ナノ材料リスク評価書
- フラーレン (C60)-
最終報告版：2011.7.22
NEDO プロジェクト（P06041）
「ナノ粒子特性評価手法の研究開発」
ナノ材料リスク評価書
フラーレン(C60)
最終報告版：2011.7.22
【作成体制】
監修
篠原 直秀 1，蒲生 昌志 1，中西 準子 1
執筆担当者
第Ⅰ章～第Ⅷ章：
篠原 直秀 1
Appendix： 遠藤茂寿 1，島田学 2，森本泰夫 3，横山秀克 1，
藤田克英 1，堀江祐範 1，加藤晴久 1，篠原直秀 1 ら
1
（独） 産業技術総合研究所, 2 広島大学大学院，3 産業医科大学
本評価書は，(独)新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)からの委託研究，
「ナノ粒子特性評価手法の研究開発(P06041)」による研究成果です．
引用の際は，下記のような表記でお願いします．
篠原直秀
編（2011）ナノ材料リスク評価書 −フラーレン（C60）−，最終報告版：2011.7.22，
NEDO プロジェクト（P06041）「ナノ粒子特性評価手法の研究開発」
SHINOHARA, Naohide (ed) (2011). Risk Assessment of Manufactured
Nanomaterials: Fullerene (C60). Final report issued on July 22, 2011. NEDO project
(P06041) “Research and Development of Nanoparticle Characterization Methods”.
連絡先：
（独）産業技術総合研究所
安全科学研究部門
篠原 直秀（ [email protected] ）
ナノ材料リスク評価書の刊行に当たって
新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）研究プロジェクト（P06041）「ナノ粒子特
性評価手法の研究開発」は，わが国のナノ材料リスク評価研究を引っ張るような感じで 2006 年 6
月にスタートし，2011 年 2 月末に終了しました．その結果として，３種のナノ材料群のリスク
評価書，「ナノ材料リスク評価書－二酸化チタン－」「ナノ材料リスク評価書－フラーレン－」
「ナノ材料リスク評価書－カーボンナノチューブ」と「ナノ材料のリスク評価－考え方と結果の
概略」を策定致しましたので公表します．評価書本文とは別に，Executive Summary（和文，英
文）も作成致しましたのでご活用ください．
この研究プロジェクトの特徴を一言で言えば，“ナノスケールで何が起きるか”の疑問に答え
るべく，ナノスケールサイズの粒子を調製し，計測し，試験することに拘わったこと，トピック
スのような有害性情報を集めるのではなく，新しい情報を見つけ，それらをつないで全体像を見
つける努力をしたことです．そのために，試験や結果の解析方法についても様々な工夫をいたし
ました．そして，３物質群の作業環境における許容暴露濃度を算出，提案いたしました．また，
作業環境における計測，ナノ材料の飛散特性の計測を行い，リスク管理の方法についての方向性
を提案しました．
長期暴露の影響についても相当丁寧な目配りをした積もりではありますが，さらなる情報を得
て改訂する余地を残した方がいいと考え，作業環境における許容暴露濃度はおおよそ 10 年の間
に見直すことを前提にした時限の値として提案しました．世界的に見れば多くの研究機関から陸
続と試験結果が発表されている現状を考慮したものでもあります．
これは新規物質のリスク評価の一つであることは間違いありませんが，新規“物質”の範疇だ
けに収まるものではありません．従来とは全く異なる特性が技術も有害性も支配している，そう
いう新規”技術”のリスク評価です．従前のリスク評価の方法を使いつつ，対象物質を変えればい
いというものではありません．ここに，今回の研究の難しさ，新しさがありました．こういう課
題に対しては，試しつつ進み，進みつつ試すという“順応的管理”の考え方が必要です．この考
え方を取り入れて，リスク評価と管理の問題に取り組みました．作業環境の許容暴露濃度を時限
としたのも，そのひとつの帰結です．評価書の内容については，外部専門家にレビューをして頂
き，ご意見も評価書の中に収録いたしました．
この評価書が作業場や一般環境でのナノ材料のリスク評価に生かされ，また，ここで開発した
評価や管理の枠組が新規技術を世に出していく際のモデルとして使われていくことを願ってやみ
ません．尚，この研究を終始応援して下さった NEDO，経産省，産総研に心からお礼申しあげま
す．
2011 年夏
プロジェクトリーダー
中西準子
目次
篠原 直秀
ナノ材料リスク評価書 -フラーレン(C60)目次
第Ⅰ章
はじめに ----------------------------------------------------------------------------- Ⅰ-1
１．背景 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-1
２．ナノ材料を取り巻く状況 ------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-2
2.1. ナノ材料とは ---------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-2
2.2. ナノ材料の一般特性 ------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-2
2.3. ナノ粒子の有害性 ---------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-3
2.4. ナノ粒子に対する管理の状況 ------------------------------------------------------------------Ⅰ-3
2.4.1. 日本 ---------------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-3
2.4.2. 米国 ---------------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-4
2.4.3. EU -----------------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-5
2.4.4. その他の国々 ---------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-5
2.4.5. OECD ------------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-5
2.4.6. ISO ----------------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-6
３．リスク評価書の対象 ------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-6
４．リスク評価書の構成 ------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-7
５． 参考文献--------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ-9
第Ⅱ章
基本的情報--------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-1
１．歴史 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-1
２．物理化学的特性 ------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-2
2.1. 構造 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-2
2.2. 結晶 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-3
2.3. 熱的物性 ---------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-3
2.4. 溶解性 ------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-3
2.5. 凝集体の液中分散 ---------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-6
2.6. 光励起特性 ------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-6
2.7. 電子特性・ラジカル捕捉能 ---------------------------------------------------------------------Ⅱ-7
2.8. 内包特性 ---------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-7
３．製造 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-8
3.1. 製造法 ------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-8
3.1.1 アーク放電法 ----------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-8
目次
3.1.2 燃焼法 -------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-8
3.1.3 その他の方法----------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-9
3.2. 分離精製法 ------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-9
3.2.1 溶媒抽出 ---------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-9
3.2.2 液体カラムクロマトグラフィー ---------------------------------------------------------Ⅱ-9
3.2.3 HPLC カラム ---------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-9
3.2.4 包摂化 ------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-10
3.2.5 錯体化 ------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-10
3.2.6 その他の方法 ---------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-10
3.3. 生産量 ------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-10
3.3.1 国内生産量 -------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-10
3.3.2 海外の生産量----------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-11
3.4. 現在の用途 ------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-11
3.4.1 ボーリング球----------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-11
3.4.2 ゴルフクラブ----------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-13
3.4.3 テニスラケット，バドミントンラケット ---------------------------------------------Ⅱ-13
3.4.4 エンジンオイル -------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-13
3.4.5 化粧品 -------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-13
3.5 将来想定される研究開発中の用途 --------------------------------------------------------------Ⅱ-14
3.5.1. 有機太陽電池 ---------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-14
3.5.2. 電気二重層キャパシタ ---------------------------------------------------------------------Ⅱ-14
3.5.3. 医薬分野での応用 ---------------------------------------------------------------------------Ⅱ-14
４. 測定方法 ----------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-16
4.1. 化学定量分析法 -------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-16
4.1.1 捕集，抽出・分析前処理-------------------------------------------------------------------Ⅱ-16
4.1.2 化学分析 ----------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-17
4.2. 粒子の計測 ------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-19
4.2.1 粒径・個数濃度測定用の装置 ------------------------------------------------------------Ⅱ-19
4.2.2 電子顕微鏡観察-------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-20
５. 一般環境でのモニタリングデータ-------------------------------------------------------------------Ⅱ-20
5.1. 非意図的な人為起源からのフラーレン ------------------------------------------------------Ⅱ-21
5.2. 自然起源等からのフラーレン ------------------------------------------------------------------Ⅱ-21
5.2.1 古代の地層 -------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-21
5.2.2 岩石，化石 -------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-21
5.2.3 隕石 ----------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-22
目次
篠原 直秀
5.2.4 その他 -------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-22
６. まとめ -------------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-22
７. 参考文献 ----------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ-23
第Ⅲ章
暴露評価 -----------------------------------------------------------------------------------------Ⅲ-1
１．ライフサイクルと排出・暴露過程 ------------------------------------------------------------------Ⅲ-1
1.1. フラーレンのライフサイクル ------------------------------------------------------------------Ⅲ-1
1.2. 製造・加工時のフラーレン暴露と排出のシナリオ ---------------------------------------Ⅲ-2
1.2.1. フラーレン・金属内包フラーレン製造------------------------------------------------Ⅲ-2
1.2.2. 樹脂・金属への添加（ボーリング球・ゴルフクラブ等） -----------------------Ⅲ-3
1.2.3. エンジンオイル ------------------------------------------------------------------------------Ⅲ-5
1.2.4. 化粧品 ------------------------------------------------------------------------------------------Ⅲ-6
1.2.5. 有機太陽電池 ---------------------------------------------------------------------------------Ⅲ-6
1.3. フラーレンのライフサイクルのまとめと暴露量推定対象の決定 ---------------------Ⅲ-7
２．フラーレン製造現場における暴露濃度推定 ～既存調査に基づく推定～ ----------------Ⅲ-10
2.1. フラーレン製造現場での測定事例 ------------------------------------------------------------Ⅲ-10
2.2. 金属内包フラーレン製造現場での測定事例 ------------------------------------------------Ⅲ-11
2.3. 既存調査に基づく作業環境における暴露濃度推定 ---------------------------------------Ⅲ-13
３．フラーレン二次製品製造現場における暴露濃度推定 ～モデル計算に基づく推定～ -Ⅲ-16
3.1. 巻き上がり性試験 ---------------------------------------------------------------------------------Ⅲ-16
3.1.1. 巻き上がり性試験とは ---------------------------------------------------------------------Ⅲ-16
3.1.2. 巻き上がり性試験の結果 ------------------------------------------------------------------Ⅲ-16
3.2. モデル計算による暴露濃度の推定 ------------------------------------------------------------Ⅲ-17
3.2.1 方法 ----------------------------------------------------------------------------------------------Ⅲ-17
3.2.2 結果 ----------------------------------------------------------------------------------------------Ⅲ-19
４．フラーレン製造工場近傍の一般環境中における暴露濃度の推定---------------------------Ⅲ-19
５．暴露評価のまとめ ---------------------------------------------------------------------------------------Ⅲ-21
６．参考文献 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅲ-22
第Ⅳ章
有害性評価--------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-1
１．体内動態 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-1
1.1. フラーレンの体内動態 ---------------------------------------------------------------------------Ⅳ-1
1.2. フラーレン誘導体の体内動態 ------------------------------------------------------------------Ⅳ-4
1.3. 細胞への取り込みや貪食，移行に関する（in vitro 試験） ----------------------------Ⅳ-5
1.3.1. フラーレンの細胞への取り込みや貪食，移行に関する試験 --------------------Ⅳ-6
目次
1.3.2. フラーレン誘導体の細胞への取り込みや貪食，移行に関する試験 -----------Ⅳ-6
1.4. 一般的なナノ粒子の体内動態について ------------------------------------------------------Ⅳ-13
1.5. 体内動態の整理 ------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-13
２．肺でのフラーレン粒子の沈着とクリアランス ---------------------------------------------------Ⅳ-15
2.1 肺への沈着とクリアランス ----------------------------------------------------------------------Ⅳ-15
2.1.1 一般の粒子の肺への沈着とクリアランス ----------------------------------------------Ⅳ-15
2.1.2 フラーレンの沈着，クリアランスに関する既存の文献 ---------------------------Ⅳ-16
2.1.3 モデルによる粒子の肺胞沈着量の計算 -------------------------------------------------Ⅳ-16
2.2 実測保持量からの沈着率及びクリアランス率の導出 ------------------------------------Ⅳ-18
2.2.1 フラーレンの肺からのクリアランスのメカニズムとモデル ---------------------Ⅳ-18
2.2.2 フラーレンの肺保持量の経時的な減衰 ------------------------------------------------Ⅳ-19
2.3 肺への沈着とクリアランスのまとめ ----------------------------------------------------------Ⅳ-20
３．吸入経路による暴露に関わる有害性試験 ---------------------------------------------------------Ⅳ-20
3.1 吸入暴露試験 ----------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-20
3.2 気管内投与試験 -------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-21
3.2.1 C60 フラーレン --------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-21
3.2.2 C60 フラーレン誘導体 -----------------------------------------------------------------------Ⅳ-22
3.3 気管内投与試験と吸入暴露試験の相違について -------------------------------------------Ⅳ-23
3.3.1 気管内投与試験の利点と欠点 ------------------------------------------------------------Ⅳ-23
3.3.2 気管内投与試験と吸入暴露試験の比較について ------------------------------------Ⅳ-23
3.3.3 気管内投与試験と吸入暴露試験の関係についてのまとめ ------------------------Ⅳ-24
3.4 肺の炎症生成メカニズム -------------------------------------------------------------------------Ⅳ-24
3.5 吸入経路による暴露に関わる有害性のまとめ ----------------------------------------------Ⅳ-26
４． 細胞毒性--------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-31
4.1 既存の文献 -------------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-31
4.2 フラーレンの細胞毒性のまとめと議論 -------------------------------------------------------Ⅳ-39
５． 遺伝毒性--------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-40
5.1 フラーレンの遺伝毒性 ----------------------------------------------------------------------------Ⅳ-40
5.1.1 フラーレン -------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-40
5.1.2 フラーレン誘導体----------------------------------------------------------------------------Ⅳ-43
5.2 遺伝毒性のまとめ -----------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-43
６． その他の試験 -------------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-48
6.1 生殖発生毒性 -----------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-48
6.2 経口暴露毒性 ----------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-48
6.2.1 フラーレンの経口毒性試験 ---------------------------------------------------------------Ⅳ-48
目次
篠原 直秀
6.2.2 フラーレン誘導体の経口暴露毒性 ------------------------------------------------------Ⅳ-48
6.3 皮膚への影響 ----------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-50
6.4 腹腔内投与試験・静脈内投与試験 -------------------------------------------------------------Ⅳ-53
6.4.1 フラーレンの急性・亜急性毒性（腹腔内投与試験） ------------------------------Ⅳ-53
6.4.2 フラーレン誘導体の急性・亜急性毒性
（腹腔内投与試験・静脈内投与試験） ---------------------------------Ⅳ-53
6.4.3 フラーレンの亜慢性・慢性毒性（腹腔内投与試験） ------------------------------Ⅳ-54
6.4.4 腹腔内投与試験・静脈内投与試験のまとめ ------------------------------------------Ⅳ-55
７．まとめ ------------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-58
８．参考文献 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅳ-58
第Ⅴ章
許容暴露濃度（PL:時限）の決定 ----------------------------------------------------Ⅴ-1
１．許容暴露濃度（PL:時限）の概念の提案 -----------------------------------------------------------Ⅴ-1
２．評価エンドポイントの設定 ----------------------------------------------------------------------------Ⅴ-2
３．NOAEL の決定 ---------------------------------------------------------------------------------------------Ⅴ-2
3.1. はじめに -----------------------------------------------------------------------------------------------Ⅴ-2
3.2. ラットにおける吸入暴露の NOAEL の導出 -----------------------------------------------------Ⅴ-3
3.2.1
ラットに対する吸入暴露試験における NOAEL -----------------------------------------Ⅴ-3
3.2.2
ラットに対する気管内投与試験における NOAEL --------------------------------------Ⅴ-4
3.2.3
気管内投与試験にもとづくラットにおける吸入暴露時の NOAEL の推定----------Ⅴ-4
3.3. ヒトに対する吸入暴露時の NOAEL の導出 ----------------------------------------------------Ⅴ-5
3.3.1 作業環境中におけるヒトに対する吸入暴露時の NOAEL -------------------------------Ⅴ-5
3.3.2.一般環境におけるヒトに対する吸入暴露の NOAEL -------------------------------------Ⅴ-6
3.4.NOAEL の意義 --------------------------------------------------------------------------------------Ⅴ-7
3.5.凝集体の粒径別 NOAEL の算出 ----------------------------------------------------------------Ⅴ-8
４．不確実係数の決定 ---------------------------------------------------------------------------------------Ⅴ-10
５．許容暴露濃度((PL:時限)の決定 ----------------------------------------------------------------------Ⅴ-11
5.1.許容暴露濃度(PL:時限)の決定 ------------------------------------------------------------------Ⅴ-11
5.2.他機関の指針値等との比較 ----------------------------------------------------------------------Ⅴ-12
６．まとめ ------------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅴ-13
７．参考文献 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅴ-14
第Ⅵ章 リスク評価 ---------------------------------------------------------------------------------------Ⅵ-1
１．評価方法 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅵ-1
２．暴露評価 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅵ-2
目次
2.1.フラーレン製造現場の作業環境における暴露濃度 ----------------------------------------Ⅵ-2
2.2 フラーレン二次製品製造現場における取扱いでの暴露濃度 ---------------------------Ⅵ-2
2.3.一般環境（工場近隣）における暴露濃度 ----------------------------------------------------Ⅵ-2
３．粒径別許容暴露濃度（PL） --------------------------------------------------------------------------Ⅵ-2
４．リスクの判定 ---------------------------------------------------------------------------------------------Ⅵ-4
4.1 フラーレン製造現場の作業環境におけるリスクの判定 ----------------------------------Ⅵ-4
4.2 フラーレン二次製品現場における取扱いでのリスクの判定 ---------------------------Ⅵ-4
4.3 一般環境（工場近隣）におけるリスクの判定 ----------------------------------------------Ⅵ-5
５．まとめ ------------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅵ-6
６．参考文献 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅵ-7
第Ⅶ章 おわりに -------------------------------------------------------------------------------------------Ⅶ-1
１．本評価書のまとめ ---------------------------------------------------------------------------------------Ⅶ-1
２．今後の課題 ------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅶ-2
第Ⅷ章 外部レビュアーのコメントと筆者らの対応 ---------------------------------------Ⅷ-1
伊藤潤平レビュアーからのコメントと筆者らの対応 ------------------------------------------------Ⅷ-2
市原学レビュアーからのコメントと筆者らの対応 ---------------------------------------------------Ⅷ-9
櫻井治彦レビュアーからのコメントと筆者らの対応 ------------------------------------------------Ⅷ-11
高橋道人レビュアーからのコメントと筆者らの対応 ------------------------------------------------Ⅷ-14
谷口武俊レビュアーからのコメントと筆者らの対応 ------------------------------------------------Ⅷ-16
Appendix C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果 ------- Appendix-1
Appendix 1．毒性試験に使用する水中フラーレン分散液のビーズミルを用いた調製
遠藤 茂寿ら -----Appendix-2
Appendix 2．フラーレンエアロゾル粒子の発生と暴露試験
島田 学ら ---------------Appendix-4
Appendix 3．フラーレンの経気道的暴露による有害性試験
森本 泰夫ら ------------Appendix-6
Appendix 4．非侵襲的 ESR を用いた C60 ナノ粒子によるマウスへの肺還元能の評価
横山 秀克ら -----Appendix-8
Appendix 5．フラーレンの肺沈着量とクリアランス速度の評価
篠原 直秀ら ----- Appendix-10
Appendix 6. フラーレン暴露によるラット肺中の網羅的遺伝子発現の解析
藤田 克英ら ---- Appendix-12
Appendix 7．フラーレンの遺伝毒性について
篠原 直秀ら ----------------------------- Appendix-14
Appendix 8．安定したフラーレン C60 培地分散液による細胞応答の評価
堀江 祐範ら ---- Appendix-16
目次
篠原 直秀
Appendix 9．水溶液及び細胞培養液中の C60 の粒径分布とキャラクタリゼーション
加藤晴久ら------ Appendix-17
Appendix 10．フラーレンはコイの脳への脂質過酸化能を有するか？ 篠原直秀ら Appendix-20
略語集
図表一覧
図Ⅰ-1．リスク評価書の構成 --------------------------------------------------------------------- Ⅰ-8
図Ⅱ-1．フラーレン C60 の構造------------------------------------------------------------------- Ⅱ-2
図Ⅱ-2．フラーレンの光照射による反応 ------------------------------------------------------ Ⅱ-6
図Ⅱ-3．フラーレンのラジカル捕捉能 --------------------------------------------------------- Ⅱ-7
図Ⅱ-4．現在及び将来のフラーレンの用途
------------------------------------------------ Ⅱ-15
図Ⅱ-5．フラーレンの HPLC 分析時のクロマトグラムの一例 -------------------------- Ⅱ-18
図Ⅱ-6．フラーレンの UV 吸光スペクトルの一例 ------------------------------------------ Ⅱ-18
図Ⅱ-7．フラーレンのマススペクトルの一例 ----------------------------------------------- Ⅱ-18
図Ⅱ-8．フラーレン粒子の TEM 画像の一例 ----------------------------------------------- Ⅱ-20
図Ⅲ-1．フラーレンのライフサイクルと想定される暴露・排出 ----------------------------- Ⅲ-2
図Ⅲ-2．フラーレン製造過程からのフラーレンの排出 ----------------------------------------- Ⅲ-3
図Ⅲ-3．ボーリング球のライフサイクルからのフラーレンの排出 -------------------------- Ⅲ-4
図Ⅲ-4．ゴルフクラブのライフサイクルからのフラーレンの排出 -------------------------- Ⅲ-5
図Ⅲ-5．エンジンオイルのライフサイクルからのフラーレンの排出------------------------ Ⅲ-6
図Ⅲ-6．有機太陽電池のライフサイクルからのフラーレンの排出 -------------------------- Ⅲ-7
図Ⅲ-7．既存の作業環境中フラーレン測定の粒径別濃度 -------------------------------------- Ⅲ-15
図Ⅲ-8．近接場/遠隔場 2 ボックスモデルの概要-------------------------------------------------- Ⅲ-17
図Ⅲ-7．工場近傍の C60 大気中濃度（将来予測） ------------------------------------------------ Ⅲ-20
図Ⅳ-1．フラーレンの体内動態に関連する既往の in vivo 試験における粒子サイズ ----- Ⅳ-10
図Ⅳ-2．吸入後の粒子の挙動------------------------------------------------------------------------ Ⅳ-15
図Ⅳ-3．ヒトとラットの肺胞への粒径別の粒子沈着率（粒子密度 1.2 g/cm3） ----------- Ⅳ-17
図Ⅳ-4．2 段階クリアランスモデルにおいて想定したメカニズム --------------------------- Ⅳ-18
図Ⅳ-5．肺中沈着量の実測値とフィッティング曲線 -------------------------------------------- Ⅳ-19
図Ⅳ-6．肺胞へ吸入されたナノ粒子の挙動とおこりうる現象 -------------------------------- Ⅳ-25
図Ⅳ-7．フラーレンの吸入暴露の有害性に関する既往の試験
（吸入暴露・気管内投与）における粒子サイズ ----------------- Ⅳ-29
図Ⅳ-8．フラーレンの遺伝毒性に関する既往の試験における粒子サイズ------------------ Ⅳ-47
図Ⅴ-1．28 日間吸入暴露試験の 90 日間吸入暴露試験への外挿------------------------------ Ⅴ-3
目次
図Ⅴ-2．気管内投与試験の 90 日間吸入暴露試験への外挿------------------------------------- Ⅴ-4
図Ⅴ-3．2 種類のミクロンサイズのフラーレン粒子の概念図 --------------------------------- Ⅴ-8
図Ⅴ-4．粒径別の作業環境および一般環境に対する NOAEL -------------------------------- Ⅴ-9
図Ⅴ-5．粒径別の許容暴露濃度（PL） ------------------------------------------------------------- Ⅴ-12
表Ⅱ-1．フラーレン C60，C70 の物理化学的特性 ------------------------------------------------- Ⅱ-2
表Ⅱ-2．各種溶媒に対する C60，C70 の溶解度 ---------------------------------------------------- Ⅱ-4,5
表Ⅱ-3．日本国内におけるフラーレンの生産能力と市場規模 -------------------------------- Ⅱ-12
表Ⅲ-1．フラーレン製造現場において製造から出荷までの間の
作業環境への排出可能性 ----------------------------------------------- Ⅲ-8
表Ⅲ-2．フラーレン製造現場において製造から廃棄までの間の
一般環境中への排出可能性 -------------------------------------------- Ⅲ-8
表Ⅲ-3．樹脂・金属へのフラーレン添加から廃棄までの間の
作業環境への排出可能性 ----------------------------------------------- Ⅲ-9
表Ⅲ-4．樹脂・金属へのフラーレン添加から廃棄までの間の
一般環境への排出可能性 ----------------------------------------------- Ⅲ-9
表Ⅲ-5．金属内包フラーレン製造現場において粒子として捕集された気中 C60 濃度 --- Ⅲ-11
表Ⅲ-6．金属内包フラーレン製造現場において粒子として捕集された気中 C60 濃度 --- Ⅲ-12
表Ⅲ-7．1.5 g 取扱い時(10 分に 1 回 × 8 時間)の暴露濃度の推定結果 ------------------- Ⅲ-19
表Ⅲ-8．C60 を大量に取り扱う工場近傍（工場敷地内を含む）における
暴露濃度の推定結果 ----------------------------------------------------- Ⅲ-21
表Ⅳ-1．フラーレンの体内動態および肺からのクリアランスに関連する
既往の in vivo 試験一覧 ------------------------------------------------ Ⅳ-8,9
表Ⅳ-2．フラーレン誘導体の体内動態に関する既往の文献 ----------------------------------- Ⅳ-11
表Ⅳ-3．フラーレンおよびフラーレン誘導体の体内動態に関連する
既往の in vitro 試験一覧 ----------------------------------------------- Ⅳ-12
表Ⅳ-4．MPPD モデルによる沈着率計算に用いたパラメータ一覧-------------------------- Ⅳ-17
