〔実 13 頁〕 特 許 公 報（Ｂ２） (19)日本国特許庁（ＪＰ） (12) (11)特許番号 特許第5771833号 (45)発行日 （Ｐ５７７１８３３） (24)登録日 平成27年7月10日(2015.7.10) 平成27年9月2日(2015.9.2) (51)Int.Cl. ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/435 (2006.01) Ｃ０７Ｋ 14/435 Ａ０１Ｋ 67/04 (2006.01) Ａ０１Ｋ 67/04 Ｚ 請求項の数14 （全18頁） (21)出願番号 特願2010-203556(P2010-203556) (22)出願日 平成22年9月10日(2010.9.10) 岡本株式会社 (65)公開番号 特開2012-055269(P2012-55269A) 奈良県北葛城郡広陵町大字大塚１５０番地 (43)公開日 平成24年3月22日(2012.3.22) 審査請求日 平成25年6月19日(2013.6.19) (73)特許権者 592154411 の１ (74)代理人 100107456 弁理士 池田 成人 (74)代理人 100148596 弁理士 山口 和弘 (74)代理人 100123995 弁理士 野田 雅一 (74)代理人 100113435 弁理士 黒木 義樹 (74)代理人 100140578 弁理士 沖田 英樹 最終頁に続く (54)【発明の名称】核酸、核酸によりコードされるタンパク質、核酸が導入された組換え生物、及び組換え生物により 作られるタンパク質 1 2 (57)【特許請求の範囲】 核酸 【請求項１】 （ｇ）前記（ｅ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有 以下の（ａ）∼（ｄ）のいずれかの核酸。 する核酸 （ａ）配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸 （ｈ）前記（ｅ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな （ｂ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列を有するタン 条件下でハイブリダイズする核酸 パク質をコードする核酸 【請求項３】 （ｃ）前記（ａ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有 配列番号１の塩基配列を有する核酸と９５％以上の配列 し、牽引糸タンパク質をコードする核酸 同一性を有する、請求項２に記載の核酸。 （ｄ）前記（ａ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな 【請求項４】 条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコード 10 以下の（ｉ）∼（ｌ）のいずれかの核酸を含み、配列番 する核酸 号１９の塩基配列を有する核酸と９０％以上の配列同一 【請求項２】 性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸。 以下の（ｅ）∼（ｈ）のいずれかの核酸を含み、配列番 （ｉ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、 号１の塩基配列を有する核酸と９０％以上の配列同一性 ３３又は３５の塩基配列を有する核酸 を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸。 （ｊ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、 （ｅ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は ３４又は３６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー １７の塩基配列を有する核酸 ドする核酸 （ｆ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又 （ｋ）前記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有 は１８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする する核酸 ( 2 ) JP 5771833 B2 2015.9.2 3 4 （ｌ）前記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ 条件下でハイブリダイズする核酸 酸配列を有する牽引糸タンパク質。 【請求項５】 ［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｍ−（Ｘ５）ｍ−（Ｘ６ 配列番号１９の塩基配列を有する核酸と９５％以上の配 ）ｍ−Ｘ７−Ｘ８］ｎ（１） 列同一性を有する、請求項４に記載の核酸。 （式中、ｍはそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｎ 【請求項６】 は１∼１０の整数を示し、Ｘ１は配列番号３７∼４５の 請求項１∼５のいずれか一項に記載の核酸によりコード いずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ２は配列番号４６∼ されるタンパク質。 ５２のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ３は配列番号 【請求項７】 ５３∼５９のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ４は配 請求項１∼５のいずれか一項に記載の核酸が導入された 10 列番号４９のアミノ酸配列を示し、Ｘ５は配列番号６０ 非ヒト組換え生物。 又は６１のアミノ酸配列を示し、Ｘ６は配列番号６２∼ 【請求項８】 ６４のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ７は配列番号 請求項１∼５のいずれか一項に記載の核酸が導入された ６５∼７０のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ８は配 組換えカイコ。 列番号７１∼８１のいずれかのアミノ酸配列を示す。） 【請求項９】 【発明の詳細な説明】 請求項７に記載の非ヒト組換え生物により作られるタン 【技術分野】 パク質。 【０００１】 【請求項１０】 本発明は、核酸、核酸によりコードされるタンパク質、 請求項８に記載の組換えカイコにより作られる絹糸。 核酸が導入された組換え生物、及び組換え生物により作 【請求項１１】 20 られるタンパク質に関する。 以下の（ｍ）又は（ｎ）のアミノ酸配列を有する、牽引 【背景技術】 糸タンパク質。 【０００２】 （ｍ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列 クモの糸は、強度と弾性の組み合わせにより優れた強靭 （ｎ）前記（ｍ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同 性を有する天然の高性能ポリマーとして知られている。 一性を有するアミノ酸配列 クモには最大７つの特化した腺が存在し、これらは性質 【請求項１２】 の異なる多種類のクモ糸を産生するが、中でも、大瓶状 以下の（ｏ）又は（ｐ）のアミノ酸配列を有する、牽引 腺により産生される牽引糸は、最も強靭なクモ糸として 糸タンパク質。 、医療、航空、衣料等の様々な産業分野における新素材 （ｏ）以下の（ｏ−１）又は（ｏ−２）のアミノ酸配列 の開発において注目されている。 