the liver of gpt delta rats treated with tamoxifen
in oral repeated doses for 3 weeks.
Type of mutation
Position in
gam gene
Source of animal (Number of mutations)
Number of mutations
Sequence change
・0 mg/kg, 101-105
Tamoxifen (mg/kg)
0
20
40
・20 mg/kg, 111-115
1
3
1
113(1), 123(1), 125(1)
111(1), 112(1), 113(1), 123(1)
101(1), 102(1), 113(1), 124(1)
121(1)
111(2), 112(2), 113(1), 121(2), 122(1), 123(2), 124(4)
124(1)
111(1)
112(3), 123(2), 124(1), 125(1)
112(1), 114(1), 125(1)
121(1)
101(1), 102(1)
124(1)
114(1), 123(2), 124(2), 125(1)
111(1)
・40 mg/kg, 121-125
One bp deletion
188-190
213-214
227-231
232-233
238-241
261
282-283
286-289
290-291
294
295-300
308-310
348-349
371-372
CCC
GG
AAAAA
GG
CCCC
A
CC
GGGG
CC
C
AAAAAA
CCC
GG
TT
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
CC
G
AAAA
G
CCC
del.
C
GGG
C
del.
AAAAA
CC
G
T
167-170
CGCG
→
CG
2
5
1
3
2
2
1
1
1
9
1
4
1
1
2
1
1
1
5
-2 bp deletion
1
> -2 bp deletion
-279 bp*
-820 bp*
-2757 bp*
-2907 bp*
> -1K bp **
2
113(1), 122(1), 123(1)
2
1
1
114(1)
112(1)
124(2)
123(1)
124(1)
1
1
Transition
176
A
→
G
1
132
135
177
226
253
366
T
C
C
G
G
C
→
→
→
→
→
→
A
A
A
T
T
A
1
190
279
289
300
351
C
A
G
A
A
→
→
→
→
→
CC
AA
GG
AA
AT
1
277→295
294
C
→
AA
111(1)
Transversion
2
1
2
1
2
1
115(1)
123(1)
112(1), 114(1), 123(1), 125(1)
124(1)
123(1), 125(1)
122(1)
Insertion
+1 bp
+1 bp
+1 bp
+1 bp
+1 bp
Complex
-18 bp +5 bp
+1 bp
Total number of mutations
1
1
1
1
1
2
4
28
111(1)
122(1)
124(1)
115(1)
113(1)
123(1)
124(2)
45
* The mutations have short homologous sequences at the deletion junction.
** Sequence at the deleted junction was not identified.
Page 61 of 71
gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Appendix 2 Classification of the independent gpt mutations in the kidney of gpt delta rats
administered dietrary phenacetin for 26 and 52 weeks.
Source of animal (Number of mutations)
Number of mutations
Position in gpt
Type of mutation
gene
Transitions
Transversions
One bp deletions
26
27
50
86
87
91
101
107
110
115
116
145
185
236
262
274
353
401
402
418
64
82
109
202
287
391
409
412
413
263
2
308
116
145
176
185
219
367
379
402
110
105
140
108
339
343
345
25
56
366
300
437
217
323
403
> -2 bp deletions
-12 bp
184-195
-13 bp
19-31
-19 bp
346-364
Insertions
+1 bp
393
+1 bp
389
Total number of mutations
Sequence change
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
C
C
C
C
C
C
C
C
C
A
T
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
C
C
C
C
A
A
T
T
T
T
T
G
A
A
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
T
T
T
T
T
T
T
T
T
G
C
C
T
T
T
T
T
T
T
T
C
A
A
G
G
C
C
A
A
A
G
G
del.
del.
del.
