DiversiLab™ Staphylococcus Kit

DiversiLab™ Staphylococcus Kit
Bacterial Barcodes, Inc.
BBCI Catalog Number: DL-SA01
bioMérieux
270628
48-Test Kit
ENGLISH
Not For Diagnostic Use.
Materials supplied in the kit
Rep-PCR Reagents
Storage Range: -10 to -30° C
Cap Color
Purple
Colorless
Colorless
Colorless
Name
Rep-PCR MM1
Primer Mix LL
Positive Control C3
Negative Control
Volume
864 µL
100 µL
16 µL
16 µL
Additional materials required, but not supplied
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Bacterial DNA isolation kit (UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit)
®
®
Taq DNA polymerase* (AmpliTaq DNA polymerase plus GeneAmp 10X PCR Buffer [containing 15mM MgCl2] by Applied
Biosystems)
®
Thermal cycler (GeneAmp PCR System 9600 or 9700 by Applied Biosystems)
Powder-free gloves, lab coat and eye protection
Pipettes: 0.1-10 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL, multi-channel or repeater pipette (optional)
Aerosol resistant barrier pipette tips: 0.1-10 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL
Microcentrifuge, variable speed
Cooler Trays: 0.2 mL and 1.5 mL
PCR tubes and caps: 0.2 mL
PCR tray retainer set
Rack to hold 0.2 mL and 1.5 mL tubes
Vortex
Intended use
The DiversiLab™ DNA fingerprinting kits are designed to generate rep-PCR DNA fingerprints from pure-cultured microbial
samples. These kits contain the reagents and buffers needed to set up PCR reactions using rep-PCR primers, starting from
extracted genomic DNA from microbial isolates.
Introduction
The DiversiLab DNA fingerprinting kits use rep-PCR technology, which takes advantage of the non-coding repetitive sequences
1,2,3
Key to the DiversiLab kit is primer sets that are
found interspersed throughout the genomes of all bacteria studied to date.
complementary to these repetitive sequences. When PCR is performed using these primer sets, the DNA sequences between
the repetitive elements are amplified. Thus, multiple fragments throughout the microbial genome are amplified simultaneously.
Principle of the DiversiLab System
The major steps involved in generating rep-PCR DNA fingerprints are as follows:
• Extract DNA from purified microbial cultures.
• Log sample information into the DiversiLab software (Internet-based).
• Perform rep-PCR amplification.
®
• Separate the DNA fragments using the Agilent 2100 Bioanalyzer.
• Compare fingerprints using the statistical analysis feature of the DiversiLab software.
®
* NOTICE: This kit should only be used with AmpliTaq DNA polymerase, a Taq DNA polymerase that may be covered by one or more patents,
which has been obtained from an authorized, licensed source. Neither the offer to sell nor the sale of this kit nor these instructions constitutes an
®
express or implied license to use AmpliTaq or other Taq DNA polymerases. Additionally, the use of a thermal cycler may require a license
under one or more patents held by third parties. This kit should only be used with an authorized, licensed thermal cycler. It is the sole
responsibility of the user of this kit to ensure that use of the kit does not infringe the patent rights of third parties. Thus, the user of this kit has the
responsibility to obtain any requisite license from parties other than the manufacturer and seller of this kit. Information on purchasing licenses to
®
use AmpliTaq may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, Inc. (www.appliedbiosystems.com).
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This document provides the specific procedure associated with rep-PCR amplification. Refer also to the DiversiLab Software
®
User's Guide and the DiversiLab Instructions for Use of LabChip Devices insert.
Instructions for use
•
•
•
This kit supplies sufficient reagents for the number of tests indicated. We recommend running a negative and positive
control for each rep-PCR experiment performed.
Do not use the components of this kit beyond the expiration date printed on the box.
Use available preventative measures to avoid contamination and cross-contamination of PCR tubes and reagents, including
but not limited to the following:
•
Separate the PCR workspace from other laboratory areas, especially those involving microbial samples or postamplification products.
•
Clean the workspace with 10% bleach, followed by 70% ethanol.
•
Change gloves often and use dedicated lab coats and equipment for pre- and post-PCR areas.
•
Separate pre-PCR and post-PCR areas as much as possible. Use nuclease-free, disposable tubes and aerosolresistant pipette tips.
Test limitations
•
•
•
This kit may not produce useful fingerprints with some microbial samples. Although repetitive sequences have been found
in all bacteria studied to date, it is possible that the primers supplied in this kit will not generate unique or discriminatory
fingerprints with some microbial strains.
The results obtained from using the DiversiLab kit may not be useful or reliable if the provided protocol is not followed
exactly, or if the results are applied in a manner for which they were not intended.
This product is not for diagnostic use and the results of this test should not be used to diagnose disease, or to cure,
mitigate, treat, or prevent disease in a patient.
Collection and preparation of samples
•
•
•
•
Proper purification of genomic DNA is critical for successful rep-PCR. Kit optimization has been performed with the
UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit. The UltraClean™ kit is available through bioMérieux (Mo Bio 50 Test Kit catalog #
270675 or Mo Bio 250 Test Kit catalog # 270676).
We recommend checking extraction consistency and DNA integrity by agarose gel electrophoresis.
If a spectrophotometer is available, best results are obtained from purified genomic DNA with an A260/A280 = 1.7-1.9.
Use 2 µL of genomic DNA at a concentration of 25-50 ng/µL in the rep-PCR protocol.
Procedure for the DiversiLab DNA fingerprinting kit
Step 1: Set up rep-PCR
1.
2.
3.
Prepare a master mix
Allow the contents of the rep-PCR reagent box and the 10X PCR buffer to thaw completely.
Vortex briefly and centrifuge each reagent tube at 10,000 x g for 3 seconds.
In a nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tube, add the following amounts of reagents for each amplification to be
performed:
•
•
Preparation must be set up on ice or in a PCR cooler tray.
We recommend adding reagents equivalent to one extra reaction for every 8-12 tests to be run (to compensate for
volume loss during pipetting). The volumes of reagents provided are sufficient provided a minimum of 8 samples is run
per setup.
Reagent
Volume/Reaction
Number of
Total Volume For Master
(µL)
Reactions
Mix (µL)
Rep-PCR MM1
18.0
N
18.0 x (N + extra)
GeneAmp® 10X PCR Buffer
2.5
N
2.5 x (N + extra)
Primer Mix LL
2.0
N
2.0 x (N + extra)
AmpliTaq® DNA Polymerase*
0.5
N
0.5 x (N + extra)
Total Volume
23.0
N
23.0 x (N + extra)
*Taq should be the last reagent added to the master mix and should be kept cold at all times.
1.
2.
3.
Aliquot master mix
Set up a nuclease-free PCR tube for each sample and control in a cold block or ice. Label the tubes according to the job
worksheet.
Thoroughly mix the contents of the master mix tube. Centrifuge at 10,000 x g for 5 seconds.
Aliquot 23 µL of the master mix into the bottom of each PCR tube.
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1.
2.
Add DNA to PCR tubes
Add 2 µL sample DNA (concentration of 25-50 ng/µL), Positive Control or Negative Control to the bottom of the
corresponding PCR tube. Pipette up and down several times to mix.
Cap the PCR tubes securely. Gently tap tubes on benchtop to bring reagents to the bottom. Return the tubes to the cold
block or ice.
Step 2: Perform rep-PCR amplification
1.
Program the thermal cycler as shown below.
Rep-PCR Protocol - repPCR45
Initial denaturation:
94°C 2 min
Repeat cycle:
35 cycles
Denaturation:
94°C 30 sec
Annealing:
45°C 30 sec
Extension:
70°C 90 sec
Final extension:
70°C 3 min
Hold:
4°C ∞
2.
3.
4.
5.
For optimal amplification, pause the program after allowing the thermal cycler to warm to 94°C during initial denaturation.
Insert the PCR tubes into the preheated thermal cycler.
Note: The temperature of the block will drop.
Resume the program after the thermal cycler temperature returns to 94°C.
®
Continue directly to DNA separation with the Caliper LabChip device, or store rep-PCR product at 4°C or -20°C. See
®
"Instructions for Use of LabChip Devices," provided with the DNA chips and DNA Chip Reagents and Supplies.
Possible sources of error
•
•
Pure microbial cultures must be used. Mixed or contaminated cultures may result in inconsistent fingerprints.
Contamination of microbial cultures, incomplete lysis of cells, carryover of reagents used during DNA extraction, and
fluctuations during rep-PCR amplification may cause the fingerprints to be weak or absent.
References
1.
2.
3.
Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J. 1994. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based
polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5:25-40.
