新製品のご紹介 クロンテック社は蛍光タンパク質を幅広く ラインナップしています！ Living Colors® 蛍光タンパク質シリーズ Fruit 蛍光タンパク質シリーズ ＊本製品は Clontech Laboratories 社の製品です。 クロンテックの Living Colors® シリーズ（9 種類）と新製 品フルーツシリーズ（6 種類）の蛍光タンパク質は、天然に Discosoma sp. （DsRed の由来生物） 存在しているサンゴやクラゲ由来の蛍光タンパク質および その変異体で、至適な波長の励起光を吸収することにより 強い蛍光を発します。基質や補因子なしでタンパク質自身 Aequorea victoria （GFP の由来生物） が蛍光を発するため、生体内の現象を生きたまま、蛍光顕 微鏡や FACS（フローサイトメーター）などでリアルタイム に観察することが可能です。 白色光下 本稿では、蛍光タンパク質の基礎知識とクロンテックの蛍 光タンパク質製品の選択方法についてご紹介します。 ■ 蛍光タンパク質の歴史 緑色の蛍光タンパク質である GFP（Green Fluorescent Protein） は、オワンクラゲ Aequorea victoria から、Aequorin UV 照射下 （エクオリン）の青色の光（極大 470 nm） を緑色の光（508 nm） に変換するタンパク質として、1962 年に下村氏らによって発 見されました。1991 年に GFP の遺伝子がクローニングされ 図１ 蛍光タンパク質の由来生物 たことを機に、GFP は様々なレポーターとして利用されるよう になりました。しかし初期の蛍光タンパク質には、 「蛍光が暗 ■ 蛍光タンパク質の構造 い」 「凝集しやすい」 「発色までに時間がかかる」 「退色しやす 蛍光タンパク質の構造は GFP を中心に研究され、アミノ酸配 い」などの問題点がありました。 列や結晶構造解析から、折り畳まれたβ-シートのバレル状 そこでクロンテックでは、多年にわたって蓄積した遺伝子発 構造内部に埋もれた蛍光発色団をもつ強固な 3 次元構造を 現や蛍光タンパク質に関する知見に基づき蛍光タンパク質に とり、各種プロテアーゼにも強い抵抗性を示すことが知られ 様々な改変を行った結果、より明るく、構造的に安定で、検 ています（図 2） 。pH5 ∼ 12の間で蛍光が見られ、凍結融解 出までの時間も短い蛍光タンパク質の開発に成功しました。 や 70 ℃程度の加熱によっても蛍光は損なわれません。クロン クラゲ以外にも、サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質 DsRed を テックの緑色単量体 AcGFP は約 24 kDa、赤色単量体 DsRed- 改変することで、多彩なバリエーションの蛍光タンパク質が登 Monomer は約 27 kDa です。RCFP には 2 量体、4 量体の タイプもあり、いずれも物理化学的に非常に安定で、pH 変動 場しています（図１） 。 ® 現在販売中の Living Colors 蛍光タンパク質シリーズには、 や変性剤、有機溶媒にも耐性を示します。 8 種類の RCFP（Reef Coral Fluorescent Proteins） と AcGFP1 が含まれます。造礁サンゴ由来のRCFP には、シアン （藍色） （AmCyan1） 、緑色（ZsGreen1） 、黄色（ZsYellow1） 、 赤色（DsRed-Monomer、DsRed2、DsRed-Express） 、深 赤色（AsRed2、HcRed1） が揃っています。RCFP は強い蛍 光強度を示し、哺乳類細胞内で非常に安定なために長期の 観察に適しています。オワンクラゲ A. victoria の近縁種 A. coerulescens の遺伝子を改変した AcGFP1は、鮮やかな 緑色の蛍光を発します。AcGFP1は EGFP（GFP の変異体） とアミノ酸レベルで 94 ％の相同性を示し、EGFP と全く同様 なアプリケーションに使用可能です。これらの蛍光タンパク質 は実験に最適なツールとして多くの研究者の方にご愛用いた だき、文献にも多数紹介されています。 図２ GFP のβ-シートのバレル状構造 16 ● BIO VIEW No.54 表1 ウェスタンブロットで使用できる検出抗体選択ガイド ■ 蛍光タンパク質の検出 細胞に導入された蛍光タンパク質は翻訳後すぐに蛍光を発 するのではなく、酸素分子の存在下で徐々に発色団を形成 します。