26 weeks
Control Phenacetin
0.5%
1
2
1
・26 weeks, control: 1-2, 11-12
52 weeks
Control Phenacetin
0.5%
2
1
1
2
1
2(1)
22(1)
110(1)
1
1
1
2
1
1
1
1
2 →1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
2 →1
1
1
1
1
1
1
1
A
C
1
6
19
・52 weeks, phenacetin: 104-106, 115-117
1
1
1
1
→
→
・52 weeks, control: 101-103, 110-112
105(1), 117(1)
16(1), 115(1)
112(1)
5(1), 18(1), 106(1), 117(1)
17(1)
116(1)
12(1),
101(1)
111(1), 106(1)
10(1), 17(1)
104(1)
105(1)
104(1)
11(1)
105(2 →1)
110(1)
104(1)
19(1)
19(1)
106(1)
12(1), 21(1), 23(1), 105(1), 116(1)
104(1)
115(1)
105(1)
115(1)
8(1)
18(1)
117(1)
115(1)
17(1)
9(1), 116(1)
115(1)
102(1)
110(1), 117(1)
115(1)
5(1)
11(1),
102(1), 110(1)
101(1)
103(1)
18(1)
105(1)
103(1)
103(1)
117(1)
115(1)
104(2 →1)
106(1)
22(1)
110(1)
101(1)
17(1)
11(1)
103(1)
102(1)
1
1
・26 weeks, phencetin: 5, 7-10, 16-23
18
2 →1
31
110(1)
116(2 →1)
Clonally corrected mutations (the identical type of mutation in the individual rat) were shown in italic type.
The number of clones actually counted → the number of the independent gpt mutations
Page 62 of 71
gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Appendix 3 Classification of the independent gpt mutations in the liver of gpt delta rats
administered dietrary phenacetin for 26 and 52 weeks.
1
Source of animal (Number of mutations)
・26 weeks, control: 1-2, 11-14
・26 weeks, phencetin: 4-10, 16-23
・52 weeks, control: 101-103, 110-112
・52 weeks, phenacetin: 104-109, 115-123
105(1)
5(1), 6(2), 7(2), 15(2), 16(1), 17(1), 19(1), 20(1), 23(1), 104(2),
105(2 →1) , 106(4 →1) , 108(1), 109(1), 117(1), 118(3 →1) , 123(1)
4(1), 8(1), 107(1), 108(1), 109(1), 119(1), 120(1), 122(1)
8(1)
20(1)
5(1), 9(1)
4(1)
110(1)
18(1)
103(1), 110(1), 111(1), 115(1)
14(1), 4(1), 10(1), 21(1), 23(1), 113(1), 112(1), 108(1), 122(1)
110(1)
18(1), 112(1)
111(1)
121(1)
105(1)
119(1)
5(1)
109(1)
119(1)
123(1)
1(1)
116(1)
7(1), 23(1), 110(1)
7(1), 8(1), 9(1), 10(1), 16(1), 17(1), 19(2), 122(1)
9(1). 20(11)
15(1), 115(1), 120(1)
111(1), 108(1)
11(1), 4(1), 6(1), 103(2 →1) , 114(1)
1(1)
12(1)
18(1)
103(1), 111(1), 114(1)
6(1)
121(2 →1)
118(1)
21(19)
20(1), 121(1)
9(1)
116(1)
8(1)
1(1), 110(1)
22(1)
1(1), 110(1)
2(1)
22(1)
11(1)
19(1), 120(1)
116(1)
118(1)
113(1)
107(1), 122(1)
14(1)
12(1), 104(1)
18(1)
13(1)
10(1)
119(1)
107(1)
119(1)
104(1)
15(1)
107(1)
14(1)
22(1)
114(1)
16(1)
12(1)
120(1)
1
111(2 →1)
16(1)
5(1)
1(1)
107(1)
Number of mutations
Type of mutation
Transitions
Transversions
One bp deletions
> -2 bp deletions
-3 bp
-12 bp
-18 bp
-45 bp
-194 bp
Position in gpt
gene
Sequence change
3
26
G
G
→
→
A
A
27
50
58
86
87
92
107
110
115
128
143
166
176
185
190
236
241
242
281
302
352
401
416
417
418
37
64
82
109
125
140
313
320
412
413
263
343
419
175
79
115
190
265
302
401
402
406
412
140
287
290
320
302
186
322
214
25
56
25
27
183
254
319
327
389
416
419
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
A
A
A
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
C
C
C
C
G
C
C
A
T
T
T
GGG
C
T
G
TTT
CCC
GGG
G
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
→
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
G
G
G
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
A
A
A
A
C
G
G
T
A
A
del.