Versalovic J, Koeuth T, Lupski J. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to
fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): 6823-6831.
Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J. 1998. Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) DNA fingerprinting of bacterial
genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York.
Contact information
Bacterial Barcodes, Inc.
425 River Road
Athens, GA 30602 USA
www.biomerieux.com
For technical assistance in the USA, contact bioMérieux Customer Service at 1-800-682-2666. Outside the USA, contact your local bioMérieux
Representative.
This article or its use is covered by one or more of the following U.S. patents: 5,523,217 and 5,691,136.
Agilent is a registered trademark of Agilent Technologies, Inc.
AmpliTaq and GeneAmp are registered trademarks of Applied Biosystems Corporation in the United States and/or other countries.
Caliper and LabChip are registered trademarks of Caliper Life Sciences in the United States and/or other countries.
DiversiLab is a trademark of bioMérieux, Inc.
UltraClean is a trademark of Mo Bio Laboratories, Inc.
November 2008
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DiversiLab™ Staphylococcus Kit
Bacterial Barcodes, Inc.
Referencia de BBCI: DL-SA01
bioMérieux
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Envase para 48 pruebas
ESPAÑOL
No destinado al uso diagnóstico.
Materiales suministrados en el envase
Reactivos Rep-PCR
Temperatura de almacenamiento: -10 a -30° C
Color de la tapa
Morado
Incoloro
Incoloro
Incoloro
Nombre
Rep-PCR MM1
Primer Mix LL
Positive Control C3
Negative Control
Volumen
864 µl
100 µl
16 µl
16 µl
Materiales adicionales necesarios pero no suministrados
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Envase para aislamiento de DNA bacteriano (UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit)
®
®
Taq DNA polimerasa* (AmpliTaq DNA polimerasa más GeneAmp 10X PCR Buffer [que contiene 15mM de MgCl2] de
Applied Biosystems)
Termociclador (GeneAmp® PCR System 9600 o 9700 de Applied Biosystems)
Guantes sin talco, batas de laboratorio y protección ocular
Pipetas: Pipeta de 0,1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl, multicanal o de repetición (opcional)
Puntas de pipeta con barrera resistente a aerosoles: 0,1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl
Tubos para microcentrifugación, 1,5 ml
Microcentrífuga, velocidad variable
Soporte refrigerado para tubos de 0,2 ml y 1,5 ml
Tubos y tapas PCR: 0,2 ml
Juego de bandejas PCR
Gradilla para tubos de 0,2 ml y 1,5 ml
Agitador vórtex
Uso previsto
Los envases para determinación de la identificación genética de DNA DiversiLab™ están diseñados para generar
identificaciones genéticas de DNA sobre producto de rep-PCR a partir de muestras microbianas de cultivos puros. Estos
envases contienen los reactivos y tampones necesarios para realizar reacciones PCR utilizando cebadores rep-PCR, a partir de
DNA genómico extraído de aislados microbianos.
Introducción
Los envases de determinación de la identificación genética de DNA DiversiLab™ utilizan la tecnología rep-PCR, que aprovecha las
1,2,3
Un
secuencias repetitivas no codificantes dispersas a lo largo de los genomas de todas las bacterias estudiadas hasta la fecha.
elemento clave del envase DiversiLab™ es la serie de juegos de cebadores que son complementarios a estas secuencias
repetitivas. Cuando se realiza la PCR utilizando estos juegos de cebadores, se amplifican las secuencias de DNA entre los
elementos repetitivos. De este modo, se amplifican simultáneamente múltiples chips a lo largo del genoma microbiano.
Principio del sistema DiversiLab
Los pasos principales involucrados en generar la identificación genérica de DNA rep-PCR son los siguientes:
•
Extraer el DNA de cultivos microbianos purificados.
•
Registrar la información de las muestras en el software DiversiLab™ (basado en Internet).
•
Realizar una amplificación rep-PCR.
®
* AVISO: Este envase sólo debe utilizarse con AmpliTaq DNA polimerasa, una Taq DNA polimerasa que puede estar cubierta por una o más
patentes, que se ha obtenido de una fuente autorizada, con licencia. Ni la oferta para vender este envase, ni la venta misma, ni estas
®
instrucciones constituyen una licencia expresa o implícita para usar AmpliTaq u otras Taq DNA polimerasas. Asimismo, la utilización de un
termociclador puede requerir una licencia bajo una o más patentes pertenecientes a terceros. Este envase sólo debe utilizarse con un
termociclador autorizado, con licencia. Es la exclusiva responsabilidad del usuario de este envase asegurar que la utilización del envase no
infrinja los derechos de patentes de terceros. Por tanto, el usuario de este envase tiene la responsabilidad de obtener cualquier licencia
requerida de terceros diferentes del fabricante y vendedor de este envase. Puede obtenerse información sobre la adquisición de licencias para
®
utilizar AmpliTaq poniéndose en contacto con el Director de Licencias de Applied Biosystems, Inc. (www.appliedbiosystems.com).
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•
Separar los chips de DNA utilizando el equipo Agilent® 2100 Bioanalyzer.
•
Comparar las identificaciones genéticas utilizando la función de análisis estadístico del software DiversiLab™.
Este documento proporciona un procedimiento específico asociado con la amplificación rep-PCR. Consulte también la guía del
®
usuario del software DiversiLab™ y el prospecto con instrucciones de DiversiLab™ para la utilización de dispositivos LabChip .
Instrucciones de uso
•
•
•
Este envase suministra suficiente cantidad de reactivos para el número de pruebas indicados. Recomendamos efectuar un
control negativo y positivo por cada experimento rep-PCR realizado.
No utilice los componentes de este envase después de la fecha de caducidad impresa en la caja.
Utilice las medidas preventivas disponibles para evitar la contaminación cruzada de los tubos y reactivos PCR, incluidas las
siguientes, sin limitarse a ellas:
•
Separe el espacio de trabajo PCR de otras áreas del laboratorio, especialmente aquellas relacionadas con muestras
microbianas o productos de amplificación posterior.
•
Limpie el espacio de trabajo con lejía al 10%, seguido de etanol al 70%.
•
Cámbiese los guantes con frecuencia y utilice batas de laboratorio y equipos dedicados para las áreas pre- y post-PCR.
•
Separe las áreas pre-PCR y post-PCR tanto como sea posible. Utilice tubos desechables sin nucleasa y puntas de
pipeta resistentes a aerosoles.
Limitaciones de la prueba
•
•
•
Este envase puede no producir identificaciones genéticas útiles en el caso de algunas muestras microbianas. Si se han
encontrado secuencias repetitivas en todas las bacterias estudiadas hasta la fecha, es posible que los cebadores
suministrados en este envase no generen huellas digitales únicas o discriminatorias en el caso de algunas cepas
microbianas.
Los resultados obtenidos al utilizar el envase DiversiLab™ pueden no resultar útiles o fiables si el protocolo recomendado
no se sigue al pie de la letra, o si los resultados se aplican de una manera para la cual no fueron destinados.
Este producto no sirve para uso diagnóstico y los resultados de esta prueba no deben utilizarse para diagnosticar
enfermedades, ni para curar, mitigar, tratar o prevenir enfermedades en un paciente.
Recolección y preparación de las muestras
•
•
•
•
Una purificación correcta del DNA genómico resulta crítica para realizar una rep-PCR satisfactoria. La optimización del
envase se ha realizado con el UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit. bioMérieux ofrece el envase UltraClean™ (envase
para 50 pruebas Mo Bio, referencia 270675, o envase para 250 pruebas Mo Bio, referencia 270676).
Recomendamos verificar la consistencia de la extracción y la integridad del DNA mediante electroforesis en gel de
agarosa.
Si hay un espectrofotómetro disponible, se obtienen resultados óptimos a partir de un DNA genómico purificado con un
valor de A260/A280 = 1,7-1,9.
Utilice 2 µl de DNA genómico a una concentración de 25-50 ng/µl en el protocolo rep-PCR.
Procedimiento para el envase de determinación de la identificación genética de DNA DiversiLab
Paso 1: Preparación de la rep-PCR
1.
2.
3.
Prepare la mezcla maestra
Permita que el contenido de la caja de reactivos de rep-PCR y del tampón 10X PCR se descongele completamente.
Agite brevemente en vórtex y centrifugue cada tubo de reactivo a 10.000 x g durante 3 segundos.
En un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml libre de nucleasa, agregue las cantidades siguientes de reactivos por cada
amplificación a realizar:
•
•
La preparación debe realizarse sobre hielo o en un soporte refrigerado para PCR.