表Ⅳ-5．フラーレンの吸入暴露の有害性に関する既往の文献 -------------------------------- Ⅳ-27,28
表Ⅳ-6．フラーレン誘導体の吸入暴露の有害性に関する既往の文献------------------------ Ⅳ-28
表Ⅳ-7．気管内投与試験と吸入暴露試験における有害性の比較 ----------------------------- Ⅳ-30
表Ⅳ-8．フラーレンの in vitro 試験------------------------------------------------------------------ Ⅳ-35～38
表Ⅳ-9．フラーレンの遺伝毒性に関する既往の文献 -------------------------- ------------------Ⅳ-44～46
表Ⅳ-10．フラーレン及びフラーレン誘導体の経口毒性に関する既往の文献 ------------- Ⅳ-49
表Ⅳ-11．フラーレンおよびフラーレン誘導体の皮膚への影響に関する既往の文献 ---- Ⅳ-52
目次
篠原 直秀
表Ⅳ-12．フラーレン C60 の腹腔内投与試験 ------------------------------------------------------- Ⅳ-56
表Ⅳ-13．フラーレン誘導体の腹腔内投与試験/静脈内投与試験 ------------------------------ Ⅳ-57
表Ⅴ-1．計算に用いたパラメータ
----------------------------------------------------------------- Ⅴ-5
表Ⅴ-2．REACH および ECETOC における暴露期間に関わる不確実性係数
--------- Ⅴ-11
表Ⅴ-3．MPPD モデルで計算される粒径別の沈着率（GSD=1.0 の場合） ----------- Ⅴ-12
表Ⅵ-1．暴露評価に対応した粒径範囲区分ごとの許容暴露濃度（PL）と
推定暴露濃度のまとめ
-------------------------------------------- Ⅵ-3
第Ⅰ章
はじめに
篠原 直秀
第Ⅰ章
はじめに
１．背景
ナノテクノロジーは，これからの社会にとって重要な科学技術と考えられており，それを支え
る基盤としてのナノ材料は様々な分野で試験・開発・実用化が進められている．しかし，ナノ材
料を使用することによるヒトや環境への影響がはっきりと分かっていないことから，その安全性
に関わるリスクについて懸念する声が上がっている．それを踏まえて，ナノ材料のリスクを評価
し，適切なリスク管理の元で，その有用性を最大限に生かせるようになることが求められている．
本書では，ナノ材料の一つとして様々な応用が期待されているフラーレンを対象として，リス
ク評価を行う．この評価は，歴史が浅いために有害性試験データや暴露試験データが不足してい
るナノ材料について，現時点までの試験結果を基にしてヒト健康へのリスクを推定し，作業環境
における許容暴露濃度を提案することと今後の安全性評価における指針を示すことを目的として
いる．本書におけるリスク評価の対象は，フラーレンを取り扱う作業者の吸入暴露によるヒト健
康を中心とするが，一般環境における吸入暴露によるリスクについても言及する．経口・経皮の
暴露経路については，現時点での暴露可能性が低いことから，参考としてこれまでに得られてい
る有害性影響情報を示すにとどめ，リスク評価の対象とはしないこととした．
本書で取り上げるフラーレンは，1985 年に Kroto 教授らによって発見された炭素のみから構成
される球状の炭素同素体の総称である（Kroto et al. 1985）．現在の産業界における用途としては，
軽量化や強度を増す目的で樹脂や金属と混合させて用いたスポーツ用品等や，電子受容能による
抗酸化機能を応用した化粧品等がある．将来はその特性を生かした太陽電池やキャパシタ等のエ
ネルギー分野，ドラッグデリバリーシステムなどの医薬分野での応用が期待されている．
Ⅰ-1
第Ⅰ章
はじめに
篠原 直秀
ナノサイズの粒子は粒径が小さいことから，暴露後に全身に移行したり，マクロファージに貪
食されずに体内で長期にわたって残留する可能性が指摘されている．さらに，吸入暴露されたナ
ノサイズの粒子は，肺胞まで到達することが分かっており，肺やその他の器官において有害性影
響を引き起こす懸念がある．本書で取り上げるフラーレンに関しても同様の懸念がなされている．
さらに，フラーレンは光励起特性を有しており，一重項酸素等の活性酸素種（Reactive Oxygen
Species: ROS）の生成によって，細胞に対する酸化的ストレス傷害の惹起が示唆されており，ナノ
材料の特性と相まって様々な有害性影響が誘引される可能性が考えられる．フラーレンの安全性
へのこれらの懸念に対して，既存の研究や新エネルギー・産業技術総合開発機構（New Energy and
Industrial Technology Development Organization: NEDO）受託研究プロジェクト“ナノ粒子特性評価
手法の研究開発”[プロジェクトリーダー：中西準子，期間 2006-2011，プロジェクト番号：P06041]
（以下，『NEDO プロジェクト（P06041）』と表記する）に基づく成果を整理・考察することで，
答えを出していくことが求められている．
２. ナノ材料を取り巻く状況
2.1. ナノ材料とは
OECD や ISO などの国際機関では，
「ナノ材料」を「元素等を原材料として製造された固体状の
材料であって，大きさを示す三次元のうち少なくとも一次元が約 1 nm～100 nm であるナノ物質及
びナノ物質により構成されるナノ構造体（ナノ物質の凝集した物体も含む）」と定義している（ISO
2008, 経済産業省 2009）（ただし，この定義は検討中のものであり，確定したものではないこと
に注意）．また，
「ナノ粒子」については，BSI（英国規格協会）で「3 つの次元でナノスケールで
ある ナノ構造体」，ISO では「直径（幾何学, 空気力学, 移動平均, 投影面積 等）が 100 nm 以下
の粒子」としている．米国 NIOSH は，直径が 1~100 nm の粒子をナノ粒子と呼び，典型的なナノ
粒子としてフラーレンを挙げている．これらの定義から，ナノ材料はナノ粒子よりも広い概念で
あると捉える事ができる．
2.2. ナノ材料の一般特性
ナノ材料固有の特性として，表面積の増大と量子効果の発現が挙げられる．材料が小さくなる
と全分子の中で表面に露出する分子の割合が大きくなり，単位質量当りの表面積が増大する．こ
れを利用すると，ナノ粒子を使う事で触媒反応に大きく関わっている触媒の表面積を増やすこと
ができ，反応速度を大きくすることが可能となる．また，電子は粒子性と波動性の二種類の性質
を持ち，物質中の電子の挙動が物質の諸特性（電気的，光学的，磁気的）を決める大きな要因に
なっている．ナノサイズの領域になると量子効果で電子の波動性が顕著に発現することが知られ
Ⅰ-2
第Ⅰ章
はじめに
篠原 直秀
ており，物性が変化する可能性がある．例えば，ナノ粒子は光を散乱しないため透明であり，光
を透過させる必要のある窓に光触媒として塗布することなどが可能となる．また，ナノ粒子は比
表面積が大きいことから凝集エネルギーも大きいため，水中や大気中で凝集体を形成しやすく，
材料として用いるためや有害性試験を行うために様々な分散技術が開発されている．
2.3. ナノ粒子の有害性
吸入暴露された粒子は，一般的に鼻腔から肺胞にかけての各部位に沈着し，体内の排出・代謝
メカニズムにより除去される．ナノ粒子の動態については，これまでに以下のような研究結果の
報告がある．ナノ粒子は，吸入暴露時に肺胞まで到達する割合が 100 nm 以上の大きな粒子と比べ
て高い（沈着率: >100 nm: <20%, 10～50 nm: 30%～40%（MPPD モデルによる計算）
）．数十 nm の
粒子は数百 nm の粒子と比べて肺胞から間質への移行が起こりやすく，肺への残留時間が長い
（TiO2: Ferin et al. 1992）．また，吸入暴露後にナノ粒子が鼻咽頭から嗅神経および嗅球を通って大
脳へ移行する可能性を示唆する結果がある（グラファイト粒子: Oberdörster et al 2004）．さらに，
肺への気管内投与試験や吸入暴露試験において，大きな粒子と比べてナノ粒子の方が大きな肺の
炎症や酸化ストレスを引き起こしていたという結果もある（Carbon black: Li et al. 1999, Gilmour et
al. 2004）．
前述のようにナノ粒子は凝集しやすいことから，環境中で凝集体として存在する割合が多いと
考えられる．しかしながら，凝集したナノ粒子を体内に取り込んだ際に，biosurfactant（生物系界
面活性剤）の影響で凝集体が壊れてナノサイズに再分散する可能性があるとする報告も存在する
（Takenaka et al. 1986, Oberdörster et al. 1994）．米国の NIOSH も体内での再分散の可能性を示唆す
る見解を出しているが（NIOSH 2005），ナノ粒子が凝集しやすく，また工業的にも分散が困難なことな
どから，産業界からは再分散は簡単には起こり得ないとする反論も大きい（ACC 2006）．
2.4. ナノ粒子に対する管理の状況
2.4.1 日本
2008 年以降，厚生労働省，経済産業省，環境省において，工業ナノ材料に関する検討会がそれ
ぞれ開催され，2009 年 3 月までに報告書が公表された．
厚生労働省は，2008 年 2 月 7 日に「ナノマテリアル製造・取扱い作業現場における当面のばく
露防止のための予防的対応について」と題する通達を発表し，事業者や都道府県の担当者に連絡
した（厚生労働省労働基準局長 2008）．さらに，2008 年 3 月から，労働現場におけるナノマテリ
アル対策の実効を上げるために，作業現場の実態を踏まえたより具体的な管理方法を示し，ばく
露防止対策上の現状と課題についての検討を行うため「ヒトに対する有害性が明らかでない化学
物質に対する労働者ばく露の予防的対策に関する検討会」を開催した．また，ヒトの健康への影
響について安全性の評価手法や安全対策のあり方等について検討を行うため，
「ナノマテリアルの
安全対策に関する検討会」も開催している．
Ⅰ-3
第Ⅰ章
はじめに
篠原 直秀
経済産業省の平成 18 年度委託調査事業「ナノテクノロジーの研究・製造現場における適切な
管理手法に関する調査研究」では，ナノテクノロジーに関連する研究や製造が行われている現場
における現状を調査するとともに，海外での管理事例を調査し，我が国にとって最適なナノ材料
の管理手法について検討した．また，NEDO プロジェクト（P06041）において，科学的根拠に基
づいたナノ粒子の適正な評価を実施するため，ナノ粒子の①計測（キャラクタリゼーション）技
術の確立，②生体影響評価手法の開発，③ばく露評価手法，④ナノ粒子のリスク評価及び管理手
法の確立を図っている．
環境省では，ナノ材料の使用実態等を踏まえた環境中への放出の可能性と管理手法についての
知見の収集と整理を行うために，2008 年 6 月から「ナノ材料環境影響基礎調査検討会」を設置
して検討を行い，2009 年 3 月に「工業用ナノ材料に関する環境影響防止ガイドライン」を作成・
公表した．
2.4.2 米国
環境保護庁（U.S.EPA）は，工業ナノ材料に関する情報の収集を目的として，2008 年 1 月 29 日，
自主的な情報提供プログラムである「ナノスケール材料スチュワードシッププログラム（NMSP) 」
を開始した．NMSP は事業者の手持ちの情報を提出する基礎的プログラム（Basic Program）と，
EPA と協議しながら追加費用をかけて動物試験などを行う詳細プログラム（In-Depth Program）の
二つから成り立っている．基礎的プログラムは半年の期間を設けて行われ，29 の組織から，123
種類のナノ材料について報告がなされている．
また，EPA は，
「ナノマテリアルの TSCA（Toxic Substances Control Act：有害物質規制法）イン
ベントリステータス－一般的アプローチ」という文書において，炭素の同素体である，カーボン
ナノチューブやフラーレンは新規化学物質と規定し，ナノサイズの二酸化チタンや銀などは既存
化学物質となる判断基準を提示している． そのため，TSCA においては，商用目的でフラーレン
の製造・輸入を行う業者は，フラーレンの製造・輸入を 90 日前に届け出ることが必要となってい
る．さらに，TSCA はカーボンナノチューブを一定量取り扱う事業者に対して，90 日間の吸入暴
露試験と 90 日間の観察をし，肺毒性の観察を行うことを義務付ける方向性を示しており，EPA の
今後の動向に注目する必要がある．
国立労働安全衛生研究所（U.S. NIOSH）は 2005 年以来，ナノ材料への労働暴露による潜在的な
健康影響を管理するためのガイドライン「安全なナノテクノロジーへのアプローチ：工業ナノ材
料に関連する健康安全への懸念を管理する」の改訂を重ねている（NIOSH 2009）．2005 年に，TiO2
ナノ粒子はミクロンサイズの粒子よりも毒性が高いとして，Evonik Deggusa 社の製品，P-25 につ
いての有害試験データを元に REL (Recommended exposure limit：作業環境勧奨値)として 0.1 mg/m3
を提案している（U.S. NIOSH 2005）．また，2010 年には，カーボンナノチューブ（CNT）に関す
る REL のドラフト版を公表した（U.S. NIOSH 2010）．
Ⅰ-4
第Ⅰ章
はじめに
篠原 直秀
2.4.3 EU
「炭素」と「グラファイト」は，これまで REACH の免除規定である Annex 4（物質固有の特性
のためリスクは最小限であることが十分な情報により示されているもの）に含まれていた．しか
し，2008 年 6 月，欧州委員会は，
「炭素」と「グラファイト」を免除規定から外し，REACH のも
とでの試験が必要な物質と変更した．これによって，炭素の同素体である CNT やフラーレンが一
般化学物質と同じ扱いになった．
欧州化学物質庁（ECHA）の共同研究センター（JRC）は 2008 年 12 月に予備登録物質
（Pre-Registered Substances）のリストを公開した．このリストには，フラーレン，カーボンナノチ
ューブ（SWCNT, MWCNT），ナノ銀が登録されている． その上で，2008 年から 2009 年に，ENRHES
(Engineered Nanoparticles - Review of Health & Environmental Safety)プロジェクトを実施し，C60，
CNTs，金属，および金属酸化物のナノ材料を対象として，製造/使用/暴露・有害性・生態毒性・
疫学・リスク評価に関する工業ナノ粒子の包括的な科学的知見のレビューを行った．この中で，
各ナノ材料に対する労働者の DNEL（導出無影響量）が，C60 については 44.4 μg/m3 （急性）及び
0.27 μg/m3 （慢性），TiO2 については 17 μg/m3 （慢性）と算出されている．CNTs については，2
つの有害性試験データに基づいた値が，201 μg/m3 及び 4 μg/m3 （急性），33.5 μg/m3 及び 0.67 μg/m3
（慢性） と併記されている．CNTs については，一般人の DNEL についても 8.3 μg/m3 及び 0.17
μg/m3 （慢性）と示されている．銀ナノ粒子については，0.33 μg/m3 及び 0.098 μg/m3 （慢性）と
2 つの値が併記されている．
2.4.4 その他の国々
オーストラリアの保健・発育省（Department of Health and Aged Care：DHAC）は，2006 年にナ
ノ材料の化学物質名，商品名，化学式，生産量等について，企業を対象に情報提供を呼びかけ，
2007 年 1 月に結果を公表した．また，2008 年 1 月からは，物理化学的データ，毒性データ，用
途情報，ライフサイクル等に関する情報提供の呼びかけも開始している．
英国では，2006 年 9 月～2008 年 9 月に，英国環境食糧地方問題省（Defra）が，任意の報告
制度として「工業ナノマテリアルについての自主的報告スキーム（Voluntary Reporting Scheme
(VRS) for Manufactured Nanomaterials）」を実施し，13 レポートが提出された．
2.4.5 OECD
2006 年 9 月に OECD 化学品委員会の下部組織として「工業ナノ材料作業部会（Working Party
onManufactured Nanomaterials）」が設置され，ナノ材料の厳格な安全性評価の開発促進を目的とす
る，工業ナノ材料の健康と環境への安全性に関係する側面における国際協力が進められている．
活動の枠組みは次のとおりである．
SG1：安全性研究に関するデータベース構築
SG2：工業ナノマテリアルに関する研究戦略
Ⅰ-5
第Ⅰ章
はじめに
篠原 直秀
SG3：代表的な工業ナノマテリアルの安全性試験
SG4：工業ナノマテリアルとテストガイドライン
SG5：ボランタリースキームと規制制度に関する協力
SG6：リスク評価に関する協力
SG7：ナノ毒性学における代替試験の役割
SG8：暴露測定と低減に関する協力
この中の SG3 の取組の一環として，2007 年 11 月からスポンサーシッププログラムが開始さ
れている．これは，生産量等の観点から選定された 14 の代表的なナノ材料に関し，合意された安
全性情報項目について情報収集あるいは試験を実施するものであり，各国が自主的に特定のナノ
材料のスポンサーとなり，試験計画を策定することとされている．日本は米国と共同で，フラー
レン，単層カーボンナノチューブ，多層カーボンナノチューブのスポンサーとなることを表明し
ている．
2.4.6 ISO
2005 年 5 月に，ISO でナノテクの技術委員会（TC229）が設置された．同時に，「用語・命名
法（JWG1）」，
「計測・キャラクタリゼーション（JWG2）」，
「環境・安全・健康（WG3）」の 3 WG
も設置された．WG1 はカナダ，WG2 は日本，WG3 はアメリカがコンビナー（議長）となって
いる．2008 年 2 月には，TC229 の 3 つの WG に加えて，
「材料規格（WG4）」が設置され，中国
がコンビナーとなった．
３．リスク評価書の対象
フラーレンは， C60 をはじめ，高次フラーレンと呼ばれる炭素原子の数が異なる C70，C76，C78，
C82，C84，C86，C88 などの数多くの種類が存在している．研究開発や製品応用の事例および，有害
性に関する研究報告の多さをふまえ，本評価書では主に C60 をリスク評価の対象とする．C70 につ
いても一部触れるが，他の高次フラーレンについては基本的に対象外とする．また，フラーレン
の誘導体は，主に太陽電池や医薬品等への応用を目的として様々な種類が開発されているが，誘
導体によって特性が大きく異なり得ることから，本リスク評価の対象からは外した．しかしなが
ら，有害性評価などで誘導体の試験結果がフラーレンの毒性として話題になることもあり，必要
なものは整理し，考察を行うこととした．本評価書ではヒト健康影響を対象とするため，基本的
に生態系への影響については取り扱わないが，2005 年にフラーレンの有害性として大きく話題と
なった水生生物への影響に関する試験結果について，第Ⅳ章の Appendix で言及した．
C60 は，第Ⅱ章で述べるように，単独では直径が約 1 nm の分子であるが，常温では結晶として
Ⅰ-6
第Ⅰ章
はじめに
篠原 直秀
凝集した固体で存在し，有機溶媒に溶解させるか水溶化するなどして水に分散させることをしな
ければ，単独の分子としては存在しない．一般的に C60 として入手されるものは，面心立方格子
からなる結晶を形成し，さらにそれらが凝集して，粉末となっている．そのため，実際に製造さ
れるフラーレンには，結晶サイズがナノ材料の定義である 100 nm を大きく超えているものが多く
存在すると考えられるが，国際的にもフラーレンはナノ材料・ナノ粒子として認知されているこ
とから，本書では，基本的に結晶・凝集状態によらず，全てのフラーレンをナノ材料として取り
扱うこととした．
また，C60 の製造から，C60 を原料とした製品の製造，製品の消費，製品の廃棄という一連の流
れにおいて，潜在的に C60 に暴露する可能性のある集団は，作業者，施設近隣住民，一般市民に
類別でき，潜在的な暴露経路として，吸入，経口，経皮といった経路を考えることができる．そ
の中で，製品応用の規模が限定的である現状（第Ⅱ章参照）を踏まえ，本リスク評価では，主に
作業環境における労働者の吸入経路での暴露を主な対象とし，参考として事業所近隣の一般人の
暴露に関しても簡易的な評価を行うこととした．なお，フラーレンの化粧品や医薬品の用途につ
いては第Ⅱ章に記載したが，その使用は，意図的な接触・摂取を目的としているため本リスク評
価の対象からは除くことにした．
４．リスク評価書の構成
本書では，有害性試験データや暴露試験データが少ないフラーレンについて，現時点までの試
験結果を基にしてヒト健康へのリスクを推定し，作業環境における許容暴露濃度を提案すること
と今後の安全性評価における指針を示すことを目的としている．本リスク評価書の構成は，以下
のとおりである．
本章は，本評価書の必要性や構成等について示す．
第Ⅱ章では，フラーレンに関する基本的な情報として，物理化学的性状，生産・用途，分析方
法，一般環境でのモニタリングデータ等に関して整理した．モニタリングデータの内，作業現場
での調査結果については第Ⅲ章において整理することとし，作業環境での暴露濃度を求めるため
に使用した．また，ナノ材料に関する各国・各機関によるリスク評価や，国内での取り組みの現
状についても整理した．
第Ⅲ章では，既存の報告におけるフラーレンを使用している作業環境におけるフラーレン濃度
（粒子濃度）計測結果について整理した上で，フラーレンの暴露評価を二通りの方法で行った．
一つ目の方法は，いくつかの既存調査に基づいて暴露濃度を推定した．もう一つは，模擬排出試
験の結果と予想される将来の使用量に基づいて暴露濃度の推定を行った．この結果は，第Ⅵ章の
リスク評価に用いる．
Ⅰ-7
第Ⅰ章
はじめに
篠原 直秀
第Ⅳ章では，ヒト健康に対する有害性情報について包括的に整理し．第Ⅴ章では，有害性評価
の結果から得られる NOAEL（No observed adverse effect level：無毒性量）を用いて，許容暴
露濃度（PL：時限）を求めた．
第Ⅵ章では，第Ⅲ章で求めた暴露濃度と第Ⅴ章で求めた許容暴露濃度（PL）を用いて，フラー
レンによるヒト健康リスクの判定を行った．
最後に，第Ⅶ章では，本リスク評価書の結論について述べた．
また，第Ⅷ章には，本評価書の外部レビュワー5 名からのコメントと，それに対する筆者らの
対応を記した．Appendix としては，本 NEDO プロジェクトにおいて公開された，フラーレンに
関連する論文等のデータを簡潔に整理した．
第Ⅰ章 はじめに
・背景
・リスク評価書の構成
第Ⅱ章 基本的情報
・歴史
・物理化学的特性
・製造法・生産量（予測）・用途（現在・将来）
・ナノ材料について（特性・有害性・管理の現状）
・測定方法・モニタリングデータ
第Ⅳ章 有害性評価
第Ⅲ章 暴露評価
・ライフサイクルと排出・暴露
・製造・加工時のフラーレン暴露と排出
・現場調査に基づく作業環境中暴露濃度の推定
・巻き上がり性試験に基づく作業環境中暴露濃度の推定
・製造工場近傍の一般環境中における暴露濃度の推定
・体内動態
・肺への沈着とクリアランス
・既存の吸入暴露による有害性情報の整理
・その他の有害性試験情報
（経口暴露・経皮暴露・細胞毒性・遺伝毒性）
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の導出
・ 評価エンドポイントの設定
・ 吸入暴露におけるNOAELの決定
・ 不確実性係数の決定
・許容暴露濃度（PL:時限）の導出
・有害性の議論
第Ⅵ章 リスク評価
・ 暴露評価結果（再掲）
・許容暴露濃度（PL：時限）
・ リスクの判定
- 対象別のリスクの判定（作業環境・一般環境）
（HQ＝推定暴露濃度/許容暴露濃度（PL：時限））
第Ⅶ章 おわりに
・本リスク評価書のまとめ
・今後の課題
第Ⅷ章 外部レビュアーのコメントと筆者らの対応
Appendix C60のリスク評価に関わるNEDOプロジェクトの成果
図Ⅰ-1. リスク評価書の構成
Ⅰ-8
第Ⅰ章
はじめに
篠原 直秀
５．参考文献
経済産業省 (2009). ナノマテリアル製造事業者等における安全対策のあり方研究会 報告書.
厚生労働省 (2008). 労働基準局長通達「ナノマテリアル製造・取扱い作業現場における当面のば
く露防止のための予防的対応について」
ACC, American Chemistry Council (2006)
Comments of The Titanium Dioxide Panel of the American
Chemistry Council and The Titanium Dioxide Manufacturers Association and The Physical
Sunscreen Manufacturers Association of The European Chemical Industry Council on NIOSH
Current Intelligence Bulletin : Evaluation of Health Hazard and Recommendations for Occupational
Exposure to Titanium Dioxide, March 31, 2006.
Ferin J, Oberdorster G, Penney DP (1992) Pulmonary Retention of Ultrafine and Fine Particles in Rats.
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Gilmour PS, Ziesenis A, Morrison ER, Vickers MA, Drost EM, Ford I, Karg E, Mossa C, Schroeppel A,
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Pharmacology 195 (1): 35-44.
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(6042): 162-163.
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intratracheal instillation of fine and ultrafine carbon black in rats. Inhalation Toxicology 11 (8):
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Oberdörster G, Ferin J, Lehnert BE (1994). Correlation between Particle-Size, in-Vivo Particle Persistence,
and Lung Injury. Environmental Health Perspectives 102 (Suppl. 5): 173-179.
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ultrafine particles to the brain. Inhalation Toxicology 16 (6-7): 437-445.
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Titanium-Dioxide After Long-Term Inhalation by Wistar Rats. Journal of Aerosol Science. 17 (3):
361-364.
U.S.NIOSH (2005) NIOSH Current intelligence bulletin: Evaluation of health hazard and recommendations
for occupational exposure to titanium dioxide (draft). November 2005
U.S.NIOSH (2009) Approaches to Safe Nanotechnology: Managing the Health and Safety
Concerns Associated with Engineered Nanomaterials. DHHS (NIOSH) Publication
2009-125.
Ⅰ-9
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
第Ⅱ章
基本的情報
本章では，本評価書の対象物質であるフラーレンの基本的な情報として，物理学的・化学的特
性と今後応用が期待される分野・用途，生産量，製造方法，分析方法，モニタリングデータ等に
ついて記述する．更に，ナノ粒子に関する一般的な性質や有害性に関する議論についても紹介す
る．
１．歴史
フラーレンとは，炭素のみから構成される球状の物質であり，グラファイト，ダイヤモンドに
次ぐ第 3 の炭素同素体である．1970 年，雑誌『化学』に，北海道大学の大澤映二助教授はサッカ
ーボール構造をした炭素分子の存在についての考察を発表したが，和文雑誌だったこともあり，
欧米の研究者から注目を集めるまでには至らなかった．その後，1985 年に Sussex 大学の Kroto 教
授，Rice 大学の Smalley 教授，Curl 教授らによる炭素系星間物質の実験室的合成に関する研究中
に C60 は発見された（Kroto et al. 1985）．C60 は，その形状が建築家バックミンスター・フラーの考
案したジオデシックドームと似ていることから，彼の名をとってバックミンスターフラーレンと
名付けられた．バッキーボールと呼ばれることもある．また，前述の 3 名は，フラーレンを発見
した功績が認められ，1996 年にノーベル化学賞を受賞している．その後の研究で，C70，C76，C78，
C82，C84，C86，C88，C90，C92，C94，C96 など，多くの高次フラーレンが発見された．
Ⅱ-1
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
２．物理化学的特性
以下にフラーレン類の物理化学的特性について，既存の文献等から分かっていることを整理し
た．C60，C70 の一般的な物性値については，表Ⅱ-1 に示す．
2.1. 構造
C60 分子は 12 個の五員環と 20 個の六員環で構成されたサッ
カーボール状の構造をしている（図Ⅱ-1）．炭素間結合の長さは
0.140 nm と 0.146 nm であり，炭素骨格の直径は 0.704 nm，π 電
子雲領域の直径（ファンデルワールス径）は 1.002 nm である
（Ahmad 1999）．内部は約 0.4 nm の空洞となっている．フラー
レンは sp2 軌道の状態で三次元的な球状構造をとっており，60
個の炭素全てが，最も近接する原子とケージを形成しているた
め，C60 分子は非圧縮性である．ちなみに，C70 や C76 などの他
の高次フラーレンも，12 個の五員環と複数個の六員環で構成さ
図Ⅱ-1.フラーレン C60 の構造
れている．C60 は常温常圧下で固体であり，その結晶は黒色の粉体である．
表Ⅱ-1．フラーレン C60，C70 の物理化学的特性
分子量
C60
C70
720.66
840.77
720
840
0.704 (骨格) ，1.002（電子雲）
0.796（長軸径），0.712（短軸径）
質量数
分子構造 [nm] a)
第 1 イオン化ポテンシャル[eV] b)，c)，d)
結晶構造
e)，f)，g)
7.6, 7.58
7.3～8.8
面心立方格子 (>263K)
相転移で面心立方格子，
(低温相)
単純立方格子
質量密度 [g/cm3]e)
1.729 (5K 計算値)
3 e)
分子密度 [個/cm ]
1.44 × 10
融点 [ºC]f)
1180
電気伝導率(300K) [S/cm]
昇華熱[kcal/mol] k)，l)
蒸気圧[Torr]
21
l)
h)，i)，j)
-8
10 ～10
40, 38
1.9 × 10
-４
1.6926 (室温)
Data なし
Data なし
-14
-5
菱面結晶，六方最密充填をとる
(400℃)
Data なし
43, 45
1.4 × 10-5 (430℃)
(500℃)
2 × 10-4 (500℃)
1 × 10-3 (600℃)
7 × 10-3 (600℃)
5 × 10
出典: a) Ahmad 1999, b) Lichtenberger et al. 1991, c) Lichtenberger et al. 1992,
d) De Vries et al. 1992, e) Heiney et al. 1991, f) Fischer and Heiney 1993,
g) 村山 2007, h)Arai et al. 1992, i) Mort et al. 1991, j) Mort et al. 1992,
k) Pan et al. 1991, l) Abrefah et al. 1992
Ⅱ-2
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
2.2. 結晶
C60 の結晶は，263 K 以上では面心立方格子（格子定数 a=1.42 nm）が安定とされ，それ以下の
温度では一次相転移をして単純立方格子になる（村山 2007）．常温での真密度は約 1.73 g/cm3，か
さ密度は約 0.6～1.0 g/cm3 とされている（村山 2007）．水中の C60 凝集体は，六方晶系の結晶構造
（a=0.94 nm，c/a=1.09）を取っていたという報告もある（Fortner et al. 2005）．
2.3. 熱的物性
フラーレンは，熱的に非常に安定で壊れにくい物質であり，酸素存在下でも 100～300 ℃程度
まで安定であり，酸素非存在下では 600 ℃程度で分子構造を保ったまま昇華する（Chen et al. 1992）．
2.4. 溶解性
フラーレンは，グラファイトやダイヤモンドと異なり，トルエンや二硫化炭素等の有機溶媒に
溶ける性質が知られているが，溶解度自体はさほど高いものではない（トルエンへの溶解度：
2.2~2.8 mg/mL（Ruoff et al. 1993a, Sivaraman et al. 1992））．水などの極性分子である溶媒（アセトン，
テトラヒドロフラン，アセトニトリル，エタノール等）には，難溶性を示すが，アルカン（ペン
タン，ヘキサン，デカン等）やシクロアルカン（シクロペンタン，シクロヘキサン）に可溶性で
あり，溶剤の炭素数に比例して溶解度が増加する傾向が見受けられる．アルカンの水素原子を塩
素原子で置換したクロロアルカンへの溶解度はアルカンより高いが，塩素数との比例関係は見ら
れない．炭素数が大きい芳香族への溶解度は明らかに高く，電子供与基（メチル基，メトキシ基）
による置換をした溶媒に対して溶解度は増加し，電子求引基（ニトロ基，ニトリル基）による置
換をした溶媒に対して溶解度は減少する傾向にある（Ruoff et al. 1993a）．フラーレンの性質であ
る溶解性は，３節で説明する精製や実際の製品への応用において，非常に重要なファクターとな
っている．各種溶媒へのフラーレンの溶解度を整理したものを表Ⅱ-2 に示す．
また，C60 を水溶化するために，C60 に官能基を修飾させて水溶化する方法 （Manolova et al. 1993,
Tokuyama et al. 1993）やポリビニルピロリドン（PVP）（Yamakoshi et al. 1994）や γ-シクロデキス
トリン（γ-CD）（Andersson et al. 1992, Priyadarsini et al. 1994）により包接して水溶化する方法が用
いられている．ただし，PVP 包摂化合物は水溶化と表現されることが多いものの，粒子として水
中に分散していると考えられる．
Ⅱ-3
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
表Ⅱ-2．各種溶媒に対する C60，C70 の溶解度
C60
分類
水
溶媒
水
溶解度
[mg/mL]
0.000013*
(計算値)
アルカン
ペンタン
2-メチルペンタン
オクタン
3-メチルペンタン
イソオクタン
ヘキサン
ヘプタン
ノナン
デカン
ドデカン
テトラデカン
ケトン
アセトン
アルコール 1,2-エタンジオール
1,2,3-プロパントリオール
メタノール
1,3-プロパンジオール
エタノール
2-プロパノール
1,4-ブタンジオール
2-ブタノール
1-プロパノール
1,5-ペンタンジオール
1-ブタノール
o-クレゾール
2-ペンタノール
3-ペンタノール
1-ペンタノール
1-ヘキサノール
1-オクタノール
0.004
0.005
0.00320
0.01840
0.025
0.01990
0.02510
0.026
0.03650
0.040
0.043
0.04850
0.06230
0.070
0.071
0.091
0.126
0.001
0.00000
0.00000
0.000
0.000035
0.000900
0.001
0.00080
0.00210
0.00217
0.00360
0.00410
0.00444
0.00940
0.014
0.01800
0.02900
0.03000
0.04200
0.04700
温度
[℃]
出典
25
3)
30
20~25
24.5
24.5
30
24.5
24.5
30
24.5
30
20~25
24.5
24.5
30
20~25
30
30
20~25
24.5
24.5
20~25
24.5
24.5
20~25
24.5
24.5
24.5
24.5
24.5
24.5
24.5
20~25
24.5
24.5
24.5
24.5
24.5
4)
1)
2)
2)
4)
2)
2)
4)
2)
4)
1), 6)
2)
2)
4)
1)
4)
4)
1)
2)
2)
1)
2)
2)
1)
2)
2)
2)
2)
2)
2)
2)
1)
2)
2)
2)
2)
2)
分類
シクロアルカン
環状エーテル
含ハロゲン化合物
（芳香族除く）
溶解度
[mg/mL]
溶媒
シクロペンタン
シクロヘキサン
trans -デカリン
cis -デカリン
デカリン （Cis : Trans = 3:7）
テトラヒドロフラン
ジオキサン
クロロホルム
ジクロロメタン
四塩化炭素
含窒素化合物
（芳香族除く）
含硫黄化合物
（芳香族除く）
1,2-ジクロロメタン
テトラクロロエチレン
トリクロロエチレン
1,1,2,2-テトラクロロエタン
1,1,2-ﾄﾘｸﾛﾛﾄﾘﾌﾙｵﾛｴﾀﾝ
ジクロロジフルオロエタン
アセトニトリル
ニトロメタン
ニトロエタン
テトラヒドロチオフェン
チオフェン
ピリジン
N -メチル-2-ピロリドン
2-メチルチオフェン
二硫化炭素
芳香族
ベンゼン
芳香族（アルキル基） tert -ブチルベンゼン
sec -ブチルベンゼン
iso -プロピルベンゼン
m-キシレン
1,3,5-トリメチルベンゼン
（メシチレン）
0.002
0.036
0.051
1.3
2.2
4.6
0.000
0.041
0.16
0.254
0.26
0.32
0.447
0.50
1.2
1.4
5.3
0.014
0.020
0.000
0.000
0.002
0.030
0.4
0.3
0.89
0.89
6.8
5.160
7.9
1.440
1.5
1.7
0.9
1.1
1.2
1.4
0.997
1.5
1.7
温度
[℃]
出典
20~25
1)
20~25
1)
30
4)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
30
4)
20~25
1)
30
4)
20~25
1)
20~25
1)
30
4)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
30
4)
20~25 1), 6)
30
4)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
30
4)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
分類
溶媒
芳香族（アルキル基） n -プロピルベンゼン
n -ブチルベンゼン
エチルベンゼン
トルエン
1,2,3-トリメチルベンゼン
キシレン
1,2,3,4-テトラメチルベンゼン
p-キシレン
o-キシレン
1,2,4-トリメチルベンゼン
1,2,3,5-テトラメチルベンゼン
芳香族（ハロゲン基） フルオロベンゼン
ヨードベンゼン
1.3-ジクロロベンゼン
ブロモベンゼン
クロロベンゼン
1,2,4-トリクロロベンゼン
1,2-ジブロモベンゼン
1,3-ジブロモベンゼン
1,2-ジクロロベンゼン
芳香族（その他）
多環芳香族
ベンゾニトリル
ニトロベンゼン
アニソール
キノリン
テトラリン
1-メチルナフタレン
1-ブロモ-2-メチルナフタレン
ジメチルナフタレン
1-フェニルナフタレン
1-クロロナフタレン
* F-T サイズ効果を考えると更に小さくなる．
1) Ruoff et al. 1993a，2) Heymann 1996a，3) Heymann 1996b，4) Sivaraman et al. 1992，5) Scrivens and Tour 1993，6) Ruoff et al. 1993b
Ⅱ-4
溶解度
[mg/mL]
1.5
1.9
2.6
2.150
2.8
2.9
4.7
5.2
5.8
5.9
8.7
17.9
20.8
0.59
1.2
2.1
2.4
2.8
3.3
5.7
7.0
8.5
10.4
13.8
13.8
27
24.6
0.41
0.80
5.6
7.2
16
33
33.2
34.8
36
50
51
温度
[℃]
出典
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
30
4)
20~25 1), 6)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
20~25
1)
24.5~25.5 5)
24.5~25.5 5)
20~25
1)
20~25
1)
20~25
1)
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
表Ⅱ-2．各種溶媒に対する C60，C70 の溶解度 (Cont.)
C70
分類
アルカン
ケトン
アルコール
シクロアルカン
含ハロゲン化合物
（芳香族除く）
含硫黄化合物
芳香族
溶媒
ペンタン
ヘキサン
オクタン
ヘプタン
デカン
ドデカン
アセトン
イソプロピルアルコール
シクロヘキサン
ジクロロメタン
四塩化炭素
1,2-ジクロロメタン
二硫化炭素
ベンゼン
トルエン
メシチレン
p-キシレン
溶解度
[mg/mL]
温度
[℃]
出典
0.0020
0.013
0.042
0.047
0.053
0.098
0.0019
0.0021
0.080
0.080
0.121
36.210
9.875
1.300
1.406
1.472
3.985
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7)
7) Sivaraman et al. 1994
Ⅱ-5
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
2.5. 凝集体の液中分散
C60 は，水やアセトニトリル，エタノール，アセトンなどの極性溶媒中で安定したナノスケール
（25-500 nm）の凝集体を生成する（Alargova et al. 2001, Fortner et al. 2005）．この原因は，凝集し
たフラーレン粒子表面の帯電（ζ 電位）によるものと考えられている．また，フラーレンの水中
分散液に電解質を添加すると，凝集度は増し，粒径は大きくなる（沈殿が起きやすくなる）
．ちな
みに，C60 のトルエン溶液は紫色透明であり，水中分散液は黄色透明（高濃度では褐色透明）であ
る．フラーレン粒子の細胞や動物に対する毒性を調べる有害性試験においては，高濃度で安定し
た水中分散液が必要とされている．
水中分散液の調製法として，i)テトラヒドロフラン（THF）（Deguchi et al. 2001）やエタノール
（Dhawan et al. 2006），トルエンとクロロホルム（Sera et al. 1996）などの有機溶媒に溶かした液に
水を加えて有機溶媒を飛ばして分散液を調製する方法，ii)Tween 80 などの界面活性剤を用いてボ
ールミルやビーズミルで摩砕して分散させる方法（Gharbi et al. 2005, Endoh et al. 2009 （NEDO プ
ロジェクト（P06041））, Shinohara et al. 2009a（NEDO プロジェクト（P06041））），iii) 氷砂糖とポ
リ オ キ シ エ チ レ ン 硬化ヒマシ油を用いて摩砕して分散させる方法（Seki et al. 2008）
，iv) 長期間
（2 週間以上）水中での攪拌を続けて分散させる方法（Mchedlov-Petrossyan et al. 1997, Brant et al.
2006）など様々な分散手法が報告されている．
2.6. 光励起特性
C60 や C70 は，連続する共役 π 電子系を有し，光照射によって π-π*励起されて励起一重項状態
（1C60*）になり，項間交差により三重項状態（3C60*）になる（Arbogast et al. 1991a, 1991b）．1C60*
の寿命は極めて短く，そのほとんどが直ちに 3C60*になるとされている．3C60*は，電子供与性の
化合物等により一電子還元されて C60・-になる（Type I 電子移動反応）ことと，エネルギー移動
反応で一重項酸素を生成する（Type II エネルギー移動反応）ことがあるとされている．C60 の一
重項酸素の発生の量子収率は，355 nm の光で 0.76，532 nm の光で 0.96，C70 の一重項酸素の発生
の量子収率は，355 nm の光で 0.81 とされており，
どちらも非常に高い（Arbogast et al. 1991a, 1991b）．
既存の複数の文献に基づき作成したフラーレンの光照射により引き起こされうる反応を図Ⅱ-2 に
示す．
電子供与体 R
一重項状態
C60: 46 kcal/mol
C70: 44 kcal/mol
1C *, 1C *
60
70
(寿命短い： 数ナノ秒)
電子移動 e－
(Type
I)
励起三重項状態
3C *, 3C *
60
70
(寿命長い： 数十マイクロ秒)
光照射 h?