を有し、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の配列 30 【０００３】 同一性を有するアミノ酸配列 牽引糸を構成する主要タンパク質として、大瓶状腺スピ （ｏ−１）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１ ドロイン（Ｍａｊｏｒ ６又は１８のアミノ酸配列 ｒｏｉｎ：ＭａＳｐ）と称されるタンパク質が知られて （ｏ−２）前記（ｏ−１）のアミノ酸配列と９０％以上 おり、これまでに、クロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔ の配列同一性を有するアミノ酸配列 ｕｓ （ｐ）以下の（ｐ−１）又は（ｐ−２）のアミノ酸配列 ｒｏｄｅｃｔｕｓ を有し、配列番号２０のアミノ酸配列と９０％以上の配 ョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ 列同一性を有するアミノ酸配列 種々のクモのＭａＳｐタンパク質をコードする遺伝子配 （ｐ−１）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３ ２、３４又は３６のアミノ酸配列 Ａｍｐｕｌｌａｔｅ Ｓｐｉｄ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、ハイイロゴケグモ（Ｌａｔ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ）、北米ジ ｃｌａｖｉｐｅｓ）等、 列が明らかにされている（非特許文献１、２等）。 40 【先行技術文献】 （ｐ−２）前記（ｐ−１）のアミノ酸配列と９０％以上 【非特許文献】 の配列同一性を有するアミノ酸配列 【０００４】 【請求項１３】 【非特許文献１】Ｎａｄｉａ 前記（ｏ）のアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配 Ａ． ａｌ．，Ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ 列と９５％以上の配列同一性を有し、前記（ｐ）のアミ −Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ノ酸配列が、配列番号２０のアミノ酸配列と９５％以上 Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ の配列同一性を有する、請求項１２に記載の牽引糸タン ｎｅ パク質。 ，ｅ５１４ 【請求項１４】 【非特許文献２】Ｗｉｌｌｉａｍ 以下の一般式（１）で表されるアミノ酸配列、又は前記 50 ＩＶ Ａｙｏｕｂ ｅｔ ｆｏｒ ａ Ｈｉｇｈ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ： Ｓｐｉｄｅｒ Ｄｒａｇｌｉ Ｓｉｌｋ Ｇｅｎｅｓ，２００７，Ｉｓｓｕｅ６ Ａ． Ｇａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ( 3 ) JP 5 ａｎｄ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｓｉｌｋ Ｓｐｉｄｒｏｉｎ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ B2 2015.9.2 6 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ 5771833 １ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ Ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｉｎ ｃｌａｖｉｐｅｓ，Ｉｎｓｅｃｔ Ｎｅｐｈｉｌａ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ 酸を含み、配列番号１９の塩基配列を有する核酸と７０ ％以上、好ましくは８０％以上の配列同一性を有し、牽 引糸タンパク質をコードする核酸に関する。 （ｉ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、 ３３又は３５の塩基配列を有する核酸 ，２００８，１７（５），４６５−４７４ （ｊ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、 【発明の概要】 ３４又は３６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー 【発明が解決しようとする課題】 ドする核酸 【０００５】 （ｋ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有 しかし、各産業分野において、優れた物性を有する天然 10 する核酸 繊維に対する需要は高まる一方であり、更なる新素材の （ｌ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな 開発が期待されている。 条件下でハイブリダイズする核酸 【０００６】 【００１１】 そこで本発明は、天然繊維において、優れた物性を有す また、本発明は、上記核酸によりコードされるタンパク る新素材を提供することを目的とする。 質に関する。 【課題を解決するための手段】 【００１２】 【０００７】 上記本発明に係る特定の核酸によれば、従来のＭａＳｐ 本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ね タンパク質とは異なる優れた物性を有するＭａＳｐタン た結果、オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ パク質（牽引糸タンパク質）がコードされ、天然繊維に ｐｉｌｌ ｉｐｅｓ）の牽引糸を構成するＭａＳｐタンパク質をコ 20 おける新素材を提供することが可能となる。特に、本発 ードする遺伝子が、従来知られているＭａＳｐ遺伝子と 明の核酸によりコードされる牽引糸タンパク質（本発明 は異なる独特の構造を有することを見出し、本発明を完 に係るタンパク質）は、従来のものよりも優れた弾性（ 成するに至った。 又は弾力性、伸縮性、伸度、柔軟性）を有し、医療用品 【０００８】 、衣料品等をはじめ、様々な産業分野において、弾性が すなわち、本発明は、以下の（ａ）∼（ｄ）のいずれか 必要とされる用途に好適に用いられる。 の核酸に関する。 【００１３】 （ａ）配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸 さらに、本発明は、上記核酸が導入された組換え生物、 （ｂ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列を有するタン 及びその組換え生物により作られるタンパク質に関する パク質をコードする核酸 。本発明の組換え生物によれば、上記核酸によりコード （ｃ）上記（ａ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有 30 される物性の優れた牽引糸タンパク質の大量生産が可能 し、牽引糸タンパク質をコードする核酸 となる。上記組換え生物により作られるタンパク質は、 （ｄ）上記（ａ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな 物性の優れた牽引糸タンパク質を含むことにより、様々 条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコード な産業分野で好適に用いられる。 する核酸 【００１４】 【０００９】 特に、本発明は、上記核酸が導入された組換えカイコ、 また、本発明は、以下の（ｅ）∼（ｈ）のいずれかの核 及びその組換えカイコにより作られる絹糸に関する。