Recomendamos agregar una cantidad de reactivos equivalente a una reacción adicional por cada 8-12 pruebas que
deban realizarse (para compensar la pérdida de volumen durante el pipeteado). Los volúmenes de reactivos provistos
son suficientes siempre y cuando se procese un mínimo de 8 muestras por configuración.
Reactivo
Volumen/reacción
Número de
Volumen total para la
(µl)
reacción
mezcla maestra (µl)
Rep-PCR MM1
18,0
N
18,0 x (N + adicional)
GeneAmp® 10X PCR Buffer
2,5
N
2,5 x (N + adicional)
Primer Mix LL
2,0
N
2,0 x (N + adicional)
AmpliTaq® DNA Polymerase*
0,5
N
0,5 x (N + adicional)
Volumen total
23,0
N
23,0 x (N + adicional)
*La Taq debe ser el último reactivo agregado a la mezcla maestra y debe mantenerse fría en todo momento.
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Adición de la mezcla maestra
Prepare un tubo de PCR libre de nucleasa por cada muestra y control en un bloque frío o hielo. Etiquete los tubos de
acuerdo con la hoja de trabajo.
2. Mezcle completamente el contenido del tubo de mezcla maestra. Centrifugue a 10.000 x g durante 5 segundos.
3. Separe una alícuota de 23 µl de la mezcla maestra en el fondo de cada tubo PCR.
Agregue DNA a los tubos PCR
1. Agregue 2 µl de DNA de muestra (concentración de 25-50 ng/µl), Control Positivo o Control Negativo al fondo del tubo de
PCR correspondiente. Pipetee arriba y abajo varias veces para mezclar.
2. Tape los tubos PCR de manera firme. Golpee delicadamente los tubos sobre la superficie de trabajo para llevar los
reactivos al fondo. Vuelva a colocar los tubos en el bloque frío o hielo.
Paso 2: Realizar una amplificación rep-PCR
1.
1.
Programe el termociclador tal como se indica a continuación.
Protocolo Rep-PCR - repPCR45
Desnaturalización inicial:
94°C 2 min
Número de ciclos:
35 ciclos
Desnaturalización:
94°C 30 seg
Hibridación:
45°C 30 seg
Extensión:
70°C 90 seg
Extensión final:
70°C 3 min
Retención:
4°C ∞
2.
3.
4.
5.
Para lograr una óptima amplificación, ponga el programa en pausa después de permitir que el termociclador se caliente a
94°C durante la desnaturalización inicial.
Inserte los tubos de PCR en el termociclador precalentado.
Nota: Disminuirá la temperatura del bloque.
Reinicie el programa después de que la temperatura del termociclador vuelva a 94°C.
®
Continuar directamente con la separación del DNA utilizando el dispositivo Caliper , o almacene el producto rep-PCR a
4°C o -20°C. Consulte "Instrucciones para la utilización de dispositivos LabChip®", provisto con los chips de DNA y los
reactivos para chips de DNA.
Fuentes posibles de error
•
•
Deben utilizarse cultivos microbianos puros. Una mezcla de cultivos o la presencia de cultivos contaminados pueden
producir identificaciones genéticas incoherentes.
La contaminación de los cultivos microbianos, una lisis incompleta de las células, una transferencia de los reactivos
utilizados durante la extracción del DNA y las fluctuaciones durante la amplificación rep-PCR puede causar que las huellas
genética sean débiles o ausentes.
Referencias
1.
2.
3.
Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J. 1994. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based
polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5:25-40.
Versalovic J, Koeuth T, Lupski J. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to
fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): 6823-6831.
Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J. 1998. Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) DNA fingerprinting of bacterial
genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York.
Información de contacto
Bacterial Barcodes, Inc.
425 River Road
Athens, GA 30602 USA
www.biomerieux.com
Para obtener asistencia técnica en EE. UU., póngase en contacto con el Servicio técnico de bioMérieux llamando al 1-800-682-2666. Fuera de
EE. UU., póngase en contacto con el representante local de bioMérieux.
Este artículo o su uso están cubiertos por una o más de las siguientes patentes de EE. UU.: 5.523.217 y 5.691.136.
Agilent es una marca registrada de Agilent Technologies, Inc.
AmpliTaq y GeneAmp son marcas registradas de Applied Biosystems Corporation en Estados Unidos y otros países.
Caliper y LabChip son marcas registradas de Caliper Life Sciences en Estados Unidos y otros países.
DiversiLab es una marca comercial de bioMérieux, Inc.
UltraClean es una marca comercial de Mo Bio Laboratories, Inc.
Noviembre de 2008
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DiversiLab™ Staphylococcus Kit
Bacterial Barcodes, Inc.
Référence du catalogue BBCI : DL-SA01
bioMérieux
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Coffret pour 48 tests
FRANÇAIS
Ne peut être utilisé à des fins diagnostiques.
Matériaux fournis dans le kit
Réactifs rep-PCR
Température de stockage : -10 à -30° C
Couleur bouchon
Mauve
Incolore
Incolore
Incolore
Nom
Rep-PCR MM1
Primer Mix LL
Contrôle positif C3
Contrôle négatif
Volume
864 µl
100 µl
16 µl
16 µl
Autre matériel nécessaire, mais non fourni
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Kit d’extraction de l’ADN bactérien (Kit d’extraction d’ADN UltraClean™)
®
®
ADN Taq polymérase* (ADN polymérase AmpliTaq avec tampon 10X PCR GeneAmp [contenant 15mM MgCl2] Applied
Biosystems)
®
Thermocycleur ( type Système GeneAmp PCR 9600 ou 9700 Applied Biosystems)
Gants non poudrés, blouse de laboratoire et protection des yeux
Pipettes : pipette 0,1-10 µl, 10-100 µl, 100-1 000 µl, multi-canaux ou à répétition (en option)
Embouts de pipette avec filtre résistant aux aérosols : 0,1-10 µl, 10-100 µl, 100-1 000 µl
Microtubes à centrifuger, 1,5 ml
Microcentrifugeuse à vitesse variable
Plateaux de refroidissement : 0,2 ml et 1,5 ml
Tubes et bouchons PCR : 0,2 ml
Plateaux PCR
Portoir pour contenir des tubes de 0,2 ml et 1,5 ml
Vortex
Utilisation
Les kits d’empreintes spécifiques ADN DiversiLab™ sont conçus pour générer des empreintes d'ADN par rep-PCR à partir
d’échantillons microbiens de cultures pures. Ces kits contiennent les réactifs et tampons nécessaires à l’exécution de réactions
de PCR utilisant des amorces rep-PCR, partant d’ADN génomique extrait d’isolats microbiens.
Introduction
Les kits d’empreintes d’ADN DiversiLab™ utilisent la technologie rep-PCR, qui utilise des séquences répétitives non codantes
1,2,3
Les réactifs DiversiLab™
que l’on trouve disséminées dans les génomes de toutes les bactéries étudiées à ce jour.
contiennent des jeux d’amorces complémentaires de ces séquences répétitives. Lorsque la PCR est effectuée en utilisant ces
jeux d’amorces, les séquences d’ADN entre les éléments répétitifs sont amplifiées. Ainsi, de nombreux fragments sont amplifiés
simultanément dans tout le génome microbien.
Principe du système DiversiLab
Les étapes principales impliquées dans la génération d’empreintes d’ADN rep-PCR sont les suivantes :
•
Extraction de l’ADN des cultures microbiennes purifiées.
•
Saisie des informations sur les échantillons dans le logiciel DiversiLab (basé sur l’Internet).
•
Amplification par rep-PCR.
•
Séparation des fragments d’ADN en utilisant l’Agilent® 2100 Bioanalyzer.
•
Comparaison des empreintes en utilisant la fonction d’analyse statistique du logiciel DiversiLab.
®
* NOTIFICATION : Ce kit ne doit être utilisé qu’avec l’ADN polymérase AmpliTaq , un ADN polymérase Taq qui peut être couvert par un ou
plusieurs brevets, qui ont été obtenus auprès d’une source autorisée, sous licence. Ni l’offre de vente, ni la vente de ce kit ou encore ces
®
instructions ne constituent une licence expresse ou implicite d’utilisation d’AmpliTaq ou autres ADN polymérases Taq. De plus, l’utilisation d’un
thermocycleur nécessite une licence sous un ou plusieurs brevets détenus par des tiers. Ce kit ne doit être utilisé que par un thermocycleur
autorisé, sous licence. Il appartient uniquement à l’utilisateur de ce kit de s’assurer que l’utilisation du kit n’enfreint pas les droits du brevet de
tiers. De ce fait, l’utilisateur de ce kit est responsable de l’obtention de toute licence requise par des tiers autres que le fabricant ou le vendeur
®
de ce kit. Il est possible de se procurer des informations concernant l’achat de licences pour utiliser AmpliTaq en contactant le directeur des
licences chez Applied Biosystems, Inc. (www.appliedbiosystems.com).