C60: 33~42 kcal/mol
C70: 33~42 kcal/mol
蛍光
（ほとんど
観測されない）
C60R, C70R
C60・－, C70・－
1O
2
エネルギー移動
(Type II)
燐光
O2
C60, C70
図Ⅱ-2．フラーレンの光照射による反応
Ⅱ-6
O2・－
e－
O2
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
この特性から，太陽電池に利用される n 型有機半導体としての応用・開発が進められている．
一方，光照射により生じる 3C60*の一重項酸素生成能や C60・-の還元能から，ROS 生成能（活性酸
素種生成能）があるとされ，酸化ストレスや DNA 切断能等を持つ可能性があるとされている．
2.7. 電子特性・ラジカル捕捉能
C60 は，低いエネルギー準位に最低空軌道（LUMO）を有しているため，6 個の電子を可逆的に
受け入れることのできる電子受容体である．ただし，酸化還元電位は一般的な電子受容体より低
いとされている．
C60 は sp2 軌道が球状構造全体に拡がっている．球状歪みのために平面状態に比べて反応性が高
く，一つの共役結合が攻撃されても他の部分が 6π 電子系を維持して構造を保つため，フリーラ
ジカル等の付加反応が容易に進むとされている．Krusic et al. (1991) は，光化学反応で生成したベ
ンジルラジカル（R = C6H5CH2・）とフラーレンが液中で容易に反応して，極めて安定な RnC60（n
＝1～15 以上）を生成することを報告している．また，CH3・との反応では，(CH3)nC60（n＝1～
34 以上）を生成するとしている．McEwen et al. (1992) は，このフラーレンのラジカル捕捉能をラ
ジカルスポンジと呼び，化学イオン化法（CI）で発生させたアルキルラジカルと C60 を反応させ
た結果から，図Ⅱ-3 のようなスキームが起きていると考えた．また，田尾ら（2008）は，NEDO
プロジェクト（P06041）において，大気中光照射下における一重項励起酸素(O2(1Δg))の生成量を
計測し，フラーレンは光励起により O2(1Δg)を生成するが，ナノ粒子上に吸着しており，大気中
への拡散はないと考察している．
フラーレンが ROS の一種であるスーパーオキシド（O2・-）を除去できたという報告もある
（Chiang et al. 1995）．
nR・
C60 (gas)
C60 (wall)
R・
・C60Rn (wall)
C60Rn+1 (wall)
C60Rn+1 (gas)
e-
eR・
C60・-
C60Rn+1 ・図Ⅱ-3．フラーレンのラジカル捕捉能（Krusic et al. 1991 を改変）
C60 (gas）は気中に存在している C60，C60 (wall）は吸着している C60 を示している．
2.8. 内包特性
フラーレンは籠状の形状をしており，内部に 0.4 nm の真空の空洞があることから，様々な金属
を内包することができる．Chai et al. (1991)は，1991 年にフラーレン精製時に金属炭素混合ロッド
を用いることにより，ランタン内包フラーレン（La@C82）の生成に成功した．それ以来，セリウ
Ⅱ-7
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
ムやカルシウム（Moro et al. 1993），チタン（Cao et al. 2001），バリウム（Reich et al. 2004）など様々
な金属原子をフラーレン C70，C74，C80，C82 等に内包した金属内包フラーレンが生成・単離されて
いる．C60 を用いた金属内包フラーレンの生成量は少ないとされてきた（Moro et al. 1993）が，国
内の（株）イデアルスターは，昇華させた C60 に金属イオンを高速で当てることにより，C60 にリ
チウムを内包したフラーレン（Li@C60）を高い収率で得ることに成功している（イデアルスター
私信 2008）．これらの金属内包フラーレンは，磁気共鳴画像診断（MRI）などの医学的応用や，
有機太陽電池の n 型半導体としての応用が考えられている．また，水素や希ガス（ヘリウムやネ
オン）なども C60 や C70 の中に内包できることが報告されており，将来何らかの用途に使用できる
のではないかと研究が進められている（Komatsu et al. 2005）．
３．製造
3.1. 製造法
3.1.1 アーク放電法
アーク放電法は，初めてフラーレンの人工合成に成功した方法である（Haufler et al. 1990）．こ
れは，ヘリウムガスなどの不活性ガスが充填された槽に 1～2 mm 程度の距離で対向させた黒鉛電
極に直流電圧をかけ，電極間に発生するアーク放電により陽極を蒸発させる，その後，空中で冷
却される過程でフラーレンが生成され，フラーレンを含む煤が減圧槽の壁面に付着するという方
法である．本荘ケミカル社や米国の Aldrich 社，MTR 社，SES Research 社等は，この方法を用い
て生産を行っている．
この方法の短所としては，槽内部が減圧もしくは真空となっているため，壁面に付着した煤を
取り出す際に大気圧に戻す必要があり，圧力調整に時間がかかるため，連続的な生成が困難であ
り量産に向かない点が挙げられている．長所は，効率良い炭素の昇華が可能であり装置や運転が
簡便であり，実験室レベルでも容易に合成を行うことができる点である．
3.1.2 燃焼法
燃焼法は，米国マサチューセッツ工科大学で考案され（Howard et al. 1992），米国のベンチャー
企業である TDA Research 社が大量合成を可能とするシステムに改良した方法である．我が国にお
けるフラーレンの大部分を生産しているフロンティアカーボン社も，この手法を用いて生産を行
っている．
この方法では，ベンゼンやアセチレンなどの炭化水素を原料かつ燃料として用いて，燃料過剰
かつ酸素不足状態で燃焼させる．燃焼温度は 1000～2000℃とされており，高エネルギー場で燃焼
に寄与しなかった炭化水素が脱水素・炭素結合の熱分解･再合成反応を繰り返す．その過程で煤と
共にフラーレンが生成される．燃焼を停止させずに回収を行えることから，半連続的に稼動させ
Ⅱ-8
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
ることができ，大量生産に適している．
3.1.3
その他の方法
その他の方法としては，Kroto らがフラーレンを発見したときの生成方法（Kroto et al. 1985）を
基本とし，希ガス中に設置した炭素に高エネルギー密度のパルスレーザーを照射して炭素原子を
蒸発させ，そこにヘリウムガスを流通させて冷却して生成する合成レーザー蒸発法（レーザー照
射法）や，ヘリウム雰囲気の釣鐘型ガラス容器中で炭素棒を電流加熱し昇華させる抵抗加熱法等
もあるが，現在までのところ実験室レベルの合成しかできておらず，工業化に適するレベルには
なっていない．
3.2. 分離精製法
フラーレンは煤と共に生成されるため，煤中から分離する必要がある．また，分離された混合
フラーレンから，純 C60 や純 C70 を得るために単離精製処理をすることも必要となる．特に，半導
体などのデバイスや医薬品用途では，混合フラーレンではなく純度の高い単離されたフラーレン
が必要となる場合が多く，様々な単離技術が開発されている．
3.2.1 溶媒抽出
合成して回収された煤中には，各フラーレン類の他に，高分子化したフラーレン，構造に欠陥
を有するフラーレン，その他の炭素物質・炭化水素（PAH など）が含まれている．その中で，フ
ラーレンと一部の炭化水素のみが有機溶媒（トルエンなど）に可溶であることから，溶解を利用
した抽出法はフラーレン分離に対して効果的かつ簡便な方法である．溶解しない固体とフラーレ
ン溶液の分離は，ペーパーフィルター等で行う．また，PAH 等の炭化水素は，沸点差や溶解度の
違いを用いて分離する．最後に，加熱等により溶媒を気化させることで，粉体としてフラーレン
類の混合物を得ることができる．一般的に抽出されたフラーレン混合物の 60～80%が C60，15～
25%が C70，5～15%が C76 や C78 とされている．
3.2.2 液体カラムクロマトグラフィー
フラーレンが発見された当初，研究者の多くが C60 の単離に用いていたのが液体カラムクロマ
トグラフィーである．装置や操作が簡単であり, 煤から溶媒抽出したフラーレンを粗分離するの
に適している．ただし，C70 より大きなフラーレンの分離精製には適さない，低分解能である，実
験室レベルの少量の分離しかできないなどの欠点がある．固定相としては，アルミナ（Taylor et al.
1990），活性炭のシリカゲルの混合物（Scrivens et al. 1994）などが報告されている．
3.2.3 HPLC カラム
一般的に HPLC で用いられているオクタデシルシリカ（ODS）などの各種アルキル結合型カラ
Ⅱ-9
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
ムなどで，煤から溶媒抽出したフラーレンを高次フラーレンにいたるまで分離を行うことができ
る．現在，これらはフラーレン専用のカラムとして各社から販売されている．この方法は操作が
容易であり，高い純度で精製することができるが，処理できる量に限界がある．処理量を上げる
ためにカラムサイズを大きくすると，設備コストがかかり寿命も短くなり，分解能が落ちる可能
性もあることから，工業用途に使用するのは困難だと考えられている．
3.2.4 包摂化
C60 を単離する方法としては，C60 のみを特異的に包摂するカリックスアレーンを用いる方法が
提案されている（Takeshita et al. 1995）．煤から溶媒抽出したフラーレン溶液とカリックスアレー
ンを混合させて包摂物を沈殿させた後，沈殿物を回収し，脱包摂することにより，C60 のみを分離
することができる方法である．今後，他のフラーレンに対しても特異的に包摂できる化合物を見
つけることができれば，より有用な方法になると考えられている．これは特殊な装置を必要とし
ない単純な方法であり，大量の処理を行うことにも問題が少ないため，工業化に適した方法であ
る．
3.2.5 錯体化
煤からの抽出溶媒中の高次フラーレンを順次錯体化することで C60 を単離する DBU 法という方
法が一般化され，実用段階に入りつつある．DBU（1,8-ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデセン
(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undecene)）はアミン類の一種であり，高次フラーレンから順次錯体化する
ため，最終的に溶液中に C60 のみを残すことが可能である．この方法も，特殊な装置を必要とし
ない単純な方法であり，大量の処理を行うことにも問題が少ないため，工業化に適した方法であ
る．ただし，HPLC 分離などと比べて純度が低いことや使用した化学物質が残留することなどの
欠点がある．
3.2.6 その他の方法
上記の他に，溶解度の違いを利用して，溶媒や温度を切り替えることにより晶析させて分離す
る方法や，昇華温度の違いを利用した昇華精製法なども提案されている．
3.3. 生産量
3.3.1 国内生産量
現在，国内で使用されているフラーレンのほとんどがフロンティアカーボン社において生産さ
れている（燃焼法）．ごくわずかに，本荘ケミカルによる生産（アーク放電法）とロシアからの輸
入がある．フロンティアカーボン社の生産能力は年間 40 t である．生産量は 15 t 程度（2005 年）
とされているが（富士経済 2006），2006 年の国内使用量として約 2 t という推計もある（厚生労
働省 2009）
．ただし，現在国内で使用されている多くが研究開発用であり，実用化された製品の
Ⅱ-10
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
用途として使用されているのは 100 kg/年程度だとされている．一方，今後用途開発が順調に進め
ば，2020 年には 400 t の数量が見込まれるとする推計もある（富士経済 2006）．ただし，これま
でのところ，推計値が実際の使用量を大きく上回って推計されていることもあり，将来の使用量
は未知数であると言える．いくつかの文献で推計されているフラーレンの市場規模について表Ⅱ
-3 に整理した．
3.3.2 海外の生産量
海外におけるフラーレン製造は，米国の TDA Research 社（燃焼法）や，Aldrich 社，Material
Technology Research (MTR)社，SES Research 社（アーク放電法）等が主である．フロンティアカ
ーボン社が大量生産を可能としたことから，これまで世界のフラーレンのほとんどが日本で生産
されていたが，同社が米国に子会社を設立したことなどもあり，今後世界各国での生産も増えて
いくと予想されている（富士キメラ総研 2008）．2006 年の生産量としては，25 t とする資料（富
士キメラ総研 2008）と 3 t とする資料（厚生労働省 2009）が存在している．
富士キメラ総研（2008）
は，2010 年には年間 40 t の生産量となると予測している．
3.4. 現在の用途
現在，フラーレンは，メガネやボーリングの球などの樹脂への添加剤や金属への添加剤，潤滑
油への添加剤，化粧品に用いられている．研究開発中の用途としては，太陽電池電極材や燃料電
池電極材の樹脂添加剤，医薬品関連原料などが挙げられる．現在は，生産量の 80%が添加剤とし
て使用されている（富士経済 2006）．現在の用途と将来検討されている用途について，図Ⅱ-3 に
整理した．本項では，現在実用化されている製品について，聞き取り調査等で得られた現状での
用途，効能に関する情報を以下に示す．
3.4.1 ボーリング球
2002 年にフラーレンを使用したボーリング球が販売された．これがフラーレンを使用した我が
国最初の実用化製品である．
当時，アルミナなどの固形物を混ぜ込むことによる樹脂の改質が盛んに試験されており，その
応用としてフラーレンを分散させた樹脂を使用したボーリング球が試作された．試作されたボー
リング球は，ピンの飛びがよいなどとプロボーラーから高い評価が得られたため，製品化へとつ
ながった．ただし，反発係数や摩擦係数などの数値は，フラーレンの有無で違いが見られていな
い（A 社 私信 2007）．このため，物理特性の面での効果については今のところ判明していない．
Ⅱ-11
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
表Ⅱ-3．日本国内におけるフラーレンの生産能力と市場規模．
数量[t]
市場規模*
金額[百万円]
生産能力[t]
2000 年
2001 年
2002 年
2003 年
2004 年
2005 年
2006 年
2007 年
0
0
0
-
0.1
120
-
0.4
200
-
1.5
700
3,000
-
10
5,000
5,000
40
15
7,500
7,500
7,000
40
20(見込み)
2
10,000(見込み)
8,500
40
10,000
-
2010 年
(予測)
40
15,000
15,000
300
2015 年
(予測)
200
20,000
300
2020 年
(予測)
400
30,000
30,000
300
2030 年
(予測)
50,000
-
参考文献
1
2
3
1
2
4
5
1
* サンプル出荷量，研究開発用出荷量を含む．
1: 富士経済 (2006), 2: 富士キメラ総研 (2005), 3: 厚生労働省(2009), 4: 経済産業省 (2006), 5: シーエムシー出版 (2008)
Ⅱ-12
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
3.4.2 ゴルフクラブ
1998 年頃からドライバーのヘッドの大型化と軽量化を目的として，フラーレンを使用したゴル
フクラブの開発が行われ，2001 年に最初の製品が販売された．
フラーレンをチタン合金に混ぜると，チタン合金の強度および硬度は高くなり，靱性は低下し
た．現在のゴルフクラブのヘッド（180~200 g）に用いるチタン合金中のフラーレン量は，強度と
靱性のバランスを考え，0.1 wt%である．最初に製造・販売されたゴルフクラブでは，CFRP（Carbon
Fiber Reinforced Plastics）の層間剥離を防ぐ目的で，シャフトにもフラーレンが混ぜて使用されて
いたが，現在 B 社ではこの効果がより大きいカップスタック型のカーボンナノチューブが使用さ
れるようになったためフラーレンは使用されていない．B 社のフラーレン含有ゴルフクラブの製
造本数は，29,000 本程度であり，コストおよび作業性の面から，その数が今後増える可能性は低
いとされている（B 社 私信 2007）．
3.4.3 テニスラケット，バドミントンラケット
フラーレンをフレームやシャフトに使用したテニスラケットやバトミントンラケットも製造・
販売されている．フレームの炭素繊維強化プラスチックにフラーレンを添加すると，フィラーと
マトリックス樹脂の接着力が増し，強度が増すため，全体の重量を 15%も軽量化できたとされて
いる．含有量等のデータは非公表である（C 社 私信 2007）．
3.4.4 エンジンオイル
エンジンオイルは，エンジン内部で発生する摩擦によるエネルギー損失，発熱，接触面の磨耗
からエンジンを保護するために使用される．エンジンオイルにフラーレンを加えると，摩擦が 15%
～30%緩和されて，潤滑性が増すとされている．また，カーエアコン用のオイルでも，エアコン
の寿命延長と低燃費性能の向上のためにフラーレンが使用されているものもある（D 社 私信
2007）．
3.4.5 化粧品
フラーレンを用いた化粧品（化粧水・美容液，クリーム）は，フラーレン（C60）のラジカル除
去能を利用しており，抗酸化物質として美白や老化防止への効果が期待されて生産・販売されて
いる．フラーレンを PVP や 1,3-ブチレングリコールを用いて包摂することによって水溶化した包
摂化合物（松林ら 2007）を含む溶液が，これらの化粧品には 1%～5%含まれており，現在は 2%
程度を含有している商品が多い．この包摂化合物は，平均粒径が 690 nm 程度であり，真皮層ま
で到達せず，体内に吸収されないとされている（松林ら 2007）．2006 年には 250 kg を生産してお
り，将来的には 2～3 t/年になると見積もられている（VC60 バイオリサーチ社 私信 2007）．
Ⅱ-13
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
3.5. 将来想定される研究開発中の用途
3.5.1. 有機太陽電池
有機太陽電池は，現在広く使用されている無機太陽電池（シリコンなど）と比べて，安価で軽
量なため，大面積化が可能である．また，塗装や転写という形での作成が可能なため，印刷技術
を応用することができ，製造プロセスの高速化と価格の低減が可能であり，実用化が容易だと考
えられている（柳田 2005）．ただし，単結晶シリコンで変換効率が約 10～20%であるのに対して
有機薄膜では変換効率が<1～3%程度と低いのが課題となっている．現在，フラーレンやフラーレ
，金属内包フラーレン等を n 型有機
ンの誘導体である PCBM（Phenyl C61 butyric acid methyl ester）
半導体として用いた有機太陽電池の開発が進んでいる（㈱イデアルスター 私信 2007，上原 2005，
今堀＆梅山 2005）．
3.5.2. 電気二重層キャパシタ
電気二重層キャパシタは，急速充放電，大電流対応，高サイクル数などのコンデンサとしての
性能と化学電池としての蓄電性能を併せ持つデバイスである．安全で長寿命とされており，ハイ
ブリッド自動車などの大型用途への研究開発が進められ，その蓄電性能を決定する電極材料とし
て，フラーレンを使用することが提案されている．ただし，最近は，フラーレンよりカーボンナ
ノチューブを用いた電極材料の応用開発の方に力が注がれている傾向がある（E 社 私信 2007）．
3.5.3. 医薬分野での応用
修飾により水溶化されたフラーレンは，分子量が大きいが形状がコンパクトであることから，
血液脳関門を越えて脳まで到達できる可能性があるため，薬物送達システム（DDS: Drug Delivery
System）のキャリアとして，応用・研究開発が進められている（Nakamura et al. 2003）．
また，HIV プロテアーゼ（HIVP）の活性部位が 1 nm 程度の対称性の高い丸い形をしているこ
とから，この活性部位にフラーレン C60 の球がはまることで，酵素活性を阻害することができる
と考えられており，エイズ治療薬としての応用開発も進められている（Mashino et al. 2005,
Marchesan et al. 2005）．さらに，フラーレンの光照射下における活性酸素種生成能による DNA 切
断能を応用した，がん細胞部位におけるがん治療薬としての開発も進められている（Milanesio et al.
2005）．
Ⅱ-14
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
添加剤 エンジンオイル
フラーレン
エアコンコンプレッサー用オイル
スキーワックス
（潤滑性・強度）
（撥油性・強度）
メガネフレーム
（ラジカル補足性）
化粧品
（強度・軽量・
柔軟性）
（金属内包性）
ディスプレイ
ボーリングの玉
ゴルフクラブ
ラケットのガット
スノーボード
金属内包フラーレン
量子ｺﾝﾋﾟｭｰﾀｰ
太陽電池
医薬品
MRI用造影剤
化粧品
（電子受容性）
電極材 太陽電池
燃料電池
電気二重層キャパシタ
磁気記録媒体
（ラジカル補足性） 磁性体・トナー
電気粘性流体
（ナノポア吸着性）
（ナノポア吸着性）
（強度）
（光吸収性）
ガス貯蔵 ・ ガス吸着 ・ ガス分離
バイオセンサー・ガスセンサー
半導体レジスト
フォトリングラフィ
電子写真
蛍光表示管
ダイヤモンドコーティング
（低熱伝導性・
高機能フィルム
強度・柔軟性）
（超伝導性）
超伝導材料
トランジスタダイオード
医薬品
（酵素活性阻害）
（DNA切断能）
C型肝炎ウィルス増殖抑制剤
エイズウィルス増殖抑制剤
建築材料・土木資源
（強度・柔軟性
断熱性・耐火性）
図Ⅱ-4．現在及び将来のフラーレンの用途 （破線内は将来可能性のある用途）
（廃棄物政策研究所 2006，フロンティアカーボン社 HP と各社への聞き取り調査をもとに作成）
Ⅱ-15
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
４. 測定方法
4.1. 化学定量分析法
各媒体中のフラーレンの定量は，捕集（サンプリング），抽出・前処理，化学分析というプロセ
スを経ることにより行われる．この方法で得られる情報は，化学物質としてのフラーレンの総重
量であり，粒子の大きさや個数といった情報については，分級操作等を加えなければ直接得るこ
とはできない．
4.1.1 捕集，抽出・分析前処理
捕集後の各媒体中のフラーレンは，基本的にトルエンにより抽出されて分析用試料とされる．
C70 以降の高次フラーレンの抽出を行う場合には，トルエンよりも抽出効率が良い 1,2,4-トリクロ
ロベンゼンなどを用いる方が望ましい場合もある（Anacleto et al. 1993）が，C60 や C60O に関して
は，トルエンが最も良いと考えられる．以下に，代表的なフラーレンの捕集・前処理方法のフロ
ーを示す．
① 気中のフラーレン
気中のフラーレンは，固体粒子として存在するため，石英フィルターなどを用いて捕集する．
捕集したフィルターから，10～30 mL のトルエンで抽出し，捕集量が少ない場合には，1 mL 程度
まで窒素吹付けや窒素風船付きロータリーエバポレーター等により濃縮した液を分析用試料とす
る（Shinohara et al. 2009b）．
② 水中のフラーレン
水中のフラーレンは，窒素風船付きロータリーエバポレーターなどを使用して蒸発乾固させた
後，窒素で復圧し，トルエンに溶解させ，2.2 μm 程度の石英メッシュなどで濾過した液を分析用
試料とする．窒素吹き付けにより 1 mL まで濃縮することもある．ただし，分散剤やたんぱく質
が含まれている場合には，蒸発乾固後に再溶出が困難な場合もあり，それらの場合には下記の生
体試料の前処理と同様の処理を行うこともある(Shinohara et al. 2009a）．
③ 生体試料
組織中のフラーレン： 組織 50～150 mg をホモジナイズ管に入れて 0.01～0.1M（2.88～28.8
mg/mL）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）0.5 mL を加えてホモジナイズし，トルエン 5 mL お
よび酢酸 0.5 mL により遠沈管に移す．数分間の振とう後 15 分間超音波処理を行い，さらに数時
間振とうさせ，15 分間超音波処理の後，遠心分離（2000G）する．遠心分離後は再び水層の超音
波処理および遠心分離を行い，トルエン層を合わせ，窒素吹付けを行うことで 1 mL に濃縮し，
Ⅱ-16
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
分析用試料とする（Moussa et al. 1997, Shinohara et al. 2010）．
血中のフラーレン： 血液 0.1 mL を試験管に入れ，0.1M（28.8 mg/mL）の SDS を 1 mL 入れて
2 分間振とうし，1 mL の酢酸を入れて，さらに 2 分振とうする．その後，15 分の超音波処理を行
い，3 mL のトルエンを加え，1 時間放置後に遠心分離して上澄みを取る（Moussa et al. 1997）．
④ 固体中のフラーレン
煤や岩石などの固体中に含まれるフラーレンは，メノウ乳鉢ですりつぶした後，約 300 mL の
トルエンや二硫化炭素中に固体 1～3 g を入れて窒素雰囲気下で数時間超音波抽出し，一晩攪拌し
て放置した後，濾過して分析用試料とする．濃度が低いと考えられる場合には，ロータリーエバ
ポレーターや窒素吹き付け等により濃縮を行うこともある．
4.1.2 化学分析
① HPLC（高速液体クロマトグラフィー）
フラーレンの分析は，多くの場合 HPLC を用いて行われる．抽出溶媒がトルエンであることか
ら，移動相にはトルエンとエタノールの混合液が用いられることが多い．検出器としては，UV/Vis
吸収検出器（Jinno et al. 1992, Moussa et al. 1997, Shinohara et al. 2009a, 2010）や質量分析器（MS）
（Jinno et al. 1992, Anacleto 1992, 1993, Moussa et al. 1997）が用いられている．以下に，代表的な分
析条件の一例を示す．
使用カラム
：
- ODS 逆相カラム ・ C30 Develosil PRFULLERENE
・ YMC-Pack ODS-AM dC18
・ Kaseisorb LC ODS-60-5 等
（孔径 5 μm，内径 2.1 ～ 4.6 mm，長さ 150 ～ 250 mm）
移動相
：
- トルエン：メタノール ＝ 47：53
- トルエン：アセトニトリル ＝ 70：30
- ジクロロメタン：アセトニトリル ＝ 50：50 等
流量
：
0.5 ～ 1.2 mL/min （0.2 mL/min での測定例もあり）
試料注入量
：
5 ～ 20 μL
カラム温度
：
30 ～ 40 ℃
検出器
：
UVD（Ultraviolet absorbance detector：紫外吸光検出器）
DAD（Diode array detector：ダイオードアレイ検出器）等
波長：308 nm, 334 nm 等
質量分析器
測定質量数 C60：720 (1.0). 721 (0.7), 722 (0.27), 723 (0.08)
（カッコ内はピーク強度比）
C70：840
Ⅱ-17
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
1,000
吸光度 [mAU]
800
C60O
C60
600
C60 O 標準試料100 ng/mL
400
C60 標準試料 100 ng/mL
200
C60 標準試料 7.1 ng/mL
トルエン溶液
0
0
10
20
30
保持時間 [min]
40
50
60
図Ⅱ-5．フラーレンの HPLC 分析時のクロマトグラムの一例
検出強度
図Ⅱ-6．フラーレンの UV 吸光スペクトルの一例
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
単位電荷当たり質量 [m/z]
図Ⅱ-7．フラーレンのマススペクトルの一例 （LC-MS 分析時）【中里哲也氏提供】
Ⅱ-18
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
質量分析器を使用した定量では，フラーレンはイオン化しにくいことから，フラーレン発見時
（Kroto et al 1985）にも使用されていた TOFMS（飛行時間型質量分析）を用いることもある．
HPLC による分析の検出下限値としては，8.9 ng/mL（Shinohara et al. 2010）や 0.1 ng/injection
（Moussa et al. 1997），定量下限値としては，22 ng/mL（Shinohara et al. 2010）や 10 ng/mL（Kubota
et al. 2009）などの報告がある．生体組織中の分析定量下限値としては，29 ng/ g-tissue（Shinohara
et al. 2010）や 1.1 μg/g-tissue（Kubota et al. 2009）などが報告されている．
② その他
フラーレン C60 を，赤外吸光分析（IR）すると，526, 576, 1183, 1428 cm-1 に特徴的な吸収波長が
見られる．
4.2. 粒子の計測
フラーレン粒子の大きさ，重量，個数等を計測する方法を以下に示す．電子顕微鏡観察などに
より結晶の格子間距離や結晶構造からフラーレンを定性することは可能だが，上記の化学分析の
ように定量も併せて行うことはできない．そのため，捕集して化学分析と併用するなどしなけれ
ば，フラーレン以外の粒子と区別してフラーレン粒子だけを定量することはできない．
また，測定手法により投影面積径・光散乱径・電気移動度径・空気力学径など得られる粒径の
意味が異なっており，これらを単純に比較できない．また，平均粒径に関しても，個数平均粒径
と体積平均粒径と重量平均粒径があり，濃度に関しても、個数濃度と体積濃度と重量濃度がある
ことに注意する必要がある．
4.2.1 粒径・個数濃度測定用の装置
① 光散乱式粒子計数器（OPC）
光散乱径別に粒子（約 0.3～10 μm）の個数濃度を計数する装置で，吸引した浮遊粒子にレーザ
ー照射し，散乱強度から粒子径を，散乱光のパルスから粒子数を測定する．
② 凝縮粒子計数器（CPC）
粒子（約 0.01～1 μm（光散乱径））の総個数濃度を計数する装置で，吸引した浮遊粒子にアル
コール蒸気等を凝縮させてレーザー照射により測定する．
③ 微分型移動度分析器（DMA）
浮遊粒子に荷電させてから電場内に導入して，電場の強さを制御することで目的の粒径の粒子
を選択的に取り出すことができる．
Ⅱ-19
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
④ 走査型移動度粒径測定器（SMPS）
電気移動度径別に粒子（約 0.003～1 μm）の個数濃度を計数する装置で，上記の DMA と CPC
を組み合わせた装置である．
⑤ エアロダイナミック粒子計数器（APS）
空気力学径別に粒子（約 0.5～20 μm）の個数濃度を計数する装置で，粒子を含む空気を勢いよ
く噴射したときの粒子の速度から粒径を求める装置である．
4.2.2 電子顕微鏡観察
走査型電子顕微鏡（SEM：Scanning Electron Microscope）や透過型電子顕微鏡（TEM： Transmission
Electron Microscope）による観察が行われている．SEM による観察では，粒径や粒子の形状を観
察することはできるが，定性的情報は得られない．TEM による観察では，格子縞の観察から分子
間距離の確認や，電子線回折により結晶構造の評価ができる．
図Ⅱ-8．フラーレン粒子の TEM 画像の一例 【山本和弘氏提供】
フラーレンナノ粒子
（分散液を乾固させたもの）を TEM で観察した像．
約 1 nm 幅のフラーレンの格子縞が観察されている．
５. 一般環境でのモニタリングデータ
ここに，一般環境においてフラーレンをモニタリングしたデータを示す．作業環境におけるモ
ニタリングデータは，第Ⅲ章 暴露評価において示すことにする．
Ⅱ-20
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
5.1. 非意図的な人為起源からのフラーレン
石炭火力発電所から排出される微粒子中のフラーレンを 30 L/min で 24 時間 PTFE フィルター
に捕集し，TOF-MS で分析した結果，C60 が検出されたという報告がある（Utsunomiya et al. 2002）．
ただし，本文中では C70 も検出されたことになっていたが，図中のクロマトからは判断できなか
った．
Murr & Soto（2005）は，都市ガスコンロ，プロパンガスコンロや都市ガス温水器などの燃料ガ
ス燃焼源からのナノ粒子の凝集体を熱泳動落下法（Thermophoretic precipitation）で捕集し，TEM
観察し，フラーレンポリへドラン（C960 等の巨大フラーレン）やカーボンナノチューブが観察さ
れたと報告している．
5.2. 自然起源等からのフラーレン
5.2.1 古代の地層
ペルム三畳紀境界（約 2 億 5000 万年前）の犬山（日本）の地層中にも 10-20 ppt の C60 や微量
の C70 の存在が確認されており，大規模な山火事による酸素欠乏状態の中で生成したフラーレン
と考えられている（Chijiwa et al. 1999, Becker et al. 2001）．また，白亜紀第 3 紀境界（約 6500 万年
前）のニュージーランドの地層堆積物（粘土）中からも 0.058～5.4 ppb の C60 が検出されており，
Chicxulub 隕石衝突に伴う世界的な山火事によるものと考えられている（Heymann et al. 1994a）．
白亜紀第 3 紀境界の地層では，ブラゾル川（米），Sumbar （トルクメニスタン），Malyi Balkhan （ト
ルクメニスタン），Stevns Klint （デンマーク），Caravaca （スペイン）などでも C60 や C70 が検出
されている（Heymann et al. 1994a, 1994b, 1996, Becker et al. 1996）．
5.2.2 岩石，化石
隕石衝突時に生成された角礫岩中から C60 が 1～10 ppm 検出されたという報告がある（Becker et
al. 1994, 1996, 2000）．これらからは酸化フラーレンが検出されず，フラーレンに会合した硫化ケ
イ酸塩の存在のために，18.5 億年の間，酸化から保護されていたことが示唆されている（Becker et
al. 1994）．シュンガ石（ほぼ有機物からなる炭素含有量が 30%程度の非晶質の岩石）中からフラ
ーレンが検出したという報告も多い（Buseck et al. 1992, 1997, Parthasarathy et al. 1998）．閃電岩中
からもフラーレンが検出されており，雷撃により生成したと考えられている（Daly et al. 1993）．
原生代の枕状溶岩から採取した固体ビチューメン（瀝青：SB）が 0.2～0.3 ppm の C60 を含有して
いたという報告もある（Jehilička et al. 2000, 2003）．石炭（Fang et al. 1997, Osawa 1999）や，Xixia
（中国）で発掘された 7,000 万年前の恐竜の骨と恐竜の卵殻中にも C60 は含まれており，巨大火山噴火に
続く山火事の燃焼過程で C60 が生成されたと考えられる（Wang et al. 1998）．これらから C70 は検出され
ず，C60O は C60 の 14%程度含まれていた．これは，山火事等による C60O の酸化生成と大気中の高濃度
の SO2 による C70 の分解が原因と推定されている．
Ⅱ-21
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
5.2.3 隕石
アエンテ隕石中のフラーレンを測定したところ，C60～C400 までのフラーレンが検出した．C60
（約 0.1ppm）や C70 は明らかなピークが検出されたが，C74，C76，C78 などは C100～C400 と同様に
．2000 年にタギッシュ湖（カナダ）
C60 および C70 より 2，3 桁低かった（Becker et al. 1994, 1999）
に落ちた隕石中にフラーレン C60 や C70，C84，C100，C120，C140，C160 が検出されたが，C60， C70
の含有率が高かった（Pizzarello et al. 2001）．マーチソン隕石中には高次フラーレンが多かったこ
とから，起源となった星雲の異なる組成や水条件，および温度条件が含有されるフラーレンの種
類に影響する可能性があると考えられる（Pizzarello et al. 2001）．
5.2.4 その他
墨中のフラーレンについても報告がある（Yamasaki et al. 1995）．日本製および中国製の 16 種類
の墨中から，
8 サンプルで C60 が検出され（0.009～0.245 ppm），3 サンプルで C70 が検出された（0.030
～0.070 ppm）
（Osawa et al. 1997）．また，キリ油の煤を用いた墨（N=2）では 0.79～1.4 ppm の C60
および 0.495～1.29 ppm の C70 が，松根油の煤を用いた墨（N=2）では 1 サンプルで 0.142 ppm の
C60 および 0.275 ppm の C70 が検出された（Osawa et al. 1997）．
雷で炭化したドイツトウヒの木炭の中のフラーレンを HPLC で分析したところ，C60 と推測さ
れるピークが検出されたが，極めて低濃度であったという報告もある（<1 ppb）
（Heymann 1998b）．
６．まとめ
フラーレンは，多様な使い道が期待されているものの，現時点で実用化されている用途は非常
に限定されている．現在，年間約 2 t が国内で使われていると推計されているが，研究開発目的
の占める割合が大きく，製品として社会に出回っている量は比較的少ないと考えられる．用途開
発が順調に進めば，2010 年に 40 t，2020 年には 400 t 生産されるという予測もある．このことか
ら，第Ⅲ章で行う暴露評価において，現在のモニタリング結果を用いた評価だけでなく，将来の
生産量での暴露予測のもとでの評価が必要となる．
一般に，ナノ材料は媒体中に存在する量を定量することが困難であるが，フラーレンについて
はその特性を生かした化学分析という手法をとることができる．本章で説明した粒子計測と化学
分析の手法を併用することによって，他のナノ材料に比べ，いくらか詳細な排出・暴露解析，動
物試験での体内動態評価が可能であると考えられる．
フラーレンは，ナノテクノロジー・ナノ材料の一つのシンボルとして見られることが多いが，
非意図的に生成されることもあり，太古の昔から隕石の衝突や雷撃などで生成され，自然界に存
在している．ただし，その量は極めて少ない．
Ⅱ-22
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
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Ⅱ-29
第Ⅱ章
基本的情報
篠原 直秀
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Technology 3: 529-543.