GG
del.
del.
del.
TT
CC
GG
del.
26 weeks
Control Phenacetin
0.5%
12
52 weeks
Control Phenacetin
0.5%
1
15 →9
2
1
1
2
1
6
1
1
1
4
1
3
2
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
8
2
1
1
1
1
2
1
1
1
3 →2
2
1
1
3
1
2 →1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2 →1
263-265
236-247
372-399
218-262
290-383
1
1
1
Insertions
+1 bp
227
+1 bp
246
+1 bp
318
+1 bp
345
Total number of mutations
→
→
→
→
G
A
A
A
1
1
15
57
1
1
22
115(1)
10(1)
110(1)
112(1)
50
Clonally corrected mutations (the identical type of mutation in the individual rat) were shown in italic type.
The number of clones actually counted → the number of the independent gpt mutations
Page 63 of 71
gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
9. 参考文献
Arlt, V.M., Stiborova, M., Schmeiser, H.H., 2002. Aristolochic acid as a probable human cancer
hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis 17, 265-77.
Asanami, S., Shimono, K., Sawamoto, O., Kurisu, K., Uejima, M., 1995. The suitability of rat
peripheral blood in subchronic studies for the micronucleus assay. Mutat. Res. 347, 73-8.
Bergman, K., Olofsson, I., Sjöberg, P., 1998. Dose selection for carcinogenicity studies of
pharmaceuticals: systemic exposure to phenacetin at carcinogenic dosage in the rat. Regul. Toxicol.
Pharmacol. 28, 226-9.
Carro-Ciampi, G., 1978. Phenacetin abuse: a review. Toxicology 10, 311-39.
CDER, 2005. Guidance for Industry on Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical
Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers.
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidance/UCM078932.pdf
Chen, T., Gamboa da Costa, G., Marques, M.M., Shelton, S.D., Beland, F.A., Manjanatha, M.G.,
2002. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic
rats. Carcinogenesis 23, 1751-7.
Chen, L., Mei, N., Yao, L., Chen, T., 2006. Mutations induced by carcinogenic doses of aristolochic
acid in kidney of Big Blue transgenic rats. Toxicol. Lett. 165, 250-6.
Davies, R., Oreffo, V.I., Martin, E.A., Festing, M.F., White, I.N., Smith, L.L., Styles, J.A., 1997.
Tamoxifen causes gene mutations in the livers of lambda/lacI transgenic rats. Cancer Res. 57,
1288-3.
De Flora, S., Russo, P., Pala, M., Fassina, G,. Zunino, A., Bennicelli, C., Zanacchi, P., Camoirano,
A., Parodi, S., 1985. Assay of phenacetin genotoxicity using in vitro and in vivo test systems. J.
Toxicol. Environ. Health 16, 355-77.
Dycaico, M.J., Provost, G.S., Kretz, P.L., Ransom, S.L., Moores, J.C., Short, J.M., 1994. The use of
shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat. Res. 307, 461-78.
Gamboa da Costa, G., Manjanatha, M.G., Marques, M.M., Beland F.A., 2002. Induction of lacI
mutations in Big Blue rats treated with tamoxifen and alpha-hydroxytamoxifen. Cancer Lett. 176,
Page 64 of 71
gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
37-45.
Gamboa da Costa, G, Pereira, P.C., Churchwell, M.I., Beland, F.A., Marques, M.M., 2007. DNA
adduct formation in the livers of female Sprague-Dawley rats treated with toremifene or
alpha-hydroxytoremifene. Chem. Res. Toxicol. 20, 300-10.
Greaves, P., Goonetilleke, R., Nunn, G., Topham, J., Orton, T., 1993. Two-year carcinogenicity
study of tamoxifen in Alderley Park Wistar-derived rats. Cancer Res. 53, 3919-24.
Grimlund, K., 1963. Phenacetin and renal damage at a Swedish factory. Acta Med. Scand. 174,
Suppl. 405:1-26.
Gupta, S., Mukhopadhyay, A., Ray, S., Giri, A.K., 1999. Comparative antimutagenic effects of Dand L-centchroman and their comparison with tamoxifen in Salmonella assay. Mutat. Res. 445, 1-8.