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Ce document fournit la procédure spécifique associée à l’amplification par rep-PCR. Se reporter au guide utilisateur du logiciel
®
DiversiLab et au mode d’emploi DiversiLab contenu dans les fiches techniques des dispositifs LabChip .
Mode d’emploi
•
•
•
Ce kit fournit suffisamment de réactifs pour le nombre de tests indiqués. Nous recommandons d’effectuer un contrôle
négatif et positif pour chaque série de rep-PCR effectuée.
Ne pas utiliser les composants de ce kit au-delà de la date d’expiration indiquée sur la boîte.
Prendre les mesures préventives suivantes afin d’éviter la contamination croisée des tubes et réactifs PCR :
•
Séparer l’espace de travail PCR des autres zones du laboratoire, tout spécialement celles impliquant des échantillons
microbiens ou des produits post-amplification.
•
Nettoyer l’espace de travail avec 10 % de Javel, suivi de 70 % d’éthanol.
•
Changer souvent de gants et utiliser du matériel ainsi que des blouses de laboratoires spéciaux pour les zones pré et
post-PCR.
•
Séparer les zones pré-PCR et post-PCR autant que possible. Utiliser des tubes sans nucléase et jetables ainsi que
des embouts de pipette avec filtres résistants aux aérosols.
Limites du test
•
•
•
Ce kit peut ne pas fournir de résultats utiles avec certains échantillons microbiens. Bien que des séquences répétitives
existent dans toutes les bactéries étudiées à ce jour, il est possible que les amorces fournies dans ce kit ne génèrent pas
d’empreintes uniques ou discriminantes avec certaines souches microbiennes.
Les résultats obtenus avec l’utilisation d’un kit DiversiLab™ peuvent ne pas être utiles ou fiables si le protocole fourni n’est
pas parfaitement suivi.
Ce produit n’est pas conçu pour une utilisation diagnostique et les résultats de ce test ne doivent pas être utilisés pour
diagnostiquer une maladie, ou pour soigner, limiter, traiter ou empêcher une maladie chez un patient.
Prélèvement et préparation d’échantillons
•
•
•
•
Une purification correcte de l’ADN génomique est essentielle pour une rep-PCR réussie. Le kit a été optimisé avec le kit
d’extraction de l’ADN UltraClean™. Le kit UltraClean™ est disponible chez bioMérieux (Mo Bio 50 Test Kit référence de
catalogue 270675 ou Mo Bio 250 Test Kit référence de catalogue 270676).
Nous recommandons de vérifier la qualité de l’extraction et l’intégrité de l’ADN par électrophorèse en gel d’agarose.
Si un spectrophotomètre est disponible, de meilleurs résultats sont obtenus à partir d’ADN génomique purifié avec un
A260/A280 = 1,7-1,9.
Utiliser 2 µl d’ADN génomique à une concentration de 25 à 50 ng/µl dans le protocole rep-PCR.
Procédure pour le kit d’empreintes d'ADN DiversiLab
Étape 1 : rep-PCR
1.
2.
3.
Préparer un mélange principal
Laisser le contenu de la boîte de réactif rep-PCR et le tampon 10X PCR décongeler complètement.
Agiter brièvement au vortex et centrifuger chacun des tubes de réactif à 10 000 x g pendant 3 secondes.
Dans un microtube à centrifuger sans nucléase de 1,5 ml, ajouter les volumes suivants de réactifs pour chaque
amplification à réaliser :
•
•
La préparation doit être faite sur de la glace ou dans un plateau de refroidissement PCR.
Nous recommandons d’ajouter des réactifs équivalents à une réaction supplémentaire tous les 8 à 12 tests à
exécuter (pour compenser la perte de volume en cours de pipetage). Les volumes de réactifs fournis sont suffisants à
condition qu’un minimum de 8 échantillons soit réalisé par préparation.
Réactif
1.
2.
3.
Volume/Réaction
Nombre de
Volume total pour
(µl)
réactions
mélange principal (µl)
Rep-PCR MM1
18,0
N
18,0 x (N + supplémentaire)
Tampon 10X PCR GeneAmp®
2,5
N
2,5 x (N + supplémentaire)
Primer Mix LL
2,0
N
2,0 x (N + supplémentaire)
ADN polymérase AmpliTaq®*
0,5
N
0,5 x (N + supplémentaire)
Volume total
23,0
N
23,0 x (N + supplémentaire)
*LaTaq polymérase doit être le dernier réactif ajouté au mélange principal et doit être conservé au froid en
permanence.
Aliquoter le mélange principal
Préparer un tube PCR sans nucléase pour chaque échantillon et contrôle dans un bloc froid ou de la glace. Étiqueter les
tubes en fonction de la feuille de travail.
Mélanger soigneusement le contenu du tube de mélange principal. Centrifuger à 10 000 x g pendant 5 secondes.
Aliquoter 23 µl du mélange principal dans le fond de chaque tube PCR.
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1.
2.
Ajouter l’ADN aux tubes PCR
Ajouter 2 µl d’échantillon d’ADN (concentration de 25 à 50 ng/µl), de contrôle positif ou contrôle négatif au fond du tube
PCR correspondant. Réaliser des cycles d’aspiration-refoulement avec la pipette pour mélanger.
Boucher fermement les tubes PCR. Tapoter doucement les tubes sur la paillasse pour amener les réactifs au fond.
Remettre les tubes dans le bloc froid ou la glace.
Étape 2 : Réaliser une amplification rep-PCR
1.
Programmer le thermocycleur comme indiqué ci-après.
Protocole Rep-PCR - repPCR45
Dénaturation initiale :
94° C 2 min
Cycle de répétition :
35 cycles
Dénaturation :
94° C 30 s
Renaturation :
45° C 30 s
Extension :
70° C 90 s
Extension finale :
70° C 3 min
Pose :
4° C ∞
2.
3.
4.
5.
Pour une amplification optimale, interrompre le programme après avoir laissé le thermocycleur chauffer à 94° C pendant la
dénaturation initiale.
Insérer les tubes PCR dans le thermocycleur préchauffé.
Remarque : La température du bloc va s’abaisser.
Reprendre le programme après que la température du thermocycleur soit revenue à 94° C.
Passer directement à l’étape de séparation des fragments d’ADN avec le dispositif Caliper® LabChip, ou bien stocker le
®
produit rep-PCR à 4° C ou -20° C. voir « Mode d’emploi des dispositifs LabChip », fourni avec les puces ADN et les
fournitures et réactifs puce ADN.
Sources d’erreur possibles
•
•
Les cultures microbiennes utilisées doivent être pures. Des cultures mixtes ou contaminées peuvent entraîner des résultats
incohérents.
La contamination des cultures microbiennes, une lyse incomplète des cellules, une contamination entre réactifs pendant
l’extraction de l’ADN et des fluctuations pendant l’amplification rep-PCR peuvent entraîner de mauvais résultats.
Références
1.
2.
3.
Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J. 1994. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based
polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5:25-40.
Versalovic J, Koeuth T, Lupski J. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to
fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): 6823-6831.
Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J. 1998. Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) DNA fingerprinting of bacterial
genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York.
Coordonnées des contacts
Bacterial Barcodes, Inc.
425 River Road
Athens, GA 30602 USA
www.biomerieux.com
Pour toute assistance technique aux États-Unis, contacter le Service clientèle de bioMérieux au 1-800-682-2666. En dehors des États-Unis,
contacter un représentant local de bioMérieux.
Cet objet, ou son utilisation, est protégé par un ou plusieurs des brevets américains suivants : 5 523 217 et 5 691 136.
Agilent est une marque déposée d’Agilent Technologies, Inc.
AmpliTaq et GeneAmp sont des marques déposées d’Applied Biosystems Corporation aux États-Unis et/ou dans d’autres pays.
Caliper et LabChip sont des marques déposées de Caliper Life Sciences aux États-Unis et/ou dans d’autres pays.
DiversiLab est une marque commerciale de bioMérieux, Inc.
UltraClean est une marque commerciale de Mo Bio Laboratories, Inc.
Novembre 2008
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DiversiLab™ Staphylococcus Kit
Bacterial Barcodes, Inc.