本 酸を含み、配列番号１の塩基配列を有する核酸と７０％ 発明の組換えカイコによれば、上記核酸によりコードさ 以上、好ましくは８０％以上の配列同一性を有し、牽引 れる物性の優れた牽引糸タンパク質を含む絹糸の大量生 糸タンパク質をコードする核酸に関する。 産が可能となる。上記組換えカイコにより作られる絹糸 （ｅ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は 40 は、物性の優れた牽引糸タンパク質を含むことにより、 １７の塩基配列を有する核酸 従来の絹糸よりも優れた物性、特に、優れた弾性を有す （ｆ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又 るものとなる。 は１８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする 【００１５】 核酸 また、本発明は、以下の（ｍ）又は（ｎ）のアミノ酸配 （ｇ）上記（ｅ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有 列を有する、牽引糸タンパク質に関する。 する核酸 （ｍ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列 （ｈ）上記（ｅ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな （ｎ）上記（ｍ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同 条件下でハイブリダイズする核酸 一性を有するアミノ酸配列 【００１０】 【００１６】 また、本発明は、以下の（ｉ）∼（ｌ）のいずれかの核 50 また、本発明は、以下の（ｏ）又は（ｐ）のアミノ酸配 ( 4 ) JP 7 5771833 B2 2015.9.2 8 列を有する、牽引糸タンパク質に関する。 【００２１】 （ｏ）以下の（ｏ−１）又は（ｏ−２）のアミノ酸配列 【図１】ＮＰ−牽引糸タンパク質ＡのｃＤＮＡ配列を示 を有し、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上、好ま す図である。 しくは８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列 【図２】ＮＰ−牽引糸タンパク質Ａのアミノ酸配列を示 （ｏ−１）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１ す図である。 ６又は１８のアミノ酸配列 【図３】ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す （ｏ−２）上記（ｏ−１）のアミノ酸配列と９０％以上 写真図である。 の配列同一性を有するアミノ酸配列 【図４】ＮＰ−牽引糸タンパク質ＢのｃＤＮＡ配列を示 （ｐ）以下の（ｐ−１）又は（ｐ−２）のアミノ酸配列 す図である。 を有し、配列番号２０のアミノ酸配列と７０％以上、好 10 【図５】ＮＰ−牽引糸タンパク質Ｂのアミノ酸配列を示 ましくは８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列 す図である。 （ｐ−１）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３ 【発明を実施するための形態】 ２、３４又は３６のアミノ酸配列 【００２２】 （ｐ−２）上記（ｐ−１）のアミノ酸配列と９０％以上 以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を実施す の配列同一性を有するアミノ酸配列 るための形態について詳細に説明する。ただし、本発明 【００１７】 は以下の実施形態に限定されるものではない。 さらに、本発明は、以下の一般式（１）で表されるアミ 【００２３】 ノ酸配列、又は上記アミノ酸配列と９０％以上の配列同 本発明は、以下の（ａ）∼（ｄ）のいずれかの核酸に関 一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に関する する。 。 20 （ａ）配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸 ［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｍ−（Ｘ５）ｍ−（Ｘ６ （ｂ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列を有するタン ）ｍ−Ｘ７−Ｘ８］ｎ パク質をコードする核酸 （１） 【００１８】 （ｃ）上記（ａ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有 上記一般式（１）中、ｍはそれぞれ独立に０又は１の整 し、牽引糸タンパク質をコードする核酸 数を示し、ｎは１∼１０の整数を示し、Ｘ１は配列番号 （ｄ）上記（ａ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな ３７∼４５のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ２は配 条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコード 列番号４６∼５２のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ する核酸 ３は配列番号５３∼５９のいずれかのアミノ酸配列を示 【００２４】 し、Ｘ４は配列番号４９のアミノ酸配列を示し、Ｘ５は まず、本発明は、配列番号１又は１９の塩基配列を有す 配列番号６０又は６１のアミノ酸配列を示し、Ｘ６は配 30 る核酸（ａ）に関する。配列番号１又は１９の塩基配列 列番号６２∼６４のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ は、いずれも、ジョロウグモ属オオジョロウグモ（Ｎｅ ７は配列番号６５∼７０のいずれかのアミノ酸配列を示 ｐｈｉｌａ し、Ｘ８は配列番号７１∼８１のいずれかのアミノ酸配 パク質の主要成分である大瓶状腺スピドロイン（Ｍａｊ 列を示す。 ｏｒ 【００１９】 ｐ）と称されるタンパク質（ポリペプチド）をコードす 上記本発明に係るタンパク質は、その独特の構造により る遺伝子である。本明細書では、配列番号１の塩基配列 、従来の牽引糸タンパク質よりも優れた物性を有するた を有する核酸によりコードされるタンパク質を、「Ｎｐ め、様々な産業分野において好適に用いられる。 −牽引糸タンパク質Ａ」と称し、配列番号１９の塩基配 【発明の効果】 【００２０】 ｐｉｌｉｐｅｓ）の牽引糸を構成するタン Ａｍｐｕｌｌａｔｅ Ｓｐｉｄｒｏｉｎ：ＭａＳ 列を有する核酸によりコードされるタンパク質を、「Ｎ 40 ｐ−牽引糸タンパク質Ｂ」と称する。これらの核酸（ａ 本発明の核酸によれば、優れた物性を有するタンパク質 ）は、オオジョロウグモから取得したものであることを が提供される。また、本発明の組換え生物によれば、優 要さず、配列番号１又は１９の塩基配列を有するもので れた物性を有するタンパク質が大量生産できる。特に、 あれば、人工合成やゲノムライブラリー又はｃＤＮＡラ 本発明の組換えカイコによれば、優れた物性を有する絹 イブラリーから取得したものでもよく、これらをＰＣＲ 糸が大量生産できる。本発明により提供される牽引糸タ で増幅したものや制限酵素で切り出したものであっても ンパク質又は絹糸は、特に、優れた弾性を有するものと よい。 なる。このように、本発明によれば、天然繊維において 【００２５】 、弾性等の物性に優れた新素材を提供することが可能と 本発明の核酸は、配列番号２又は２０のアミノ酸配列を なる。 有するタンパク質をコードする核酸（ｂ）であってもよ 【図面の簡単な説明】 50 い。