Hayashi, H., Kondo, H., Masumura, K., Shindo, Y., Nohmi, T., 2003. Novel transgenic rat for in vivo
genotoxicity assays using 6-thioguanine and Spi– selection. Environ. Mol. Mutagen. 41, 253-9.
Horiguchi, M., Masumura, K.I., Ikehata, H., Ono, T., Kanke, Y., Nohmi, T., 2001. Molecular nature of
ultraviolet B light-induced deletions in the murine epidermis. Cancer Res. 61, 3913-8.
ICH, 1995. ICH S2B Guideline on Genotoxicity: A Standard Battery for Genotoxicity Testing of
Pharmaceuticals.
http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm0749
29.pdf
ICH, 1997. ICH S1B Guideline: Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals.
http://www.pmda.go.jp/ich/s/s1b_98_7_9e.pdf
ICH, 1998. ICH S4 Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medicinal Products & Toxicity
to Male Fertility.
http://www.pmda.go.jp/ich/s/s4_99_4_5e.pdf
ICH, 2011. ICH S2 (R1) Guideline on Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for
Pharmaceuticals Intended for Human Use.
http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_
Step4.pdf
Page 65 of 71
gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Inglis, J.A., 1966. Phenacetin and renal papillary necrosis: results of a prospective autopsy
investigation. Med. J. Aust. 2, 332-3.
Isaka, H., Yoshii, H., Otsuji, A., Koike, M., Nagai, Y., Koura, M., Sugiyasu, K., Kanabayashi, T., 1979.
Tumors of Sprague-Dawley rats induced by long-term feeding of phenacetin. Gann 70, 29-36.
Jakubczak, JL1., Merlino, G., French, JE., Muller, WJ., Paul, B., Adhya, S., Garges, S., 1996.
Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based
assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93, 9073-8.
Johansson, S.L., 1981. Carcinogenicity of analgesics: long-term treatment of Sprague-Dawley rats
with phenacetin, phenazone, caffeine and paracetamol (acetamidophen). Int. J. Cancer 27, 521-9.
Johansson, S., Angervall, L., 1976. Urothelial changes of the renal papillae in Sprague-Dawley rats
induced by long term feeding of phenacetin. Acta Pathol. Microbiol. Scand. A. 84, 375-83.
Johansson, S., Angervall, L., Bengtsson, U., Wahlqvist, L., 1974. Uroepithelial tumors of the renal
pelvis associated with abuse of phenacetin-containing analgesics. Cancer 33, 743-53.
Jordan, V.C., 1992. Overview from the International Conference on Long-Term Tamoxifen Therapy
for Breast Cancer. J. Natl. Cancer Inst. 84, 231-4.
Kangas, L., 1990. Review of the pharmacological properties of toremifene. J. Steroid Biochem. 36,
191-5.
Kanki, K., Nishikawa, A., Masumura, K., Umemura, T., Imazawa, T., Kitamura, Y., Nohmi, T., Hirose,
M., 2005. In vivo mutational analysis of liver DNA in gpt delta transgenic rats treated with the
hepatocarcinogens
N-nitrosopyrrolidine,
2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline,
and
di(2-ethylhexyl)phthalate. Mol. Carcinog. 42, 9-17.
Karlsson, S., Hirsimäki, Y., Mäntylä, E., Nieminen, L., Kangas, L., Hirsimäki, P., Perry, C.J., Mulhern,
M., Millar, P., Handa, J., Williams, G.M., 1996. A two-year dietary carcinogenicity study of the
antiestrogen toremifene in Sprague-Dawley Rats. Drug Chem. Toxicol. 19, 245-66.
Kirkland, D., Aardema, M., Henderson, L., Müller. L., 2005. Evaluation of the ability of a battery of
three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens I. Sensitivity,
specificity and relative predictivity. Mutat. Res. 584, 1-256.
Page 66 of 71
gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Kite, G.C., Yule, M.A., Leon, C., Simmonds, M.S., 2002. Detecting aristolochic acids in herbal
remedies by liquid chromatography/serial mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrom 16,
585-90.