Numero di catalogo BBCI DL-SA01
bioMérieux
270628
Kit di 48 test
ITALIANO
Non per uso diagnostico
Materiali forniti nel kit
Reagenti Rep-PCR
Condizioni di conservazione: da -10 a -30° C
Colore tappo
Viola
Trasparente
Trasparente
Trasparente
Nome
Rep-PCR MM1
Primer Mix LL
Controllo positivo C3
Controllo negativo
Volume
864 µl
100 µl
16 µl
16 µl
Altri materiali necessari ma non forniti
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Kit i per l’estrazione del DNA batterico (UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit)
Taq DNA polimerasi* (DNA polimerasi AmpliTaq® più GeneAmp® 10X PCR Buffer [contenente15mM MgCl2] di Applied
Biosystems)
Termociclatore (GeneAmp® PCR System 9600 oppure 9700 di Applied Biosystems)
Guanti senza talco, camice da laboratorio e protezione per gli occhi
Pipette: da 0,1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl, multicanale o pipette ripetitrici (opzionali)
Punte per pipette aerosol resistenti: 0,1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl
Provette per microcentrifuga, 1,5 ml
Microcentrifuga a velocità variabile
Vassoi refrigeranti: da 0,2 ml e 1,5 ml
Provette e tappi per PCR: 0,2 ml
Vassoio portaprovette post PCR
Rack supporto provette da 0,2 ml e 1,5 ml
Vortex
Uso previsto
I kit DNA fingerprinting DiversiLab™ sono studiati per caratterizzare geneticamente tramite rep-PCR DNA campioni provenienti
da coltura microbica pura. Tali kit contengono i reagenti ed i buffer necessari ad avviare le reazioni PCR utilizzando primer repPCR a partire da DNA genomico estratto da isolati microbici
Introduzione
I kit DiversiLab per il fingerprinting del DNA di si basano sulla tecnologia rep-PCR, che utilizza sequenze ripetitive non
1,2,3
Essenziale per i kit DiversiLab sono i set di primer
codificanti disperse nel genoma di tutti i batteri studiati fino ad oggi.
complementari a tali sequenze ripetitive. Utilizzando tali set di primer per eseguire la PCR, vengonolamplificate le sequenze di
DNA tra gli elementi ripetitivi. Pertanto, vengono amplificati simultaneamente diversi frammenti del genoma microbico.
Principi del sistema Diversilab
Di seguito sono riportati i principali stepeseguiti per originare ilfingerprint del DNA con rep-PCR.
• Estrazione del DNA da colture microbiche purificate.
• Registrazione delle informazioni del campione nel software DiversiLab tramite Internet.
• Esecuzione dell’amplificazione rep-PCR.
®
• Separazione dei frammenti di DNA utilizzando Agilent 2100 Bioanalyzer.
• Confronto dei fingerprint utilizzando la funzione di analisi statistica del software DiversiLab.
Il presente documento fornisce la procedura specifica da utilizzare per l’amplificazione rep-PCR. Consultare anche la Guida
®
utente del software DiversiLab e le Istruzioni per l’uso dei dispositivi LabChip .
®
* ATTENZIONE: Questo kit deve essere utilizzato solamente con la DNA polimerasi AmpliTaq , una Taq DNA polimerasi che potrebbe essere
protetta da uno o più brevetti, ottenuti da fonti autorizzate e con licenza. Né l’offerta di vendita né la vendita del presente kit costituiscono una
®
licenza esplicita o implicita all'uso di AmpliTaq o altri Taq DNA polimerasi. Inoltre, l’uso di un termociclatore potrebbe richiedere la licenza ai
sensi di eventuali brevetti detenuti da terze parti. Il presente kit deve essere utilizzato solamente con un termociclatore autorizzato e con
licenza. L'utente del presente kit ha la responsabilità esclusiva dell'uso dello stesso senza incorrere in violazioni dei brevetti di terze parti.
Inoltre, l’utente del kit è responsabile per l’ottenimento delle licenze da parti diverse dal produttore e dal rivenditore del presente kit. Contattare il
®
Direttore delle licenze di Applied Biosystems, Inc. (www.appliedbiosystems.com), per informazioni sul rilascio della licenza d’uso di AmpliTaq .
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Istruzioni per l'uso
•
•
•
Il kit fornisce una quantità di reagenti sufficiente per il numero di test indicati. Si consiglia di eseguire un controllo positivo
ed un controllo negativo per ciascuna rep-PCR eseguita.
Non utilizzare i componenti del kit oltre ladata di scadenza stampata sulla confezione.
Utilizzare le misure di prevenzione disponibili per evitare contaminazioni e contaminazioni incrociate delle provette PCR e
dei reagenti. Tali misure includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo:
•
separazione dello spazio di lavoro riservato alla PCR dalle altre zone del laboratorio, in special modo le zone ove si
trattano campioni microbici o prodotti successivi all'amplificazione.
•
Pulizia dello spazio di lavoro con una soluzione di candeggina al 10%, seguita da una soluzione di etanolo al 70%.
•
Cambio frequente dei guanti e utilizzo di camici di laboratorio dedicati rispettivamente alle zone pre-PCR e post-PCR.
•
Maggior separazione possibile tra zone pre-PCR e zone post-PCR. Utilizzo di provette monouso prive di nucleasi e
puntali per pipette aerosol resistenti.
Limitazioni del test
•
•
•
Il kit potrebbe non produrre fingerprint utili con alcuni campioni microbici. Anche se alcune sequenze ripetitive sono state
trovate in tutti i batteri studiati ad oggi, è possibile che i primer forniti nel kit non generino fingerprint unici o discriminatori
per alcuni ceppi microbici.
I risultati ottenuti con l’uso del kit DiversiLab potrebbero non essere utili o affidabili se non si segue alla lettera il protocollo
fornito o se i risultati sono applicati in maniera non corretta.
Il prodotto non è inteso per uso diagnostico. Non utilizzare i risultati dei test per diagnosticare patologie o per curare,
alleviare, trattare o prevenire patologie nei pazienti.
Raccolta e preparazione dei campioni
•
•
•
•
Una corretta purificazione del DNA genomico è essenziale per la riuscita della rep-PCR. L’ottimizzazione del kit è stata
eseguita con UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit. Il kit UltraClean™ è disponibile da bioMérieux (Mo Bio 50 Test Kit n.
di catalogo 270675 oppure Mo Bio 250 Test Kit n. di catalogo 270676).
Si consiglia di controllare la compattezza dell'estrazione e l'integrità del DNA tramite elettroforesi su gel agarosio.
Nel caso fosse disponibile uno spettrofotometro, si osserva che i migliori risultati si ottengono da DNA genomico purificato
con A260/A280 = 1,7-1,9.
Utilizzare 2 µl di DNA genomico alla concentrazione di 25-50 ng/µl nel protocollo rep-PCR.
Procedura da utilizzare con il DNA fingerprinting kit DiversiLab
Operazione 1: preparazione della rep-PCR
1.
2.
3.
Preparazione della master mix
Lasciare sciogliere completamente il contenuto del contenitore dei reagenti rep-PCR e del buffer 10X PCR.
Agitare brevemente su Vortex e centrifugare ciascuna provetta dei reagenti a 10.000 x g per 3 secondi.
Dentro una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml priva di nucleasi, aggiungere le quantità di reagenti indicate in basso per
ciascuna amplificazione da eseguire.
•
•
Eseguire la preparazione su ghiaccio oppure sul vassoio refrigerante per PCR.
Si consiglia di aggiungere una quantità di reagente per una reazione supplementare (extra) ogni 8-12 test da
eseguire per compensare il volume perduto per pipettamento. I volumi indicati dei reagenti sono sufficienti per un
minimo di 8 campioni per preparazione.
Reagente
1.
2.
3.
Volume/Reazione
Numero di
Volume totale per master
(µl)
reazioni
mix (µl)
Rep-PCR MM1
18,0
N
18,0 x (N + extra)
Buffer GeneAmp® 10X PCR
2,5
N
2,5 x (N + extra)
Primer Mix LL
2,0
N
2,0 x (N + extra)
AmpliTaq® DNA Polimerasi*
0,5
N
0,5 x (N + extra)
Volume totale
23,0
N
23,0 x (N + extra)
*Aggiungere Taq come ultimo reagente alla miscela master mantenendola sempre a freddo.
Aliquotare la master mix
Preparare per ciascun campione e per il controllo una provetta per PCR priva di nucleasi nel blocco freddo o con ghiaccio.
Etichettare le provette secondo il foglio di lavoro.
Miscelare accuratamente i contenuti della provetta master mix. Centrifugare a 10.000 x g per 5 secondi.
Aliquotare 23 µl di master mix sul fondo di ciascuna provetta PCR.
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1.
2.
Aggiungere il DNA alle provette PCR.