Ⅱ-30
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
第Ⅲ章
暴露評価
本章では，フラーレンのリスク評価に必要な暴露評価を行う．最初に，主要な製品のライフサ
イクルについて記述した．次にフラーレン粒子の排出・暴露に関わる国内外の既存の研究を整理
した．それらのデータや NEDO プロジェクト（P06041）で行われた巻き上がり性試験（模擬排
出試験)と，簡単な濃度推定モデルに基づいて，１）フラーレン製造現場における暴露濃度，２）
フラーレン二次製品製造現場における暴露濃度，３）フラーレン製造工場近傍の一般環境中にお
ける暴露濃度を推定した．さらに，製品使用時の暴露についても定性的な評価を行った．暴露評
価の一部は，Shinohara et al. (submitted)を改変・追記したものである．
１．ライフサイクルと排出・暴露過程
1.1. フラーレンのライフサイクル
フラーレンの製造から廃棄までのライフサイクルを図Ⅲ-1 に示す．局所的な環境では，フラー
レン製造・加工時の作業環境における労働者の吸入・経皮暴露と使用時の一般人の吸入・経皮暴
露が想定される．
一般大気中へは，製造・加工時の作業現場からの排気，オイル等使用時の排出，廃棄後の焼却の
際の排出が考えられる．一般水系へは，製造・加工の作業現場からの排水，スポーツ用品等に使
用したワックスの雪面や土壌からの浸出，廃棄時や焼却後の埋立処分場からの浸出などが考えら
れる．医薬品・化粧品に使用されるフラーレンは，使用時に経皮暴露や経口暴露をすることにな
るが，本評価書では意図的に摂取するナノ材料は対象外とし，ここでは扱わない．樹脂や金属に
含まれている C60 は酸素存在下において 300 ºC まで安定であり，物理的衝撃以外の要因で外部に
排出されることはほとんどないと考えられる．
Ⅲ-1
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
製造
室内
加工
作業時暴露
（労働者）
使用
使用時暴露
（使用者）
吸入暴露
経皮暴露
樹脂・電池等
製造
フラーレン製造
一般環境
吸入暴露
経口暴露
生態影響
排気
大気
排水
水系
廃棄
吸入暴露
経皮暴露
埋立
使用
焼却
医薬品・化粧品等
製造
使用
排泄・洗浄
ワックス・オイル等
添加剤製造
使用
焼却
排気
大気
排水
水系
排気
大気
排水
排気
水系
大気
排水
水系
図Ⅲ-1. フラーレンのライフサイクルと想定される暴露・排出
1.2. 製造・加工時のフラーレン暴露と排出のシナリオ
製造・加工から使用・廃棄に至るまでのフラーレン暴露の可能性について，2007 年～2008 年
に行った各企業への聞き取り調査における情報及び各種文献情報に基づいて，以下のように推定
した．使用量や含有量については一定の推定値を示すが，排出に関しては情報が少ないこともあ
り，定性的な評価・推定にとどめ，定量的な推定は行わなかった．
1.2.1. フラーレン・金属内包フラーレン製造
フラーレンや金属内包フラーレンの製造から出荷までの流れから，合成は真空中，精製は湿式
もしくは密閉機器中で行われることより，煤の回収時，計量梱包時，装置のメンテナンス・清掃
時に，粉塵として作業環境中への排出が起こりうると考えてよい．このことは，既存のいくつか
の報告でも確認されている （Fujitani et al. 2008, Yeganeh et al. 2008）．抽出・精製工程は，湿式の
工程であるため，排出はないものと考えられている（（株）イデアルスター 私信 2007）．
一般環境中へは，排気口からの排出，衣服への付着による外部への持ち出し，残渣や廃棄物と
共に処分場への移動が考えられる．ただし，排気口には HEPA などのフィルターがつけられてい
ることが多く，管理された密閉型の製造工場からの排出量は極めて小さいと考えられる．また，
衣服等への付着についても，クリーンルームの出入り口にエア等による粒子除去設備があれば，
ほとんど外へ持ち出されることはなく，残渣や廃棄物を経由しての排出に関しても，燃焼処理さ
れることからほとんどないと考えられる．しかし、排気設備や粒子除去設備の清掃・メンテナン
ス時や排気設備に不備があった場合に、外部に排出される可能性がある．
Ⅲ-2
第Ⅲ章
暴露評価
工程
篠原 直秀
合成 ⇒ 煤を回収 ⇒ 精製 ⇒ 回収 ⇒ 計量 ⇒ 梱包 ⇒ 出荷
環境中への排出
想定される ・ 清掃・メンテ
ナンス時の排出
排出
巻きあがり等
による排出
巻きあがり等
による排出
排気口からの排出や
衣服への付着により
一般環境中へ移動
残渣や廃棄物は焼却
図Ⅲ-2．フラーレン製造過程からのフラーレンの排出
第Ⅱ章で述べたように，フラーレンの生産量に関する推計としては，現状の生産能力として年
間 40 t（現状の設備で 300 t まで対応可能），実際の生産は 2 t ないし 15 t，将来的（10 年後）には
400 t 程度とされている．
（富士経済 2006，厚生労働省 2009）
1.2.2. 樹脂・金属への添加（ボーリング球・ゴルフクラブ等）
樹脂・金属への添加というシナリオの形でフラーレンが使用されるのは，ゴルフクラブやテニ
スラケット，ボーリング球やメガネフレーム等である．これらの製品について，聞き取り調査結
果や文献情報を元にして，製造・使用・廃棄段階での排出について，定性的な推定を行った．ま
た，それらに関連する定量的情報として，それぞれの製品における C60 の使用量を推定した．
樹脂や金属へのフラーレンの添加は，溶けた樹脂や合金に混入する形で行なわれる（A 社 私信
2007，B 社 私信 2007）．このため，フラーレン単体では，樹脂との混合工程で排出される可能性
のみが考えられる．成型後の工場における加工（研磨）や，使用現場（ボーリング場・ゴルフ場・
練習場）等における加工時や使用時に，樹脂や合金中の微粉として排出される可能性があるが，
フラーレン単体としての排出は非常に小さいと考えられる．また，清掃やメンテナンス時の巻き
上がりなどで暴露する可能性もあるが，極めて小さいと考えられる．
一般環境中へは，排気口からの排出，衣服への付着による外部への持ち出し，および，製造工
程から出る残渣や廃棄物と一緒に処分場へ移動することが想定される．排気口にナノ材料専用の
フィルターがつけられていないケースも予想され，工場内の粒子の一定量が周辺環境へ排出され
る可能性が考えられる．同様に衣服への付着による外部への持ち出しについても，製造現場がク
リーンルーム化されておらず，特別な衣服を使用していないケースが少なくない．一方，製造現
場における残渣や廃棄物については，焼却により処理されており，ほとんど排出はないものと考
えられる．
使用時には，摩耗や破損などで樹脂や金属に混じった破片が出る可能性があり，それらが暴露
する可能性があるが，おそらく極めて小さいものと予想される．また，フラーレンのみからなる
粒子の排出はほとんど起こりえず，樹脂や金属の粒子に含有されたフラーレンが排出されると考
えられる．
Ⅲ-3
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
これらの製品については，再資源化を定めた法律がないため，一般の廃棄物と同様に廃棄物処
理法の適用を受ける．製品使用後の廃棄時には，ほとんどの場合が処分場で埋め立てられるとさ
れており（株式会社エックス都市研究所），埋め立て後に樹脂や金属に固定されたフラーレンが溶
出などで環境中に排出される可能性は極めて低い．
【ボーリング球（樹脂への添加）】フラーレンは，ボーリングの外周 14 mm に用いられているウ
レタン樹脂中に分散されており，無色のウレタン樹脂を用いた試作ボーリング球において，均一
に分散されていることが目視で確認されている（A 社 私信 2007）．1 個当たりのフラーレン含有
量を 0.1～15 g/個とするボーリング球が試作･検討されており，現在販売されている製品の含有量
は数百 mg/個である（A 社 私信 2007）．ボーリング球は，国内では輸入品も含めて年間 30 万個
が販売され，同時にほぼ同じ数が廃棄されていると考えられる．国内で使用されているボーリン
グ球（約 1 万個）の数%にフラーレンが 1 個当たり 300 mg 使用されていると仮定すると，ボーリ
ング球に使用されるフラーレン量は，1 年当たり 3 kg と見積もることができる．ちなみに，フラ
ーレンを使用したボーリング球の数が今後増える可能性は低いとされている（A 社，私信 2007）．
テニスラケットやボウリングボールの廃棄については，プラスチック類を可燃ごみに区分する
かどうかや焼却施設の受入条件の違いから，市町村によって「可燃ごみ」
「不燃ごみ」
「粗大ごみ」
「排出禁止物」と分別区分が異なっている．粗大ごみに区分される場合は，多くは破砕機によっ
て破砕され，可燃分は焼却処理，不燃分は埋立処分される．
（株式会社エックス都市研究所 2008）．
不燃ごみに区分される場合は，プラスチックの回収時に共に回収されるか，残渣として焼却処分
もしくは埋立処分されるかのいずれかと考えられる．可燃ごみに区分される場合には，焼却処分
される．現在稼働している市町村の焼却施設の多くが 800℃以上で焼却を行っていることを考え
ると，焼却時にフラーレンはほぼ燃焼されるものと考えられる．
過程
・ 表面研磨・掘削
により
樹脂と共に排出
・ 投入時に
巻きあがり
・ 清掃時の排出
事業所内での暴露
ボーリング場での暴露
排気口からの排出や
衣服への付着により
一般環境中へ移動
残渣や廃棄物は焼却
もしくは処分場へ移動
燃焼
（排出しない）
（可燃ゴミ） 廃棄
ボーリング場での使用
（不燃ゴミ）
（粗大ゴミ）
埋立
・ 表面研磨・掘削
により
樹脂と共に排出
⇒⇒⇒⇒ ⇒⇒ ⇒
想定される
排出
樹脂と混合 ⇒ 樹脂コーティング ⇒ 加工（工場） ⇒ 加工（ボーリング場等）
・ 摩擦や衝撃により
樹脂と共に排出
破砕
・破砕時にわずかに排出
・浸出水への溶出
・風化（ほとんどなし）
図Ⅲ-3．ボーリング球のライフサイクルからのフラーレンの排出
Ⅲ-4
第Ⅲ章
暴露評価
過程
想定される
排出
篠原 直秀
合金と混合 ⇒ 成型 ⇒ 加工（工場） ⇒ ゴルフ場・練習場での使用 ⇒ 廃棄
（破砕・埋立）
・ 投入時に
巻きあがり
・ 清掃時の排出
・ 表面研磨時に
金属粉と共に排出
・摩擦や衝撃により
金属粉と共に排出
事業所内での暴露
・破砕時に排出の可能性
・浸出水への溶出
・風化
（ほとんどないと推察）
排気口からの排出や衣服への付着や使用により
一般環境中へ移動
残渣や廃棄物は焼却もしくは処分場へ移動
図Ⅲ-4．ゴルフクラブのライフサイクルからのフラーレンの排出
【ゴルフクラブ（金属への添加）】ゴルフクラブのヘッドは，鋳造後に 10 g 以上研磨処理を施さ
れる（B 社 私信 2007）．このことから，研磨前のゴルフクラブのヘッド重量を 210 g として，現
在我が国でゴルフクラブに使用されているフラーレン量の見積もりを行った．その結果，B 社の
ゴルフクラブのヘッドに使用されているフラーレンは 1 年当たり約 6 kg と計算された．この量は
今後も大きく変わらないと考えられる．B 社は，ゴルフクラブのシャフトおよびヘッドクラウン
部にフラーレンを使用していると考えられるが，データは一切非公開のため，以下の仮定で推定
を行った．シャフトの重量が 60 g で，フラーレンが 0.75 wt%含まれているとし，同様に，ヘッド
のクラウン部の重量が 100 g で，フラーレンが 0.1 wt%含まれているとする．フラーレン含有ゴル
フクラブの製造本数を，25,000 本と仮定すると，B 社のゴルフクラブに使用されているフラーレ
ン量は，1 年当たり約 14 kg となる．合計すると，我が国で使用されているゴルフクラブに使用さ
れているフラーレンの総量は，1 年当たり約 20 kg と推定できる．
ゴルフクラブは，
「粗大ごみ」として廃棄されることが一般的である．ただし，一部の市町村で
は「排出禁止物」とされており，使用者が直接処理業者に持ち込む形で廃棄される．収集された
ゴルフクラブは，破砕された後，フラーレンの使用される金属部分は不燃物として埋立処理され
る．ただし，市町村によっては，ゴルフクラブを破砕できる破砕機を有さない場合があり，その
ような場合には，破砕されずに金属資源として売却されるか，そのまま埋立処分されているもの
と考えられる（株式会社エックス都市研究所 2008）．
1.2.3. エンジンオイル
フラーレンのエンジンオイル等への含有量はメーカーから一切公表されていない．このため，
得られた情報と様々な仮定のもとで，エンジンオイルに添加されるフラーレンの年間使用量の推
定を行った．350 mL のエンジンオイル缶中に含まれるフラーレン量は 1 g よりもはるかに低いと
いう情報（D 社 私信 2007）と他の製品の含有量等から，フラーレン含有量は 0.05 wt%とし，エ
ンジンオイルの比重を一般的な値として 0.85 と仮定した．年間の日本製フラーレン入りエンジン
Ⅲ-5
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
過程
オイルと混合
想定される
排出
⇒
自動車での使用
⇒
混合時に巻き上がり ・エンジンの隙間からの漏出
（ほとんどなし）
・事故などの際に排出
廃棄（焼却）
ほとんど排出なし
図Ⅲ-5．エンジンオイルのライフサイクルからのフラーレンの排出
オイル販売量（350 mL）が約 30,000 本である（D 社 私信 2007）ことから，1 年当たりの日本全
国でのエンジンオイルへのフラーレンの使用量は約 4.5 kg と推定される．エンジンオイルやカー
エアコンオイルは，欧米から輸入されているものもあるため，実際の使用量はこれより多いと考
えられる（D 社 私信 2007）．エンジンオイルの使用最高温度（耐熱）は 150～160 ºC であり，C60
が酸素存在下でも 100～300 ºC で安定であり，酸素非存在下において 600℃程度で昇華する（Chen
et al. 1992）ことを考えると，車の使用中にフラーレンがエンジン内の隙間等から昇華して排出さ
れることはほぼないと考えられる．
廃棄については，エンジンオイルの埋立は禁止されているため，専門業者が高温での焼却を行
うことになっている（厚生労働省 1995）．その際，C60 は燃焼するためほとんど環境中へは排出さ
れないと考えられる．
1.2.4. 化粧品
特許資料において，好適な化粧品用フラーレン水溶液は，50 ppm 以上とされている．（ビタミ
ン C60 バイオリサーチ株式会社 2010）このことより， 250 ppm の C60 を含有している化粧品を
2.5 t/年で生産していると仮定し，生成過程等でのロスを 30%として試算したところ，化粧品に使
用されるフラーレン量の見積もりは，1 年当たり 0.7 kg と算出された．現在のところ，化粧品用
にフラーレン-PVP 液を製造している企業は，廃液を保管しており，外部への排出はない（ビタミ
ン C60 バイオリサーチ株式会社 私信 2007）．消費者により化粧品が使用された後には，洗顔等
で下水へ排出される．下水中では凝集しているため，その多くは下水処理場の沈殿池等で沈殿し，
汚泥処理後に焼却処理される．このため，環境中への排出は少ないと考えられる．ただし，誘導
体化されるなどにより，水溶化されたフラーレンが化粧品中に使用されているような場合には，
そのまま環境水中へ排出される可能性がある（Shinohara 2011）．
1.2.5. 有機太陽電池
有機太陽電池は，まだ工業化こそされていないが，現在使用されている無機太陽電池とは製造
工程が大きく異なり，既存の印刷技術を応用した製造工程が検討されており，それにより大幅な
コストダウンと大型太陽電池の製作が可能になると考えられている．そこで，現在検討が進めら
れている基板への薄膜材料の印刷工程と既存の印刷に関わる事業所における顔料等の排出・暴露
Ⅲ-6
第Ⅲ章
暴露評価
過程
想定される
排出
篠原 直秀
樹脂や溶液との
混合
⇒ 印刷
・湿式過程で排出する
・清掃時の排出
⇒
使用
・摩耗や事故など
で排出
（ほとんどなし）
⇒
廃棄
基盤が
紙・繊維
焼却
基盤が
金属・コンクリート
破砕 破砕時にわずかに
排出の可能性
埋立 ・浸出水への溶出
・風化
（ほとんどなし）
図Ⅲ-6．有機太陽電池のライフサイクルからのフラーレンの排出
を参考にし，ライフサイクルフローを検討した．
製造段階の排出であるが，PRTR（Pollutant Release and Transfer Register：化学物質排出移動量届
出制度）で推定されている印刷工程における顔料成分の排出と同様とすると，大気中・土壌・水
系への排出はほとんどなく，廃インキ成分として事業所外に持ち出されるのみである（経済産業
省＆環境省 2009）．廃インキ成分は高温で焼却処分されるため，フラーレンの環境中への排出は
ほとんどないと考えられる．使用段階では，塗布されている表面から，摩耗や事故などでフラー
レンが排出される可能性はあるが，極めて少ないものとみられる．廃棄後の処理については，基
盤に用いる材料にもよるが，繊維や紙等を基盤とした場合には，そのまま高温で焼却処分される
ことで，排出はほとんどない．また，建築物や金属等を基盤として用いた場合には，破砕後に埋
立となる可能性が高い．この場合，破砕時にわずかに環境中へ排出されうるが，大量に排出・暴
露が起こる可能性は低いと考えられる．
1.3. フラーレンのライフサイクルのまとめと暴露量推定対象の決定
フラーレンのライフサイクルにおける排出可能性をまとめたものを，表Ⅲ-1～4 に示す．また，
表中で塗りつぶした部分は，暴露評価の対象とした過程である．
フラーレンを製造するプロセス自体は，密閉系で行われる．そのため，ここでシナリオを検討
したプロセスで，フラーレンが排出され作業者の暴露が生じる可能性のあるのは，回収・秤量・
梱包等の工程が中心であると考えてよい．ただし，清掃・メンテナンス時にも作業環境中濃度が
上昇する可能性がある．この前提から，これらの過程における作業環境中への排出と，それに伴
う労働者の暴露量を推定することとした．フラーレン製造プロセスからの一般環境中への排出量
は極めて小さいと考えられているが，フラーレン製造工場や大量にフラーレンを使用するフラー
レン加工工場を仮定することで，屋外への排出量と工場周辺における暴露量の推定を行うことと
した．
Ⅲ-7
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
フラーレンの加工プロセスに関しては，樹脂・金属への添加について検討を行った．このプロ
セスでは，樹脂や金属との混合工程においてフラーレンが作業環境中に排出される可能性がある
ため，類似の状況を仮定した巻き上がり性試験を基に暴露量推定を行うこととした．表面研磨時
の排出に関しては、研磨される総量が小さいため、樹脂や金属に交じって排出されるフラーレン
の排出も極めて小さいと考えられ，評価対象からははずした．フラーレン二次製品製造プロセス
における一般環境中への排出可能性は，管理が不十分なケース（フィルターがない場合等）を想
定し，且つ，排気口からわずかな排出があると仮定して，工場周辺における暴露量を推定した．
今回，衣服への付着による持ち出しについては，可能性はあるが評価は行わなかった．
表Ⅲ-1. フラーレン製造現場において製造から出荷までの間の作業環境への排出可能性
プロセス
定期／高頻度
不定期／低頻度
製造過程
無視できる
清掃・メンテナンス時や不備があ
った場合に可能性あり
⇒ 現場調査に基づき評価（２節）
回収
可能性あり（巻き上がり）
なし
⇒ 現場調査に基づき評価（２節）
精製
溶媒の乾燥時に排出可能性あり
なし
⇒ 無視できる
回収・計量・梱包
可能性あり（巻き上がり）
なし
⇒ 現場調査に基づき評価（２節）
出荷
無視できる
なし
表Ⅲ-2. フラーレン製造現場において製造から廃棄までの間の一般環境中への排出可能性
プロセス
定期／高頻度
不定期／低頻度
排気口から
無視できる(HEPA 等フィルター
空調設備の清掃・メンテナンス時
が付いていれば)
や不備があった場合に可能性あ
り
⇒ 一部が排出されると仮定して
評価（４節）
衣服への付着によ
無視できる（クリーンルームの出
る持ち出し
入り口でエア等による粒子除去設
なし
備があれば）
残渣や廃棄物に随
なし
なし
伴する持ち出し
Ⅲ-8
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
表Ⅲ-3. 樹脂・金属へのフラーレン添加から廃棄までの間の作業環境への排出可能性
プロセス
定期／高頻度
不定期／低頻度
樹脂・合金と混合
投入時に可能性あり
清掃・メンテナンス時可能性あり
⇒ （巻き上がり）
⇒ 極めて小さい可能性から，評
⇒ 類似の状況を仮定して，巻き上
価せず
がり性試験に基づき評価（３節）
成型
なし
清掃・メンテナンス時可能性あり
⇒ 極めて小さい可能性から，評
価せず
加工（工場）
加工（使用現場）
廃棄
表面研磨時
清掃・メンテナンス時可能性あり
⇒極めて小さい可能性から，評価
⇒ 極めて小さい可能性から，評
せず
価せず
表面研磨
清掃・メンテナンス時可能性あり
⇒ 極めて小さい可能性から，評価
⇒ 極めて小さい可能性から，評
せず
価せず
粉砕時
なし
⇒ 極めて小さい可能性から，評価
せず
埋立時，焼却時
⇒ 無視できる
表Ⅲ-4.樹脂・金属へのフラーレン添加から廃棄までの間の一般環境への排出可能性
プロセス
定期／高頻度
不定期／低頻度
排気口から
可能性あり（フィルター等による
清掃・メンテナンス時可能性あり
除去をしていないケースが多い）
⇒ 極めて小さい可能性から，評
⇒ 一部が排出されると仮定して
価せず
評価（４節）
衣服への付着によ
可能性あり（クリーンルーム化さ
る持ち出し
れておらず，特別な衣服を使用し
なし
ていないケースが多い）
⇒ 可能性はあるが，今回は評価せ
ず．
残渣や廃棄物に随
粉砕時，埋立時，焼却時
伴する持ち出し
⇒
なし
無視できる．
Ⅲ-9
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
一方，製品中のフラーレン量や各ライフサイクルにおいて使用されるフラーレンの量を，概算
で足し合わせたところ，全てを合計してもせいぜい数 10～100 kg 程度であり，現在年間 2 t ない
し 15 t とされている生産量と大きく隔たりがある．これは，現在までに実用化されたフラーレン
製品は少なく，研究開発用途に使用されるフラーレンの量がかなり大きいことを示唆している可
能性がある．
２．フラーレン製造現場における暴露濃度推定
～既存調査に基づく推定～
ここでは，既存調査結果に基づいて，フラーレンの製造現場における暴露濃度を推定すること
とした．
2.1. フラーレン製造現場での測定事例
藤谷らは，国内のフラーレン製造現場（燃焼法による製造）における作業中のフラーレンの粒
径別の個数濃度を，光散乱式粒子計数器（OPC）や走査型移動度粒径測定器（SMPS：Scanning
Mobility Particle Sizer）を用いて実測した（嵐谷ら 2006, 藤谷ら 2006, Fujitani et al. 2008）．測定を
行った作業所の広さは，6.5 m × 11 m であり，換気回数は 11 回/h であった．貯蔵タンクから 1.5 m
の距離で，屋外及び作業現場（フラーレン製造時，清掃時，計量・袋詰め時），agitation（攪拌）
（実際の作業ではない操作であるが，粒径分布や形態学的な観察のためにわざと排出を促進する
操作を実施した）時の測定を行った．
OPC による測定では，フラーレン製造開始と共に PM2.5～PM10（粒径 10 μm 以下）の粒径範
囲の濃度が上昇し，計量および袋詰め作業では明らかに PM7～PM10 の粒径範囲の濃度が上昇し
ていたが，粒径 1,000 nm 以下の粒子の上昇は確認されなかった．SMPS による測定では，フラー
レン袋詰め作業時には，<50 nm と>2,000 nm の粒子が明らかに上昇していた（論文（Fujitani et al.
2008）中の図から読み取ると，ピーク高さは< 1 × 108 nm3/cm3（<1 × 104 個/cm3）および<5 × 1010
nm3/cm3（個数濃度読み取れず））．50～100 nm 及び 100～2,000 nm の粒子の上昇はほとんど確認さ
れなかった（論文（Fujitani et al. 2008）中の図のベースラインのノイズ幅から読み取ると，検出
下限以下としてどちらも< 1 × 109 nm3/cm3 程度と判断）．掃除機を用いた清掃作業時には，<50 nm
3
× 104 個/cm3））
．
の粒子が明らかに上昇していた（論文中の図から読み取ると，< 1 × 108 nm3/cm（<1
また，agitation を行った時の気中の粒子を測定したところ，>2,000 nm の粒子濃度が大きく上昇し
）．ただし，これらの粒子
ていた（論文中の図では，< 3 × 1012 nm3/cm3（個数濃度は読み取れず）
濃度の上昇はほんの数分間のみであり，すぐに減衰していた．また，袋詰め作業時には粒径 1 μm
Ⅲ-10
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
以上の粒子個数が増加し，掃除機を用いた作業時には粒径 487 nm 以下の粒子個数が増加してい
たことから，袋詰め作業時には凝集したナノ粒子が飛散し，掃除機を用いた作業時にはナノ領域
の粒子が飛散している可能性が示唆された．SEM 写真による形態観察からは，作業中に捕集され
た粒径 1,000 nm 以上の粒子はフラーレンだと判断されている．
Yeganeh et al. (2008) は，米国内のフラーレン製造工場（アーク放電法による製造）において，
光散乱エアロゾル光度計で PM2.5 濃度，SMPS と CPC を使って 164 - 673 nm と 4 - 160 nm の粒子
の個数濃度を計測した．2 日間，12 回の製造工程の間に，反応装置の入ったフード内（反応装置
の開閉部から 20 cm），フードのすぐ外（反応装置から 50 cm，高さ 150 cm），フードの外（実験
室内のバックグラウンド，反応装置から 200 cm，高さ 150 cm）で測定を行った．その結果，平均
PM2.5 濃度と平均粒子個数濃度に工場の内外で違いはなかった．しかし，掃除の準備など作業者
が物理的な操作をする際に，フードの内外で短時間 PM2.5 濃度と粒子個数濃度が大きく上昇して
おり，その多くが 100～sub nm の大きさであった．工場内外で濃度が同程度であったということ
から，著者らは，本工場での工学的制御はうまくいっていると結論している．
2.2. 金属内包フラーレン製造現場での測定事例
甲田ら (2008) は，日本国内の金属内包フラーレン（Li@C60）製造事業所において，作業環境
中のフラーレン濃度および粒子濃度を測定・報告している．粒子カウンターの結果から，合成さ
れた Li@C60 を基盤から掻き取る作業の際に，C60 あるいは Li@C60 由来の粒子が室内に放出され
ていることが分かった．ただし，直径が数千 nm の粒子は顕著に観察されたが，100 nm 以下の粒
子はわずかなピークが観測されたのみであった．作業が行われなかった日の C60 濃度は定量下限
付近であったが，作業を行った日の C60 濃度は充分定量が可能な濃度であった．粒径が 1,000 nm よ
り大きな粒子中の C60 濃度は高かったが，1,000 nm 以下の粒子中からはほとんど C60 が観察され
なかった．（表Ⅲ-5 参照）
Shinohara et al. (2009)は，NEDO プロジェクト（P06041）において，日本国内の金属内包フラー
レン（Li@C60）製造事業所（（株）イデアルスター）において，作業環境中のフラーレン濃度お
表Ⅲ-5．金属内包フラーレン製造現場において粒子として捕集された気中 C60 濃度
空気中の濃度[μg/m3]
粒子径[nm]
作業日
非作業日
＞2,500
1.65
0.04
1,000-2,500
0.32
N.D.
500-1,000
0.08
N.D.
250-500
0.03
N.D.
＜250
N.D.
N.D.
3
N.D.は検出下限値以下，0.03～0.08 μg/m は定量下限値以下
Ⅲ-11
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
よび粒子濃度を測定・報告している．この事業所は，前述の甲田らが調査した事業所と同一であ
り，甲田らの指摘によって作業環境への排出工程を改善した（Li@C60 を基盤から掻き取る作業の
密閉化）後に，測定を行った．これは，凝縮核粒子計数器（CNC）で 10～>1,000 nm の粒子の総
個数濃度を，OPC で 300～10,000 nm の粒径別個数濃度を計数し，石英フィルター及びカスケード
インパクターを用いた捕集と HPLC 分析により，全粒子中の C60 濃度及び粒径別 C60 濃度を測定
する方法を用いている．3 日間の作業時間中を通した環境測定（約 6 h × 3 day）とプロセスごと
の環境測定（回収時間 約 30 min，合成中 約 2 h）を合成装置近傍（20～60 cm）と秤量用電子天
秤近傍（20～40 cm）において行った．合成装置近傍では，合成装置を開放し，合成装置内から未
反応の C60 や Li 内包 C60 が付着した基板（皿）を回収してデシケータへ入れる作業（回収作業）
が行われた時間帯に 500 nm 以上もしくは 1,000 nm より大きな粒子の個数濃度（OPC の値）の上
昇が見られた．10～300 nm の粒子個数濃度（CNC の値）の上昇がみられた場合もあったが，常
に観察されたわけではないことから，合成装置の炉によって気化した何らかのガスが室内で冷却
してできた凝縮粒子である可能性も考えられる．回収作業・装置運転・その他の作業時間を通し
て 3 日間（18 時間）測定した作業環境中の平均 C60 濃度は，合成装置の横で 0.13 μg/m3，秤量機
器の横で 0.040 μg/m3 であった．回収作業時（約 30 分）の全粒径のフラーレン濃度は平均 0.44 μg/m3
（0.22 μg/m3 & 2 回目 0.66 μg/m3）であり，装置運転中（約 2 時間）の全粒径のフラーレン濃度は
平均 0.0057 μg/m3（0.0045 μg/m3 & 2 回目 0.0069 μg/m3）であった．C60 はそのほとんどがサブミク
ロンからミクロンサイズであった（2,500 nm を超える粒子中の C60 は，全 C60 の 26～54 wt%）が，
250 nm より小さな粒子も 4.3～30 wt%であり，ある程度の C60 ナノ粒子が気中に存在することが
表Ⅲ-6．金属内包フラーレン製造現場において粒子として捕集された気中 C60 濃度
気中濃度 [μg/m3]
合成装置横
秤量横
粒径 [nm]
労働時間中
労働時間中
取扱作業中
合成中
（6 時間×3 日）
(30 分)
(2 時間）
< 250 nm
0.0023
0.064
0.00083
0.014
250-500 nm
0.0014
Data lost
0.00065
0.0040
500-1,000 nm
0.0038
0.11
0.0029
0.0028
1,000-2,500 nm
0.0040
0.056
0.0032
N.D.
2,500-10,000 nm
0.0092
0.080
0.0049
0.025
0.040
測定せず
全粒子（10,000 nm
以上も含む）
0.13
測定せず
0.22
0.0045
0.66
0.0069
（6 時間×3
日）
取扱作業中
(30 分)
N.D.: 検出下限値以下（0.001 μg/m3）
Ⅲ-12
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
確認された．また，C60O 濃度は非常に低く，どのサンプルでも C60 の 2.0%以下であった．甲田ら
の調査と比べて，作業環境中濃度が大きく下がっていることが確認された．（表Ⅲ-6 参照）
2.3. 既存調査に基づく作業環境における暴露濃度推定
既存調査結果に基づいて，フラーレン粉体の袋詰め等を伴う製造現場での暴露濃度を推定する．
既存のどの報告においても，フラーレンや金属内包フラーレンの合成装置自体からの排出はほと
んどないことが分かる．ただし，合成装置からの取り出しや袋詰め，清掃作業などの時に粒子濃
度の上昇が観察されており，フラーレンへの暴露の懸念がある．また，作業現場の環境中では，
ナノサイズの粒子中のフラーレンは非常に少なく，ほとんどがミクロンサイズの凝集体と考えら
れる．
嵐谷ら(2006)，藤谷ら(2006)，Fujitani et al. (2008)の報告から，フラーレンの袋詰め作業及び清
掃時の，作業環境中の<50 nm および>2000 nm の粒子濃度は<1 × 108 nm3/cm3 および<5 × 1010
nm3/cm3 であり（図中ピーク濃度の読み取り），それらの濃度はすぐに減少していた．50～100 nm
および 100～2,000 nm の粒径範囲ではこれらの作業中に濃度の上昇は見られず，図中のベースラ
インのノイズから判断すると，どちらも 1 × 109 nm3/cm3 より大きいことはないと考えられる．袋
詰め作業や清掃を労働時間中に継続的に行い，これらの報告で測定された粒子が全て C60 である
という二つの仮定に基づいて，作業環境における暴露濃度を推定した．ここで，単位を μg/m3 換
算するための粒子のかさ密度は，0.9～1.2 g/cm3 として計算を行った．それぞれの環境における作
業時間中の<50 nm，50～100 nm，100～2,000 nm， >2,000 nm の C60 粒子への平均暴露濃度は 1.2 ×
10-4 mg/m3，1.2 × 10-3 mg/m3，1.2 × 10-3 mg/m3，6.0 × 10-2 mg/m3 になると推定された．ただし，こ
の濃度は粒子数の計測結果の図から読み取ったデータそのままであり，フラーレン以外の粒子が
含まれているため，過大評価した数値である可能性が高いことには注意が必要である．
Yeganeh et al. (2008) は，作業者が物理的な操作をする際に，PM2.5 濃度と粒子個数濃度がフー
ドの内外で短時間上昇したと報告しているが，これはフラーレン製造以外の工程（グラファイト
や金属の加工など）を同時に行っている現場での測定であり，本文中に上昇した時の濃度が示さ
れていないことから，暴露濃度の推定に用いることはできない．
甲田ら(2008) は，金属内包フラーレン製造現場における粒子中フラーレン濃度を測定し，作
業のない日の作業環境中の 250～2,500 nm の粒子中 C60 濃度は検出下限以下であり，>2,500 nm の
粒子中 C60 濃度は定量下限以下だったと報告している（検出下限，定量下限のそれぞれの値につ
いては，記述なし）．一方，作業日の作業環境中の<250 nm の粒子中 C60 濃度は検出下限以下であ
3
250～1,000 nm は定量下限以下），
り，250～2,500 nm の粒子中 C60 濃度は 0.43 × 10-3 mg/m（ただし，
>2,500 nm の粒子中 C60 濃度は 1.65 × 10-3 mg/m3 だったと報告している（検出下限，定量下限のそ
れぞれの値については，記述なし）．甲田らの指摘により工程管理を改善した後に，同じ作業現場
で測定を行った Shinohara et al. (2009) の報告では，金属内包フラーレン製造現場における 3 日間
の作業環境中濃度は，作業現場で最も高濃度となる装置の横で測定を行っても 1.3 × 10-4 mg/m3
Ⅲ-13
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
（<250 nm では 0.0008.3 × 10-7 mg/m3）だった．最も高濃度となる回収時の濃度（30 分間）につい
ても測定した最大値が 6.6 × 10-4 mg/m3（<250 nm では 6.37 × 10-5 mg/m3）を示していた．
これらのことから，粒子濃度が高くなるのは，フラーレンの粉体を直接取り扱う作業であるこ
とがわかった．また，現状の作業環境におけるフラーレンへの暴露としては，ナノサイズのもの
（< 50 nm および 50～100 nm）では 1.2 × 10-4 mg/m3 および 1.2 × 10-3 mg/m3，サブミクロンサイズ
のもの（100 nm～2,000 nm）では 1.2 × 10-3 mg/m3，ミクロンサイズのもの（> 2,000 nm）では 6.0 ×
10-2 mg/m3 が現実に起こりうる上限の濃度となる．ただし，これらは作業環境中の濃度であり，
作業中に呼吸防護具を装着したりドラフトチャンバーを使用したりすることによって，暴露濃度
は更に小さくなると考えられる．
Ⅲ-14
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
50 nm
Fujitani et al. 2008
フラーレン工場（袋詰め及び清掃工程）
100 nm
ピーク観察されず
<0.008 µg/m3
[SMPS （走査型移動度粒径測定） ]
2,000 nm
<4.0 µg/m3
250 nm 500 nm 1,000 nm
甲田ら 2008
作業中
N.D.
N.D.
フラーレン工場
金属内包フラーレン製造現場 非作業中
0.03
N.D.
10,000 nm
0.08
N.D.
2,500 nm
0.32
N.D.