細胞のもつ自家蛍光にもよりますが、哺乳類細胞に Fruit ベクター 蛍光タンパク質 製品コード トランスフェクション後、早いもので約 5 時間、遅いものでも DsRed Polyclonal Antibody 製品コード 632392 , 632393 製品コード 632496 マウスモノクローナル抗体 ウサギポリクローナル抗体 （1 ： 1000） （1 ： 500） 約 72 時間で自家蛍光と識別できる蛍光の観察が可能です。 632522 細胞内での半減期は 24 時間以上で、比較的安定に存在し ます。また、長時間観察したい場合は、安定に形質導入す DsRed Monoclonal Antibody 632523 mCherry 632524 ることも可能です。これまでにたくさんのトランスジェニックア +++ +++ 632525 ニマルや組換え植物が作られてきました。 mRaspberry 632526 ++ +++ Living Colors® シリーズやフルーツシリーズでは、蛍光タンパ mPlum 632527 +++ +++ mBanana 632528 + +++ mOrange 632529 N.R. +++ mStrawberry 632530 ++ +++ ク質を検出するモノクローナル抗体やポリクローナル抗体もご 用意しています（表 1） 。これら抗体により、蛍光タンパク質 単体はもちろん、蛍光タンパク質との N 末端、C 末端融合タ ンパク質も検出可能です。 N.R.： not recommended ＊ Living Colors® 蛍光タンパク質を検出する抗体については、弊社ホームページをご覧下さい。 UV 照射下の Living Colors® 蛍光タンパク質 ■ クロンテックの蛍光タンパク質の特性と種類 クロンテックの蛍光タンパク質製品群は、489 nm ∼ 649 nm Oligomers 4 量体は蛍光強度が高く、レポーターとして最適！ にわたる広範囲の波長域をカバーしており、単量体、2 量体、 4 量体の 3 つのタイプがあります（表２、３） 。4 量体は蛍光強 度が強いため、レポーターとして最適です。目的遺伝子と蛍 光タンパク質を融合体として発現させる場合には、立体構造 AmCyan1 への影響が少ない単量体をお勧めします。また蛍光波長が ZsGreen1 ZsYellow1 DsRed2 AsRed2 離れている蛍光タンパク質を選択することで、二重あるいは Monomers 多重染色が可能です（図３） 。 単量体はコンパクトであり、 融合タンパク質として最適！ 表 2 Living Colors® 蛍光タンパク質の特性 タンパク質 励起極大 蛍光極大 検出までの 相対的な 波長 （nm） 波長（nm） 時間 （hr） 蛍光強度 構造 AcGFP1 レポーター 融合タンパク としての利用 としての利用 HcRed1 DsRed-Monomer 蛍光タンパク質の二重染色 Reef Coral Fluorescent Proteins(RCFPs)…サンゴ由来 DsRedMonomer 556 586 12 DsRed2 563 582 24 DsRedExpress 557 579 8 ∼ 12 AsRed2 576 592 8 ∼ 12 HcRed1 588 618 16 AmCyan 458 489 8 ∼ 12 ZsYellow 529 539 8 ∼ 12 ZsGreen 493 505 8 ∼ 12 Bright ++ Very Bright +++ Very Bright +++ Very Bright +++ Bright ++ Very Bright +++ Very Bright +++ Extremely Bright ++++ 単量体 Fair ++ Excellent ++++ 4 量体 Good +++ ++ 4 量体 Excellent ++++ Good +++ 4 量体 Good +++ ++ 2 量体 + ++ 4 量体 Good +++ ++ 4 量体 Good +++ ++ 4 量体 Excellent ++++ ++ AcGFP1 Fluorescent Proteins …オワンクラゲ由来 AcGFP1 475 505 8 ∼ 12 Very Bright +++ 単量体 Excellent Excellent ++++ ++++ 図 3 蛍光タンパク質の染色画像 表 3 Fruit 蛍光タンパク質の特性 タンパク質 励起極大 蛍光極大 相対的な 波長（nm） 波長 （nm） 蛍光強度 構造 レポーター 融合タンパク としての利用 としての利用 特徴 Fruit Fluorescent Proteins …サンゴ由来 mBanana 540 553 Fair + 単量体 mOrange 