Aggiungere sul fondo della corrispondente provetta PCR 2 µl di DNA campione (concentrazione di 25-50 ng/µl), il Controllo
Positivo o il Controllo Negativo. Pipettare verso l’alto e verso il basso diverse volte per miscelare.
Tappare bene le provette PCR. Picchiettare delicatamente le provette sul bancone per portare i reagenti sul fondo.
Riportare le provette nel blocco freddo o sotto ghiaccio.
Operazione 2: esecuzione dell’amplificazione rep-PCR.
1.
Programmare il ciclizzatore termico come illustrato di seguito.
Protocollo Rep-PCR - repPCR45
Denaturazione iniziale:
94°C 2 min
Ripetizione ciclo:
35 cicli
Denaturazione:
94°C 30 sec
Ibridazione:
45°C 30 sec
Estensione:
70°C 90 sec
Estensione finale:
70°C 3 min
Conservazione:
4°C ∞
2.
3.
4.
5.
Per ottenere un’amplificazione ottimale, mettere in pausa il programma dopo che il termociclatore ha raggiunto i 94°C
durante la denaturazione iniziale.
Inserire le provette PCR nel termociclatore preriscaldato.
Nota: la temperatura del blocco scenderà.
Riavviare il programma dopo che la temperatura del ciclizzatore termico è ritornata a 94°C.
Passare direttamente alla separazione del DNA con il dispositivo Caliper® LabChip oppure conservare i prodotti della rep®
PCR a 4°C o - 20°C. Consultare le “Istruzioni per l’uso dei dispositivi LabChip ” forniti con i DNA chip e con i reagenti DNA
Chip e le forniture .
Possibili fonti di errore
•
•
Utilizzare colture microbiche pure. Colture miscelate o contaminate potrebbero dare luogo a fingerprint incoerenti.
La contaminazione di culture microbiche, la lisi incompleta delle cellule, la contaminazione da carry-over dei reagenti
utilizzati durante l'estrazione del DNA e le fluttuazioni durante l'amplificazione rep-PCR potrebbero dare luogo a fingerprint
assenti o deboli.
Riferimenti
1.
2.
3.
Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J. 1994. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based
polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5:25-40.
Versalovic J, Koeuth T, Lupski J. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to
fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): 6823-6831.
Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J. 1998. Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) DNA fingerprinting of bacterial
genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York.
Contatti
Bacterial Barcodes, Inc.
425 River Road
Athens, GA 30602 USA
www.biomerieux.com
Per l'assistenza tecnica negli USA, rivolgersi al bioMérieux Customer Service al numero +1-800-682-2666. Al di fuori degli USA, rivolgersi al
rappresentante locale bioMérieux.
Questo prodotto e il suo uso sono coperti da almeno uno dei seguenti brevetti USA: 5.523.217 e 5.691.136
Agilent è un marchio registrato di Agilent Technologies, Inc.
AmpliTaq e GeneAmp sono marchi registrati di Applied Biosystems Corporation negli Stati Uniti e/o in altri paesi.
Caliper e LabChip sono marchi registrati di Caliper Life Sciences negli Stati Uniti e/o in altri paesi.
DiversiLab è un marchio di bioMérieux, Inc.
UltraClean è un marchio di Mo Bio Laboratories, Inc.
Novembre 2008
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DiversiLab™ Staphylococcus Kit
Bacterial Barcodes, Inc.
BBCI Catalog Number: DL-SA01
bioMérieux
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48 試験用
日本語
研究用
キット内容
Rep-PCR 試薬
貯法: -10 ～ -30° C
キャップの色
試薬名
Rep-PCR MM1
容量
864 µL
無色
Primer Mix LL
100 µL
無色
陽性コントロール C3
16 µL
無色
陰性コントロール
16 µL
紫色
付属していないその他の必要器具
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
細菌 DNA 抽出キット(UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit)
Taq DNA ポリメラーゼ*(AmpliTaq® DNA polymerase plus GeneAmp® 10X PCR Buffer [15mM MgCl2 含有] ：Applied
Biosystems 社製)
サーマルサイクラー(GeneAmp® PCR System 9600 または 9700 ：Applied Biosystems 社製等)
パウダーフリー手袋、実験着、保護メガネ
ピペット：0.1-10 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL, 可変式または連続分注ピペット（任意）
エアロゾルバリアーピペットチップ：: 0.1-10 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL
マイクロ遠心チューブ 1.5mL
マイクロ遠心機可変スピード型
保冷トレー：0.2mL および 1.5mL
PCR 用チューブおよびキャップ：0.2mL
PCR トレー/リテーナセット
0.2mL および 1.5mL チューブ立てラック
ボルテックスミキサー
用途
DiversiLab™ DNA フィンガープリンティングキットは、純培養微生物をサンプルに用い rep-PCR フィンガープリントを得るた
めに設計されました。これらのキットには、微生物分離株から抽出したゲノム DNA と、rep-PCR プライマーを使った PCR 反
応のために必要な試薬及び緩衝液が含まれます。
はじめに
DiversiLab DNA フィンガープリンティングキットには、現在までに研究済みである全ての細菌のゲノム上に散在して見られる
非コード反復配列を利用した rep-PCR 技術が使われています。1,2,3 DiversiLab キットの特徴は、これらの反復配列に相補的な
プライマーセットにあります。これらのプライマーセット使った PCR を行うことで、反復配列間の領域の DNA 配列が増幅さ
れます。これにより微生物のゲノムから多数の断片が同時に増幅されます。
DiversiLab システムの原理
Rep-PCR フィンガープリントを得るための主なステップ：
• 純培養微生物から DNA を抽出します。
• DiversiLab ソフトウェア(インターネット環境)にサンプル情報を記録します。
• Rep-PCR 増幅を行います。
®
• Agilent 2100 Bioanalyzer を使って DNA 断片を分離します。
• DiversiLab ソフトウェアの機能の 1 つである統計分析を使ってフィンガープリントの比較を行います。
* ご注意:
本キットは、許可およびライセンスを受けたサーマルサイクラーを用いた上でご使用下さい。本キットの使用が第三者
の特許権を侵害しないことを請け負う責任は、キットをご使用になる使用者にあります。よって、製造者および販売者以
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外の団体から必要なライセンスの取得は使用者の責任となります。AmpliTaq®を使用するためのライセンスについての情報
は、アプライドバイオシステム社へお問い合わせ下さい。
®
本書では特に rep-PCR に関連した作業手順を説明しています。DiversiLab ソフトウェアユーザーガイドおよび LabChip
®
に添付されている"Instructions for Use of LabChip Devices"を参照してください。
使用方法
•
•
•
キットには、規定の使用回数に対する十分量の試薬が含まれています。rep-PCR 試験を行う際には陰性および陽性コント
ロールを測定することをお勧めします。
外箱に記載されている有効期限を過ぎた試薬は使用しないでください。
下記以外にも PCR チューブおよび試薬の汚染および二次汚染を避けるために可能な予防措置を行ってください。
•
実験室では、特に微生物サンプルまたは増幅後検体が含まれる作業域から PCR 作業スペースを隔離してください。
•
10%ブリーチで作業スペースを洗浄後、さらに 70%エタノールで洗浄してください。
•
定期的に手袋を交換し、PCR 区域の前後で専用の器具および実験着を使用してください。
•
可能な限り PCR 前後のエリアを分けてください。ヌクレアーゼフリーのディスポーザブルチューブおよびエアロゾル
バリアーピペットチップを使用してください。
制限事項
•
•
•
このキットでいくつかの微生物サンプルから有用なフィンガープリントが得られないことがあります。現在までの研究で
全ての細菌で反復配列が見つかっていますが、いくつかの微生物株では、このキットに供給されているプライマーで固有
のまたは識別可能なフィンガープリントが得られないことがあります。
DiversiLab キットの操作方法に正確に従っていなかったり、目的と異なる適用で用いた場合、得られた結果が有用でない
または信頼性に欠けることがあります。
この製品は、体外診断薬として使用できません。そのため得られた結果を、患者の診断、治療、処置、予防などに使用す
ることはできません。
サンプルの採取及び準備
•
•
•
•
良好な rep-PCR 反応を得るためには、ゲノム DNA の適切な精製が重要です。最適なキットは、弊社から販売している
UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit です（Mo Bio 50 テストキット（品番 270675）または Mo Bio 250 テストキット
（品番 270676））。
アガロースゲル電気泳動で DNA 抽出の一貫性および完全性を確認することをお勧めします。
分光光度計を使用する場合は、精製ゲノム DNA が A260/A280 = 1.7-1.9 であると最適な状態です。
rep-PCR の操作では、ゲノム DNA 濃度 20-50ng/µL を 2µL 使用します。
DiversiLab DNA フィンガープリンティングキットの操作手順
Step 1: rep-PCR のセットアップ
Master mix の準備
1.
rep-PCR キットに含まれる各試薬および 10XPCR バッファーを完全に解凍します。
2.