配列番号２又は２０のアミノ酸配列は、いずれも、 ( 5 ) JP 9 5771833 B2 2015.9.2 10 オオジョロウグモのＭａＳｐタンパク質が有するアミノ 【００２９】 酸配列である。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列 代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１ は、上記Ｎｐ−牽引糸タンパク質Ａが有するアミノ酸配 ．０Ｍ 列であり、配列番号２０のアミノ酸配列は、上記Ｎｐ− ８．３で約０．０１∼１．０ＭのＮａ 牽引糸タンパク質Ｂが有するアミノ酸配列である。 の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例え 【００２６】 ば、１０∼５０ヌクレオチド）については少なくとも約 また、本発明の核酸は、牽引糸タンパク質（ＭａＳｐ） ３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレ をコードするものであれば、配列番号１又は１９の塩基 オチドより長い）については少なくとも約６０℃である 配列を有する核酸と９０％以上の配列同一性を有する核 。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのよう 酸（ｃ）であってもよい。上記配列同一性は９０％以上 10 な不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書に であればよいが、９３％以上であることが好ましく、９ おけるストリンジェントな条件として、５０％のホルム ５％以上であることがより好ましく、９８％以上である アミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩 ことが更に好ましい。 衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１× 【００２７】 ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。 さらに、本発明の核酸は、牽引糸タンパク質をコードす 【００３０】 るものであれば、配列番号１又は１９の塩基配列を有す また、本発明の核酸は、以下の（ｅ）∼（ｈ）のいずれ る核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリ かの核酸を含み、牽引糸タンパク質をコードするもので ダイズする核酸（ｄ）であってもよい。本明細書におい あれば、配列番号１の塩基配列を有する核酸と７０％以 て、核酸の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に 上の配列同一性を有する核酸であってもよい。上記配列 基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇ 20 同一性は７０％以上であればよいが、７５％以上である に対するＣ）をいう。また、「ハイブリダイズ」とは、 ことが好ましく、８０％以上であることがより好ましく 上記相補鎖間で起こる相補的結合、又は一本鎖核酸分子 、８５％以上であることが更に好ましく、８８％以上で 間の塩基対相互作用の形成を意味する。 あることが特に好ましい。 【００２８】 （ｅ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は 本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、 １７の塩基配列を有する核酸 標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補 （ｆ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又 鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同 は１８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする 性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブ 核酸 リダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条 （ｇ）上記（ｅ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有 件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。よ 30 する核酸 り長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズ （ｈ）上記（ｅ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな する。一般に、ストリンジェントな条件は、規定された 条件下でハイブリダイズする核酸 イオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解 【００３１】 温度（Ｔｍ ）より約５℃低く選択される。Ｔｍ は、規定 上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１ されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配 ７の塩基配列は、配列番号１の塩基配列のうち、本発明 列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配 の優れた物性を有する牽引糸タンパク質をコードする上 列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェン で重要な特徴を有する配列である。このような特徴的配 トな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラ 列を有する核酸を含むことによって、配列番号１の塩基 メーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーショ 配列を有する核酸と７０％以上の配列同一性しか有しな ンの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ 40 い核酸であっても、配列番号１の塩基配列を有する核酸 （１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ と同様に、本発明の優れた物性を有する牽引糸タンパク ｑｕｅｓ Ｔｅｃｈｎｎｉ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎｄ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅ ｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ａｃｉｄ 配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８ のアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれ、上記 ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｂｅ 濃度（または他 【００３２】 配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ される。 ｏｆ ＋ 質をコードすることが可能となる。 Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉ ｚａｔｉｏｎ ＋ Ｎａ 未満であり、代表的には、ｐＨ７．