1.65 µg/m3
0.04 µg/m3
[カスケードインパクター捕集＆HPLC分析]
Shinohara et al. 3日間作業中(18h)
2009
回収作業中(30min)
甲田らと同じ工場
工程管理の改善後
0.13µg/m3 （合成装置横）, 0.040µg/m3 （秤量器横）
0.22～0.66 µg/m3 （合成装置横）
0.0045～0.0069 µg/m3 （合成装置横）
合成中(2h)
3日間作業中(18h) 合成装置横
0.0023
0.00083
0.064
0.014
秤量器横
回収作業中(30min) 合成装置横
秤量器横
0.0014
0.00065
data lost
0.0040
0.0038
0.0029
0.105
0.0028
0.0040
0.0032
0.0564
N.D.
0.0092 µg/m3
0.0049 µg/m3
0.080 µg/m3
0.025 µg/m3
[カスケードインパクター捕集＆HPLC分析]
10
100
1000
10000
粒径 [nm]
1
2
*N.D：検出下限値以下（甲田ら（2008）では，検出下限値については，記述なし
3
Shinohara et al. (2009)では，検出下限値は，0.001 μg/m3）
4
図Ⅲ-7．既存の作業環境中フラーレン測定の粒径別濃度
5
Fujitani et al. (2008)の調査対象はフラーレン製造工場であり，甲田ら (2008)及び Shinohara et al. (2009)の調査対象は，金属内包フラーレン合成工場である．
Ⅲ-15
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
３．フラーレン二次製品製造現場における暴露濃度推定
～モデル計算に基づく推定～
NEDO プロジェクト（P06041）において Ogura et al. (2009) が実施した巻き上がり性試験の結果
と，2 ボックスモデルを用いて作業環境中の暴露濃度を求めた．ここで推定する作業環境として
は，フラーレン二次製品製造現場である樹脂や金属への添加作業現場を想定した．樹脂や金属へ
の添加作業現場において， 1 度に取り扱う数量は現状ではさほど大きくない．しかし，逆にその
作業の性質から，必ずしも密閉化した設備によって行われず，工学的対策も十分でないケースが
ある．
ここでは，フラーレンの巻き上がり性（気流等の外乱によって粒子が飛散する特性）の試験結
果をもとに，樹脂や金属への添加作業現場での少量取り扱い時の粒径区分別の暴露濃度を算出し
た．
3.1. 巻き上がり性試験
3.1.1. 巻き上がり性試験とは
NIOSH のグループ（Baron et al. 2003，Maynard et al. 2004，2007）や NEDO プロジェクト（P06041）
において Ogura et al. (2009) が行っている粒子の模擬排出試験であり，粒子を遠沈管に入れて洗浄
空気を流しながら攪拌して，排出されてくる粒子の粒径分布や個数濃度を測定する試験である．
他にも，模擬排出試験としては，清浄空気を流しながら粒子の入ったドラム缶を回転させて，排
出されてくる粒子を計測する方法などが報告されている（Mark et al. 2007）．様々な金属酸化物や
CNT についての試験が広く行われているが，2010 年 10 月現在，Ogura et al. (2009) の研究を除い
てフラーレンの巻き上がり性試験についての報告は存在しない．
3.1.2. 巻き上がり性試験の結果
Ogura et al. (2009) は，NEDO プロジェクト（P06041）において，ガラス試験管（外径 25 mm; 長
さ 20 cm）中に市販されている C60 粒子（比表面積 27 m2/g，平均粒径 1 ミクロン程度）を約 1 cm3
入れて 5 L/min で空気を流しながら攪拌し（約 2,500 rpm），出てくる粒子の発生量及び粒径分布
を測定した．その結果得られた 1 分間排出速度は，昇華精製された C60 で 73 μg/g/min（10-100 nm:
1.4 × 10-9 mg/g/min, 100-1,000 nm: 0.29 × 10-3 mg/g/min, 1,000-10,000 nm: 6.3 × 10-2 mg/g/min, >10,000
nm: 9.1 × 10-3 mg/g/min）であった．
Ⅲ-16
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
作業場全体（遠隔場）
外部との吸排気
発生源周囲の空気の流れ
C60の取扱時
その他の作業時
発生源近傍
（近接場）
装置or作業台
（上部から粒子発生）
作業員
図Ⅲ-８．近接場/遠隔場 2 ボックスモデルの概要
3.2. モデル計算による暴露濃度の推定
3.2.1 方法
① 想定するモデル
作業環境中のナノ粒子の気相におけるマクロな挙動は，一般の化学物質と同様に扱うことがで
きると仮定して，以下のモデルを用いて作業環境中濃度を推定した．
そこで，フラーレンの使用工程における作業環境中の濃度を，2 ボックスモデル（近接場/遠隔
場モデル； Spencer & Plisko 2007）により計算した．その上で，作業する場所付近を近接場，そ
れ以外の同じ空間にある作業環境を遠隔場とし，フラーレンを直接取り扱う作業時間中に近接場
における暴露がおこり，その他の作業時間は遠隔場における暴露が生じると仮定して，暴露濃度
を求めた（図Ⅲ-8）．
暴露濃度
C exp osure  C near 
t ope
t work
 C far 
t work  t ope
t work
 R2
近接場濃度
dCnear E  R1

 Cnear  C far  Fn to f  A
dt
Vnear
遠隔場濃度
dC far
dt
 C far  C near  Fn to f  A  C far  V far  N
ここで，Cexposure [mg/m3]：暴露濃度，Cnear [mg/m3]：近接場濃度，Cfar [mg/m3]：遠隔場濃度，tope [h/
回]：取り扱い作業時間，twork [h]：労働時間 [h/day]，E [mg/min]：排出速度，Vnear [m3]：近接場体
積，Vfar [m3]：遠隔場体積，Fn to f [m/min]：近接場⇒遠隔場空気流れ，A [m2]：近接場遠隔場境界
面面積，N [回/hour]：換気回数，R1[-]：工学的対策による排出削減率，R2[-]：呼吸用保護具によ
る防護係数とする．
Ⅲ-17
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
このモデルで考慮されていない過程は，粒子の壁面や床面への沈着，および，沈着した粒子の
再飛散である．前者はどちらかと言えば気中濃度を減少させる方向に働き，後者は逆に気中濃度
を上昇させる方向に働く．一部の粒子は壁面・床面への沈着，再飛散が起こる．長期間作業を続
けた場合には，沈着と飛散は最終的に平衡に到達すると考えられるが，適当な頻度で床面等の清
掃を行うことを想定すれば，清掃時に一時的に気中濃度が上昇はするものの，平均的な暴露濃度
はここで推定した値よりも低くなると考えられる．
② 想定するシナリオおよびモデルパラメーター
フラーレンの巻き上がり性（気流等の外乱によって粒子が飛散する特性）の試験結果をもとに，
樹脂や金属への添加作業現場での少量取り扱いというシナリオについて評価を行う．前提として，
1 個あたり 300 mg のフラーレンが用いられているスポーツ製品が 1 作業者 1 日あたり 240 個製造
されていると仮定した（年間 1 万個）．シナリオとしては，1.5 g の C60 を 10 分に一度 1 分間取り
扱う作業を一日 8 時間行うと想定して，8 時間の平均暴露濃度を求めることとした．作業に伴う
粒子の排出速度は，巻き上がり性試験による排出速度を元に求めた．
排出速度 E [mg/min ] ＝ 1.5 [g] × 巻き上がり性試験排出速度 [mg/g/min]
巻き上がり性試験排出速度：<100 nm: 1.4 × 10-9 mg/g/min, 100-1,000 nm: 2.9 × 10-4 mg/g/min,
1,000-10,000 nm: 6.3 × 10-2 mg/g/min, >10,000 nm: 9.1 × 10-3 mg/g/min
巻き上がり性試験は，機械的に激しく攪拌した場合の排出を計測しているため，現実の取扱い
に比べると排出速度が大きい可能性が高い．また，ここで想定されている 1.5 g という数値は，巻
き上がり性試験における量（1 cm3）と大きな違いがないため，評価系の規模の違いからくる過大
／過小評価の影響は小さいと考えられる．これらのことから，現実にあり得るワーストケースの
評価となっていると思われる．
モデルのパラメーターとしては，以下のような値を設定した．とくに近接場の半径，近接場−
遠隔場間の空気の流れについては，Spencer & Plisko (2007) で用いられた値を用いた．
遠隔場体積 Vfar：5 m × 6 m × 3.5 m = 105 m3
近接場：半径 1 m の半球
近接場−遠隔場間の空気の流れ, Fn to f：3.3 m/min （比較的穏やかな条件）
遠隔場−外気の換気回数 N：5 回/hour（実験室等の通常の換気として）
ここでは，工学的対策および呼吸用保護具については考慮せず，
工学的対策による排出削減率 R1[-]＝1
呼吸用保護具による防護係数 R2[-]＝1
Ⅲ-18
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
表Ⅲ-7．1.5 g 取扱い時(10 分に 1 回 × 8 時間)の暴露濃度の推定結果
粒径 [nm]
10 - 100
100 - 1,000
1,000 - 10,000
>10,000
暴露濃度 [mg/m3]
9.4 × 10-11
2.0 × 10-5
4.2 × 10-3
6.1 × 10-4
とした．
3.2.2 結果
上記のシナリオとパラメーターにより，粒径区分別の暴露濃度は表Ⅲ-7 のように算出された．
巻き上がり性試験の粒径別の排出速度を反映すると，暴露濃度は 1,000 nm - 10,000 nm の範囲が最
も大きく 4.2 × 10-3 [mg/m3]であった．ただし，これは，工学的対策や呼吸用保護具を適用してい
ないケースでの推定値である．仮にフラーレンの排出速度を 10 分の 1 にするような工学的対策（除
去率 90%のドラフトチャンバーやグローブボックスの使用等）を講じたり，あるいは，防護係数
10 の呼吸用保護具を装着したりするならば，前述の式中の R1 及び R2 をそれぞれ 1/10 にした暴露
濃度となり，暴露濃度はこれよりもはるかに小さくなる．
４．フラーレン製造工場近傍の一般環境中における
暴露濃度の推定
一般環境大気へのフラーレンの排出源となるのは，フラーレンの製造・使用工場やフラーレン
を含む製品の処分場・焼却場である．フラーレンを含む製品使用時の排出や自然起源のフラーレ
ンの排出が極めて小さいと予想されることから，工場周辺以外の地域の大気中フラーレン濃度が
工場周辺大気中のフラーレン濃度を超えることはまずないと考えられる．そのため，本評価書で
は，将来大規模にフラーレンを製造もしくは使用する工場近傍地域における大気中フラーレン濃
度の見積りを行った．既存の調査等では，フラーレン製造工場近傍を含む屋外環境中でフラーレ
ンを検出したという報告はない．これは現在の使用量がまだ小さいことと，調査した工場からの
排気の管理（フィルター等）がきちんと行われていることによる．
ワーストケースとして，近い将来の生産量として推計されている年間 40 t の数量が一つの工場
で扱われ，そこでのプロセスにおいてドラフト内や密閉装置内で発生する粉じんが，排気設備を
通して工場外に排出されるケースを考える．年間 40 t の取扱いが年間終日運転で行われるとして，
そこからの排出係数は次のように考えた．前述の巻き上がり性試験の結果を援用するために，ま
ず，40 t/year を 1 分あたりの取扱量として 76.1 g とした．排気設備による効果としては，HEPA
フィルターを導入した際には少なくとも 99.97%以上の除去率（0.3 μm 粒子において）が見込める
Ⅲ-19
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
ことから，排ガス濃度の 0.03%が外気に排出されるとした．1 分あたりの粒子発生速度は次式で
計算できる．
排出速度 E [mg/min ] ＝ 76.1 g × 巻き上がり性試験排出速度 [mg/g/min] × 0.0003
1 分あたりの全粒径の総粒子発生速度は 1.7 × 10-6 g/min となり，この量を年間での値に換算す
ると約 0.87 g/年となる．
現在フラーレン製造工場のある地点を対象として，METI-LIS（Ministry of Economy, Trade
and Industry - Low rise Industrial Source dispersion model：経済産業省‐低煙源工場拡散モデ
ル）を用いて周辺の大気中濃度を推定した．ここではフラーレン粒子は球形と仮定している．
METI-LIS を用いて発生源近傍における年平均濃度のシミュレーションを行うにあたって，諸
条件を以下のように設定した．解析対象区域は発生源である事業所をほぼ中央に据え，縦横の長
さをそれぞれ約 5 km×約 5 km とした．排出位置は不明なため，地図上で識別される工場等敷地
の中央部に位置していると仮定した．排気口高さについても不明なため，1, 5, 10, 20 m の 4 通り
について計算を行った．濃度計算点は，東西南北に 100 m 間隔で設定し，高さはヒトの呼吸高さ
として 1.5 m に設定した．気象条件は，2008 年アメダスデータを用いて，2008 年 1 月 1 日から
12 月 31 日の平均値とした．
結果として，年間 40 t のフラーレンを取り扱う事業所の工場周辺（工場敷地内も含む）におけ
る全粒径の C60 大気中濃度は，煙突高さ 1 m と仮定した場合に最も高濃度になり，その場合の工
場敷地内における最大濃度は 8.0× 10-8 mg/m3 となった．ただし，工場敷地外では<5.0 × 10-12 mg/m3
であった．煙突高さを高く仮定するほど最大
大気中濃度[×10-9 mg/m3]
0.005 – 0.01
0.01 – 0.05
0.05 – 0.1
0.1 – 0.5
0.5 - 1.0
1.0-
濃度は低くなったが，周辺への粒子の広がり
は大きくなった．煙突高さ 20 m の場合でも
工場敷地外では 5.0× 10-11 mg/m3 を超える地
点はなかった．推定結果を表Ⅲ-8 に示す．
ちなみに，排気設備の故障により排ガスが
HEPA フィルターを通過せずにそのまま排出
された場合の工場周辺における大気中濃度を
同様にして計算した全粒径の合計は，煙突高
さが 1 m の時に工場敷地内の最大濃度が 3.1 ×
10-5 mg/m3 となる．どの場合の煙突高さでも，
工場敷地外で 5.0× 10-11 mg/m3 を超える地点
はなかった．
図Ⅲ-7．工場近傍の C60 大気中濃度（将来予測）
Ⅲ-20
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
表Ⅲ-8．C60 を大量に取り扱う工場近傍（工場敷地内を含む）における暴露濃度の推定結果
粒径 [nm]
暴露濃度[mg/m3]
（煙突高さ 20 m の場合）
暴露濃度[mg/m3]
（煙突高さ 10 m の場合）
暴露濃度[mg/m3]
（煙突高さ 5 m の場合）
暴露濃度[mg/m3]
（煙突高さ 1 m の場合）
全粒径 合計
10 - 100
100 - 1,000
1,000 - 10,000
>10,000
2.4 × 10-9
4.7 × 10-17
9.7 × 10-12
2.1 × 10-9
3.0 × 10-10
8.1 × 10-9
1.6 × 10-16
3.2 × 10-11
7.0 × 10-9
1.0 × 10-9
2.7 × 10-8
5.3 × 10-16
1.1 × 10-10
2.4 × 10-8
3.4 × 10-9
8.0 × 10-8
1.5 × 10-15
3.2 × 10-10
6.9 × 10-8
1.0 × 10-8
５．暴露評価のまとめ
本リスク評価書の対象ではない化粧品用途を除き，本章でシナリオを検討したような，現在実
用化されている製品に関しては，使用時や廃棄時に排出や暴露が生じる可能性は極めて小さいと
想定された．
既存文献（Fujitani et al. 2008, 甲田ら 2008）に基づく暴露評価から，C60 製造工場や金属内包
C60 製造工場における作業環境中の最大濃度は，ナノサイズの粒子（< 50 nm および 50～100 nm）
で 1.2 × 10-4 mg/m3 および 1.2 × 10-3 mg/m3，サブミクロンサイズの粒子（100 nm～2,000 nm）で 1.2
× 10-3 mg/m3 mg/m3，ミクロンサイズの粒子（> 2,000 nm）で 6.0 × 10-2 mg/m3 になると計算された．
フラーレンを使用する現場（樹脂加工工場）における取扱いの評価では，巻き上がり性試験に
基づくデータを用いて 2 ボックスモデルによる評価を行った結果， 10-100 nm の粒子への暴露は
3
時間平均値）となると推定された．同様に 100-1,000 nm および 1,000-10,000 nm
9.4 × 10-11 mg/m（8
の粒子への暴露は，2.0 × 10-5 mg/m3 および 4.2 × 10-3 mg/m3（8 時間平均値）と推定された．
ここで、製造工場における 10-100nm の粒子への暴露が、加工工場での 10-100nm の粒子への暴
露と比べて極端に大きくなっているのは、フラーレン以外の粒子を多く含んだ粒子濃度を元にし
ていることに起因している。
一般大気中における暴露濃度は，METI-LIS を用いて推定を行った結果，工場近傍において最
も高濃度となる条件での全粒径粒子の合計濃度が 8.0 × 10-8 mg/m3 と推定され，作業環境における
粒子濃度よりはるかに低くなる可能性が高い．このことから，今後ある程度製造量が増加したと
しても，屋外環境中でフラーレンが検出される可能性は非常に低いことが確認された．
製品の使用時の暴露は，極めて小さいものと考えられるが，新しい用途の製品が出てきた場合
には，改めて検討することが必要である．
Ⅲ-21
第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
これらの結果は，第Ⅵ章のリスクの判定における HQ（Hazard Quotient：ハザード比）の算出に
用いる．また，この結果は工場内作業における防護対策が考慮されていない．そのため，工学的
対策や呼吸用保護具を適用していない場合では，仮にフラーレンの排出速度を 10 分の 1 にするよ
うな工学的対策を講じたり，あるいは，防護係数 10 の呼吸用保護具を装着すると，それぞれ更に
暴露濃度は低くなる．
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第Ⅲ章
暴露評価
篠原 直秀
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Ⅲ-23
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
第Ⅳ章
有害性評価
本章では，フラーレン（主に C60）の吸入，経口，経皮暴露により引き起こされるヒト健康へ
の有害性の評価を行う．具体的には，既存文献及び NEDO プロジェクト（P06041）「ナノ粒子の
特性評価手法の研究開発」の成果の整理を行う．ちなみに，フラーレンはまだ使用が始まったば
かりであり，ヒト疫学調査は存在しないため，実験動物を用いた試験（in vivo 試験）及び培養細
胞を用いた試験（in vitro 試験）の結果を整理して評価することとする．
本評価書では主に C60 を対象とし，誘導体は評価の対象外としている．しかしながら，既存の
文献において，フラーレンの誘導体で見られた毒性についてもフラーレンの毒性として紹介され
ることも多かったため，フラーレンの誘導体に関する有害性試験の報告についても代表的なもの
を整理した．ここで，フラーレンとはそのものもしくは分散剤で分散させたものや，PVP
（Polyvinylpyrrolidone: ポリビニルピロリドン）等で包摂体を形成させたものとし，何らかの官能
基が修飾されたものは誘導体として扱った．また，ナノサイズのフラーレンによる有害性試験は
極めて少ないことから，ミクロンサイズやサイズの分からないフラーレンによる試験も含めて整
理し，考察を行った．
１．体内動態
1.1. フラーレンの体内動態
Bullard-Dillard et al. (1996) は，C60 の in vivo での挙動とそれが取りうる代謝について検討した．
14
C を高濃度で含むグラファイトから C60 を生成して，SD ラット（Sprague-Dawley ラット）
（雌，
120～200 g）に静脈内注射したところ，14C 標識 C60（以下*C60 と記述）は，すぐ（1 分以内）に
血液循環から取り除かれ，大部分（90-95%）が肝臓に蓄積した．蓄積された*C60 は，120 時間以
上肝臓に残存しており，C60 は，他の多環芳香族に典型的な酸化型の代謝が行われないことが示唆
Ⅳ-1
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
された．このことから，C60 は急性毒性を有していないものの，C60 や C60 誘導体の使用が肝臓に
おける長期のフラーレン蓄積につながる可能性があることが示唆された． Moussa et al. (1996) は，
0.02%Tween80 と 0.02%CMC
（carboxymethylcellulose: カルボキシメチルセルロース）液で 0.9%NaCl
水溶液中のミクロンサイズの C60 分散液（2 μm の結晶が 10~100 μm の凝集体になったもの）を各
2,500, 4,000, 5,000 mg/kg，スイスマウス（雄，20±2 g）に腹腔内投与し，各臓器の顕微鏡観察に
より体内での移行を調べた．C60 の沈着は，肝臓では主にクッパー細胞と脂肪摂取細胞中に見られ，
肝細胞中には少なかった．脾臓/肺/心臓/腎臓では，細網内皮細胞中に沈着が見られた．脳では C60
の沈着はなかった．クッパー細胞，脂肪摂取細胞，細網内皮細胞中のフラーレン凝集体は TEM
（Transmission Electron Microscope: 透過型電子顕微鏡）でも確認された．
Tsuchiya et al. (1996a) は，PVP で C60 を包摂して C60 分散液を調製し，妊娠した SLC-ICR マウ
ス（妊娠 11 日目）への腹腔内投与後の胎児への分布を観察した．顕微鏡による観察から，50 mg/kg
で投与された C60 は明らかに卵黄嚢や胚に分布していることが分かった．
Moussa et al. (1997) は，0.02%Tween80 と 0.02%CMC 液で 0.9%NaCl 水溶液中に分散させたミク
（100 mg/mL）を，スイスマウス（雄，
ロンサイズの C60 分散液（2 μm の結晶の 10~100 μm の凝集体）
20±2 g）に 0.5 mL ずつ腹腔内投与し，1 日後，3 日後，6 日後に血中，肝臓中，脾臓中の C60 濃
度を HPLC で分析した．その結果，血中の C60 濃度は経時的に大きく減少していた（0.179 mg/mL
⇒ 8.75×10-2 mg/mL ⇒ 1.10×10-3 mg/mL）が，肝臓中の C60 は 3 日後に濃度のピークを迎え（0.7%wt
⇒ 1.0%wt ⇒ 0.4%wt）
，脾臓中の C60 は 3 日後と 6 日後の濃度がいずれも 1 日後より増加してい
た（0.5%wt ⇒ 2.4%wt ⇒ 2.4%wt）
．
Gharbi et al. (2005) は，幅広いサイズ（60~1,650 nm）の凝集体が含まれる C60 水分散液，0.5 g/kg
を Wistar ラット（雄，200±10 g）に腹腔内投与したところ，肝臓中の C60 濃度は，投与後 1 週間
で投与量の 24%程度，2 週間および 3 週間後では 1 週間後の 5%および 1%程度まで減少したと報
告している．肝細胞中の凝集体は大部分が 50 nm 未満であり，投与した粒子のサイズより小さか
った．また，投与後 2 週間で糞中に排出された C60 は，同時期に肝臓中に含まれていた最大量の
14%未満であった．このことから，投与されたフラーレンの多くがおそらく肝臓中で代謝された
と考えられる．また，C60 を投与したラットの肝臓からの抽出液のクロマトグラムから，2 つの大
きな追加ピークが検出されている．このことは，ディールス・アルダー反応によって，C60 のレチ
ノール付加体ができていることを示していると考えられる．2,000 mg/kg を投与されたラットの 6
匹中 4 匹では，7 日後まで肝臓が均一に茶色くなっており，14 日後には薄茶色になったが，残る
2 匹には不規則な茶色の斑点があり，肝葉が視認された．500 mg/kg を投与されたラットの 6 匹
中 3 匹では，7 日後まで肝臓がまだらに茶色くなっていたが，14 日後や 21 日後には標準的な色で
あった．250 mg/kg を投与されたラットでは，肝臓の色素沈着は標準的なものであった．TEM 観
察を行い，肝臓中の C60 の多くはクッパー細胞中に存在していることが確認された．
Naota et al. (2009) は，0.625 mg/ mouse あるいは 1.0 mg/ mouse の用量で，C60 フラーレン粒子を
ICR マウス（雌，10～11 週齢，29～34 g）に気管内投与し，投与された粒子が肺から血流へ移行
Ⅳ-2
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
する様子を調べた．観察は，投与直後（0 分後），5 分後，1 時間後，6 時間後，24 時間後，7 日後
に，光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて行われた．投与された凝集粒子のサイズに関する記述はな
いが，画像より，小さいものは 100 nm 以下，大きいものは数 μm と推測される．投与 5 分後には，
肺の毛細管腔，肺リンパ節，空気血液関門の構造内部に，観察期間中を通して凝集した粒子の存
在が認められた．これは，気管内投与された粒子が速やかに空気血液関門を通過し，全身の血流
に移行する可能性を示唆するものである．この観察から，二つのメカニズムが考えられた；拡散
および，肺胞上皮細胞や内皮細胞によるカベオラ（小窩）媒介の飲作用である．
Gao et al. (2009)は，PBS と 1% Tween 80 を用いて分散させた C60（約 1 μm）を雄の JVC F344 ラ
ットに 10 mg/kg 静脈内注射したところ，C60 は 1 時間後に肝臓で最も多く検出されたと報告して
いる．また，PBS と 1% Tween 80 を用いて分散させた C60（約 1 μm）について，1 もしくは 5 mg/kg
で気管内投与，および，昇華法により生成した C60（約 20 nm）1 mg/m3 の吸入暴露を行った 7 日
後の観察では，いずれも 50%および 60%が肺中に残存していた．血液，脾臓，肝臓からは検出さ
れなかったが，気管内投与試験でのみ，腎臓から微量の C60 が検出された（肺の 0.5%未満）．13C
による解析結果からは代謝は確認されなかった．
Sumner et al. (2009)は，トルエンとクロロホルムを用いて PVP 中の*C60 分散液を調製し（本文
献では同様の手法で調製した既往の文献における平均粒径：2 nm, 10 nm を粒子のサイズとして示
している），妊娠 15 日目及び泌乳期の SD ラットに静脈内注射し，24 時間後及び 48 時間後の体
内分布を測定した（妊娠ラットは 24 時間後のみ）．放射線計測の結果，妊娠ラットでは，投与 24
時間後に 43%が肝臓に，4%が脾臓に，3%が生殖器官に，2%が胎盤に分布していた．また，胎児
にも 0.87%分布していた．泌乳期のラットでは，投与 24 時間後に 35%が肝臓に，4%が脾臓に，
0.1～0.42%が生殖器官に，0.48%～0.94%が乳房組織に分布していた．乳からも検出された．
NEDO プロジェクト（P06041）において，Shinohara et al. (2010)は，0.1%Tween80 を分散剤とし
てナノサイズに分散させた C60（50%ile 径 30 nm, 95%ile 径 70~80 nm; C60O 含有率: 約 1%），0.1, 0.2,
1.0 mg/匹 （0.33, 0.66, 3.3 mg/kg-bw）を Wistar ラット（雄，9 週齢，約 300 g）に気管内投与し，
直後から 180 日後までの臓器（肺・肝臓・脳）中の C60 濃度を分析した．また，気中に噴霧した
C60 ナノ粒子（平均粒径 96 nm）を吸入暴露（0.12 mg/m3, 4.1×104 particle/cm3, 6 hour/day, 5 day/week,
4 week）させ，暴露 7 日後および 30 日後の臓器中の C60 濃度についても分析した．その結果，気
管内投与直後には肺中にほぼ 100%が沈着し，20 日程度で半減し，2~3 ヶ月で 10%程度まで減衰
することが分かった．また，肺以外の臓器からは C60 は検出されなかった（< 8.9×10-6 mg/g-組織，
脳: <1.8×10-5 mg/脳（投与量の<0.0019%）, 肝臓: <1.5×10-4 mg/肝臓（投与量の<0.015%））．
Xia et al. (2010)は，ヨークシャー離乳ブタ（25 kg）の背中に，0.10 mg/匹（0.20 mg/mL を 0.5 mL）
の C60 をトルエン溶液，シクロヘキサン溶液，クロロホルム溶液，鉱油溶液それぞれの形で塗布
した．塗布は 24 時間ごとに 4 回行い，最後の塗布から 24 時間後に塗布部位を 26 回テープストリ
ッピングし，HPLC 分析することにより，深さ別の C60 浸透量を測定した．その結果，トルエン
溶液，シクロヘキサン溶液，クロロホルム溶液の塗布群では，角質層まで C60 が浸透しているこ
Ⅳ-3
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
とが確認された．クロロホルム溶液では，他の溶媒を用いた場合と比べて，より多くの C60 が角
質層まで浸透していた．鉱油の場合には，皮膚から C60 は検出されなかった．このことから，C60
の皮膚への浸透には，溶媒の種類が大きく寄与することが示された．また，ガラスバイアル内で，
角質へ各溶媒中の C60 がどの程度吸着するかを試験したところ，溶媒ごとの傾向が前述の in vivo
試験結果と相関する結果が得られた．さらに，ブタの皮膚による 24 時間の流水式拡散セル試験を
行ったところ，受け手側の溶媒中に C60 は検出されなかった．
これらの試験結果については表Ⅳ-1 と図Ⅳ-1 にまとめた．
1.2 フラーレン誘導体の体内動態
Yamago et al. (1995) は，トリメチレンメタンをフラーレン C60 に対して付加環化することで水
溶化したカルボン酸フラーレン（14C 標識）を合成し，Fisher ラット（雄，85～95 g）に経口投与
および静脈内注射を行った後の体内動態を観察した．経口投与した場合には，この物質は効率よ
く吸収されず，主に糞中に排泄された（48h 以内に 97%が糞中に排出）
．しかし，静脈内注射した
場合には，直ちに様々な組織に分配され，その多くは 1 週間後も体内に残っていた．その化合物
は，血液脳関門を通過することも可能であった．
Bullard-Dillard et al. (1996) は，水溶性の高い第 4 級アンモニウム塩誘導体 C60 の in vivo での挙
動とそれが取りうる代謝について検討した． 14C を高濃度で含むグラファイトから生成して，SD
ラット（Sprague-Dawley ラット）
（雌，120～200 g）に静脈内注射したところ，前述の*C60 と同様
の挙動を示し，急性毒性は有していないが，C60 の誘導体の使用で肝臓における長期のフラーレン
蓄積につながる可能性があることが示唆された．
Rajagopalan et al. (1996) は，水溶性の p,p'-ビス(2-アミノエチル)-ジフェニル-C60（MSAD-C60）
のビス（モノスクシンイミド）誘導体の体内動態について報告している．この誘導体は，in vitro
でヒト免疫不全ウィルス タイプ 1 およびタイプ 2 に対して抗ウィルス活性を持つことが知られて
おり，ヒト免疫不全ウィルスの殺ウィルス酵素活性やタンパク分解酵素活性を持っていることも
分かっている．15 mg/kg の MSAD-C60 を SD ラット（雄，287±12 g）に静脈内投与を行ったとこ
ろ，血漿中の MSAD-C60 濃度は指数関数的に減少した．MSAD-C60 の最終相での平均半減期は 6.8
±1.1 h であった．結合試験から，この化合物の 99%以上が血漿タンパクと結合していることが示
された．この化合物の平均総クリアランスは，0.19 ± 0.06 L/h/kg であった．静脈内投与 24 時間後
の尿サンプル中に，この物質は検出されなかった．これは，明らかに腎臓のメカニズムで
MSAD-C60 が排泄されないことを示している．
Cagle et al. (1999) は，水溶性の放射性金属内包フラーレンの生体内分布について BALB/c マウ
ス（雌，7 週齢）を用いて試験した．まず Hox@C82（x=1, 2）を含むサンプルを精製し，誘導体化
して水溶性の金属フラロール Hox@C82(OH)y を得る．その後，この金属フラロールは中性子放射
化され，放射性トレーサーとして 166Hox@C82(OH)y になる．166Hox@C82(OH)y は，静脈内注射後 48
時間に渡って放射分析法によりモニターされ，その生体内分布を対照物質の
Ⅳ-4
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
Na2[166Ho(DTPA)(H2O)]と比較した．その結果，166Hox@C82(OH)y は肝臓内の特定の部位に局在し，
クリアランスは遅く，骨にもクリアランスなしで吸収されていた．一方，対照物質は 1 時間後に
は排出が確認された． Fischer ラット（雌，12 週齢）における生体内分布についても，同様に
166
Hox@C82(OH)y の測定を行うことで明らかにした．その結果，5 日以内に 166Hox@C82(OH)y の 20%
がそのまま排泄された．これらの結果から，フラーレン関連材料の動物の体中での運命をモニタ
ーするために水溶性金属内包フラーレン放射性トレーサーを用いることの有用性が示され，水溶
性フラーレン化合物は一般的に薬剤設計において有用である可能性が示唆された．
Ji et al. (2006) は，クロロアミン-T 法で放射性ラベルしたポリ水酸化フラーレン（125I-C60(OH)x）
を，マウス H22 肝細胞癌を持つ Kunming マウス（雌，30-32 g）と，ヒト巨細胞癌 PD，ヒト結腸
癌 HCT-8，ヒト胃癌 MGC803，ヒト OS732 骨肉腫の 4 種類の癌モデルを持つ BALB/c マウス（雌，
18-22 g）に静脈内投与し，生体内分布を X 線光電子分光法（XPS）やレーザー光散乱分光法を用
いて測定した．125I-C60(OH)x が凝集して大きなばらつきを持った大きなナノ粒子になっているこ
とが観察された．1,6,24,72 時間後の 125I-C60(OH)x のマウス H22 肝細胞癌の通常筋肉細胞への蓄積
率（T/N）や血液への蓄積率（T/B）では，H22 腫瘍に徐々に蓄積が起こることが示されており，
かなり長い時間保持されていた．24 時間後に，T/N は 3.41，T/B は 3.94，72 時間後に，T/N は 2.71，
T/B は 3.99 となった．他の 4 つの腫瘍モデルに対しては，24 時間後の T/N は 1.21～6.26 であり，
T/B は 1.23～4.73 であった．125I-C60(OH)x の腫瘍中への蓄積は主に EPR 効果（enhanced permeability
and retention effect）と単核食細胞の貪食によるものである．そのため，125I-C60(OH)x はいくつかの
種類の腫瘍の光動力学的療法における光線感作物質として使える可能性がある．
Xu et al. (2007) は，ポリ水酸化フラーレン（C60(OH)x, x=22, 24）に 99mTc で標識した誘導体の分
散液を SD ラット（雄，240±10 g）に気管内投与して，生体内分布を調べた．最も多く分布して
いたのは肺であり，肝臓や骨や脾臓にも分布していたが，脳では検出されなかった．肺からのク
リアランスは非常に遅く，ナノサイズの C60(OH)x 粒子（99mTc 標識）は Na99mTcO4 のような水溶性
の分子よりミクロンサイズの粒子に近い挙動を示していた．ナノサイズの C60(OH)x 粒子（99mTc
標識）は肺胞に残り，肺からのクリアランスが遅いことから，炭素系ナノ材料の吸入暴露による
毒性評価は主に肺の毒性に注目すべきだと考えられる．また，粒径について別途計測を行った結
果，分散液中の粒子の粒径は平均 20 nm であったが，37 ℃の無菌生理食塩水中では 12 時間後に
68.4 nm に凝集することが分かった．
表Ⅳ-2 にこれらの試験結果をまとめた．
1.3. 細胞への取り込みや貪食，移行に関する試験（in vitro 試験）
フラーレンとフラーレン誘導体の in vitro 試験の結果については表Ⅳ-3 に記載した．
1.3.1 フラーレンの細胞への取り込みや貪食，移行に関する試験
Scrivens et al. (1994) は，14C で標識したフラーレン（*C60）を用いて，ヒト角化細胞への取り込
みを観察した．フラーレンの分散液は，C60 のベンゼン溶液（0.15 mg/100 μL）を THF（10 mL）
Ⅳ-5
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
に加え，生成した溶液をアセトン（100 mL）中で急速にかき混ぜ，それをゆっくり水に加えた後，
溶媒を飛ばして調製した（2.1 μM（1.5×10-3 mg/mL）．97%が C60 だが 2.7%の C60O と思われるピー
クが存在）．培養液中で，ヒト角化細胞に 1.3 μM（9.4×10-4 mg/mL）の C60 を暴露させたところ，6
時間で約 50%の C60 が細胞と結合（associate）し，その後 9 時間にわたりその量は変わらなかった．
また，ヒト角化細胞に 4 時間 C60 を暴露させた後に培養液で洗い流して，新しい培養液中に放置
したところ，11 時間後も細胞結合型の C60 は減少しなかった．細胞の原形質膜の厚さは 5-7 nm で
あり，粒子全体を取り込んだとは考えにくく，細胞表面と小さな C60 粒子もしくは分子 C60 と
associate している可能性が考えられる．
Moussa et al. (1995) は，ミクロンサイズの C60 粒子をヒト白血球に暴露させ，SEM や TEM によ
る観察から好中球による C60 の貪食を報告している．
Bullard-Dillard et al. (1996) は，14C 標識 C60（*C60）や 14C 標識アンモニウム塩誘導化 C60（*C60A）
をヒト角化細胞に投与して，細胞への取り込みを観察した．*C60 や*C60A の細胞への取り込みは
共に速いが，*C60A の細胞への蓄積速度は*C60 より遅いことが確認された．
Porter et al. (2007) は，C60 を HMM（Human Monocyte-derived Macrophages: ヒト単球由来マクロ
ファージ）に暴露させて，EFTEM（Energy Filtering Transmission Electron Microscope: エネルギー
フィルター透過型電子顕微鏡）で C60 凝集体の細胞中における分布を観察した．C60 分散液は THF
を用いて調製し，その一次粒径は 60-270 nm，凝集体の径は 420-1,300 nm であった．C60 は in vitro
で HMM に取り込まれることで，細胞中の細胞質，リソソーム，細胞核に分布し，また，原形質
膜に沿って一列に存在しているものや，細胞核やリソソーム中に存在しているものもあった．C60
は原形質膜上と細胞質において高濃度であり，細胞質ゾル中の細胞膜を通って拡散できる．この
ために細胞質構成物質が脂質二重層によって C60 の侵入から守られない可能性が示唆される．
Horie et al. (2010) は，培養液（10%FBS/DMEM）中に分散させた 6.6×10-3~0.153 mg/mL の C60
ナノ粒子（光散乱強度平均径 200~210 nm, 数平均径 100~130 nm）中でヒト角化細胞 HaCaT とヒ
ト肺がん細胞 A549 を培養して，細胞への取り込みを TEM により観察した．その結果，細胞質中
に凝集体のまま存在する C60 粒子が観察された．これらの C60 粒子は，膜に包まれたような像が観
察されており，食胞（ファゴソーム）に取り込まれている可能性が示唆された．
1.3.2 フラーレン誘導体の細胞への取り込みや貪食，移行に関する試験
Foley et al. (2002) は，フラーレンマロン酸誘導体 C60C(COOH)2 を，ヒト繊維芽細胞株 HS68
及びサル腎臓細胞株 COS-7 に添加し，24 時間培養後に二重染色して蛍光顕微鏡による観察をし
た．その結果，フラーレン誘導体は核周辺に点状に分布しており，核付近の微小管には存在して
いなかった．また，放射能標識した 14C-C60C(COOH)2 をヒト繊維芽細胞株 HS68 及びサル腎臓細
胞株 COS-7 に添加し，24 時間培養後にミトコンドリア画分とミクロソーム画分を観察したとこ
ろ，主にミトコンドリア画分に分布し，一部はミクロソーム画分に分布していた．このことから，
フラーレン誘導体は細胞質膜を透過してミトコンドリアに局在していることが確認された．
Ⅳ-6
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
Rouse et al. (2007) は，皮膚腫のブタの皮膚に局所的に 33.5 mg/mL のフラーレン-フェニルアラ
ニン誘導体の水溶液を暴露させ，共焦点顕微鏡で観察した．60 分間及び 90 分間屈曲させていた
皮膚では，8 時間後にナノ粒子の皮膚中への移行が観察されたのに対し，屈曲させなかった皮膚
では 24 時間後まで真皮までの移行はなかった．非染色 TEM による観察では，屈曲させていた皮
膚には，顆粒層の間質にフラーレン-フェニルアラニン誘導体粒子が存在していることが確認され
た．
Ⅳ-7
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-1．フラーレンの体内動態および肺からのクリアランスに関連する既往の in vivo 試験一覧
試験物質
粒径
対象動物
投与方法
用量（暴露濃度）
観察期間
対象・分析方法
結果
Bullard-Dillard
et al. 1996
文献
C60 分散液
（ベンゼン，
THF，アセトン
で調製）
（14C で標識）
平均 300 nm
95%が
250-350 nm
（PBS 追加&
濃縮前）
[SEM 観察]
SD ラット
（雌，週齢記載な
し，120～200 g）
静脈内注射
（0.05-0.5
mL）
血中： 投与 1
～120 分
臓器中： 投与
2, 120 時間後
脳，血液，脂肪，
心臓，腎臓，肝
臓，肺，筋肉，
皮膚，脾臓，尿
[HPLC 分析，
NMR 分析]
*C60 は，すぐ（1 分以内）に血液の循
環から取り除かれ，*C60 の大部分
（90-95%）が肝臓に蓄積.*C60 は，120
時間以上肝臓から取り除かれなかっ
た．酸化や代謝も確認されなかった．
Tsuchiya et al.
