新規酵素固定化用担体の開発と酵素阻害剤スクリーニングへの適用 ○飯田泰広神奈川工科大学安藝翔佐藤生男 [目的] 近年、薬剤スクリーニングが精力的に行なわれているが、そのスクリーニングにおいて最も重要な点は、得られる薬剤の性質が表現型であるスクリーニング法に依存する点であり、その活性評価法により取得できるリード化合物が異なってくることである。一般に、酵素阻害剤を対象としたスクリーニングには、バッチシステムが用いられているが、基質と試料（阻害剤）が共存しており、薬剤濃度の変化を考慮した阻害効果の評価が難しい。本研究室では、これまでに固定化酵素とFIA（Flow Injection Analysis）システムを組み合わせることにより、その点を容易に評価、より実質的に有用な薬剤をスクリーニングできる可能性を見出している。本研究では、スクリーニングの高効率化、微量サンプルを対象とすることを念頭に置き、新規の酵素固定化担体を開発、その特性を評価するとともに、酵素阻害剤スクリーニングへの適用を試みた。 [方法] 開発した新規固定化担体は、立体網目状構造を持ち、体積が小さくても大きな表面積を有するモノリスシリカカラムを基本としている。通常ではカラムを形成させた後、酵素固定化用にアミノ基を導入するが、本実験では、予めモノリスシリカの骨格にアミノ基を導入して作製することにより、煩雑なアミノ基導入の操作を簡略化することを可能としている。 γ-APTES（3-アミノプロピルトリエトキシシラン）に等量の pH5.5 50mM クエン酸塩緩衝液キャリヤー溶液 0.2 mL/min 回転式注入弁 20μL (Boc) ２ O ( 二炭酸ジ -tert- ブチル ) を加えることにより、排出 Boc-APTES を合成、 NMR,GC-MS により構造を確認した。 Boc-APTES、 N2 PEG(ポリエチレングリコール)、酢酸、TMOS(テトラメトキシシラン)を混合、乾燥させることにより、あらかじめアミノ基の導入されたモノリスシリカカラムを作製した。また、作成に用いる試薬の濃度などを変更し、固定化担体としての適性を比較、 N2 検討した。その評価には、GFP（緑色蛍光タンパク質）を用いて検出器排出ポンプ 0.05 mM ブロモチモールブルー pH 7.6 0.2mL/min 酵素カラム一体型ガス拡散デバイス記録計図1 FIAシステムモノリスシリカカラム表面での固定化状態を蛍光顕微鏡で確認するとともに、固定化率の計測を行った。また、キャピラリー内にモノリスシリカカラムを作製、FIA（フローインジェクション分析）システム（図 1）に導入し、送液時の圧力などの比較を行った。 [結果] 作製したモノリスシリカカラムにタンパク質を固定化可能であるかを検討した結果を図 2 に示す。図 2(b) に示すように、グルタルアルデヒド処理を行った後、GFP をカップリングさせたものは GFP 由来の蛍光を示すのに対して、GFP を作用させなかったもの図 2(a)からは蛍光が観察されず、当該カラムが予めアミノ基を骨格に有していることが示された。次に、当該カラム作成条件の検討を行った。作製の際、試薬を様々な比率で混合し、作製されたモノリスシリカに固定化を行い、その固定化率を評価するとともに、FIA システムに導入した際の圧力を評価した結果を図 3 に示す。TMOS:Boc-APTES:PEG 溶液が 1：2：3 の作成条件が固定化率も高く、圧力もそれほど高くないことから以後の実験 (a) (b) には、条件ｇ）により作製することとした。開発した新規モノリスシリカカラムを担体として、酸性ウレアーゼを固定化、FIA システムと組み合わせることにより、酸性ウレアーゼ阻害剤のスクリーニングに適用した。図2 GFPを固定化させた新規モノリスシリカカラムの高校顕微鏡像 (a) モノリスシリカカラムにグルタルアルデヒド処理を行ったもの（GFPを固定化していない）。(b) モノリスシリカカラムにグルタルアルデヒド処理を行い、 GFPを固定化させたもの。