０∼ 塩基配列によりコードされるタンパク質である。 ａｓｓ 【００３３】 Ｙｏｒｋ）に見出 上記核酸（ｇ）において、核酸（ｅ）との配列同一性は 50 ９０％以上であればよいが、９３％以上であることが好 ( 6 ) JP 11 5771833 B2 2015.9.2 12 ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％ 生物を示す。形質転換される対象となる被組換え生物と 以上であることが更に好ましい。 しては、特に制限はなく、昆虫、動物、植物、微生物等 【００３４】 を用いることができるが、昆虫を用いることが好ましい また、本発明の核酸は、以下の（ｉ）∼（ｌ）のいずれ 。好適な昆虫としては、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ かの核酸を含み、牽引糸タンパク質をコードするもので ｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ あれば、配列番号１９の塩基配列を有する核酸と７０％ 天蚕（てんさん）（Ａｎｔｈｅｒａｅａ 以上の配列同一性を有する核酸であってもよい。上記配 ｉ）、柞蚕（さくさん）（Ａｎｔｈｅｒａｅａ 列同一性は７０％以上であればよいが、７５％以上であ ｎｙｉ）等が挙げられる。なかでも、カイコガ科に属す ることが好ましく、８０％以上であることがより好まし るカイコ、クワコ等が好適に用いられ、特に、カイコを く、８５％以上であることが更に好ましく、８８％以上 10 用いることが好ましい。 であることが特に好ましい。 【００４０】 （ｉ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、 本明細書において、「カイコ」とは、カイコガ属カイコ ３３又は３５の塩基配列を有する核酸 （Ｂｏｍｂｙｘ （ｊ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、 の品種であっても、実用商品化された実用品種であって ３４又は３６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー もよい。 ドする核酸 また、「組換えカイコ」とは、遺伝子組換えにより外来 （ｋ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有 遺伝子がカイコ染色体に導入され、形質転換されたカイ する核酸 コを示す。遺伝子組み換えは、例えば、トランスポゾン （ｌ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな を用いる方法により行うが、外来遺伝子をカイコに導入 条件下でハイブリダイズする核酸 20 ｍｏｒ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、 ｙａｍａｍａ ｐｅｒ ｍｏｒｉ）をいう。カイコは、実験用 できる方法であれば制限はなく、エレクトロポレーショ 【００３５】 ン等の他の方法によって遺伝子組み換えを行ってもよい 上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３ 。 ３又は３５の塩基配列は、配列番号１９の塩基配列のう 【００４１】 ち、本発明の優れた物性を有する牽引糸タンパク質をコ 本明細書において、「絹糸」とは、カイコ（Ｂｏｍｂｙ ードする上で重要な特徴を有する配列である。このよう ｘ ｍｏｒｉ）により吐糸される繊維であり、繭を構成 な特徴的配列を有する核酸を含むことによって、配列番 し、フィブロインタンパク質を主成分とするものである 号１９の塩基配列を有する核酸と７０％以上の配列同一 。フィブロインタンパク質は、大小２つのサブユニット 性しか有しない核酸であっても、配列番号１９の塩基配 （Ｈ鎖及びＬ鎖）からなる。 列を有する核酸と同様に、本発明の優れた物性を有する 【００４２】 牽引糸タンパク質をコードすることが可能となる。 30 本明細書において、「オオジョロウグモ」とは、ジョロ 【００３６】 ウグモ属オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ 配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又 ｐｅｓ）をいい、オオジョロウグモの産地は特に限定さ ｐｉｌｉ は３６のアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれ れない。 、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、 【００４３】 ３３又は３５の塩基配列によりコードされるタンパク質 また、本発明は、以下の（ｍ）又は（ｎ）のアミノ酸配 である。 列を有する、牽引糸タンパク質に関する。 【００３７】 （ｍ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列 上記核酸（ｋ）において、核酸（ｉ）との配列同一性は （ｎ）上記（ｍ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同 ９０％以上であればよいが、９３％以上であることが好 一性を有するアミノ酸配列 ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％ 40 【００４４】 以上であることが更に好ましい。 上記アミノ酸配列（ｎ）において、上記（ｍ）のアミノ 【００３８】 酸配列との配列同一性は９０％以上であればよいが、９ また、本発明は、上記本発明の核酸が導入された組換え ３％以上であることが好ましく、９５％以上であること 生物及びその組換え生物により作られるタンパク質に関 がより好ましく、９８％以上であることが更に好ましい する。特に、本発明は、上記本発明の核酸が導入された 。 組換えカイコ及びその組換えカイコにより作られる絹糸 【００４５】 に関する。 また、本発明は、以下の（ｏ）又は（ｐ）のアミノ酸配 【００３９】 列を有する、牽引糸タンパク質に関する。 本明細書において、「組換え生物」とは、遺伝子組換え （ｏ）以下の（ｏ−１）又は（ｏ−２）のアミノ酸配列 により外来遺伝子が染色体に導入され、形質転換された 50 を有し、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の配列 ( 7 ) JP 13 5771833 B2 2015.9.2 14 同一性を有するアミノ酸配列 式（１）中、ｍはそれぞれ独立に０又は１の整数を示す （ｏ−１）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１ 。すなわち、繰り返し単位ごとに、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６ ６又は１８のアミノ酸配列 で表されるアミノ酸配列を有する場合と、有しない場合 （ｏ−２）上記（ｏ−１）のアミノ酸配列と９０％以上 とがある。 の配列同一性を有するアミノ酸配列 【００５３】 （ｐ）以下の（ｐ−１）又は（ｐ−２）のアミノ酸配列 式（１）中、Ｘ１は配列番号３７∼４５のいずれかのア を有し、配列番号２０のアミノ酸配列と７０％以上の配 ミノ酸配列を示し、Ｘ２は配列番号４６∼５２のいずれ 列同一性を有するアミノ酸配列 かのアミノ酸配列を示し、Ｘ３は配列番号５３∼５９の （ｐ−１）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３ ２、３４又は３６のアミノ酸配列 いずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ４は配列番号４９の 10 アミノ酸配列を示し、Ｘ５は配列番号６０又は６１のア （ｐ−２）上記（ｐ−１）のアミノ酸配列と９０％以上 ミノ酸配列を示し、Ｘ６は配列番号６２∼６４のいずれ の配列同一性を有するアミノ酸配列 かのアミノ酸配列を示し、Ｘ７は配列番号６５∼７０の 【００４６】 いずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ８は配列番号７１∼ 上記アミノ酸配列（ｏ）において、配列番号２のアミノ ８１のいずれかのアミノ酸配列を示す。 