各試薬を軽くボルテックスし、10,000 x g で 3 秒間遠心分離します。
3.
増幅に使用する各試薬を下記の手順と容量でヌクレアーゼフリーの 1.5 mL マイクロ遠心チューブに加えます：
•
•
試薬の準備は、必ず氷冷箱または PCR クーラートレー中で行ってください。
1 度に行なう測定は常に 8-12 テストとし、それに 1 反応分を加えた試薬を調製することをお勧めします（ピペット操
作による試薬ロスを補正するため）。各試薬量は、１回のセットアップあたりの測定が最低 8 サンプルとした場合に
十分な量が供給されています。
試薬
Rep-PCR MM1
GeneAmp® 10X PCR Buffer
Primer Mix LL
AmpliTaq® DNA Polymerase*
総容量
容量/反応
(µL)
18.0
2.5
2.0
0.5
23.0
反応数
N
N
N
N
N
Master Mix の総容量
(µL)
18.0 x (N + extra)
2.5 x (N + extra)
2.0 x (N + extra)
0.5 x (N + extra)
23.0 x (N + extra)
*Taq は、最後に master mix に加えてください。また、随時保冷するようにしてください。
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Master mix の等分
1.
氷中に各サンプルおよびコントロール用のヌクレアーゼフリーPCR チューブを準備してください。Rep-PCR worksheet に
従ってチューブにラベルをしてください。
2.
master mix チューブの内容物を完全に混和し、10,000 x g で 5 秒間遠心分離します。
3.
各 PCR チューブの底に master mix を 23 µL ずつ等分します。
PCR チューブへの DNA の添加
1.
DNA サンプル (濃度：25-50 ng/µL), 陽性コントロール、陰性コントロール 2 µL を相当する PCR チューブの底に加え、ピ
ペットで数回吸引排出を繰り返して混和します。
2.
安全のために PCR チューブにキャップをして静かにチューブをタップすることで試薬を底部に集め、氷中に戻します。
Step 2: rep-PCR 増幅の実施
1.
下記の条件でサーマルサイクラーをプログラムします。
Rep-PCR プロトコール- repPCR45
94°C 2 min
初期変性:
35 cycles
リピートサイクル:
94°C 30 sec
変性:
45°C 30 sec
アニーリング:
70°C 90 sec
伸張:
70°C 3 min
最終伸張:
4°C ∞
保持:
2.
増幅を最適化するために、初期変性中にサーマルサイクラーを 94°C に加温しプログラムを一時停止にします。
3.
加温されたサーマルサイクラーに PCR チューブを挿入します。
Note: ブロックの温度が低下します。
4.
サーマルサイクラーが 94°C に戻った後、プログラムを再開します。
5.
Caliper® LabChip device で DNA 分離を直接続けて行うか、4°C または-20°C で rep-PCR 産物を保存します。LabChip®に
添付されている"Instructions for Use of LabChip® Devices"を参照してください。
エラーの要因
•
•
純培養微生物菌体を必ず使用してください。混合または汚染した培養物は、矛盾したフィンガープリントの原因になりま
す。
菌体培養のコンタミネーション、細胞の不完全な溶解、DNA 抽出に用いた試薬の残存、rep-PCR 増幅中の変動はフィンガ
ープリントが弱くなったり欠損する原因となることがあります。
参考文献
1.
2.
3.
Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J. 1994. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based
polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5:25-40.
Versalovic J, Koeuth T, Lupski J. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to
fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): 6823-6831.
Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J. 1998. Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) DNA fingerprinting of bacterial
genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York.
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お問合せ
シスメックス株式会社
CS センター
〒651-2241
神戸市西区室谷１丁目３番地の 2
TEL 0120-265-034
シスメックス・ビオメリュー株式会社
〒141-0032
東京都品川区大崎一丁目 2 番 2 号
大崎セントラルタワー8 階
TEL 03-6834-2666（代表）
この説明書およびその使用は、米国特許番号 5,523,217 、 5,691,136 にて保護されています。
Agilent は Agilent Technologies Inc が所有し、使用している登録済み商標です。
AmpliTaq および GeneAmp は Applied Biosystems Corporation が米国もしくはまた米国以外の国で使用している登録済み商標で
す。
Caliper および LabChip は Caliper Life Sciences が米国もしくはまた米国以外の国で使用している登録済み商標です。
DiversiLab bioMérieux, Inc.はの登録商標です。
UltraClean は Mo Bio の登録商標です。
November 2008
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DiversiLab™ Staphylococcus Kit
Bacterial Barcodes, Inc.
Referência de Catálogo BBCI: DL-SA01
bioMérieux
270628
Embalagem de 48 testes
PORTUGUÊS
Não se Destina à Utilização em Diagnóstico.
Materiais fornecidos na embalagem
Reagentes Rep-PCR
Armazenar entre: -30 ° e -10 °C
Cor da Tampa
Roxo
Incolor
Incolor
Incolor
Nome
Rep-PCR MM1
Mistura de Primers LL
Controlo Positivo C3
Controlo Negativo
Volume
864 µL
100 µL
16 µL
16 µL
Outros materiais necessários, mas não fornecidos
•
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•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Embalagem de extracção de ADN bacteriano (UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit)
Taq ADN polimerase* (AmpliTaq® DNA polymerase e GeneAmp® 10X PCR Buffer [contendo 15 mM de MgCl2] da Applied
Biosystems)
Termociclador (GeneAmp® PCR System 9600 ou 9700 da Applied Biosystems)
Luvas sem pó, bata e protecção ocular
Pipetas: Pipeta multicanal ou de repetição de 0,1–10 µL, 10–100 µL, 100–1000 µL (opcional)
Pontas de pipetas com filtro para barreira a aerossóis: 0,1–10 µL, 10–100 µL, 100–1000 µL
Tubos de microcentrifugação, 1,5 mL
Microcentrífuga, velocidade variável
Suportes de refrigeração: 0,2 mL e 1,5 mL
Tubos PCR com tampas: 0,2 mL
Conjunto de retenção de tabuleiros PCR
Suporte com capacidade para tubos de 0,2 mL e 1,5 mL
Vórtex
Aplicação
As embalagens de fingerprinting de ADN (impressão digital genética) DiversiLab™ destinam-se a criar fingerprintings de ADN
por rep-PCR a partir de culturas puras de amostras microbianas. Estas embalagens contêm os reagentes e tampões
necessários para preparar reacções de PCR utilizando primers rep-PCR, começando pelo ADN genómico extraído a partir de
isolados microbianos.
Introdução
As embalagens de fingerprinting DiversiLab utilizam a tecnologia rep-PCR, que tira partido das sequências repetitivas não
1,2,3
A característica principal da
codificantes espalhadas ao longo dos genomas de todas as bactérias estudadas até à data.
embalagem DiversiLab consiste nos conjuntos de primers que complementam estas sequências repetitivas. Quando a PCR
tem lugar utilizando estes conjuntos de primers, as sequências de ADN entre os elementos repetitivos são amplificadas. Assim,
verifica-se simultaneamente a amplificação de múltiplos fragmentos em todo o genoma microbiano.
Princípio do Sistema DiversiLab
As principais etapas envolvidas na criação de fingerprintings de ADN por rep-PCR são descritas em seguida:
•
Extrair o ADN de culturas puras microbianas.
•
Registar as informações das amostras no software DiversiLab (situado na Internet).
•
Realizar uma amplificação por rep-PCR.
®
* AVISO: Esta embalagem só deve ser utilizada com AmpliTaq DNA polymerase, uma Taq ADN polimerase que pode estar coberta por uma
ou mais patentes e que tenha sido obtida junto de uma fonte autorizada e licenciada. Nem a oferta de venda, nem a venda desta embalagem
®
nem estas instruções constituem uma licença expressa ou implícita de utilização de AmpliTaq ou outras Taq ADN polimerases. Além disso, a
utilização de um termociclador poderá necessitar de uma licença ao abrigo de uma ou mais patentes detidas por terceiros. Esta embalagem só
deve ser utilizada com um termociclador autorizado e licenciado. É da exclusiva responsabilidade do utilizador desta embalagem garantir que a
utilização da mesma não transgride os direitos das patentes pertencentes a terceiros. Assim, o utilizador desta embalagem é responsável por
obter qualquer licença necessária de outras entidades além da do fabricante e vendedor desta embalagem. Para obter informações
®
relativamente à aquisição de licenças de utilização do AmpliTaq deve-se contactar o Director de Licenciamento da Applied Biosystems, Inc.