1996a
C60PVP 抱合体
記載なし
腹腔内投与
注射 18 時間後
卵黄嚢，胚（11
日目）[光学顕
微鏡観察]
50 mg/kg の投与マウスで卵黄嚢や胚に
分布していることを色で確認
Moussa et al.
1996
C60 分散液
（Tween80/
CMC+NaCl 水溶
液）
結晶: 2 μm，
凝集体: 10～
100 μm
[偏光顕微鏡
観察]
妊娠している
SLS マウス
（性別記載なし，
妊娠 11 日目，体
重記載なし）
スイスマウス
（雄，週齢記載な
し，20±2 g）
1.5×10-3 mg/mL a
を 10~100 倍に
濃縮した C60 分
散液を PBS と混
ぜて注射
（0.2~1.6 ×10-3
mCi/匹）
25-137 mg/kg-bw
腹腔内投与
50, 80, 100 mg/
匹 (2500, 4000,
5000 mg/kg-bw)
投与 7, 14 日後
脳，肝臓，肺，
心臓，脾臓，腎
臓
[偏光顕微鏡観
察]
C60 の沈着は，肝臓では主にクッパー細
胞と脂肪摂取細胞中に見られ，肝細胞
中には少なかった．脾臓/肺/心臓/腎臓
では，細網内皮細胞中に沈着が見られ
た．脳では C60 の沈着はなかった．
Gharbi et al.
2005
C60 分散液
（Tween60/
CMC+NaCl 水溶
液）
Wistar ラット
（雄，週齢記載な
し，200±10 g）
腹腔内投与
500 mg/kg-bw
(100 mg/匹 b)
投与 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 9, 14,
21 日後
肝臓，糞便
[HPLC 分析，
SEM 観察]
肝臓中の C60 濃度は，投与後１週間は
投与量の 24%程度．2 週間および 3 週
間後は，1 週間後の 5%および 1%．SEM
観察では，マクロファージによる貪食
がみられる．
Baker et al. 2008
C60 ナノ粒子
（粉砕後，昇華）
60-1,650 nm
（1,000-1,650
nm: 7%,
500-1,000 nm:
43%, 250-450
nm: 28%, <200
nm: 22%）
[SEM 観察]
55 nm
Fisher 344 ラット
（雄，10 週齢，体
重記載なし）
吸入暴露
（3 hour/day,
10 days）
2.22 mg/m3
暴露終了 1, 5,
7 日後
肺
[HPLC 分析]
投与直後，5
分，1 時間，6
時間，24 時間，
7 日後
肺内の毛細管
腔，肺リンパ
節，空気血液関
門の観察 [電
子顕微鏡観察]
10 日間の吸入暴露直後の肺への粒子沈
着率は，ナノサイズの方がミクロンサ
イズより高かった（ナノサイズ 14.1%，
ミクロンサイズ 9.3%）が，半減期はサ
イズによる違いなし（ナノサイズ 26
日，ミクロンサイズ 29 日）．
投与 5 分後以降で，肺の毛細管腔，肺
リンパ節，空気血液関門の構造内部に
おいて，凝集した粒子の存在を確認し
た．
Naota et al.
2009
*
C60:
[SMPS]
C60 ミクロン粒子
（粉砕後に噴霧）
930 nm
C60 分散液
（ PBS 中 分 散
液）
記述なし
（画像から，
小さいものは
100 nm 以下，
大きいものは
数 μm）
2.35 mg/m3
[SMPS]
ICR マウス
（雌，10～11 週
齢，29～34 g）
気管内投与
(0.05 mL)
0.625, 1.0 mg/匹
14
C で標識した C60，a: 論文中の 2.1 μM から計算，b: 同じ用量単位で比較できるように，筆者らが換算した値
Ⅳ-8
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-1．フラーレンの体内動態および肺からのクリアランスに関連する既往の in vivo 試験一覧
文献
Gao et al. 2009
試験物質
C60 分散液
(PBS/1% Tween
80)
C60 分散液
(PBS/1% Tween
80)
（13C 標識）
C60 分散液
(昇華法)
粒径
投与方法
約 1 μm
[DLS]
JVC F344 ラット
（雄，週齢記載な
し，体重記載な
し）
静脈内注射
10 mg/kg
1 時間後
約 1 μm
Normal F344 ラッ
ト（雄，週齢記載
なし，体重記載な
し）
Normal F344 ラッ
ト（雄，週齢記載
なし，体重記載な
し）
SD ラット
（妊娠 15 日目，出
産後）
気管内投与
1 or 5 mg/kg
0.5, 2, 6, 24,
168 時間後
吸入暴露
（6 時間暴露）
1.0 mg/m3
0.5, 2, 6, 24,
168 時間後
静脈内注射
（0.7 mL）
0.3 mg/kg
気管内投与
(0.4 mL)
[DLS]
20 nm
[測定装置記
載なし]
Sumner et al.
2009
C60 分散液
（トルエン，クロ
ロホルムを用い
て PVP 溶液中で
調製）
（14C で標識）
平均 2 nm or 10
nm
[同様の手法で
の既存文献値
を著者らが引
用して記載】
Shinohara et al.
2010
C60 分散液
（0.1%Tween80 水
溶液）
50%ile 30 nm
95%ile 70～80
nm
[DLS]
平均 96 nm
[SMPS]
Wistar ラット
（雄，9 週齢，
約 300 g）
記述なし
ヨークシャー離乳
ブタ（25 kg）
(NEDO プロジェ
クト（P06041）)
Xia et al. 2010
C60 ナノ粒子
（0.1%Tween80 水
溶液を噴霧）
C60
(トルエン溶液，
シクロヘキサン
溶液，クロロホル
ム溶液，鉱油溶
液)
用量（暴露濃度）
(Cont.)
対象動物
対象・分析方法
結果
肺，血液，腎
臓，脾臓，肝臓
[HPLC 分析]
気管内投与及び吸入暴露 7 日後には，
50%及び 60%が肺中に残存しており，肺
中半減期を計算すると 14 日及び 22 日で
あった．血液，脾臓，肝臓からは検出され
なかったが，気管内投与試験でのみ，腎
臓から微量の C60 が検出された（肺の
0.5%未満）．13C による解析結果から，代
謝は確認されなかった．静脈内注射 1 時
間後には，肝臓で最も多く検出された．
妊娠ラット：投
与 24 時間後
泌乳期ラット：
投与 24, 48 時間
後
尿，糞，脾臓，肝
臓，腎臓，脳，心
臓，肺，子宮・
膣・頸部，胎盤，
血液 等
[シンチレーショ
ンカウンター]
妊娠ラットでは，投与 24 時間後に 43%が肝
臓に，4%が脾臓に，3%が生殖器官に，2%が
胎盤に分布していた．また，胎児にも 0.87%
分布していた．泌乳期のラットでは，投与 24
時間後に 35%が肝臓に，4%が脾臓に，0.1～
0.42%が生殖器官に，0.48%～0.94%が乳房
組織に分布していた．乳からも検出された．
0.1, 0.2, 1.0 mg/
匹 (0.33, 0.66,
3.3 mg/kg-bw)
投与 1, 17 時間
後, 7, 30, 90, 180
日後
肺，肝臓，脳
[HPLC 分析]
注入直後には肺中にほぼ 100%が沈着して
おり，二段階で減衰することが示唆され
吸入暴露
（6 hour/day,
5 day/week,
4 week）
0.12 mg/m3
（4.1×104
particle/cm3）
暴露終了 7, 30
日後
経皮暴露
（24 時間ごと
に 4 回背中に
塗布）
0.10 mg/匹 c
最初の塗布から
5 日目（最後の塗
布の 24 時間後）
c
：論文中の 0.20 mg/mL を 0.50 mL 投与との記述から計算
Ⅳ-9
観察期間
た．肺以外への臓器では，，検出下限以
下であり，，移行はみられなかった．
（3.3 mg/kg の投与時，脳: < 1.8×10-5 mg/
脳（投与量の<0.0019%）, 肝臓: <
1.5×10-4 mg/肝臓（投与量の<0.015%））
皮膚深さ別 C60
浸透量
（塗布部位を 26
回テープストリ
ッピング）
トルエン溶液，シクロヘキサン溶液，ク
ロロホルム溶液の塗布群では，角質層ま
で深く C60 が浸透していることが確認さ
れた．クロロホルム溶液では，他の溶媒
を用いた場合と比べて，より多くの C60
が角質層まで浸透していた．鉱油の場合
には，皮膚から C60 は検出されなかった．
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
腹腔内投与
粒径記載なし
Tsuchiya et al. 1996
肝臓では主にクッパー細胞と脂肪摂取細胞中
Moussa et al. 1996，1997
Gharbi et al 2005
に存在．脳に移行なし．
10～100 μm
[偏光顕微鏡観察] [偏光顕微鏡観察]
肝臓中存在量は，投与１週間後に投与量の
24%，2，3週間後は，1週間後の5%，1%．
[HPLC分析]
60～1650 nm
[SEM観察]
Gao et al. 2009
静脈内注射
注射1時間後に肝臓で最も多く検出
[HPLC分析]
1 μm [DLS（動的光散乱法）]
Bullard-Dillard et al. 1996
1分以内に血中から除去，90-95%が肝臓に蓄
積し，120時間以上肝臓から除去されず．
[NMR分析]
個数平均径300 nm (95%: 250~350 nm)
[SEM観察]
Sumner et al. 2010
平均2nm/10nm [既存文献より]
35～43%が肝臓に分布．脾臓や生殖器官等
にも分布[シンチレーションカウンター]
（NEDOプロジェクト（P06041 ））
Shinohara et al. 2010
体積平均径95 nm [SMPS （走査型移動度粒径測定）]
Gao et al. 2009
20 nm [測定装置記載なし]
Naota et al. 2009
吸入暴露
肺以外への移行なし．
[HPLC分析]
7日後でも血液・脾臓・肝臓・腎臓への移行な
し[HPLC分析]
気管内注入
100 nm以下～数 μm
[電子顕微鏡観察]
Gao et al. 2009
（NEDOプロジェクト（P06041 ））
Shinohara et al. 2010
体積50%ile径30 nm, 体積95%ile径80 nm
[DLS（動的光散乱法）]
100
1000
10000
肺の毛細管腔，肺リンパ節，空気血液関門等
に粒子が見られる
[電子顕微鏡観察]
7日後に血液・脾臓・肝臓への移行なし．腎臓
で微量検出
[HPLC分析]
1 μm [DLS（動的光散乱法）]
10
卵黄嚢，胚に分布
[光学顕微鏡観察]
肺以外への移行なし．
[HPLC分析]
100000
粒径［nm］
図Ⅳ-1．フラーレンの体内動態に関連する既往の in vivo 試験における粒子サイズ
（矢印線は粒径範囲.点線は想定される粒径範囲を示している）
Ⅳ-10
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-2．フラーレン誘導体の体内動態に関する既往の文献
文献
Yamago et
al. 1995
Bullard-Di
llard et al.
1996
試験物質
C60 トリメチレンメタ
ン誘導体
（14C で標識）[水
溶性]
第 4 級アンモニウ
ム塩誘導体 C60
[水溶性]
粒径
記述なし
対象動物
Fisher ラット
（雄，週齢記載
なし，85～95 g）
投与方法
経口摂取，
静脈内注射
用量（暴露濃度）
200-500 mg/kg
観察期間
1, 3, 6, 16, 30,
160 時間後
記述なし
SD ラット
（雌，週齢記載
なし，120～200
g）
静脈内注射
（0.05-0.5
mL）
1.5×10-3 mg/mLa を
10~100 倍に濃縮し
た C60 分散液を PBS
と混ぜて注射
（0.2~1.6 ×10-3
mCi/匹）
15 mg/kg
血中： 投与 1
～120 分
臓器中： 投与
2, 120 時間後
Rajagopal
an et
al.1996
p,p’-ビス(2-アミノエ
チル)-ジフェニル
C60 誘導体
（MSAD-C60）
[DMSO 溶液]
記述なし
SD ラット
(雄，週齢記載な
し，287±12 g)
静脈内注射
Cagle et
al. 1999
金属内包フラロー
ル
(Hox@C82(OH)y)
[水溶性]
記述なし
BALB/c マウス
（雌，7 週齢，体
重記述なし，）
Fishcher ラット
（雌，12 週齢）
静脈内注射
(マウス： 0.2
mL, ラ ッ ト ：
0.5 mL)
1.0x10-2mCi/匹
Ji et al.
2006
125
I 標識フラロール
（ I-C60(OH)x）
(10~70 時間攪拌し
て調製)
平 均 40
nm
(0.7~373
nm)
[DLS]
Kunming マウス
（雌，週齢記載
なし，30~32 g）
BALB/c マウス
（雌，週齢記載
なし，18~22 g）
静脈内注射
（0.1 mL）
Xu et al.
2007
金属内包フラロー
ル 分 散 液
（99mTc-C60(OH)x）
（ベンゼン，水酸化
テトラブチルアンモ
ニ ウ ム ， NaOH ，
H2O2 を 用 い て 調
製）
分散液：
20.0 ± 3.8
nm
生理食塩
水 中 ：
68.4 ± 13.7
nm
[DLS]
SD ラット
（雄，週齢記載
な し ， 240 ± 10
g）
気管内投与
（0.3 mL）
125
対象・分析方法
肝臓，脾臓，肺，腎
臓，心臓，脳，睾丸，
血液 [液体シンチレー
ションカウンター分析]
脳，血液，脂肪，心臓，
腎臓，肝臓，肺，筋肉，
皮膚，脾臓，尿
[NMR 分析]
血 液 ： 0.08,
0.25, 0.50, 1.0,
1.5, 2, 3, 4, 5,
6,
8, 12, 16, 24
時間後
尿： 24 時間後
1, 4, 24, 48 時
間後
血液，尿 [HPLC 分析]
血漿中タンパク吸着
[限外濾過（1,500 rpm,
5 min）後に HPLC 分
析]
1.0x10-2mg/匹
1, 4, 24, 72 時
間後
3.7 x 107 Bq/匹
（放射線量で用量を
記載しており，C60 量
は不明）
SPECT 画像解
析： 3, 30, 45,
60 分後
1, 3，6，12, 24,
48 時間後
血液，皮膚，筋肉，
骨，脳，心臓，肺，肝
臓，腎臓，脾臓，胃，
腸，がん細胞 [γカウ
ンター分析]
尿，糞 [ラジオ TLC分
析]
全身分布観察
[SPECT 画像解析]
血液，心臓，肺，肝
臓，脾臓，胃，腎臓，
筋肉，骨，腸，脳 [γ カ
ウンター分析]
Ⅳ-11
脳，腹部脂肪，筋肉，
皮膚，子宮/卵巣，大
腸，胸腺，心臓 ，胃，
肺，血液，腎臓 ，骨，
脾臓，肝臓 [中性子放
射化分析]
結果
経口摂取⇒ほとんど排泄，静脈内
注射⇒1 週間後には体内各組織に
早く分配，血液脳関門も通過
*C60と比べると，血液の循環から
取り除かれるのが遅く，1分後も
10%弱が血中に残っており，120
分後にも1.5%が血液中に存在し
ていた．
．これは，*C60と比べて
親水性が高いためと考えられる．
血漿中のMSAD-C60濃度は指数関
数的に減少．平均半減期は
6.8±1.1 h．99%以上が血漿タンパ
クと結合していた．
166Hox@C82(OH)y は，肝臓に多く
分布し，クリアランスは遅かった．ま
た，骨にも分布し，1～48 時間に掛
けて骨中保持量は増加していた．
本手法は，他の水溶性金属内包フ
ラーレンの体内分布測定に有用な
方法である．．
肝臓や筋肉に最も多く分布してい
た．通常の筋肉細胞や血中よりも
がん細胞中に蓄積しており，がん
治療のために有用な可能性が示
唆された．72 時間までに，尿中に
53%，糞中に 4%排泄された．
SPECT 画像解析で，陰性対照と異
なる分布のため，フラロールを測れ
ている．最も多く分布していたのは
肺であり，肝臓や骨や脾臓にも分
布していたが，脳では検出されな
かった．肺からのクリアランスは非
常に遅かった．
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-3．フラーレンおよびフラーレン誘導体の体内動態に関連する既往の in vitro 試験一覧
文献
Scrivens et al.
1994
試験物質
C60 分散液
（ベンゼン，THF，アセ
トンで調整）
（14C で標識）
Moussa et al. 1995
C60 分散液
（TWEEN80/
CMC+NaCl 水溶液）
*C60
14
C 標識アンモニウム
塩誘導化 C60
C60 マロン酸誘導体
C60C(COOH)2
20%: <1 μm，60%: 1-20
μm，20%: >20 μmb
[偏光顕微鏡観察]
記載なし
記載なし
Porter et al. 2007
C60 分散液
（THF 法で調整）
Rouse et al. 2007
Horie et al. 2010
Bullard-Dillard et
al. 1996
Foley et al. 2002
粒径
対象細胞
ヒト角化細胞
用量
9.4×10-4 mg/mLa
投与条件
15 時間暴露
4 時間暴露後 11 時
間非暴露
分析方法
放射線測定
ヒト白血球
約 1 mg/mL
(最低 5~10 粒子
/cell)
-c
24 時間培養
記載なし
SEM 観察, TEM
観察, 電子線回
折
放射線測定
ヒト繊維が細胞
株 HS68，
サル腎臓細胞株
COS-7
記載なし
記載なし
蛍光顕微鏡観
察
一次粒子径： 60-270 nm
二次粒子径： 420-1300 nm
[文献値を記載（培養液に入
れる前の分散液）]
ヒト単球由来マク
ロファージ
5.0×10-4 mg/mL
24 時間暴露
Low loss EELS,
Zeroloss EFTEM
C60-フェニルアラニ
ン誘導体
3.5 nm
[計算値]
皮膚腫のブタの
皮膚（60 分もしく
は 90 分屈曲，屈
曲なし）
0.67 mg
（33.5 mg/mL を
20μL）
塗布 24 時間後に観
察
共焦点顕微鏡
観察
非染色 TEM 観
察
C60 分散液
（培養液中で分散）
光散乱強度平均径 200~210
nm
数平均径 100~130 nm
[DLS]
ヒト角化細胞
HaCaT
ヒト肺がん細胞
A549
6.6×10-3~
0.153 mg/mL
24 時間暴露
2～24 時間観察
TEM 観察
記載なし
ヒト角化細胞
a
結果
ヒト角化細胞に C60 を暴露させると，
6 時間後には 50%の C60 粒子もしく
は 分 子 C60 が 細 胞 表 面 と 結 合
（associate）し，暴露を停止させても
細胞結合型の C60 は減少しなかっ
た．
好中球が C60 粒子(結晶）を貪食し
ていることが画像において観察され
た．
*C60 や*C60A はすぐに細胞に取り
込まれるが，*C60A の蓄積は*C60 よ
りゆっくりであることを確認.
フラーレン誘導体は核周辺に点状
に分布．微小管には重ならず．主
にミトコンドリア画分に分布し，一部
はミクロソーム画分に分布．細胞質
膜を透過してミトコンドリアに局在し
ていることを確認．
C60 は in vitro で HMM に取り込ま
れる ことに よ り，細 胞中の 原形質
膜，リソソーム，細胞核に分布して
いた．特に原形質膜上と細胞質に
おいて高濃度に見られ，C60 が細胞
質ゾル中の細胞膜を通って拡散で
きることが示唆された．d
屈曲させた皮膚では，ナノ粒子が
皮膚中に移行していたが（8 時間
後），非屈曲皮膚では真皮までの
移行はなかった（24 時間後）．屈曲
皮膚では，顆粒層の間質に C60 誘
導体粒子が存在していた．
細胞質中に凝集体のまま存在する
C60 粒子が観察された．これらの C60
粒子は，膜に包まれたような像が観
察されており，食胞に取り込まれて
いる可能性が示唆された．
: 論文中の 1.3 μM から計算．b: 当該論文のメソッドには，1 mm と 20 mm の表記だったが，他の個所の記述を考え合わせて，単位は mm でなく μm
と考えるのが妥当と思われる．c: 用量は，放射線量で記載されており，C60 誘導体の量は不明．d: 筆者らは画像による判断のみから C60 の存在を結論
付けているが，これらが C60 でなく artifact である可能性は否定できないと思われる．
Ⅳ-12
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
1.4. 一般的なナノ粒子の体内動態について
一般に，吸入された粒子は，肺胞沈着後にマクロファージにより貪食され，マクロファージが
気管支末端まで移動し，気道の粘膜繊毛運動によって体外に排出される（Lehnert & Morrow 1985,
Naumann & Schlesinger 1986）．また，マクロファージによる粒子貪食後の肺の間質やリンパ節へ
の移行も確認されている．ナノ粒子ではサイズが大きな粒子と比較して，マクロファージによる
貪食の著しい遅延と間質部位やリンパ節への移行が確認されている（Oberdörster G et al. 1994,
Madl et al. 1998）．この経路に関しては，ナノ粒子以外の粒子でも認められているが小さく，マク
ロファージの増加が確認できる粒子負荷量を超えると徐々に寄与が大きくなるとされている
（Ferin et al. 1992）．吸入されたポリスチレン粒子が細胞による貪食後に肺毛細血管領域へ移動す
ることもあり，これは細胞の移動によるものだという報告もある（Kato et al. 2003）．二酸化チタ
ンについても吸入されたナノサイズ（個数中央径 22 nm）の粒子で，毛細血管への移行が報告さ
れている（Geiser et al. 2005）．
吸入暴露した粒子の他臓器への移行については，99mTc 標識した炭素の超微粒子を吸入させたと
ころ，数十分で全身循環が確認されたという報告もあるが（Nemmar et al. 2002），これは超微粒子
から外れた放射性指標の全身循環が観察されているに過ぎず，数時間程度では超微粒子の大半は
肺中に残存しているとされている（Mills et al. 2006）．Möller et al. (2008) は，99mTc 標識した 100 nm
の炭素粒子を用いて，肝臓への移行は，肺への保持量の 0.5%以下（ガンマカメラによる測定限界
値以下）であることを示した．また，192Ir で標識されたイリジウムのナノ粒子の吸入試験では，
肝臓や脾臓等の主要臓器への移行はわずかであった（Kreyling et al. 2002）．13C で標識した炭素ナ
ノ粒子（< 100 nm, 160 μg/m3）を 6 時間ラットに吸入させたところ，肺中の 13C は 1 日後から 7 日
，嗅球・大脳・小脳では暴
後に掛けて減少したが（1.39×10-3 mg/g-tissue ⇒ 5.9×10-4 mg/g-tissue）
露 1 日後から 7 日後に掛けて
13
C が増加していた（嗅球：3.5×10-4 mg/g-tissue ⇒ 4.3×10-4
mg/g-tissue）ことから，ナノ粒子が鼻粘膜から嗅球を経由して脳への移行が起こるという可能性
を示唆する報告もある（Oberdörster G et al., 2004）．
経口暴露された粒子類は，腸管リンパ組織内の特異化された腸細胞やリンパ組織の遊離小胞や
正常な腸管細胞によって貪食された後，リンパ行性で全身に循環することや胃腸管を通過して排
泄されることが報告されている（Florence & Hussain 2001）．
ナノ粒子の経皮暴露に関する研究において，ナノ粒子は真皮まで到達しうるという報告はある
が，現段階では経皮暴露後に全身への移行を示す可能性は低いと考えられる（Lademann et al. 1999,
Hoet et al. 2004）．ただし，皮膚内で溶出しうる金属等の物質については，血流に入る可能性があ
る（Hoet et al. 2004）．
1.5. 体内動態の整理
フラーレン誘導体やナノ粒子の体内動態に関する既存の研究（Yamago et al. 1995; Florence &
Hussain 2001）から，フラーレンナノ粒子を経口暴露した場合には，ほとんどが排泄され，全身へ
Ⅳ-13
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
移行したり有害性を及ぼしたりする可能性が低いと考えられる．
作業環境や一般環境中で化学物質や粒子を吸入した場合，肺から血中に入り，全身に移行して
影響を与える可能性と，嗅球を通って脳へと移行する可能性がある．静脈内注射された C60 は，
ほとんどが血液から肝臓へ移行・蓄積しており（1 時間後 92%，120 時間後 95.7%）
（Bullard-Dillard
et al. 1996），吸入暴露後に肺から血中へ C60 粒子が移行したとしても，すぐに肝臓へ移行・蓄積す
ると考えられる．そのため，肝臓における C60 の移行量が小さいことが確認できれば，血中へ移
行した粒子の量が非常に少ないと考えられ，他臓器への移行はほとんどないと結論づけることが
できる．NEDO プロジェクト（P06041）の，Shinohara et al. (2010) の結果において，気管内投与
（3.0 mg/kg）や吸入暴露（0.12 mg/m3）された C60 の肝臓や脳への移行は見られなかった（検出下
限以下（以下 N.D.と表記） (<8.9×10-6 mg/g)）．また，非水溶性のフラーレン誘導体のナノ粒子の
気管内投与試験でも，脳への移行は確認されず，他臓器への移行も極めて少なかった（Xu JY et al.