Lambert, I.B., Singer, T.M., Boucher, S.E., Douglas, G.R., 2005. Detailed review of transgenic
rodent mutation assays. Mutat. Res. 590, 1-280.
Leone, A., Nie, A., Brandon, P.J., Sawant, S., Piechta, L.A., Kelley, M.F., Mark, K.L., Jim, P.S.,
Verheyen, G., Johnson, M.D., Lord, P.G., McMillian, M.K., 2014. Oxidative stress/reactive metabolite
gene expression signature in rat liver detects idiosyncratic hepatotoxicants. Toxicol. Appl. Pharmacol.
275, 189-97.
Masumura, K., Kuniya, K., Kurobe, T., Fukuoka, M., Yatagai, F., Nohmi, T., 2002.
Heavy-ion-induced mutations in the gpt delta transgenic mouse: comparison of mutation spectra
induced by heavy-ion, X-ray, and gamma-ray radiation. Environ. Mol. Mutagen. 40, 207-15.
Mei, N., Arlt, V.M., Phillips, D.H., Heflich, R.H., Chen, T., 2006. DNA adduct formation and mutation
induction by aristolochic acid in rat kidney and liver. Mutat. Res. 602, 83-91.
Mengs, U., Lang, Wm Poch J-A, 1982. The carcinogenic action of aristolochic acid in rats. Arch.
Toxicol. 51, 107-19.
Myhr, B.C., 1991. Validation studies with Muta Mouse: a transgenic mouse model for detecting
mutations in vivo. Environ. Mol. Mutagen. 18, 308-15.
National Toxicology Program., 2011. Phenacetin and analgesic mixtures containing phenacetin. Rep.
Carcinog. 12, 340-1.
Nohmi, T., Katoh, M., Suzuki, H., Matsui, M., Yamada, M., Watanabe, M., Suzuki, M., Horiya, N.,
Ueda, O., Shibuya, T., Ikeda, H., Sofuni, T., 1996. A new transgenic mouse mutagenesis test
system using Spi- and 6-thioguanine selections. Environ. Mol. Mutagen. 28, 465-70.
Nohmi, T., Suzuki, T., Masumura, K., 2000. Recent advances in the protocols of transgenic mouse
mutation assays. Mutat. Res. 455, 191-215.
Nohmi, T., Suzuki, M., Masumura, K., Yamada, M., Matsui, K., Ueda, O., Suzuki, H., Katoh, M.,
Ikeda, H., Sofuni, T., 1999. Spi- selection: An efficient method to detect gamma-ray-induced
deletions in transgenic mice. Environ. Mol. Mutagen. 34, 9-15.
Page 67 of 71
gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Nohmi, T., Yoshikawa, K., Ishidate, M.Jr, Hiratsuka, A., Watabe, T., 1984. Mechanism of species
differences in N-hydroxyphenacetin mutagenicity: the role of deacetylation by rat and hamster liver
microsomes. Chem. Pharm. Bull. 32, 4525-31.
Nohmi, T., Yoshikawa, K., Nakadate, M., Ishidate, M.Jr., 1983. Species difference in the metabolic
activation of phenacetin by rat and hamster liver microsomes. Biochem Biophys Res. Commun. 110,
746-52.
OECD, 2011. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: Test Guideline 488 “Transgenic
Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays,” OECD Publication Office, France, Paris.
Phillips, D.H., 2001. Understanding the genotoxicity of tamoxifen? Carcinogenesis 22, 839-49.
Schmeiser, H.H., Stiborovà, M., Arlt, V.M., 2009. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity
of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 141-8.
Shibutani, S., Ravindernath, A., Terashima, I., Suzuki, N., Laxmi, Y.R., Kanno, Y., Suzuki, M., Apak,
T.I., Sheng, J.J., Duffel, M.W., 2001. Mechanism of lower genotoxicity of toremifene compared with
tamoxifen. Cancer Res. 61, 3925-31.
Stewart, J.H., Hobbs, J.B, McCredie, M.R., 1999. Morphologic evidence that analgesic-induced
kidney pathology contributes to the progression of tumors of the renal pelvis. Cancer 86, 1576-82.