酸配列との配列同一性は７０％以上であればよいが、７ 【００５４】 ５％以上であることが好ましく、８０％以上であること また、本発明に係るタンパク質は、上記一般式（１）で がより好ましく、８５％以上であることが更に好ましく 表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有す 、８８％以上であることが特に好ましい。 るアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。上 【００４７】 記配列同一性は、９０％以上であればよいが、９３％以 同様に上記アミノ酸配列（ｐ）において、配列番号２０ 20 上であることが好ましく、９５％以上であることがより のアミノ酸配列との配列同一性は７０％以上であればよ 好ましく、９８％以上であることが更に好ましい。 いが、７５％以上であることが好ましく、８０％以上で 【００５５】 あることがより好ましく、８５％以上であることが更に 図１は、オオジョロウグモのＭａＳｐタンパク質の１種 好ましく、８８％以上であることが特に好ましい。 であるＮＰ−牽引糸タンパク質ＡのｃＤＮＡ配列を示す 【００４８】 図である。図１に示す遺伝子配列は、配列番号１の塩基 また、上記アミノ酸配列（ｏ−２）において、上記（ｏ 配列と同じである。 −１）のアミノ酸配列との配列同一性は９０％以上であ 【００５６】 ればよいが、９３％以上であることが好ましく、９５％ 図２は、図１に示す遺伝子配列（配列番号１の塩基配列 以上であることがより好ましく、９８％以上であること ）を有する核酸によりコードされるＮＰ−牽引糸タンパ が更に好ましい。 30 ク質Ａのアミノ酸配列を示す図である。図２に示すアミ 【００４９】 ノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列と同じである。 同様に、上記アミノ酸配列（ｐ−２）において、上記（ 【００５７】 ｐ−１）のアミノ酸配列との配列同一性は９０％以上で また、図４は、オオジョロウグモのＭａＳｐタンパク質 あればよいが、９３％以上であることが好ましく、９５ のほかの１種であるＮＰ−牽引糸タンパク質ＢのｃＤＮ ％以上であることがより好ましく、９８％以上であるこ Ａ配列を示す図である。図４に示す遺伝子配列は、配列 とが更に好ましい。 番号１９の塩基配列と同じである。 【００５０】 【００５８】 さらに、本発明は、以下の一般式（１）で表されるアミ 図５は、図４に示す遺伝子配列（配列番号１９の塩基配 ノ酸配列を有するタンパク質に関する。 列）を有する核酸によりコードされるＮＰ−牽引糸タン ［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｍ−（Ｘ５）ｍ−（Ｘ６ 40 パク質Ｂのアミノ酸配列を示す図である。図５に示すア ）ｍ−Ｘ７−Ｘ８］ｎ ミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列と同じであ （１） 【００５１】 る。 上記一般式（１）で表されるアミノ酸配列は、［Ｘ１− 【００５９】 Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｍ−（Ｘ５）ｍ−（Ｘ６）ｍ−Ｘ 図２又は図５に示すように、配列番号１又は１９の塩基 ７−Ｘ８］で表される繰り返し単位をｎ個有する。繰り 配列を有する核酸によりコードされる牽引糸タンパク質 返し単位の数（ｎ）は特に制限されないが、１∼１０で は、下記一般式（２）によって表されるアミノ酸配列か あることが好ましく、２∼９であることがより好ましく らなる。 、３∼８であることが更に好ましく、特にｎ＝８である ［（α）（Ｖ）（β）］ｑ ことが好ましい。 【００６０】 【００５２】 50 （２） 上記一般式（２）で表されるアミノ酸配列は、［（α） ( 8 ) JP 15 5771833 B2 2015.9.2 16 （Ｖ）（β）］で表される繰り返し単位をｑ個有する。 ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 繰り返し単位の数（ｑ）は特に制限されず、１∼１００ ｒｏｔｅｉｎｓ，２００４，ｐ．２ であればよいが、１∼１０であることが好ましく、２∼ 【００６６】 ９であることがより好ましく、３∼８であることが更に また、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質の（Ｖ）領 好ましく、特にｑ＝８であることが好ましい。 域（準結晶領域）には、親水性アミノ酸が豊富に含まれ 【００６１】 ている。表１に示すように、図２又は図５に示す牽引糸 上記式（２）において、（α）は、２∼４個のＧＧＸを タンパク質は、従来公知の北米ジョロウグモ（Ｎｅｐｈ 連続的に有するグリシンリッチな配列からなり、非結晶 ｉｌａ 性α−ヘリックス構造を形成する無定型領域を示す。（ ｅｐｈｉｌａ Ｖ）は、ＧＸ含有率の高い準結晶領域を示し、（β）は 10 酸を多く含む。これにより、本発明によって得られる牽 、アラニン又はトレオニンを豊富に含み、βプリーツシ 引糸タンパク質は、吸湿性が高いものになると考えられ ートを形成する結晶領域を示す。 る。また、牽引糸タンパク質の結晶化度が低いことも、 【００６２】 吸湿性を増加させる要因になっていると考えられる。 上記（α）及び（Ｖ）に含まれるＸは、グルタミン、ア 【００６７】 ラニン、セリン、ロイシン、プロリン、チロシン等であ さらに、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質の（β） る場合が多いが、これらに限定されず、ほかのアミノ酸 領域（結晶領域）には、ポリアラニンの合間に、トレオ であってもよい。また、Ｘは同一のアミノ酸である必要 ニン、アスパラギンなどの極性アミノ酸が含まれている はない。 。本発明によって得られる牽引糸タンパク質は、このよ 【００６３】 うに極性アミノ酸が豊富なポリアラニン（Ｐｏｌｙ（Ａ 以下、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質が有する独 20 ））モチーフを有することによって、優れた強靭性を有 特な分子構造と、それによって得られる牽引糸タンパク するものになると考えられる。 質の物性について説明する。 【００６８】 【００６４】 なお、極性アミノ酸が豊富なポリアラニン（Ｐｏｌｙ（ まず、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質の（α）領 Ａ））モチーフが糸に強靭性を付与することは、以下の 域（非結晶性無定型領域）においては、４個のＧＧＸが 文献にも記載されている。 連続して配列している。このような配列により、牽引糸 ・Ｇｌａｒｅｈ はα−ヘリックス構造を形成する。α−ヘリックス構造 ｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ は、通常、繊維中で曲がった状態で存在するが、引っ張 ｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ られることによって繊維軸に沿って直鎖状構造に変わる ｂｙ 。このように、外部からの応力に対してα−ヘリックス 30 １０，ｖｏｌ．４６５，ｐ．１ 構造が大幅に伸展することにより、繊維に弾性が付与さ ・Ｊ．Ｍ．ＧＯＳＬＩＮＥ，ｅｔ れる。