548 562 Extremely Bright ++++ 単量体 mStrawberry 574 596 Bright ++ 単量体 Good +++ Excellent ++++ mCherry 580 610 Bright ++ 単量体 Good +++ FRET での Excellent 使用例 ++++ あり mRaspberry 598 625 Bright ++ 単量体 Fair ++ Excellent ++++ mPlum 590 649 Bright ++ 単量体 Fair ++ Excellent ++++ Fair ++ Excellent ++++ FRET での Excellent Excellent 使用例 ++++ ++++ あり BIO VIEW No.54 ● 17 哺乳類細胞用 目的遺伝子と 蛍光タンパク質 （FP） を 融合させて発現したい 目的遺伝子と 生細胞中の細胞骨格や 蛍光タンパク質（FP）を 小器官の構造・機能を 同時に発現したい 調べたい プロモーター活性を 調べたい プロテアソーム 活性を調べたい N 末端 or C 末端融合ベクター pFP-N1 or pFP-C1 IRES 発現ベクター pIRES2-FP プロモーターレスベクター プロテアソームセンサー ベクター 【使用 FP】 AcGFP1 AmCyan1 AsRed2 DsRed2 DsRed-Express DsRed-Monomer HcRed1 ZsGreen1 ZsYellow1 mCherry 細菌・酵母＊・植物＊用 蛍光タンパク質 ベーシックベクター 【使用 FP】 AcGFP1 ZsGreen1 DsRed2 DsRed-Express 細胞内局在化ベクター pFP-1 【標的となる細胞内構造】 【使用 FP】 ・エンドソーム ・核 AcGFP1 ・ミトコンドリア ・微小管 DsRed2 ・小胞体 ・細胞膜 DsRed-Express ・ゴルジ体 HcRed1 ・ペルオキシソーム ZsGreen1 ・アクチンフィラメント mCherry pZsProsensor-1 【使用 FP】 AcGFP1 DsRed-Monomer DsRed2 HcRed1 pAcGFP1 pAmCyan pAsRed2 pDsRed2 pDsRed-Express pDsRed-Monomer pHcRed1 pZsGreen pZsYellow pmCherry pmPlum pmOrange pmBanana pmStrawberry pmRaspberry pGFP pGFPuv ベクターの詳細は右の パンフレットおよび リーフレットに記載されて いますのでご請求ください。 Clontech ホームページの カタログ・資料請求コーナー でパンフレットPDF を ご覧いただけます。 ＊遺伝子を切り出し、酵母、植物用ベクターに載せ換えてご使用ください。 図 4 蛍光タンパク質ベクター選択ガイド ■ 蛍光タンパク質ベクターの選択 既存の Living Colors® 蛍光タンパク質シリーズにフルーツ蛍 クロンテックでは、約 80 種類の蛍光タンパク質搭載ベクター 光タンパク質シリーズを追加することで、複数の目的タンパク を販売しています。目的タンパク質の N 末端または C 末端に 質について細胞内での局在化を調べる場合などに色彩の選 蛍光タンパク質を融合発現する汎用ベクターから、細胞内局 択肢の幅が広がります。これらはすべて単量体で、融合タン 在を調べるベクター、IRES 配列を介して蛍光タンパク質を パク質としての利用に最適です。また mCherry は細胞内で 発現するベクター、プロモーター活性検出用ベクター、ウイル 起こるタンパク質間の相互作用や分子レベルの事象を検出 スマーカーベクターなど、さまざまな用途に役立つベクターが するFRET 解析にもご利用いただけます。 揃っています。選択ガイド （図 4）を参考に最適なものをお選 びください。 ■ まとめ また発現系にあわせて、哺乳類細胞用ベクターと細菌用ベク 蛍光タンパク質は、単に機能未知タンパク質の局在を調べ ターの 2 タイプをご用意しています。哺乳類用ベクターは、哺 る蛍光タグとしてだけでなく、プロモーター活性をモニターす 乳類のコドン使用頻度に最適化してあるため、ヒト細胞内で るレポーターとして、あるいは細胞小器官などを生きたまま染 効率の良い発現が可能です。細菌用ベクターは大腸菌での 色するマーカーとして、哺乳類細胞・酵母・植物・菌類と様々 アッセイに用いるほか、蛍光タンパク質を制限酵素で切り出 な実験系で広く活用されています。