2007）．これらのことから，吸入暴露されたフラーレンナノ粒子の肺経由での脳や他臓器への移行
は無視できると考えられる．Oberdöster G et al. (2004) は，構造不明の炭素系ナノ粒子が，嗅球経
由で脳へ移行する可能性を示唆している．この研究では，0.16 mg/m3 の吸入暴露濃度で嗅球にお
ける組織重量当たりの炭素濃度が 3.5×10-4～4.3×10-4 mg/g と，肺中における組織重量当たりの炭
素濃度の 25%～73%であったのに対し，NEDO プロジェクト（P06041）
（Shinohara et al. (2010)）
の C60 ナノ粒子の吸入暴露試験では，脳における組織重量当たりの C60 濃度が検出下限以下
（<8.9×10-6 mg/g）と，肺中における組織重量当たりの C60 濃度の< 0.17%であった．Oberdöster G et
al.は，6 時間の暴露 1，2，3，7 日後に測定を行っており、1 日後から 7 日後まで、脳内の濃度に
変化は見られないことから、脳からのクリアランスは進んでいないことが示唆される．Shinohara
et al.は，28 日間の暴露 3 日後に測って、検出下限以下であり、Oberdöster G et al.の粒子と同様に
C60 の脳からの 1 週間程度でのクリアランスがない場合には，フラーレンナノ粒子の吸入暴露時の
嗅球を経由した脳への移行もほとんどないと考えることができる．もし，C60 が脳へ移行してもす
ぐにクリアランスされる物質だった場合には，3 日後の測定で観察できなかった可能性はあるが，
ただちにクリアランスされており、有害影響もみられていないことから，問題にならないと考え
られる．フラーレンが脳へ移行するという既存の報告は，水溶性のフラーレン誘導体を静脈内注
射したものだけである（Yamago et al. 1995）．Oberdöster G et al. (2004)の試験の場合も，炭素ナノ
粒子生成時に副生成した有機炭素類が粒子に吸着して取り込まれ，溶けだして脳まで移行した可
能性もある．炭素ナノ粒子には、フラーレンナノ粒子が含まれている可能性は否定できないが、
含まれていたとしても、生成条件を考えると多くても数％以下でありごく微量と考えられる．ま
た、たんぱくの吸着量はナノ粒子の種類ごとに異なるため、炭素ナノ粒子とフラーレンナノ粒子
で体内の挙動が異なることはあり得ると考えられる．
これらのことから判断すると，フラーレンのナノ粒子は吸入暴露後に全身へ移行する可能性は
ほとんどないと考えられる．
経皮暴露後の体内動態については，フラーレンおよびその誘導体が，表皮における角質や顆粒
Ⅳ-14
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
層まで移行する可能性があり，皮膚の条件によっては真皮まで到達する可能性があるとされてい
る（Xia et al. 2010; Rouse et al. 2007）．ナノ粒子に関する報告（Lademann et al. 1999, Hoet et al. 2004）
を考え合わせると，フラーレン粒子が真皮まで到達する可能性はあるものの，全身へ移行する可
能性は低いと考えられる．
２．肺でのフラーレン粒子の沈着とクリアランス
肺における粒子の有害性を考える上で，肺における粒子の保持量は重要な情報である．保持量
は，肺に沈着する量に加え，肺からの粒子のクリアランス（排出）速度に依存している．ここで
は，既存の研究に基づき肺における沈着とクリアランスをモデル化し，気管内投与試験と吸入暴
露試験における肺中保持量の比較に用いる情報を得ることを目的とした．
2.1 肺への沈着とクリアランス
2.1.1 一般の粒子の肺への沈着とクリアランス
鼻咽頭
空気中の粒子は，鼻や口から吸入され，気管を通って肺胞
まで到達する．その過程で，鼻腔や口腔，気管・気管支・，
上気道
肺胞へ沈着する．気管や肺胞への粒子の沈着は，慣性衝突，
沈降，さえぎり，ブラウン拡散などによって起こるとされて
いる（図Ⅳ-2； Rostami 2009）．慣性衝突は，粒子重量，表
下気道
面との距離，速度，方向変化角度などによるとされており，
鼻喉頭・気道・気管分岐部で起こりやすい．沈降は，重力が
寄与しており，末梢気道や肺胞で起こりやすい．さえぎりは，
形状や物理的大きさが寄与しており，末梢気道，気道，気管
分岐部で主に起こる．ブラウン拡散には，ガス粘度・粒子サ
肺胞
図 Ⅳ -2 ． 吸 入 後 の 粒 子 の 挙 動
(Rostami et al. 2009)
イズが寄与し，気管最末梢部で起こる．その他，静電的沈降や対流なども各部位への沈着へ影響
を与えうる．粒径が大きくなると，慣性衝突，沈降，さえぎりの効果が顕著になり，ブラウン拡
散や対流の寄与が小さくなる（Rostami et al. 2009）．
前述のように，吸入された粒子は，肺胞沈着後にマクロファージにより貪食され，マクロファ
ージが気管支末端まで移動し，気道の粘膜繊毛運動によって体外に排出される（Lehnert & Morrow
1985, Naumann & Schlesinger 1986）．また，マクロファージによる粒子貪食後の肺の間質やリンパ
節への移行も確認されている．
Ⅳ-15
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
2.1.2 フラーレンの沈着，クリアランスに関する既存の文献
Baker et al. (2008) は，ナノサイズ（2.22 mg/m3, 55 nm）とミクロンサイズ（2.35 mg/m3, 930 nm）
の C60 粒子を Fischer 344 ラット（雄，10 週齢）に 3 時間/日で 10 日間吸入（鼻部）暴露させ，暴
露終了直後, 1, 5, 7 日後の肺中フラーレン量を測定した．その結果，10 日間の吸入暴露直後の肺へ
の粒子沈着率は，ナノサイズの方がミクロンサイズより高かった（ナノサイズ 14.1%，ミクロン
サイズ 9.3%）が，半減期はサイズによって大きく異なっておらず（ナノサイズ 26 日，ミクロン
サイズ 29 日），これらの C60 粒子のラット肺からのクリアランスは一般的なメカニズムを通して
行われていることが示唆された．また，肺からのクリアランス率は 0.0271 および 0.0237 /day であ
った．Baker et al. (2008) の論文中では，暴露直後の保持量と総暴露量の比を沈着率としているが，
暴露中もクリアランスが進んでいることは考慮されていないため，沈着率は過小評価になってい
ると考えられる．
Gao et al. (2009) は，雄の Normal F344 ラットを対象として，PBS と 1% Tween 80 を用いて分散
させた C60（約 1 μm）を，1 mg/kg もしくは 5 mg/kg の気管内投与，および，昇華法により生成し
た C60（約 20 nm）の 1 mg/m3 の吸入暴露を行い，0.5, 2, 6, 24, 168 時間後の肺中保持量を分析した．
その結果，投与および暴露の 7 日後の肺中保持量は投与量の 50%及び 60%であり，肺中半減期は
14 日及び 22 日と計算された．
NEDO プロジェクト（P06041）において，Shinohara et al. (2010) は， 0.1%Tween80 を分散剤と
してナノサイズに分散させた C60（50%ile 径 30 nm, 95%ile 径 70~80 nm; C60O 含有率: 約 1%）を，
0.1, 0.2, 1.0 mg/匹（0.33, 0.66, 3.3 mg/kg-bw）で Wistar ラット（雄，9 週齢，約 300 g）に気管内投
与し，注入直後から 180 日後までの臓器中の C60 濃度を分析した．その結果，注入直後には肺中
にほぼ 100%が沈着しており，その後二段階で減衰することが示唆された（半減期:16~24 day，90%
減衰時間: 58~81 day）．また，気中に噴霧した C60 ナノ粒子（平均粒径 96 nm）を吸入暴露（0.12 mg/m3,
4.1×104 particle/cm3, 6 hour/day, 5day/week, 4 week）させ，暴露 7 日後および 30 日後の臓器中の C60
濃度についても分析した．クリアランス率を考慮して計算を行った結果，今回試験した大きさの
C60 ナノ粒子のラットの肺への沈着率は 0.14 であった．
2.1.3 モデルによる粒子の肺胞沈着量の計算
粒子の肺胞への沈着は，沈着モデルで求めることができる．これまでに報告されている沈着モデ
ルは，大きく分けて全肺粒子沈着モデルと局所沈着/CFD モデルの 2 種類に分類することができる．
全肺粒子沈着モデルは，主に 1-D のモデルで，単純な気道幾何学モデルに基づくものであり，全
肺沈着/局所気道沈着の推定に適している．一方，局所沈着/CFD モデルは，主に 3-D モデルであ
り，より現実的で精緻な気道幾何学モデルに基づくものであり，上部気道や局所沈着分布推定に
適しているとされている（Rostami et al. 2009）．全肺粒子沈着モデルは，更に理論的モデルと経
験的/半経験的モデルに分けることができる．前者は現実的な気道構造や生理学／物理プロセスの
数学的表現に基づくものであり，後者はヒトの気管を解剖学的コンパートメントの連続と想定
Ⅳ-16
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-4．MPPD モデルによる沈着率計算に用いたパラメータ一覧
ラット
ヒト
モデル
Asymm Multiple-path
Yeh/Schum Symmetric
機能的残気量
4 mL
3,300 mL
上部気道用量
0.42 mL
50 mL
呼吸頻度
102 /min
20 /min（軽運動時），15 /min（日常生活時），12 /min（安息時）
一回換気量
1.84 mL a
1250 mL（軽運動時），925 mL（日常生活時），750 mL（安息時）
吸気率
0.5
0.5
休止率
0
0
呼吸経路
Nasal
Oronasal-Normal augmenter
a
: Bide(2000)に基づいた 300 g のラットの呼吸量（0.188L/min）と呼吸頻度 102/min から導出
し，それらを吸気/呼気により粒子が通過するとして立てたモデルを，実測値で補正したものであ
る．この経験的/半経験的モデルの代表的なものとしては，Multiple Path Particle Dosimetry (MPPD：
オランダ国立公衆衛生環境保護研究所)モデルや ICRP モデルがあり，一般的にも多く用いられて
いる．ここでは，MPPD モデルを用いて，フラーレン粒子の質量密度（かさ密度 1.2 g/cm3）を持
つ粒子の沈着率を，表Ⅳ-4 に示すパラメータを用いて計算した．
計算された結果を図Ⅳ-3 に示す．粒径 100 nm では，ラットとヒトの肺胞沈着率は 0.17 及び 0.19
とほぼ同じであるが，それより小さい粒子ではラットの肺胞沈着率に比べて，ヒトの沈着率の方
が高くなっている（20～40 nm の粒子ではラット：0.25～0.26 vs. ヒト：0.35～0.40）．モデルのデ
フォルト値でよく用いられている質量密度（1.0 g/cm3）の粒子の沈着率の場合と比べると，粒径
100 nm 以下ではほとんど変わらないが，1,000 nm 以上では多少フラーレン粒子の質量密度を持つ
1.2 g/cm3 の粒子の方が沈着率は低くなる．
0.50
ラット
ヒト 軽運動時
ヒト 日常生活平均
ヒト 安息時
沈着率 [-]
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
10
100
1,000
10,000
粒径 [nm]
図Ⅳ-3 ヒトとラットの肺胞への粒径別の粒子沈着率（粒子密度 1.2 g/cm3）
Ⅳ-17
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
上記で行ったヒトについての試算は，鼻呼吸と口呼吸を合わせた吸入を行い，その比率は一回
換気量により決まるとの仮定で行ったものである．一般的に，ヒトは運動強度が強い場合を除い
てほとんど口呼吸をしないとされている（運動強度が強い場合は，鼻呼吸：口呼吸＝1：1（Yamada
et al. 1997））が，13%は口呼吸をしているという報告もある（Niinimaa et al. 1981）．MPPD model
による計算をしたところ，1 μm 以下の粒子では，鼻呼吸と口呼吸による肺沈着率に大きな違いは
なかったが，1 μm 以上の粒子では，鼻呼吸の場合と比べて口呼吸の場合の肺保持量は 6 倍以上に
なったため，粗大粒子では口呼吸をする人のリスクが高くなる可能性があると考えられる．ちな
みに，ラットは鼻呼吸のみを行っており，1 μm を超えると鼻に入る粒子の割合が減り始め，7 μm
の粒子では 50%程しか鼻に入らない（Brown et al. 2005）．
2.2 実測保持量からの沈着率及びクリアランス率の導出
2.2.1 フラーレンの肺からのクリアランスのメカニズムとモデル
前述のように，吸入された粒子の一部は肺胞表面に沈着し，マクロファージや好中球等により
貪食され，マクロファージ等の気管支へ移動後の粘膜繊毛輸送による体外への排出や間質からリ
ンパ節への移行を経た排出などの経路をたどることが報告されている．また，Shinohara et al.
(2010) のフラーレンの気管内投与後の肺保持量の減衰は，90 日以上で一段階減衰速度式を適用す
ると実測値と乖離が見られ，二段階減衰速度式でうまくフィッティングできたことから，肺胞か
らのクリアランスには，速い相と遅い相が存在していると考えられる．そのため，図Ⅳ-4 に示す
ような 2 段階のクリアランスモデルを用いて保持量の結果を解析することとした．
濃度 C，呼吸量 V ，沈着率 f
初期保持量 A0
コンパートメント １
(保持量 A)
k1
排出１
（速いクリアランス）
k12
初期保持量 I0
コンパートメント２
(保持量 I)
k2
排出２
（遅いクリアランス）
図Ⅳ-4．2 段階クリアランスモデルにおいて想定したメカニズム
肺胞から直接クリアランスされる排出 1（速いクリアランス）はマクロファージによる貪食
後に気管から排出される経路，コンパートメント 2 を経て排出される経路（遅いクリアラ
ンス）は，間質を経てリンパ節から排出される経路や肺胞上皮に接着してクリアランス
が遅れる系などを想定している．
Ⅳ-18
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
100.0
1200
本評価書
(実測値)
0.1 mg投与 (実測値)
0.2 mg投与 (実測値)
80.0
本評価書
(フィッティング)
1.0 mg投与 (実測値)
800
肺中C60 保持量 [μg]
肺中C60 保持量 [μg]
1000
0.1 mg投与 (フィッティング)
0.2 mg投与 (フィッティング)
600
1.0 mg投与 (フィッティング)
400
200
0
Baker et al. 2008
(実測値)
60.0
Baker et al. 2008
(フィッティング)
40.0
20.0
0.0
0
30
60
90
120 150 180 210 240
投与後経過時間 [日]
0
10
20
30
40
50
60
70
暴露開始後経過時間 [日]
図Ⅳ-5．肺中保持量の実測値とフィッティング曲線 (左図：気管内投与試験，右図：吸入暴露試験)
2.2.2 フラーレンの肺保持量の経時的な減衰
NEDO プロジェクト（P06041）において，Shinohara et al. (2010) が，0.1%Tween80 を分散剤と
（50%ile 径 30 nm, 95%ile 径 70~80 nm; C60O 含有率: 約 1%）
して用いてナノサイズに分散させた C60
を Wistar ラット（雄，9 週齢，約 300 g）に対して 0.1 mg/匹での気管内投与を行ったところ，7, 30,
90, 180 日後の肺中 C60 保持量は，7.08×10-2, 2.65×10-2, 5.22×10-3, 2.86×10-3 mg/肺であった．0.2 mg/
匹の気管内投与では，18 時間後及び 30, 90, 180 日後の肺中 C60 保持量は，0.21, 6.2×10-2, 1.7×10-2,
1.5×10-2 mg/肺，1.0 mg/匹の気管内投与では，18 時間後，及び 3, 7, 30, 90, 180 日後の肺中 C60 保持
量は，1.0, 1.0, 1.1, 0.48, 9.1×10-2, 2.2×10-2 mg/肺であった．得られた保持量と 3.2.1 で示したモデル
を用いてフィッティングした結果（図Ⅳ-5 左図）
，クリアランス速度定数 k1, k12, k2 は，0.029 – 0.047,
0.00044 – 0.0034, and 0 – 0.0042 /day と求められた．
Baker et al. (2008) は，ナノサイズ（濃度 2.22 mg/m3, 平均粒径 55 nm）の C60 粒子を Fischer 344
ラット（雄，10 週齢）に 3 時間/日で 10 日間吸入（鼻部）暴露させて，暴露直後, 1, 5, 7 日後の肺
胞中 C60 量が 0.07889, 0.07551, 0.06763, 0.05872 mg/肺だったと報告している．また，Shinohara et al.
（2010）が，ナノサイズ（平均粒径 96 nm）のフラーレンを濃度 0.12 mg/m3,で 6 hour/day, 5 day/week
で Wistar ラット（雄，8 週齢，約 300 g）に 4 週間暴露させたときの，3 日後及び 1 ヶ月後の肺胞
への保持量は 1.01×10-2, 5.08×10-3 mg/肺だった．
Bide (2000) によると，ラットの呼吸量は，MV =0.499×BW0.809 で表わされ，ラットの系統別，性
別，暴露期間別の体重も示されている．この式を用いると，体重 300 g の Wistar 雄ラットの呼吸
量は 0.27 m3/day（188 ml/min）と計算された．また，Baker et al. (2008) は試験に用いた Fischer 344
ラット（雄）の呼吸量を 140 ml/min としている．これらの値を用いて、前述のモデル（Appendix
（Ⅳ-78，79）に網掛けで示した２式）により得られる肺保持量と実測値との差の二乗和が、最も
小さくなるように、エクセルのソルバー機能により最適な沈着率を求めたところ，それぞれの沈
着率は 0.18 および 0.14 となった．これらは，MPPD モデルで計算される 55 nm
（GSD 1.48, 密度 1.7
Ⅳ-19
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
g/cm3）及び 96 nm（GSD 2.0, 密度 1.2 g/cm3）の粒子の沈着率（0.12 および 0.078）より大きな値
となった．これは， MPPD モデルで設定した対数正規分布の粗大側の粒子が実際の試験では存在
していなかったことにより起きた過小評価と考えられる．つまり，MPPD モデルでの計算時に分
布を入れる場合には，粗大粒子の寄与について注意することが必要と考えられる．
2.3 肺への沈着とクリアランスのまとめ
既往の研究と MPPD モデルの計算結果から，ナノサイズ（< 100 nm）のフラーレンのラットの
肺胞への沈着率は 0.2~0.3 であり，ヒトでは 0.2～0.4 になると考えられる．2 段階のクリアランス
を想定したモデル式を Baker et al. (2008) と Shinohara et al. (2010) の報告している実測値にフィッ
ティングさせたところ，0.14～0.18 の沈着率となった．この結果は，吸入暴露時のラットの肺保
持量の値を，気管内投与試験結果を用いて推定する際に用いる．
３. 吸入経路による暴露に関わる有害性試験
吸入経路による暴露の有害性を評価する in vivo 試験系としては気管内投与試験と吸入暴露試験
がある．吸入暴露試験は，実験室の暴露チャンバー内で一定濃度の被験物質に実験動物を暴露さ
せる試験であり，吸入暴露の評価に最も適しているとされている（森本＆田中 2008）．ただし，
大型で高価な装置が必要とされ，実施できる試験機関は少ない．また，試験試料も非常に多く必
要とするため，試験の実施は容易ではない．吸入経路による暴露の有害性を評価した既存の試験
について，表Ⅳ-5 と図Ⅳ-6 にまとめた．
3.1. 吸入暴露試験
Baker et al. (2008)は，ナノサイズ（2.22 mg/m3, 55 nm）とミクロンサイズ（2.35 mg/m3, 930 nm）
の C60 粒子を Fischer 344 ラット（雄，10 週齢）に 3 時間/日で 10 日間吸入（鼻部）暴露させて，
暴露終了直後/1, 5, 7 日後の影響を観察した．体重や臓器重量に有意な変化は確認されなかった．
BALF（bronchoalveolar lavage fluid: 気管支肺胞洗浄液）中のたんぱく濃度については，ナノサイ
ズのフラーレンで増加が確認されたが，総細胞数やサイトカインにはほとんど変化はなかった．
NEDO プロジェクト（P06041）において，Yokoyama et al. (2009) は， 0.1%Tween80 を用いて調
製した C60 分散液を噴霧して生成させた C60 ナノ粒子（個数幾何平均径 86 nm，個数濃度 1.6 × 105
個/cm3）を ICR マウス（雄，約 30 g）に吸入させ，700 MHz の電子常磁性共鳴（EPR）計測によ
り，肺中の酸化還元能を調べた．その結果，陽性対照の酸化ニッケル（NiO）ナノ粒子では酸化
還元能が確認されたのに対し，C60 では酸化還元能は確認できなかった．
NEDO プロジェクト（P06041）において，Morimoto et al. (2010) は，0.1%Tween80 を用いて水
Ⅳ-20
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
中に分散させた C60 を気中へ噴霧させて生成した 0.12 mg/m3 の C60 ナノ粒子（平均粒径: 96 nm
（mobility 径）（粒径約 30 nm の粒子の凝集体），個数濃度（SMPS 計測）: 4.1 × 104 個）に Wistar
ラット（雄，9 週齢，300 g）を 6 hour/day, 5 day/week で 4 週間暴露させ，3 日後，1 ヶ月後，3 ヶ
月後，6 ヶ月後の観察をした．その結果，肺湿重量，BALF の所見（総細胞数・好中球数），肺組
織における HO-1 遺伝子（炎症線維化関連遺伝子）発現では，陰性対照と違いは認められなかっ
た．また，病理組織学検査の結果，肺組織における炎症は 3 日後のみ一過性にごく軽度にみられ
たが，それ以降は肺組織における炎症は観察されなかった．その他の臓器（大脳・小脳，鼻腔，
精巣，肝臓，腎臓，脾臓）でも，特に異常所見は認められなかった．一方，陽性対照の酸化ニッ
ケル投与群では，肺湿重量の増加や BALF 中の総細胞数の増加など複数の項目で，有意な増加が
確認された．また，酸化ニッケルでは好中球や肺胞マクロファージの炎症細胞浸潤も認められた．
3.2 気管内投与試験
3.2.1 C60 フラーレン
Sayes et al. (2007) は，160 ± 50 nm の粒径の C60 水分散液（粒子は結晶構造）を 0.2, 0.4, 1.5, 3.0
mg/kg で SD CD（Crl:CD®(SD)IGS BR）ラット（雄，約 7 週齢，220-240 g）に単回気管内投与し
た後，24 時間，1 週間，1 ヶ月，3 ヶ月の BALF と肺組織の観察を行った．陽性対照は結晶性シ
リカ（Min-U-Sil 5）とした．BALF 中の乳酸脱水素酵素（LDH），マイクロ総タンパク（MTP），
アルカリ性リン酸塩（AlkP）の値は，結晶性シリカ投与後に有意な増加が持続的にみられたが，
C60 分散液では有意な増加は持続的に見られなかった．BALF 中の総細胞数は C60 分散液の投与後
に変化はなく，好中球数は C60 投与 24 時間後のみ上昇したが，持続的なものではなかった．BALF
中の脂質過酸化は，1.5, 3.0 mg/kg の C60 分散液の投与 1 日および 3 ヶ月後に有意な上昇を示した
が，結晶性シリカでは変化は見られなかった．同様に総グルタチオン量は，各群で変化はなかっ
た．また，肺組織の観察において，結晶性シリカでは持続的な炎症が有意に認められたのに対し，
C60 分散液では有意な炎症は持続的に見られなかった．
Jacobsen et al. (2009) は，平均ゼータサイズ体積径が 211 nm（ピークは 122 nm と 164 nm）の
C60 粒子 5.4×10-2 mg を apolipoprotein E ノックアウトマウスに対して気管内投与し，3 時間後と 24
時間後の肺細胞や BALF への影響を観察した．その結果，3 時間後には，肺細胞の Mcp-1 が対照
群と比べて有意に上昇していたが，SWCNT や CB よりはるかに変化は小さく，金粒子と同程度
であった．24 時間後にも，肺細胞中の Mip-2，Mcp-1，IL-6 が対照群と比べて有意に上昇してい
たが，SWCNT や CB よりはるかに変化は小さかった．また，3 時間後と 24 時間後の観察におい
て，共に BALF 中のたんぱく濃度が対照群よりも有意に減少していたが，著者らはこの原因が実
際に肺内で起きている現象によるものなのか，もしくは何らかの試験上の干渉なのかは結論でき
ないとしていた．本試験の結果では C60 の肺への毒性は非常に小さかったが，Qiao et al. (2007) の
研究を元に，もし凝集体が小さいサイズにかい離した場合には細胞膜を通して全身に移行するか
もしれないとしている．
Ⅳ-21
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
NEDO プロジェクト（P06041）において，Morimoto et al. (2010) は，0.1%Tween80 を用いて水
中に分散させた C60（質量基準 50%ile 径: 33 nm）を 0.1, 0.2, 1.0 mg/匹（0.33, 0.66, 3.3 mg/kg）で，
Wistar ラット（雄，9 週齢）に単回気管内投与し，3 日後，1 週間後，1 ヶ月後，3 ヶ月後，6 ヶ月
後の観察を行った．その結果，肺湿重量が 0.33, 0.66, 3.3 mg/kg の全ての投与群において 1 週間後
にのみ有意な増加が認められた．BALF の所見（総細胞数・好中球数）では，3.3 mg/kg 投与群に
おいて 1 週間後まで総細胞数が増加しており，好中球数は 3 ヶ月後まで有意に増加していたが，
陽性対照の酸化ニッケル投与群（0.2 mg/rat）の増加率の 1/10 以下とわずかであった．肺組織にお
ける HO-1 遺伝子発現では，1 週間後まで発現の亢進が認められた．また，肺組織の炎症を観察
したところ，0.33, 0.66 mg/kg 投与群で 3 日後に，3.3 mg/kg 投与群で 3 日後と 1 週間後に軽微な
増加が確認されたが，一過性のものであり，それ以降は陰性対照と違いはなかった．炎症と関連
する血液細胞（白血球数や好中球数）の変化は認められず，その他の臓器（大脳・小脳，鼻腔，
精巣，肝臓，腎臓，脾臓）では特に異常所見は認められなかった．一方，比較対照の酸化ニッケ
ル投与群では，肺湿重量や BALF 中の総細胞数など複数の項目で，有意な増加が確認され，好中
球や肺胞マクロファージの炎症細胞浸潤も認められた．
Park et al. (2010) は，C60 のトルエン溶液を水と混ぜてからトルエンを飛ばす方法で分散液を調
製し，PBS で希釈した C60 分散液を雄の ICR マウス（25±1 g）に 0.5, 1.0, 2.0 mg/kg で気管内投与
し，1, 7, 14, 28 日後の BALF および血液中の各種サイトカインや IgE を計測した（0.5 mg/kg およ
び 1.0 mg/kg は 1 日後のみ）．また，肺における遺伝子発現解析も行った．1 日後の測定結果では，
用量反応的なサイトカイン値の増加が見られたが，0.5 mg/kg では有意な増加を示したものはなかった．
2.0 mg/kg 投与群では，IL-6 が 14 日後まで有意に上昇しており，IFN-γ が 28 日後まで有意に上昇して
いた．血中の IgE は，2.0 mg/kg 投与群で 7 日後まで有意に上昇していたが，BALF 中の IgE には有
意な上昇は見られなかった．これらの結果から，C60 単回気管内投与により，肺の炎症反応が引き
起こされるかもしれないと結論付けられている．
3.2.2 C60 フラーレン誘導体
Sayes et al. (2007) は， フラレノール C60(OH)24 水分散液（粒子は非結晶構造，粒径不明）0.2, 0.4,
1.5, 3.0 mg/kg で SD CD（Crl:CD®(SD)IGS BR）ラット（雄，約 7 週齢，体重 220-240 g）に単回気
管内投与した後，24 時間，1 週間，1 ヶ月，3 ヶ月の BALF と肺組織の観察を行った．BALF 中の
LDH，MTP，AlkP の値や肺組織中の炎症観察について，結晶性シリカ投与後には持続的に有意な
増加がみられたが，C60(OH)24 分散液では一時的な増加はあったが持続的なものではなかった．
BALF 中の総細胞数は投与後に変化はなく，好中球数は投与 24 時間後のみ上昇したが，持続的な
ものではなかった．BALF 中の脂質過酸化や総グルタチオン量も投与による変化はなかった．
Roursgaard et al. (2008)は，生理食塩水で希釈したフラレノール C60(OH)20±2 を BALB/cJ マウス
（雌，7–8 週齢，体重 19.6–21.9 g）に 2.0×10-5, 2.0×10-4, 2.0×10-3, 2.0×10-2, 0.20 mg/匹で気管内投与
し，24 時間後の BALF の観察を行った．0.20 mg/匹投与群では，好中球数が有意に増加していた
Ⅳ-22
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
が，2.0×10-2 mg/匹までの投与群では好中球数の増加は認められなかった．好中球を誘引するケモ
カイン（MIP-2）についても，0.20 mg/匹投与群では有意に増加していたが，20 μg/匹までの投与
群では増加は認められなかった．また，二酸化ケイ素 5.0×10-2 mg/匹+ C60(OH)20±2 投与群
（C60(OH)20±2 は 2.0×10-4, 2.0×10-3, 2.0×10-3 mg/匹）では，二酸化ケイ素 5.0×10-2 mg/匹投与群と比
べて好中球数の増加が有意に小さくなった．
Xu et al. (2009) は，生理食塩水で希釈したフラレノール C60(OH)22, 24（平均粒径 20.0±3.8 nm）
を SD ラット（雄，週齢記載なし，200 ±10 g）に 3 日間連続で気管内投与した．総投与量は，1，
5，10 mg/匹で，最後の投与の 24 時間後に BALF の観察と各臓器（肺，肝臓，脳，腎臓，脾臓，
心臓）の病理観察を行った．その結果，1 mg/匹では肺における有害性影響は確認されなかったが，
5, 10 mg/匹では用量反応的に細胞障害や酸化/ニトロ化ストレスや炎症が引き起こされていた．肺
以外の臓器では，どの用量でも有害性影響は観察されなかった．
3.3 気管内投与試験と吸入暴露試験の相違について
3.3.1 気管内投与試験の利点と欠点 (Driscoll et al. 2000)
気管内投与試験は，難溶性粒子への暴露後のラットの肺の炎症・線維化や感染への感受性，ア
レルギー性感作や肺がんなどの生物学的エンドポイントに対して，吸入暴露試験と定性的に同様
の結果を生じるとされている．また，気管内投与試験は吸入暴露試験と比べて安価かつ簡便であ
り，既知量を肺に対して投与できる．これらのことから，高価で大型の装置が必要な吸入暴露試
験の代替として，吸入暴露時の有害性試験として広く用いられている．
しかし，同時にいくつかの欠点があるとされている．気管内投与試験では，一度に大量の試験
物質を肺に入れることから，肺の防御機能を上回り，低用量で生じる可能性のない非特異的応答
を引き起こす可能性がある．これは，単なる生理食塩水を注入した場合にも起こる．そのため，
一般的に気管内投与の 1 日後や 3 日後では肺において生ずる非特異的応答指標の変化は必ずしも
有害性を示唆するものではないとされている．また，気管内投与試験では，吸入暴露試験と違い，
試験物質が肺胞領域に均一に沈着するわけではないため，局所的高用量を生じる可能性があり，
そのためクリアランスの経路や有害影響の発現が吸入暴露時と異なった形で評価される可能性が
ある．
3.3.2 気管内投与試験と吸入暴露試験の比較について
Costa et al. (2006) は，残渣油燃焼時に生成されるフライアッシュについて，肺保持量が同程度
になるように，SD ラット（雄，60 日齢）に対する気管内投与試験（0.110 mg/匹）と吸入暴露試
験（12 mg/m3, 6 hour/day）を行い，注入 24, 48, 96 時間後に肺 BALF 中のマーカー等の測定や病理
学的観察を行い，両者に数倍もの大きな違いがなかったと報告している．
Li et al. (2007) は，Kunming マウス（雌，10 週齢，30 g（ただし試験は一週間の馴化後実施））
に対する MWCNT（Multi-Wall Carbon Nano Tube: 多層カーボンナノチューブ）の気管内投与試験
Ⅳ-23
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
（0.05 mg/匹）と吸入暴露試験（32.61 mg/m3, 6 hour/day）を行い，注入直後，8, 16, 24 日後に肺の
病理学的所見を観察した．推定される肺保持量は，注入 8, 16, 24 日後で 7.0×10-2, 0.14, 0.21 mg で
ある．両試験における，沈着部位の違いや凝集体の違い等が観察され，炎症や傷害の度合いは吸
入暴露の方が軽度であった．
Jacobsen et al. (2009) は，apolipoprotein E ノックアウトマウスに対して肺保持量が同等になるよ
うにカーボンブラックの気管内投与（1.8×10-2, 5.4×10-2 mg/匹, 30 min & 90 min）および吸入暴露（60
mg/m3）を行い，暴露 3 時間後及び 24 時間後の肺の炎症を比較している．その結果，気管内投与
のマウスの肺の炎症は，吸入暴露のマウスの炎症と比べてはるかに重かった．
Warheit et al.（2005）は，表面修飾の異なる複数の二酸化チタン粒子を用いた気管内投与試験（2,
10 mg/kg; 24 時間後, 1 週間後, 1, 3 ヶ月後観察）および吸入暴露試験（1130-1300 mg/m3; 一日 6 時
間，週 5 日間，4 週間暴露; 直後，2 週間後，3，6，12 ヶ月後観察）を行い，両試験における肺
への有害性影響が質的に類似していたと報告している．
3.3.3 気管内投与試験と吸入暴露試験の関係についてのまとめ
気管内投与試験は，肺の炎症に関わるエンドポイントに対して，定性的には吸入暴露試験と同
様の結果を示す．定量的には，投与 24 時間程度では気管内投与試験の方が炎症の発現は強いとい
う報告が多い．肺中の保持量に差がなければ，慢性的な影響についてはある程度同等の影響が見
られる可能性がある．ただし，気管内投与試験と吸入暴露試験を比較した既往の論文の多くが短
期の暴露と短期の影響を観察している．ある程度の期間における暴露とそれによる肺の慢性影響
についての観察結果について論じているのは Warheit et al.（2005）のみであるが，有害性の種類
や質を比較して有害性のスクリーニングツールとしての有用性には言及しているものの，気管内
投与試験結果のみから吸入暴露に関する許容暴露濃度を提案するまでには至っていない．
3.4. 肺の炎症生成メカニズム
粒子により引き起こされる可能性のある肺における現象を整理した（図Ⅳ-6）．前述のように，
吸入した粒子の一部は気道及び肺胞表面に沈着する．沈着の刺激により血管の拡張による血漿の
漏出や肥満細胞等の活性化によって，急性の炎症がおこり，それに伴いマクロファージや好中球
の浸潤が起こる．マクロファージや好中球は粒子を貪食するとともに，炎症性のサイトカインを
産生して，さらにマクロファージ/好中球の活性化・浸潤が促進される．マクロファージは貪食後
に気管支へ移動して粘膜繊毛輸送によって体外に粒子が排出される．マクロファージや好中球は、
貪食処理の細胞反応として ROS（Reactive Oxygen Species: 活性酸素種）や RNS（Reactive Nitrogen
Species: 活性窒素種）を産生するため，その ROS や RNS がその部位において細胞を損傷して炎
症を引き起こす．粒子が強毒性の場合には，貪食後にアポトーシスを起こし，炎症を誘発する．
肺胞表面に沈着している粒子も沈着が持続すると相互作用で炎症がおこることもある．初期の炎
症は可逆性のものであり，長期の粒子残留によって不可逆性の慢性炎症を引き起こし，線維化等
Ⅳ-24
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
の間質反応を引き起こす可能性がある．
炎症を抑える体内の働きとしては，グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）やカタラーゼ（CAT），
HO-1（ヘムオキシゲナーゼ-1）などの抗酸化酵素の活性により，ROS が低減して回復することや，
サイトカインの分泌の抑制，新たな血管による血流の正常化などがあげられる．基本的に不可逆
性の慢性炎症になっていない場合，粒子が除去されれば炎症は回復していく．
ナノ粒子自体が ROS 生成に寄与することで炎症が起こるメカニズムもあると考えられている．
フラーレンについても，光照射時に一重項酸素を生成することで脂質やたんぱく質に対する酸化
的傷害性を示し，抗酸化剤の添加により緩和されるという報告があることから，フラーレンは
ROS を生成して細胞膜に酸化的傷害を与えるという指摘がある．しかし，C60 はフリーラジカル
と容易に付加反応するため，光照射のない場合には ROS 生成には寄与せず，逆に ROS を減らす
働きを持つと考えられる．光照射下においては，光励起した 3C60*（励起三重項状態の C60）の Type
I エネルギー移動反応による一重項酸素生成による炎症生成と，ROS 捕捉能による炎症抑制作用
の双方の可能性があり，どちらが効くかは今の段階では断定はできない．ただし，生体内におい
て光照射が起こるとは考えられないことから，基本的にフラーレン自体が ROS を生成して炎症を
引き起こすとは考えにくい．
間質
排出（呼気）
リンパ節
上皮細胞の
隙間から移動？
ナノ粒子
肺胞
吸入
即時
《肥満細胞の応答》
《血管の膨張》
炎症
(急性)
沈着
貪食
持続
移動
マクロファージ/
好中球 等
気管支
粘膜繊毛輸送
排出
（強毒性の場合）アポトーシス
粒子の代謝（分解）
活性化
浸潤
産生
移行
《上皮細胞と相互作用》 《炎症性サイトカイン産生》 《ROS・RNS産生》
（取り込み？）
（TNFa，IL-1ß，IL-6，IL-8等）
炎症
炎症
《マクロファージ等の活性化》
《T細胞や単球の肺への流入》
《HO-1等の抗酸化酵素の誘発》
炎症
炎症
炎症
《LDH活性上昇》
《好酸球等がタンパク質の放出》
図Ⅳ-6．肺胞へ吸入されたナノ粒子の挙動とおこりうる現象
（調べうる文献や参考書を元に作成（菊池&滝沢 2003，松元ら 2003，高橋 2006，中村&石坂 2006，桑野
ら 2006，宮崎&吉澤 2006，相良 2006，星野ら 2006，豊嶋ら 2006，森ら 2006）．起こる可能性が示唆さ
れているのみで確認されていない現象も含む．また，微細な現象で記載していない現象も存在す
る．）
Ⅳ-25
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
3.5. 吸入経路による暴露に関わる有害性のまとめ
産業医科大学の森本教授によると，
“気管内投与では，試験液が肺に注入されており，肺では
異物が入ってきたとして非特異的応答を示すため，1 日後のデータは医学的な意味が少なく，気
管内投与 1 週間後の応答を見ることが望ましいとされている．”（私信）．
そのため，1 週間後以降に陰性対照群と有意な差が見られた影響についてのみを対象として，
吸入経路による暴露に関わる有害性を表Ⅳ-5,6 に整理した．1.5, 3.0 mg/kg の C60 の気管内投与で
は，3 ヶ月後のみで BALF 中の脂質過酸化の上昇がみられている（Sayes et al. 2007）．一方，3.3 mg/kg
の気管内投与では，BALF 中総細胞数が 1 週間後まで好中球数は 3 ヶ月後までわずかな増加が確
認され，1 週間後までに回復する肺における軽い炎症も認められた（Morimoto et al. 2010）．
Ⅳ-26
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-5．フラーレンの吸入暴露の有害性に関する既往の文献
観察期間
結果
Sayes et al.