一方、従来公知のクモ牽引糸タンパク質（ＭａＳ ＥＣＨＡＮＩＣＡＬ ｐ）には、４個のＧＧＸが連続して配列する構造は見ら Ｒ ＳＩＬＫＳ：ＦＲＯＭ れない（非特許文献１、２等参照）。以上のことから、 ＥＮＣＥ （α）領域において４個のＧＧＸが連続して配列する独 ＯＮ，１９９９，ｐ．３２９９ 自構造を形成することによって、本発明によって得られ 【００６９】 る牽引糸タンパク質は、弾性（又は弾力性、伸縮性、伸 また、表１に示すように、図２又は図５に示す牽引糸タ 度、柔軟性）が優れたものになると考えられる。 ンパク質は、従来公知の北米ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉ 【００６５】 ｌａ なお、ＧＧＸ繰り返しモチーフが糸に弾性を付与するこ 40 ｐｈｉｌａ とは、以下の文献にも記載されている。 アミノ酸を含む。このように分子内に大量に存在する極 ・Ｃｈｅｒｙｌ Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｍ Ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ｔｕｒａｌＢａｓｉｓ ｅｔ ｃｌａｖｉｐｅｓ）や日本産ジョロウグモ（Ｎ ｃｌａｖａｔａ）と比べて親水性アミノ Ａｓｋａｒｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓ ｏｆｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｌａｙ，２０ ａｌ．，ＴＨＥ ＤＥＳＩＧＮ Ｍ ＯＦ ＳＰＩＤＥ ＦＩＢＲＯＩＮ ＴＯ ＭＥＣＨＡＮＩＣＡＬ ＳＥＱＵ ＦＵＮＣＴＩ ｃｌａｖｉｐｅｓ）や日本産ジョロウグモ（Ｎｅ ｃｌａｖａｔａ）に対して、約２倍の極性 ａｌ．， 性アミノ酸残基は、外部からの応力に対して、分子を応 力の方向に沿って規則的に配列し、分子間の作用力を大 Ｓｔｒｕｃ Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｄｕｌａｒ ｄｅｒ Ｓｉｌｋｓ，１９９８，ｐ．７７９ ・Ｔｈｏｍａｓ ｐ Ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｆ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｎａｔｕｒｅ ｏｆ のとする。特に、分子間の水素結合が、糸繊維の強度増 Ｓｐｉ Ｓｃｈｅｉｂｅｌ，Ｓｐｉｄｅｒ ｉｌｋｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ 加に役立っていると考えられる。 【００７０】 ｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉ ｓ，ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｓｐｉｎｎｉｎｇ，ａｎｄ きくすることによって、牽引糸を優れた強度を有するも ｅ 50 表１に、オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｐｅｓ）、北米ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｐｉｌｉ ｃｌａ ｖｉｐｅｓ）、日本産ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ( 9 ) JP 17 5771833 B2 2015.9.2 18 ｃｌａｖａｔａ）のＭａＳｐタンパク質における極性ア ３１２−０１７）を用い、キュベットとしては０．１ｃ ミノ酸及び親水性アミノ酸の含有率（％）を示す。なお ｍサイズのものを用いた。 、極性アミノ酸の含有率は、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｃ（Ｃｙｓ 【００７７】 ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）及びＹ まず、キュベットを予め氷上で冷やしておき、コンピテ （Ｔｙｒ）の含有率を示し、親水性アミノ酸の含有率は ントセル（＞１０ 、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｑ（Ｇ 融かした後、１μｌのｃＤＮＡライブラリー溶液をチュ ｌｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、 ーブに添加した。この混合液をキュベットの底に一様に Ｓ（Ｓｅｒ）及びＴ（Ｔｈｒ）の含有率を示す。 なるように移した。エレクロポレーションの条件は、電 【００７１】 １ ０ ｃｆｕ／μｇ）５０μｌを氷上で 圧２．５ｋＶ、パルスコントローラー（Ｒ２ 【表１】 10 − ７ ）２０ ０Ω、キャパシタンス２５μＦとした。パルスを一回か け、可能な限り素早く１ｍｌのＳＯＣ培地（２％ ｃｔｏ ｅａｓｔ ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ ｅｘｔｒａｃｔ，１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｂａ Ｂａｃｔｏ ｙ ＮａＣｌ，２． 【実施例】 ５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１０ｍＭ Ｍ 【００７２】 ｇＳ０４ ，２０ｍＭ 以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明 え、溶液を懸濁した。懸濁液を培養チューブに移し１時 する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるもの 間から１時間半培養後、抗生物質（アンピシリン）、Ｉ ではない。 ＰＴＧ及びＸ−Ｇａｌを含むＬＢプレート（１％ 【００７３】 ｃｔｏ グルコース）をキュベット内に加 ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ Ｂａｃｔｏ ｙ 供試動物としては、７月に採集したオオジョロウグモ（ 20 ｅａｓｔ Ｎｅｐｈｉｌａ いた。プレートにできた白色コロニーをＬＢ（＋アンピ ｐｉｌｉｐｅｓ）の雌成虫を用いた。 ｅｘｔｒａｘｔ，０．５％ Ｂａ ＮａＣｌ）にま 【００７４】 シリン）培地に植菌させ、５８８個の組換えプラスミド （ＲＮＡ抽出） をランダムに選択し、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ Ｔｏｔａｌ アマシャム社製）を用いて精製した。 ｌａ ＲＮＡは、オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉ ｐｉｌｉｐｅｓ）の大瓶状腺から準備した。生理 食塩水（ＮａＣｌ ０．７５％）中でクモの大瓶状腺を Ｔ Ｍ Ｋｉｔ（ 【００７８】 （シークエンスと配列の比較解析） 解剖し、１ｍｌのＴＲＩＺＯＬを添加し、よく砕いた。 インサートの配列は、「ＡＢＩ 懸濁液は２００μｌのクロロホルムで分離し除去した。 ｔｉｃ 水層を別のチューブに移し、同量のイソプロパノールを ロジーズジャパン（株）製）とＴ７ｐｒｉｍｅｒを使用 加えＲＮＡを沈殿させた。沈殿物を７５％エタノールで 30 しシークエンスした。ＤＮＡとアミノ酸配列のコンピュ リンスし、−８０℃で保存した。その後、７５００ｒｐ ーター分析は、「Ｇｅｎｅｔｙｘ ｍ、４℃にて５分間遠心分離し、８分間真空乾燥したの （株）ゼネティック製）と「Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ち、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ．１４」（Ｄｅｍｏｖｅｒｓｉｏｎ）（Ｇｅｎｅ ｗａｔｅｒに溶解した。