実験に最適な蛍光タン してお好みのベクターに載せて使用するための遺伝子供給 パク質を選択することで、皆様の研究にお役立てください。 源にもなります。植物や酵母などの実験には、細菌用ベクタ ーから蛍光タンパク質遺伝子を載せ換えてご使用ください。 非営利施設または法人の方は、Living Colors® 蛍光タンパク質 ■ フルーツ蛍光タンパク質を新発売 今年 8月に発売を開始したフルーツ蛍光タンパク質は、カリ およびフルーツ蛍光タンパク質製品のご注文に際して、ライセンス 確認書が必要です。ご記入の上、取引代理店の営業担当者にお渡 しください。 フォルニア大学 Roger Tsien 博士らにより開発されたサンゴ 営利施設または法人の方は、使用目的に関わらず、ご購入に際し 由来の蛍光タンパク質です。その色彩がフルーツの色に似て てクロンテック社からライセンスを取得する必要があります。 いたことから、黄色（mBanana） 、オレンジ色（mOrange） 、赤 紫色（mPlum、mRaspberry、mStrawberry、mCherry） と 名づけられました。 18 ● BIO VIEW No.54 Living Colors® 蛍光タンパク質や新製品のフルーツ蛍光タンパク 質にご興味のある方は、お問い合わせください。 タカラバイオ （株） 営業企画担当 TEL. 077-543-7231 【参考文献】 1） DsRed-Monomer とGFP をレポーターとして使用 Link, CD., et al. :Conversion of Green Fluorescent Protein into a Toxic, Aggregation-prone Protein by C-terminal Addition of a Short Peptide. （2006）J. Biol. Chem., 281（3）, 1808-1816. 2） Living Colors ® シリーズの蛍光タンパク質（AmCyan, AsRed, DsRed, ZsGreen, ZsYellow） を植物の形質転換に利用 Wenck A., et al. :Reef-coral proteins as visual, non-destructive reporters for plant transformation.（2003）Plant Cell Rep., 22（4）, 244-251 ＜Clontechniques 秋号 2006 P26-28 掲載＞ 3） 酵母系で DsRed を核局在レポーターとして利用 Rodrigues, F., et al. :Red Fluorescent Protein（DsRed）as a Reporter in Saccharomyces cerevisiae.（2001）Journal of Bacteriology, 183（12）, 3791-3794. 4） マウスで乳がん細胞の転移を ZsGreen を用いてモニタリング Harrell JC., et al. :Estrogen Receptor Positive Breast Cancer Metastasis: Altered Hormonal Sensitivity and Tumor Aggressiveness in Lymphatic （18） , 9308-9315 Vessels and Lymph Nodes.（2006）Cancer Research, 66 ＜Clontechniques 初夏号2007 P25-27掲載＞ 5） GFP/mCherry で FRET 解析を実施 Tramier M., et al. :Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry pairs to donor photobleaching on FRET determination by fluorescence lifetime imaging microscopy in living cells.（2006）Microscopy Research and Technique, 69（11）, 933-939 ■ 製品一覧 ベクター 1 ：ホストセル 2 ：プロモーター 製品 コード 容量 価格（税別） a b ベクター 製品 コード 容量 価格（税別） a b 哺乳類汎用レポーターに！ N-末端融合蛍光タンパク質発現ベクター 1：哺乳類細胞 2：CMV IE 生細胞中の細胞骨格や小器官の構造機能の解析用に！ 