(www.appliedbiosystems.com).
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•
Separar os fragmentos de ADN utilizando o Agilent® 2100 Bioanalyzer.
•
Comparar os fingerprintings utilizando a funcionalidade de análise estatística do software DiversiLab.
Este documento fornece o procedimento específico associado à amplificação por rep-PCR. Consultar também o Guia do
®
Utilizador do Software DiversiLab e as Instruções DiversiLab para Utilização dos dispositivos LabChip .
Instruções de utilização
•
•
•
Esta embalagem contém reagentes suficientes para o número de testes indicado. Recomendamos que seja executado um
controlo negativo e um positivo para cada experiência de rep-PCR realizada.
Não utilizar os componentes desta embalagem após a data de validade impressa na caixa.
Utilizar as medidas de prevenção disponíveis por forma a evitar a contaminação e contaminação cruzada dos tubos de
PCR e reagentes, incluindo mas sem se limitar ao seguinte:
•
Separar o espaço de trabalho para PCR de outras áreas do laboratório, especialmente nos casos que envolvem
amostras microbianas ou produtos de pós-amplificação.
•
Limpar o espaço de trabalho com lixívia a 10%, seguida de etanol a 70%.
•
Trocar de luvas com frequência e utilizar batas de laboratório e equipamento dedicados para as áreas de pré e pós-PCR.
•
Separar as áreas de pré-PCR e pós-PCR o máximo possível. Utilizar tubos descartáveis sem nuclease e pontas de
pipetas com filtro.
Limitações do teste
•
•
•
Esta embalagem poderá não produzir fingerprintings úteis com algumas amostras microbianas. Embora tenham sido
observadas sequências repetitivas em todas as bactérias estudadas até à data, é possível que os primers fornecidos nesta
embalagem não criem fingerprintings únicos ou discriminatórios com determinadas estirpes microbianas.
Os resultados obtidos a partir da utilização da embalagem DiversiLab poderão não ser úteis ou fiáveis, caso o protocolo fornecido
não seja seguido de forma exacta ou se os resultados forem utilizados numa aplicação para a qual não eram destinados.
Este produto não se destina a ser utilizado em diagnóstico e os resultados deste teste não devem ser utilizados no
diagnóstico de doenças ou para curar, mitigar, tratar ou prevenir a ocorrência de uma doença num doente.
Colheita e preparação das amostras
•
•
•
•
Uma purificação adequada do ADN genómico é essencial para se obter uma técnica de rep-PCR bem sucedida. A
optimização dos resultados obtidos com esta embalagem foi realizada com UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit. A
embalagem UltraClean™ está disponível junto da bioMérieux (embalagem de 50 testes “Mo Bio 50 Test Kit”, ref. de
catálogo nº 270675, ou embalagem de 250 testes “Mo Bio 250 Test Kit”, ref. de catálogo nº 270676).
Recomendamos a verificação da consistência de extracção e da integridade do ADN através de electroforese em gel de agarose.
Caso esteja disponível um espectrofotómetro, são obtidos melhores resultados a partir de ADN genómico purificado com
A260/A280 = 1,7–1,9.
Utilizar 2 µL de ADN genómico com uma concentração de 25–50 ng/µL no protocolo rep-PCR.
Procedimento para a utilização da embalagem de fingerprinting de ADN DiversiLab
Etapa 1: Preparar a técnica rep-PCR
1.
2.
3.
Preparar a mistura principal
Aguardar até que o conteúdo da caixa de reagentes de rep-PCR e o tampão 10X PCR descongelem completamente.
Colocar no vórtex por breves momentos e centrifugar cada tubo de reagente a 10.000 x g durante 3 segundos.
Num tubo de microcentrifugação de 1,5 mL sem nuclease, adicionar as seguintes quantidades de reagentes para cada
procedimento de amplificação a realizar:
•
•
A preparação tem de ser realizada sobre gelo ou num suporte de refrigeração PCR.
Recomendamos a adição de reagentes por forma a equivaler a uma reacção extra para cada 8 a 12 testes a serem
executados (para compensar a perda de volume durante a pipetagem). Os volumes de reagentes fornecidos são
suficientes desde que sejam realizados, no mínimo, 8 amostras por preparação.
Reagente
Volume/Reacção
Número de
Volume Total para a
(µL)
Reacções
Mistura Principal (µL)
Rep-PCR MM1
18,0
N
18,0 x (N + extra)
GeneAmp® 10X PCR Buffer
2,5
N
2,5 x (N + extra)
Mistura de Primers LL
2,0
N
2,0 x (N + extra)
AmpliTaq® DNA Polymerase*
0,5
N
0,5 x (N + extra)
Volume Total
23,0
N
23,0 x (N + extra)
*Taq deverá ser o último reagente adicionado à mistura principal e deve ser mantido sempre frio.
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2.
3.
1.
2.
Obter alíquotas da mistura principal
Preparar um tubo PCR sem nucleases para cada amostra e controlo num bloco frio ou em gelo. Rotular os tubos de acordo
com a folha de trabalho.
Homogeneizar completamente o conteúdo do tubo da mistura principal. Centrifugar a 10.000 x g durante 5 segundos.
Transferir uma alíquota de 23 µL da mistura principal para o fundo de cada tubo PCR.
Adicionar ADN aos tubos PCR
Adicionar 2 µL de ADN extraído (concentração de 25–50 ng/µL), de Controlo Positivo ou de Controlo Negativo no fundo do
tubo PCR. Pipetar para cima e para baixo várias vezes para misturar.
Tapar os tubos PCR de forma segura. Bater ligeiramente com os tubos na bancada para que os reagentes assentem no
fundo. Voltar a colocar os tubos no bloco frio ou em gelo.
Etapa 2: Realizar a amplificação por rep-PCR
1.
Programar o termociclador conforme apresentado em baixo.
Protocolo Rep-PCR - repPCR45
Desnaturação inicial:
94 °C 2 min
Ciclo de repetição:
35 ciclos
Desnaturação:
94 °C 30 seg
Hibridização:
45 °C 30 seg
Extensão:
70 °C 90 seg
Extensão final:
70 °C 3 min
Paragem:
4 °C ∞
2.
3.
4.
5.
De modo a obter-se uma amplificação óptima, colocar o programa em pausa depois de deixar que o termociclador aqueça
até aos 94 °C, durante a desnaturação inicial.
Inserir os tubos de PCR no termociclador pré-aquecido.
Nota: A temperatura do bloco vai descer.
Retomar o programa depois da temperatura do termociclador regressar aos 94 °C.
®
Prosseguir directamente para a separação de ADN com o dispositivo Caliper LabChip ou armazenar o produto rep-PCR a 4 °C
®
ou -20 °C. Consultar as “Instruções de Utilização dos Dispositivos LabChip ”, fornecidas com os chips de ADN e Acessórios e
Reagentes de Chips de ADN.
Possíveis origens de erro
•
•
Têm de ser utilizadas culturas puras microbianas. A utilização de culturas mistas ou contaminadas poderá resultar em
fingerprintings inconsistentes.
A contaminação de culturas microbianas, a lise incompleta das células, a contaminação dos reagentes utilizados durante a
extracção de ADN e flutuações durante a amplificação por rep-PCR poderão provocar fingerprintings fracos ou ausentes.
Referências
1.
2.
3.
Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J. 1994. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based
polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5:25-40.
Versalovic J, Koeuth T, Lupski J. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to
fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): 6823-6831.
Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J. 1998. Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) DNA fingerprinting of bacterial
genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York.
Informações de contacto
Bacterial Barcodes, Inc.
425 River Road
Athens, GA 30602 USA
www.biomerieux.com
Para obter assistência técnica nos EUA, contactar o Serviço de Atendimento ao Cliente da bioMérieux, através do telefone +1-800-682-2666.
Fora dos EUA, contactar o representante local da bioMérieux.
Este produto e a sua utilização estão cobertos por uma ou mais das seguintes patentes nos EUA: 5.523.217 e 5.691.136.
Agilent é uma marca comercial registada da Agilent Technologies, Inc.
AmpliTaq e GeneAmp são marcas comerciais registadas da Applied Biosystems Corporation nos Estados Unidos e/ou noutros países.
Caliper e LabChip são marcas comerciais registadas da Caliper Life Sciences nos Estados Unidos e/ou noutros países.
DiversiLab é uma marca comercial da bioMérieux, Inc.
UltraClean é uma marca comercial da Mo Bio Laboratories, Inc.
Novembro de 2008
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