５ ａｎａｌｙｚｅｒ Ｐｒｉｓｍ ｇｅｎｅ ３１００」（ライフテクノ ｐａｃｋａｇｅ」（ ４ Ｃｏ ５℃で１０分間ＲＮＡを溶解した後、サンプルとして使 ｄｅｓ社製）を用いて行った。配列の比較はタンパク質 用した。 のデータベースに対してＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍ サンプルをアガロース電気泳動することにより、ＲＮＡ ｉｃｓ ｗｗｗ．ｅｘｐ が抽出できたことを確認した。 ａｓｙ．ｏｒｇ）のＳＩＢ 【００７５】 ｋ Ｓｅｒｖｉｃｅにより相同性分析を行った。 （ｃＤＮＡライブラリーの構築） 【００７９】 Ｇ−キャッピング法による大瓶状腺のｃＤＮＡライブラ 40 （糸腺特異的発現を証明する実験） リーの合成と構築は、タカラバイオ株式会社に委託した ＭａＳｐ（ｍａｊｏｒ 。ライブラリーベクター（ｐＤＮＲ−ＬＩＢ）は約５０ ｒｏｉｎ）は名前の通り、大瓶状腺で発現するとされて μｌのＴＥに溶解した。 いる。本発明の遺伝子が大瓶状腺で働いていることを証 【００７６】 明するため、ｃＤＮＡ配列の３’末端（アミノ酸配列の （クローニングとシークエンス） Ｃ末端）配列を用いてプローブを作成し、クモの四種類 高い確率で形質転換を行うため、エレクトロポレーショ 糸腺（鞭状腺、管状腺、大瓶状腺、小瓶状腺）から抽出 ン法を用いた。ＤＮＡ溶液としては、準備されたｃＤＮ したＲＮＡとノーザンハイブリダイゼーション実験を行 Ａライブラリー溶液を用い、コンピテントセルとしては った。図３は、ノーザンハイブリダイゼーションの結果 、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「Ｅｌｅｃｔｒｏ を示す図である。図３のレーン１∼４には、順に、鞭状 Ｔ Ｍ ＤＨ１２Ｓ Ｔ Ｍ ＭＡＸ Ｃｅｌｌｓ」（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８ 50 ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ；／ ＢＬＡＳＴ Ｎｅｔｗｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄ 腺、管状腺、大瓶状腺、小瓶状腺から抽出したＲＮＡを ( 10 ) JP 19 5771833 B2 2015.9.2 20 流した。この結果より、本発明の遺伝子（核酸）は、オ 【００８１】 オジョロウグモの大瓶状腺で特異的に発現していること 【表２】 が分かった。また、転写物質の分子量は約３∼４ｋｂで あると推測される。 【００８０】 （牽引糸の物性評価） 【００８２】 オオジョロウグモの牽引糸と、従来公知のクモの牽引糸 表２に示されるように、オオジョロウグモの牽引糸は、 の物性を比較するため、それぞれの伸度（弾性率）を測 従来公知のクモの牽引糸と比べて、優れた弾性を有する 定した。伸度の測定は、測定前日から、２０℃、ＲＨ６ ことが明らかとなった。すなわち、本発明の核酸が、優 ５％で２４時間放置し、吸湿量をバランス状態にした２ 10 れた弾性を有する牽引糸タンパク質をコードするもので ０ｍｍの各牽引糸をサンプルとして、２０℃、ＲＨ６５ あることが示された。 ％で引張り速度２０ｍｍ／ｍｉｎの条件のもと、引張試 【産業上の利用可能性】 験機「Ｔｅｎｓｉｌｏｎ 【００８３】 Ｔｏｙｏ ＵＴＭ−ＩＩＩ−１００」（ Ｂａｌｄｗｉｎ社製）を用いた伸度試験によ 本発明により提供される牽引糸タンパク質は、弾性等の り行った。従来公知のクモとしては、日本産ジョロウグ 物性に優れる天然繊維であるため、医療、航空、衣料等 モ（Ｎｅｐｈｉｌａ の様々な産業分野における新素材として、好適に用いら ｃｌａｖａｔａ）及びナガコガネ グモ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）を用い れる。 た。結果を表２に示す。 【図１】 【図４】 ( 11 ) 【図５】 【図２】 JP 【図３】 5771833 B2 2015.9.2 ( 12 ) 【配列表】 0005771833000001.app JP 5771833 B2 2015.9.2 ( 13 ) JP 5771833 B2 2015.9.2 ──────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (74)代理人 100126653 弁理士 (72)発明者 木元 克輔 趙 天福 奈良県北葛城郡広陵町大塚１５０番地の１ (72)発明者 奈良県北葛城郡広陵町大塚１５０番地の１ (72)発明者 岡本株式会社内 王 玉軍 中垣 岡本株式会社内 雅雄 長野県上田市古里１６６６−７ 審査官 (56)参考文献 伊達 利奈 特表２００８−５０６４０９（ＪＰ，Ａ） 特表２００５−５０２３４７（ＪＰ，Ａ） 国際公開第２００５／０６８４９５（ＷＯ，Ａ１） TAI,P.L. et al.，Inter-specific sequence conservation and intra-individual sequence va riation in a spider silk gene.，Int. J. Biol. Macromol.，２００４年１０月，Vol.34, No. 5，pp.237-43 WEN,H. et al.，Transgenic silkworms (Bombyx mori) produce recombinant spider dragline silk in cocoons.，Mol. Biol. Rep.，２０１０年 ４月，Vol.37, No.4，pp.1815-21 GOSLINE,J.M. et al.，The structure and properties of spider silk，Endeavour，１９８６ 年，Vol.10, No.1，pp.37-43 ZHAO,A. et al.，New and highly efficient expression systems for expressing selectively foreign protein in the silk glands of transgenic silkworm.，Transgenic Res.，２０１０ 年 ２月，Vol.19, No.1，pp.29-44 GAINES,W.A. 4th AND MARCOTTE,W.R. Jr，Identification and characterization of multiple Spidroin 1 genes encoding major ampullate silk proteins in Nephila clavipes.，Insect M ol. Biol.，２００８年 ９月，Vol.17, No.5，pp.465-74 SHEU,H.S. et al.，Lattice deformation and thermal stability of crystals in spider silk .，Int. J. Biol. Macromol.，２００４年１０月，Vol.34, No.5，pp.267-73 TSO,I.M. et al.，Giant wood spider Nephila pilipes alters silk protein in response to prey variation.，J. Exp. Biol.，２００５年 ３月，Vol.208, No.6，pp.1053-61 (58)調査した分野(Int.Cl.，ＤＢ名) Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ） ＰｕｂＭｅｄ ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）
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