単年度試験研究成績課題の分類：（作成１１年１月）北陸農業生物工学 − 花き類−12 研究課題名：遺伝子組換えによる実用的新品種作出法の確立３新遺伝子導入法の検討２）ユリ培養細胞への遺伝子導入法の検討（３）アグロバクテリウムの感染効率の向上予算区分：県単・特別担当研究室：新潟農総研バイオ研究部研究期間：中平１０年度（平１０∼１３年度）担当者：六井勝協力・分担関係：１目的土壌細菌を利用したユリへの遺伝子導入方法を検討する。ここでは、効率的なアグロバクテリウム感染条件を検討する。２方法（１）供試材料無菌培養したシンテッポウユリ、オレンジブロッサムの子球、カルス誘導用固体培地（ＭＳ培地、ショ糖 30g/l、NAA0.1mg/l、BA1.0mg/l、ゲランガム 2g/l、pH 5.8）で 15 日間培養したシンテッポウユリ、紅姿、オレンジブロッサム、カサブランカ、アカプルコのリン片 Agrobacterium tumefaciens EHA101+ pIG121-Hm（名古屋大学農学部中村研三教授より分譲）（２）培地条件アグロバクテリウム懸濁培地： DKN 液体培地（ショ糖 30g/l、ピクロラム 1mg/l、アセトシリンゴン 10mg/l、pH5.8）共存培養培地： DKN 固体培地（ショ糖 30g/l、ブドウ糖 10g/l、ピクロラム 1mg/l、アセトシリンゴン 10mg/l、ゲランガム 2g/l、pH5.8）（３）培養方法アハイグロマイシン 50mg/l を添加した AB 固体培地で 25℃、暗黒条件で 4 日間培養したアグロバクテリウムを懸濁培地に懸濁した。イこの菌液に 5mm 角に調製したリン片またはカルスを 5 分間浸漬し、水分を除いた後、共存培養培地に置床した。ウ 25℃、暗黒条件で 7 日間培養した。（４）調査方法共存培養後 GUS アッセイし、ブルースポットの有無を観察した。染色液：1mM X-Gluc、20％メタノール、0.1％ Triton X-100、50mM リン酸バッファー３結果の概要（１）アグロバクテリウムの感染処理後、トランジェントアッセイを行ったところ、シンテッポウユリとオレンジブロッサムのリン片及びシンテッポウユリ、カサブランカ、アカプルコのカルス誘導用固体培地で培養したリン片でブルースポットが確認された（表、図）。しかし紅姿及びオレンジブロッサムのカルス誘導用固体培地で培養したリン片ではブルースポットは認められなかった。（２）カルス誘導用固体培地で培養したリン片ではカルス化した部分に、子球から切り取ったリン片では切断面でのみ、ブルースポットが確認された。（３）カルス誘導用固体培地で培養したリン片を用いて共存培養したシンテッポウユリで、もっとも多くのブルースポットが確認された。（４）カルス化して間もないカルスを材料に用い、共存培養期間を 7 日間とすることで、アグロバクテリウムの感染効率が向上した。表トランジェントアッセイの結果品種外植体ブルースポットの数＊ ++ シンテッポウユリ子球リン片 +++ カルス化リン片紅姿カルス化リン片 ‐ + オレンジブロッサム子球リン片カルス化リン片 ‐ ++ カサブランカカルス化リン片 + アカプルコカルス化リン片＊1 個あたりブルースポット数、+：0∼1、++：2∼4、+++：5∼ シンテッポウユリ（リン片の断面）シンテッポウユリ（カルス化リン片）オレンジブロッサム（リン片の断面）カサブランカ（カルス化リン片）アカプルコ（カルス化リン片）（対照）カサブランカ（懸濁培養カルス）図Ｘ−Ｇｌｕｃによる反応４今後の問題点と次年度以降の計画新規課題で形質転換植物体の獲得と遺伝子レベルでの解析を行う。５結果の発表・活用等特になし