細胞内局在化ベクター 1：哺乳類細胞 2：CMV IE pAcGFP1-Hyg-N1 632489 pAcGFP1-Actin 632453 ¥88,000 ¥264,000 pAcGFP1-N1 632469 pDsRed-Monomer-Actin 632479 ¥126,000 ¥319,000 pAcGFP1-N2 632483 pAcGFP1-Endo 632490 pAcGFP1-N3 632484 pAcGFP1-Golgi 632464 pAcGFP1-N （In-Fusion Ready） 632501 pDsRed-Monomer-Golgi 632480 pAcGFP1-Mito 632432 pDsRed-Monomer-Hyg-N1 632494 pAcGFP1-Nuc 632431 pDsRed-Monomer-N1 632465 pAcGFP1-Tubulin 632488 pAcGFP1-Mem 632491 pAcGFP1-Mem Hyg 632509 pDsRed-Monomer-Mem 632512 632513 各 20 µg 各¥88,000 各¥264,000 1 µg 営 ラ 各 20 µg 各¥126,000 各¥319,000 pDsRed-Monomer-N （In-Fusion Ready) 632498 1 µg pmCherry-N1 632523 20 µg ¥112,000 ¥275,000 C-末端融合蛍光タンパク質発現ベクター 1：哺乳類細胞 2：CMV IE pAcGFP1-Hyg-C1 632492 pDsRed-MonomerMem Hyg pAcGFP1-C1 632470 pDsRed-Monomer-F 632493 pAcGFP1-C2 632481 pDsRed-Monomer-F Hyg 632514 pAcGFP1-C3 632482 pAcGFP1-F 632511 pAcGFP1-F Hyg 632510 pAcGFP1-C （In-Fusion Ready） 632500 pDsRed-Monomer- Hyg-C1 632495 pDsRed-Monomer-C1 632466 各 20 µg 各¥88,000 各¥264,000 1 µg ¥88,000 ¥264,000 営 ラ 各 20 µg 各¥126,000 各¥319,000 pDsRed-Monomer-C （In-Fusion Ready) 632499 1 µg pmCherry-C1 632524 20 µg ¥112,000 ¥275,000 ¥88,000 ¥264,000 ¥126,000 ¥319,000 pmCherry 632522 pmRaspberry 632526 pmPlum 632527 pmBanana 632528 pmOrange 632529 pmCherry-1 632525 pmStrawberry 632530 632435 各¥88,000 各¥264,000 632468 ¥88,000 ¥264,000 pIRES2-AcGFP1 各¥126,000 各¥319,000 632467 1：哺乳類細胞 2：なし 安定発現細胞株の選択用に！ IRES 蛍光タンパク質発現ベクター 営 ラ pDsRed-Monomer 632497 営 ラ 各¥88,000 各¥264,000 各 20 µg pAcGFP1 pAcGFP1-1 ¥112,000 ¥275,000 ¥126,000 ¥319,000 細菌系でのアッセイや遺伝子の供給源に！ 蛍光タンパク質ベーシックベクター 1：細菌 2：lac プロモーター活性の研究に！ プロモーターレス蛍光タンパク質ベクター 各 20 µg 各¥88,000 各¥264,000 営 ラ 各 20 µg 各¥112,000 各¥275,000 1：哺乳類細胞 2：CMV IE 20 µg ¥88,000 ¥264,000 営 ラ ＊：Living Colors® シリーズの AcGFP および DsRed-Monomer のベクター製品とフルーツ蛍光タンパク質ベクター製品を掲載しています。 そのほかの蛍光タンパク質ベクターについての詳細はクロンテックウェブサイト （http://clontech.takara-bio.co.jp） をご覧ください。 a ：非営利施設対象価格です。 b：営利施設対象価格です。 営 営利施設の場合、ご購入前にライセンスを取得していただく必要があります。 ラ マークのある製品は、ご購入に際してライセンス確認書が必要になります。 本文中の製品に該当するライセンス確認事項は 43 ページをご覧ください。 ¤1 BIO VIEW No.54 ● 19
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