Takasawa, H., Suzuki, H., Ogawa, I., Shimada, Y., Kobayashi, K., Terashima, Y., Matsumoto, H.,
Aruga, C., Oshida, K., Ohta, R., Imamura, T., Miyazaki, A., Kawabata, M., Minowa, S., Hayashi, M.,
2010. Evaluation of a liver micronucleus assay in young rats (III): a study using nine hepatotoxicants
by the Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT)/Japanese Environmental
Mutagen Society (JEMS)-Mammalian Mutagenicity Study Group (MMS). Mutat. Res. 698, 30-7.
Thybaud, V., Dean, S., Nohmi, T., de Boer, J., Douglas, G.R., Glickman, B.W., Gorelick, N.J.,
Heddle, J.A., Heflich, R.H., Lambert, I., Martus, H.J., Mirsalis, J.C., Suzuki, T., Yajima, N., 2003. In
vivo transgenic mutation assays. Mutat. Res. 540, 141-51.
Toyoda-Hokaiwado, N., Inoue, T., Masumura, K., Hayashi, H., Kawamura, Y., Kurata, Y., Takamune
M, Yamada M, Sanada H, Umemura T, Nishikawa A, Nohmi T., 2010.
Integration of in vivo
genotoxicity and short-term carcinogenicity assays using F344 gpt delta transgenic rats: in vivo
mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene structural isomers. Toxicol. Sci. 114,
71-78.
Page 68 of 71
gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
Zhang, H., Cifone, M.A., Murli, H., Erexson, G.L., Mecchi, M.S., Lawlor, T.E., 2004. Application of
simplified in vitro screening tests to detect genotoxicity of aristolochic acid. Food Chem. Toxicol. 42,
2021-8.
Page 69 of 71
gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
10. 発表論文
Kawamura, Y., Hayashi, H., Masumura, K., Numazawa, S., Nohmi, T., 2014. Genotoxicity of
phenacetin in the kidney and liver of Sprague-Dawley gpt delta transgenic rat in 26-week and
52-week repeated dose studies. Toxicology 324, 10-17.
Kawamura, Y., Hayashi, H., Kurata, Y., Hiratsuka, K., Masumura, K., Nohmi, T., 2013. Evaluation of
the genotoxicity of tamoxifen in the liver and kidney of F344 gpt delta transgenic rat in 3-week and
13-week repeated dose studies. Toxicology 312, 56–62.
Kawamura, Y., Hayashi, H., Tajima, O., Yamada, S., Takayanagi, T., Hori, H., Fujii, W., Masumura,
K., Nohmi, T., 2012. Evaluation of the genotoxicity of aristolochic acid in the kidney and liver of F344
gpt delta transgenic rat using a 28-day repeated-dose protocol: A collaborative study of the gpt delta
transgenic rat mutation assay. Genes Environment. 34, 18-24.
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gpt delta ラットによる遺伝毒性評価系
11. 謝辞
本研究の取りまとめ及び本論文の作成に際し、終始ご親切なご指導を頂きました昭和大学薬学
部生体制御機能薬学講座毒物学部門 沼澤 聡教授に心より御礼申し上げます。
また本研究の実施及び投稿論文の作成に際し、終始ご親切なご指導を頂きました国立医薬品食
品衛生研究所 能美 健彦博士、増村 健一博士に心より御礼を申し上げます。
また研究生としての採用に際し、貴重なご助言を頂きました元昭和大学薬学部生体制御機能薬
学講座毒物学部門 吉田 武美名誉教授に心より感謝致します。
また本研究の実施に際し多大なご協力を頂きました、キリンホールディングス株式会社 田隝
修氏、山田 小百合氏、並びにサントリービジネスエキスパート株式会社 藤居 亙氏 堀 妃佐
子氏、高柳 智美氏に心より感謝致します。
また研究の機会を与えて頂き、多大なご理解とご協力を頂きました、Meiji Seika ファルマ株式
会社 林 宏行氏、黒沢 亨博士、鈴木 幸吉博士、倉田 靖博士、平塚 一幸氏、土屋 敏行博士、
並びに安全性研究室の研究員の皆様に心より感謝致します。
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