2007
文献
C60 水分散液,
試験物質
160 ±50 nm
[測定法記載
なし]
粒径
SD CD ラット
（雄，約 7 週齢，
220-240 g）
対象動物
気管内投与
(単回投与)
投与方法
0.2, 0.4, 1.5, 3.0
mg/kg-bw
（5.0×10-2, 9.0×10-2,
0.3, 0.7 mg/匹 a）
用量（暴露濃度）
BALF，
病理観察（肺）
投与 1 日,
1 週間, 1 ヶ
月，3 ヶ月後
1.5, 3.0 mg/kg で，BALF 中の脂
質過酸化が増加．その他の
BALF 中マーカーや肺組織に
おける持続的な炎症等もなかっ
た．
Baker et al.
2008
C60 ナノ粒子
（昇華生成）
平均 55 nm
[SMPS]
Fischer 344 ラット
（雄，10 週齢）
2.22 mg/m3
BALF，
病理観察（肺）
C60 ミクロン粒子
（ボールミルで粉砕後
に噴霧）
平均 930 nm
[SMPS]
吸入暴露
（鼻部暴露）
(3 hour/day,
10 day)
暴露終了直
後, 1, 5, 7
日後
ナノサイズの粒子へ暴露群で
BALF 中のたんぱく濃度の増加
が確認されたが，総細胞数やサ
イトカイン等のマーカーで変化
なし．
Yokoyama et al.
2009
(NEDO プロジェ
クト（P06041）)
C60 ナノ粒子
（0.1%Tween80 水溶液
を噴霧）
個数幾何平均
86 nm
[SMPS]
ICR マウス
（雄，約 30 g）
吸入暴露
（鼻部暴露）
0.35 mg/m3
（1.6×105 particle/cm3）
肺内酸化還元能
測定[電子常磁
性共鳴（EPR）計
測 （700 MHz）]
暴露 2 日, 2
週間後
陽性対照群（NiO 投与群）では
肺内酸化還元能が確認された
が，C60 では確認されず．
Jacobsen et al.
2009
C60 粒子
（0.22 μm フィルターで
ろ過した以外の記述な
し）
平均体積径
211 ± 14 nm
[DLS]
Apolipoprotein E ノッ
クアウトマウス
（雌，8 週齢, 体重記
載なし）
気管内投与
(単回投与)
5.4×10-2 mg/匹
BALF，
投与 3 時
間，24 時間
後
SWCNT や量子ドットやカーボ
ンブラックと比べて，C60 粒子は
極めて弱い炎症反応しか示さな
かった．
Morimoto et al.
2010
C60 分散液
（0.1%Tween80 水溶
液）
50%ile 30 nm
95%ile 80 nm
[DLS]
Wistar 雄ラット
（雄，9 週齢，
約 300g）
気管内投与
(単回投与)
(0.4 mL)
0.1, 0.2, 1.0 mg/匹
(0.33, 0.66, 3.3
mg/kg-bw)
BALF，
HO-1 遺伝子発
現，各臓器病理
観察
投与 3 日,
1 週間, 1 ヶ
月，3 ヶ月, 6
ヶ月後
ほぼ全ての項目で陰性対照群
と差なし．1.0 mg/匹の 1 週間後
までの肺において,一過性の炎
症が確認されたが，持続的な炎
症は観察されず．1.0 mg/匹投
与群では，3 ヶ月後まで高中級
数の有意な増加が確認された．
C60 ナノ粒子
（0.1%Tween80 水溶液
を噴霧）
平均 95 nm
[SMPS]
Wistar 雄ラット
（雄，9 週齢，
約 300g）
吸入暴露
（6 hour/day,
5 day/week,
4 week）
0.12 mg/m3
（4.1×104 particle/cm3）
BALF，
HO-1 遺伝子発
現，各臓器病理
観察
暴露 7 日, 1
ヶ月後
ほぼ全ての項目で陰性対照群
と差なし．持続的な炎症も観察
されず．
2.35 mg/m3
(NEDO プロジェ
クト（P06041）)
a
： 同じ用量単位で比較できるように，筆者らが換算した値
Ⅳ-27
観察項目
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-5．フラーレンの吸入暴露の有害性に関する既往の文献 (Cont.)
文献
試験物質
粒径
対象動物
投与方法
用量（暴露濃度）
Park et al. 2010
C60 分散液
（トルエンを用いて水
中に分散，PBS 中で希
釈）
46.7 ± 18.6 nm
[DLS]
ICR マウス
（雄，週齢記載なし，
25 ± 1 g）
気管内投与
（単回投与）
用量反応試験: 0.5,
1.0, 2.0 mg/kg
（0.125, 2.5×10-2,
5.0×10-2 mg/匹 a）
経時観察試験: 2.0
mg/kg
（5.0×10-2 mg/匹 a）
a
観察項目
BALF, 血液
遺伝子発現
観察期間
結果
1, 7, 14, 28
日後
(用量反応試
験は，1 日後
のみ)
1 日後の測定結果では，用量反
応的なサイトカイン値の増加が
見られたが，0.5 mg/kg では有
意な増加はなし．2.0 mg/kg 投
与群では，IL-6 が 14 日後まで，
IFNr が 28 日後まで有意に上
昇していた．
： 同じ用量単位で比較できるように，筆者らが換算した値
表Ⅳ-6．フラーレン誘導体の吸入暴露の有害性に関する既往の文献
観察項目
観察期間
結果
Sayes et al.
2007
文献
C60(OH)24 水分散液
-
SD CD ラット
（雄，約 7 週齢，
220-240 g）
気管内投与
(単回投与)
0.2, 0.4, 1.5, 3.0
mg/kg-bw
（5.0×10-2, 9.0×10-2,
0.3, 0.7 mg/匹 a）
BALF，
病理観察観察
（肺）
投与 1 日,
1 週間, 1 ヶ
月，3 ヶ月後
BALF 中の LDH，MTP，AlkP
や総細胞数や脂質過酸化，総
グルタチオン量の値や肺組織
中の炎症観察について，持続
的に有意な増加は見られなか
った．好中球数は投与 24 時間
後のみ上昇した．
Roursgaard et
al. 2008
C60(OH)20±2 水分散液
-
BALB/cJ マウス
（雌，7–8 週齢，19.6–
21.9 g）
気管内投与
(単回投与)
(0.04 mL)
2.0×10-5, 2.0×10-4,
2.0×10-3, 2.0×10-2, 0.20
mg/匹
（9.6×10-4, 9.6×10-3,
9.6×10-2, 0.96, 9.6
mg/kg-bwa）
BALF の観察
投与 24 時間
後
0.20 mg/匹投与群では，好中球
数や MIP-2 が有意に増加して
いたが，2.0×10-2 mg/匹までの
投与群では増加は認められな
かった．
Xu JY et al.
2007
C60(OH)22-24 水分散液
超音波直後：
20.0±3.8 nm
12 時間後：
68.4±3.8 nm
[DLS]
SD ラット（雄，週齢記
載なし，200 ±10 g）
気管内投与
(3 回投与（3
日間）)
(0.3 mL)
1, 5, 10 mg/匹
（5, 25, 50 mg/kg-bwa）
BALF, 各臓器
病理観察
投与 24 時間
後
1 mg/匹では肺における有害性
影響は確認されなかったが，5,
10 mg/匹では用量反応的に細
胞障害や酸化/ニトロ化ストレス
や炎症が引き起こされていた．
肺以外の臓器では，有害性影
響は観察されなかった．
a
試験物質
粒径
対象動物
投与方法
： 同じ用量単位で比較できるように，筆者らが換算した値
Ⅳ-28
用量（暴露濃度）
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
気管内注入
Jacobsen et al. 2009
5.4×10-2 mg/匹で極めて弱い炎症反応のみ．
211±14 nm [DLS（動的光散乱測定）]
Sayes et al. 2007
1.5, 3.0 mg/kgで，BALF中の脂質過酸化が増加．
その他のBALF中マーカーや肺組織における持続
的な炎症等はなし．
160±50 nm [TEM観察]
（0.2 ～ 3.0 mg/kg-bw）
Park et al. 2010
46.7±18.6nm [DLS（動的光散乱測定）]
（0.5 ～ 2.0 mg//kg-bw）
2.0 mg/kgでBALF中のIL-6やIFN-γが有意に上昇.
3.3 mg/kg投与群において、3ヶ月後まで好中球数が
非常にわずかであるが有意に増加していた．肺組
織の炎症度は、0.33, 0.66 mg/kg投与群で 3日後に、
3.0 mg/kg投与群で1週間後まで一過性の軽微な増
加が確認されたが，持続的な炎症は観察されず．
（NEDOプロジェクト（P06041 ））
Morimoto et al. 2010
体積50%ile径 30 nm, 体積95%ile径70～80 nm
[DLS（動的光散乱測定）]
（0.33～3.3 mg/kg-bw）
吸入暴露
（NEDOプロジェクト（P06041 ））
Morimoto et al. 2010
（0.12 mg/m3）
個数幾何平均径 96 nm
[SMPS （走査型移動度粒径測定）]
肺組織の炎症度は、3日後に一過性の増加が確
認されたが、持続的な炎症は観察されず．
（NEDOプロジェクト（P06041 ））
Yokoyama et al. 2008
（0.35 mg/m3）
Baker et al. 2008
Baker et al. 2008
3
（2.22 mg/m ）
10
肺での酸化還元能は確認されず．
個数幾何平均径 86 nm
[SMPS （走査型移動度粒径測定）]
100
3
（2.35 mg/m ）
1000
個数平均径55nm & 個数平均径930 nm
[SMPS （走査型移動度粒径測定）]
10000
7日後までの観察で，ナノサイズのフラーレン暴露
群でBALF中のたんぱく濃度の増加が確認された
が，総細胞数やサイトカイン等のほとんどのマー
カーで変化なし．
100000
粒径［nm］
図Ⅳ-7．フラーレンの吸入暴露の有害性に関する既往の試験（吸入暴露・気管内投与）における粒子サイズ
Ⅳ-29
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-7．気管内投与試験と吸入暴露試験における有害性の比較
文献
試験物質
対象動物
気管内投与
吸入暴露
観察期間
比較結果
Costa et al.
2006
フライアッシュ
（~1.95 μm [OPC]）
SD ラット
（雄，60 日齢，体重
記載なし）
0.11 mg/匹
12 mg/m3
(6 hour)
（鼻部吸入暴露）
注入・暴露直後，
24，48，96 時間後
BALF，病理観察で数倍の違いはなし
Li et al. 2007
MWCNT
（平均径 50 nm，平均長
さ 10 μm）
Kuming マウス
（雌，10 週齢，30 g）
5.0×10-2 mg/匹
（1.7 mg/kg a）
32.61 mg/m3
(6 hour /day)
注入・暴露直後
8，16，24 日後
肺病理（炎症）では吸入の方が軽度
Jacobsen et al.
2009
カーボンブラック
（注入：150, 700 nm
[DLS]）
（吸入： 45 nm（個数
50%径），331 nm（質量
50%径）[SMPS]）
apolipoprotein E ノッ
クアウトマウス
(性別記載なし，週齢
記載なし，体重記載
なし）
1.8×10-2, 5.4×10-2 mg/匹
平均 61.1 ± 3.3 mg/m3
(30 min, 90 min)
（鼻部吸入暴露）
注入 3，24 時間後，暴
露 24 時間後
肺の炎症については，気管内投与の方
が，吸入暴露よりも有害性が高かった．
Warheit et al
2005
SD ラット
TiO，6 種類
（雄，50 日齢，
（原粉： 290-440 nm b
（50%径）[SEM 観察]） 240-255 g）
（吸入：1.3-1.8 μm（空
気動力学中央径））
2.0, 10 mg/匹
(8, 40 mg/kg a)
1130-1310 mg/m3
(6 hour /day，6day/week，4
week)
注入 24 時間，1 週間，
1 ヶ月，3 ヶ月後
暴露直後，2 週間，
3,6,12 ヶ月後
質的に同様の有害性影響が観察された．
Morimoto et
al. 2010
Wistar 雄ラット
C60
（注入：30 nm（50%径） （雄，9 週齢，約 300 g）
[DLS]）
（吸入：95 nm (50%径)
[SMPS]）
0.1，0.2，1.0 mg/匹
(0.33，0.67，3.3 mg/kg)
0.12 mg/m3
(6h/day×5day/week×4
week)
注入・暴露終了後
3~6 ヶ月
吸入暴露の方がはるかに軽度
a
： 同じ用量単位で比較できるように，筆者らが換算した値
b
： 気管内投与用試料の粒径は記載されていないが，気管内投与試験・吸入暴露試験ともに，一次粒径はこのサイズと考えられる．
Ⅳ-30
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
４. 細胞毒性
C60 粒子の有害性を明らかにするための細胞試験（in vitro 試験）の報告は数多くあり，それら
の結果について以下に整理した．フラーレンの光励起特性による ROS 生成能が in vitro に及ぼす
可能性があるため，試験時の光照射条件についても整理した．ただし，光照射下での試験を行っ
ていると明記していない場合も多く，おそらくは暗条件下で試験されていると考えられるが，試
験の過程で光照射が起こっている可能性は否定できない．
4.1. 既存の文献
Scrivens et al. (1994) は，ベンゼンと THF とアセトンを用いて水中分散させたフラーレン粒子
（14C で標識した C60（*C60））を，20 nM～2 μM（0.0000144 mg/mL～0.00144 mg/mL）でヒト角化
細胞とヒト線維芽細胞に暴露させて細胞増殖率を観察したが，どの濃度においても影響は見られ
なかった．
Adelmann et al. (1994) は，ヒト肺胞マクロファージ（HL-60M）や BAM（ウシ肺胞マクロファ
ージ）に対するフラーレン（C60 と C70 の混合物，0.10 mg/mL）の影響を見るために，腫瘍壊死因
子（TNF），IL-6，IL-8 の測定を行った．4 時間および 20 時間培養した後に HL-60M および BAM
の C60 暴露群の細胞生存率は対照群の 60%になった．炎症系のサイトカイン濃度も，対照群と比べ
て大きく上昇していた．
Moussa et al. (1995) は，ミクロンサイズの C60 粒子（1 mg/mL）をヒト白血球に暴露させたとこ
ろ，貪食は観察されたものの，白血球の生存率（0～24 h）や LDH 活性は陰性対照群やグラファ
イト（1 mg/mL）と違いがなかった．
Sakai et al. (1995) は，トルエンとトリクロロメチルを用いて PVP で包摂した C60（99.9%）及び
C60 と C70 の混合品（92 : 8）の影響量をみたところ，最大用量（3.75×10-2 mg/mL）においても，
マウス BALB/3T3 A31-1-1 細胞に細胞毒性（発がんイニシエーション活性及びプロモーション活性）
は示されなかった（暗条件下）．
Tsuchiya et al. (1995) によると，トルエンとトリクロロメチルを用いて PVP により包摂した C60
粒子は，3.8×10-2 mg/mL 以上でラット胎児の胚芽細胞に対する細胞分化（軟骨形成）を促進すること
が観察された（0.30 mg/mL で対照群の 3.2 倍）．PVP のみの場合， C60 粒子の場合よりも細胞分化の
促進は低かった（PVP 4.0×10-2 mg/mL で対照群の約 1.5 倍）．一方，細胞増殖率は，C60 濃度が上がるに
つれて対照群と比べて低下していたが，1.2 mg/mL でも対照群の 50%以上あった．
Bullard-Dillard et al. (1996) は，ベンゼン，THF，アセトンを用いて調製した 14C 標識 C60（*C60）（平均
粒径: 300 nm）や 14C 標識アンモニウム塩誘導化 C60（*C60A）の分散液中でヒト角化細胞を培養し
たところ，高濃度（2.0 μM（1.44×10-3 mg/mL））で長時間（8 日間）の C60 の暴露は，ヒト角化細
胞の成長を約 50%抑制したが，光励起があった場合にはこの影響はほとんど見られなかったと報
Ⅳ-31
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
告している．
Tsuchiya et al. (1996a) は，PVP により水中分散させた C60 粒子をマウスの中脳細胞分化システム
に投与した．その結果，細胞分化と細胞増殖の抑制が観察された（IC50: 0.43, 0.47 mg/mL）．
Tsuchiya et al. (1996b) において，同様に PVP で包摂した C60 液を含む培地で SLC-ICR マウスの
胎仔の胚芽細胞を培養したところ，0.30 ～1.2 mg/mL で胚芽細胞に対する細胞分化（軟骨形成）を
促進することが観察された．細胞分化の促進が対照群の約 1.5 倍になる濃度は，ラットで 38×10-2
mg/mL だったのに対し，マウスでは 0.60 mg/mL であり，この違いは ROS に対する感受性の違いではな
いかと推察されている．
Baierl et al. (1996) は，ウシ肺胞マクロファージ（BAM）やマクロファージ状細胞 (HL-60M) を 100
μg/mL の C60，C60 製造時にできた煤，DQ12 石英（陽性対照（ドイツの標準結晶性シリカ））を含
む各培養液中で培養し，細胞毒性（LDH 活性）
，免疫作用（走化性活性），ROS 生成能を調べた．
C60 分散液は，氷冷しながら培養液中で 5 分間超音波処理して調製した．その結果，C60 は，細胞
毒性はほとんどなく，走化性活性も低く，ROS 生成能もほとんど影響ないことが分かった．一方，
DQ12 石英では LDH が対照群と比べて大きく上昇し，煤では光照射の影響で ROS 生成が確認さ
れた．
Ueng et al. (1997) は，ポリ水酸化 C60 誘導体（フラレノール-1）をラット肝ミクロソームへ投与
した結果，ベンゾ[a]ピレン，7-エトキシクマリン，アニリン，エリスロマイシンに対するモノオ
キシゲナーゼ活性が抑制され，その IC50 はそれぞれ 42，94，102，349μM（4.4×10-2, 9.9×10-2, 0.107,
0.367 mg/mL（フラレノールを C60H19(OH)10O9（分子量 1053）と仮定して算出）であった．フラレ
ノール-1 は水酸化ベンゾ[a]ピレンに対して非拮抗阻害を，7-エトキシクマリン-O-ジメチラーゼに
対しては混合型の阻害を示した．ラット肝ミトコンドリアへのフラレノール投与は，用量依存的
に ADP（Adenosine 5`-diphosphate: アデノシン 2 リン酸）脱共役を阻害し，ミトコンドリアの
Mg2+-ATP アーゼ活性を著しく阻害した（IC50：7.1 μM (7.5×10-3 mg/mL)）．これらの結果から，フ
ラレノール-1 は in vitro では P-450 依存性のモノオキシゲナーゼ活性およびミトコンドリアの酸化
的リン酸化反応を低下させることが分かった．
Kamat et al. (1998) は，γ-シクロデキストリンで包摂した C60（5.0×10-3mg/5.0×10-2 mg-protein）
を用いたラット肝ミクロソームに対する試験を行い，UV 照射下で脂質やタンパク質に対して酸
化的傷害が引き起こされることを観察した．抗酸化剤を用いた試験の結果，エネルギー移動によ
る Type II により生成する 1O2 がこの傷害の主な原因と考えられる．また，C60 や C60(OH)18 を用い
て同様の試験を行い，用量（2.5×10-2, 5.0×10-2, 0.10 mg/mg-protein）・光照射時間（5, 15, 60 min）
に依存的な脂質やたんぱく質の過酸化が確認された（Kamat et al. 2000）．この脂質過酸化は，カ
タラーゼやビタミン C，ビタミン E などの ROS 捕捉剤や抗酸化剤によって抑制された．
Sakai et al. (1999) は，マウスの BALB/3T3 A3 1-1-1 細胞に対する PVP で包摂した C60 の細胞毒性
と発がんイニシエーション活性について調べた．光照射なしの場合には 1.5×10-3～7.5×10-2 mg/mL で細
胞生存率に対照群と違いがなかったが，光照射時には 15 μg/mL で細胞生存率は対照群の 15%まで低
Ⅳ-32
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
下した．発がんイニシエーション活性については，一般的な二段階細胞形質転換試験でははっきりしな
かったが，改良二段階細胞形質転換試験では可視光照射下の C60 は 1.5×10-2 mg/mL で明らかなイニシ
エーション活性を示した．
Piotrovsky et al. (2000) は，PVP で包摂した C60 粒子の抗ウィルス剤としての適用可能性を明ら
かにするために，MDCK 細胞に対する細胞毒性と様々なウィルス（インフルエンザ A，B，単純ヘル
ペス，ヒトパラインフルエンザ ウィルスタイプ 3）に対する抗ウィルス活性を測定した．その結果，
1.6×10-5～8.0×10-2 mg/mL （本論文中では 0.8%C60 含有 C60/PVP を 10 mg/mL との記述）の濃度範囲に
おいて細胞毒性は確認されなかった．一方，1.65×10-3 ～4.05×10-2 mg/mL（本論文中では 0.33%～
0.81%C60 含有 C60/PVP を 0.50 mg/mL との記述）でウィルスに対する生物学的活性が観察され，C60/PVP
包摂化合物がウィルス形態形成の後期の膜依存段階を妨げる膜刺激抗ウィルス化合物としての作用を
持つことが分かった．
（分散方法は溶媒
Sayes et al. (2004) は，水中分散させた C60（顕微鏡観察から平均粒径 100 nm）
法もしくは水攪拌法と考えられるが，論文中に記述はない）と水溶性のフラーレン誘導体 3 種の，
ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）とヒト肝臓がん細胞（HepG2）に対する細胞毒性を LDH アッセイ及
び MTT アッセイにより測定した．その結果，HDF に対して，分散した C60 は，水溶性フラーレ
ン誘導体よりもはるかに強い毒性（LC50: 20ppb（2.0×10-5 mg/mL））を示しており，C60(OH)24 では
5,000,000ppb（5.0 mg/mL）でも LC50（半数致死濃度）に達しなかった．また，HepG2 でも同様の
結果が得られた．死滅した細胞においては，細胞膜における脂質過酸化に関わる損傷が認められ，
DNA の酸化やたんぱく質の酸化等は起こっていなかった．キサンチン/ヨードフェノール反応に
より C60 ナノ粒子が酸素ラジカルを生成していることを確認した．
Sayes et al. (2005) が THF を用いて水中分散させた C60 をいくつかの細胞に対して 48 時間暴露
させた後に LDH 活性を測定したところ，ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）とヒト肝臓がん細胞（HepG2）
と神経星状膠細胞（NHA）に対して細胞毒性を有していた（LC50 ：2-50ppb（2.0×10-6-5.0×10-5
mg/mL））．一方，どの細胞においても，C60 粒子への暴露は，ミトコンドリア活性や DNA 濃度に
影響を与えていなかった．一方，培養細胞中にあるマロンジアルデヒドの酸化により生成する
MDTA 濃度は C60 粒子への暴露によって，0.24 - 4.8ppb（2.4×10-7-4.8×10-6 mg/mL）で増加し，さら
に，240-2,400ppb（2.4×10-4-2.4×10-3 mg/mL）では劇的な増加が認められ，生体が生成する抗酸化
剤であるグルタチオン濃度も 240ppb（2.4×10-4 mg/mL）で上昇していた．膜の酸化に伴う蛍光も
時間経過とともに上昇していた．同様の試験を抗酸化剤である L-アスコルビン酸を加えて実施し
た場合には，細胞死も MDTA 濃度の上昇も観察されなかった．これは ROS 生成に伴う脂質過酸
化による細胞膜損傷が原因と考えられる．
Jia et al. (2005) によると，ヒト肺胞マクロファージに対して，SWCNT（単層カーボンナノチュ
ーブ（論文中では SWNT と記載））が 1.13×10-2 mg/cm2 で細胞毒性（MTT 活性）の増加が見られ
たのに対し，C60 では最大用量（0.226 mg/cm2）でも毒性確認できなかった．また，3.06×10-3 mg/cm2
以上の C60 では，マクロファージによる貪食が見られた．
Ⅳ-33
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
Isakovic et al. (2006a) は，ハツカネズミ L929 線維肉腫，ネズミ C6 神経膠腫，U251 ヒト神経膠
腫細胞系に対して，THF を用いて調製した C60（96.3 nm）や C60(OH)n を投与した．その結果，C60
ではネクローシスが観察されたが C60(OH)n では観察されなかったと報告している．
Isakovic et al. (2006b) は，ハツカネズミ L929 線維肉腫，マウスメラノーマ細胞株 B16，ネズミ
C6 神経膠腫，U251 ヒト神経膠腫細胞系に対して，γ 線照射をした THF 調製 C60 分散液（49.6 nm）
および γ 線照射をしなかった THF 調製 C60 分散液（41.7 nm）を投与した．その結果，γ 線照射を
しなかった THF 調製 C60 ナノ粒子分散液と比べて，γ 線を照射した C60 ナノ粒子分散液は，酸素
ラジカルを発生させず，ネクローシスも起さなかったと報告している．
Jacobsen et al. (2008) は，24kHz の超音波槽で 150W，1 時間超音波処理することで調製した C60
分散液を用いて，A549 肺胞上皮細胞を対象とした試験を行った．その結果，SWCNT と違い，24-72
時間後まで，どの細胞周期（G1, S, G2/M）でも，細胞数は陰性対照群と違いはなかった．ROS 生
成もカーボンブラックと比べて極めて低かった．
Ni et al. (2008) によると，THF を用いて調製した C60 粒子（90 - 100 nm）を二種類のがん細胞（B16，
SMMU-7221）に 24h 暴露させた時の IC50 は，それぞれ 65 ppb（6.5×10-5 mg/mL）及び 150 ppb（1.5×10-4
mg/mL）であった．ここで毒性の見られなかった 50 ppb（5.0×10-5 mg/mL）のフラーレンに γ 線照射下
（2~10 Gy）で暴露させたところ，がん細胞に対する明らかな抗増殖作用が見られた．
NEDO プロジェクト（P06041）において，Horie et al. (2010) は，培養液（10%FBS/DMEM）中
に分散させた 6.58×10-3~0.153 mg/mL の C60 ナノ粒子（光散乱強度平均径 200~210 nm, 数平均径
100~130 nm）中でヒト角化細胞 HaCaT とヒト肺がん細胞 A549 を培養して，影響を観察した．細
胞生存率やアポトーシス，ネクローシスには，最高用量（0.153 mg/mL）でも影響はなかった．一
方，細胞増殖率については，HaCaT 細胞で 6.79×10-2 mg/mL 以上，A549 細胞で 6.58×10-3 mg/mL
以上において有意な増殖率の減少が観察された．また，DCF（2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein）の
測定から，0.0679 μg/mL 以上において，HaCaT 細胞では 6 時間経過以降，A549 では 24 時間経過
後に ROS が有意に上昇していた．脂質の過酸化についても，全濃度で両細胞ともに有意な上昇が
みられた．
Ⅳ-34
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-8．フラーレンの in vitro 試験
文献
Adelman et al.
1994
Scrivens et al.
1994
Moussa et al.
1995
Sakai et al. 1995
Tsuchiya et al.
1995
Tsuchiya et al.
1996a
Tsuchiya et al.
1996b
Baiel et al. 1996
Bullard-Dillard
et al. 1996
a
：
C60 分散液の調製法
アーク放電で生成して
クロマト分離した後，マ
クロファージと共に 4 時
間超音波
ベンゼン，THF，アセト
ンを用いて調製
アーク放電で生成して
クロマト分離した後，マ
クロファージと共に 4 時
間超音波
トルエンとトリクロロメチ
ルを用いて PVP 包摂
化
トルエンとトリクロロメチ
ルを用いて PVP 包摂
化
トルエンとトリクロロメチ
ルを用いて PVP 包摂
化
トルエンとトリクロロメチ
ルを用いて PVP 包摂
化
氷冷しながら培養液中
で 5 分間超音波処理
ベンゼン，THF，アセト
ンを用いて調製
キャラクタ
ライズ
記載なし
光条件
試験対象
濃度・用量
記載なし
記載なし
記載なし
ミクロンサ
イズ
記載なし
肺胞マクロファージ
・ヒトマクロファージ状細胞
（HL60M）
・ウシ肺胞マクロファージ（BAM）
ヒト角化細胞
ヒト線維芽細胞
ヒト白血球
記載なし
×
記載なし
エンドポイント等
結果
0.1 mg/mL
細胞毒性（生存率）
炎症性サイトカイン
（TNF，IL-6，IL-8）
1.44×10-5～1.44×
10-3 mg/mL a
1 mg/mL
細胞増殖率
HL60M は 4 時間，BAM は 20 時間培
養後に細胞生存率が 60%に減少．炎
症性サイトカインの濃度は，対照群と
比べて大きく上昇．
どの濃度においても影響なし
細胞毒性（生存率）
影響なし
マウス BALB/3T3 細胞
3.75×10-4～3.75×
10-2 mg/mL
細胞形質転換
×
ラット胎児の胚芽細胞（LB）
～1.2 mg/mL
細胞分化（軟骨形成）
細胞増殖率
記載なし
記載なし
マウス中脳細胞分化システム
～0.6 mg/mL
細胞分化
細胞増殖
3.75×10-4～3.75×10-2 mg/mL でプロ
モーション活性及びイニシエーション
活性なし．
4.0×10-2 mg/mL 以上で細胞分化が
促進．0.30 mg/mL では対照群の 3.2
倍になった．
細胞分化と細胞増殖が抑制（IC50:
0.43，0.47 mg/mL）．
記載なし
記載なし
マウス BALB/3T3 細胞
～1.2 mg/mL
細胞分化（軟骨形成）
細胞増殖率
記載なし
記載なし
ウシ肺胞マクロファージ（BAM）
ヒトマクロファージ状細胞
（HL60M）
0.1 mg/mL
細胞毒性，免疫作用，
（走化性活性），ROS
生成能
平均粒径
300 nm
○，×
（Vis）
ヒト角化細胞
1.44×10-3 mg/mL b
細胞成長
0.3 mg/mL 以上では細胞分化が促
進．0.6 mg/mL では対照群の 1.5 倍に
なった．
C60，煤共に細胞毒性はほとんどなし．
C60 の走化性活性は，煤や石英と比べ
て低い．ROS 生成能についても，影響
ほとんどなし．
高濃度（2.0 μM（1.44×10-3 mg/mL））
及び長時間（8 日間）で細胞成長が約
50%抑制．光非照射下では毒性はほ
とんどなし
論文中の 20 nM～2 μM という記述から計算
b
： 論文中の 2.0 μM という記述から計算 (論文中では，調製部分では 2.1 μM，その他の箇所では 2.0 μM と記述されている)
Ⅳ-35
第Ⅳ章 有害性評価
表Ⅳ-8．フラーレンの in vitro 試験
文献
C60 分散液の調製法
Sakai et al. 1999
トルエンとトリクロロメチ
ルを用いて PVP 包摂
化
Kamat et al.
1998
メタノールを用いて γ シ
クロデキストリン包摂化
Kamat et al.
2000
篠原 直秀
(Cont.)
キャラクタ
ライズ
記載なし
光条件
試験対象
濃度・用量
エンドポイント等
○，×
（Vis）
マウス BALB/3T3 細胞
1.5×10-3～7.5 ×10-2
mg/mL
細胞毒性（生存率）
細胞形質転換
記載なし
光照射
（UV）
ラット肝ミクロソーム
5.0×10-3 mg/5.0×
10-2mg-protein
メタノールを用いて
C60，C60(OH)18 を γ シク
ロデキストリン包摂化
記載なし
ラット肝ミクロソーム
2.5×10-2， 5.0×10-2，
0.10 mg/mg-protein
Piotrovsky et al.
2000
トルエンとトリクロロメチ
ルを用いて PVP 包摂
化
記載なし
光照射
（UV，タ
ングステ
ンラン
プ）
記載なし
酸化的障害（脂質過酸
化，たんぱく質酸化障
害）
酸化的障害（膜の脂質
過酸化，たんぱく質過
酸化）
MDCK 細胞
ウィルス（インフルエンザ A，B，
単純ヘルペス，ヒトパライフルエ
ンザウィルスタイプ 3）
Sayes et al. 2004
記載なし
平均粒径
100 nm
記載なし
ヒト皮膚線維芽細胞（HDF），
ヒト肝がん細胞（HepG2）
細胞毒性試験： 1.6×
10-5～8.0×10-2
mg/mL*
抗ウィルス活性
1.65×10-3～4.05×
10-2 mg/mL c
2.4×10-7～2.4×10-3
mg/mL
c
可視光照射なしの場合には 1.5×10-3
～7.5×10-2 mg/mL で細胞生存率に
対照群と違いがなかったが，可視光
照射時には 1.5×10-2 mg/mL で細胞
生存率は対照群の 15%まで低下．改
良二段階細胞形質転換試験におい
て，可視光照射下においてのみ 1.5×
10-2 mg/mL で明らかなイニシエーショ
ン活性を示した．
光照射下で，脂質の過酸化とたんぱ
く質酸化障害を確認
光照射下で，用量・光照射時間依存
的に脂質やたんぱく質の過酸化が確
認された
細胞毒性（形態学的観
察）
生物学的活性（抗ウィ
ルス活性）
細胞毒性は最高用量でも観察されな
かった．
ウィルス形態形成の後期の膜依存段
階を妨げる膜刺激抗ウィルス化合物と
しての作用を持つ．
細胞毒性（膜損傷，細
胞死（LDH アッセイ，
MTT アッセイ））
HDF に対して，分散した C60（LC50: 2.0
×10-5 mg/mL）が，水溶性フラーレン
誘導体よりもはるかに強い細胞毒性を
示しており，C60(OH)24 では 5.0 mg/mL
でも半数致死量に達しなかった．
： 0.8%C60 含有 C60/PVP を 2～10,000 μg/mL 及び 0.33%～0.81%C60 含有 C60/PVP を 500 μg/mL という記述から計算
Ⅳ-36
結果
第Ⅳ章 有害性評価
表Ⅳ-8．フラーレンの in vitro 試験
文献
C60 分散液の調製法
篠原 直秀
(Cont.)
キャラクタ
ライズ
記載なし
光条件
記載なし
試験対象
濃度・用量
エンドポイント等
結果
肺胞マクロファージ
1.41 × 10-3 ～ 0.226
mg/cm2
細胞毒性（MTT 活性）
最大用量（0.226 mg/cm2 ）でも細胞
毒性（MTT 活性）は確認できなかっ
た．
48 時間暴露後，どの細胞に対して
も細胞毒性を有していた（LC50： 2.0
×10-6~5.0×10-5 mg/mL）．また，，ミ
トコンドリア活性や DNA 濃度には影
響を与えてなかった．ROS 生成に
伴う脂質過酸化による細胞膜損傷
が原因と考えられる．
C60 ではネクローシスが観察された
が，，C60(OH)n では観察されなかっ
た．．
Jia et al.
2005
培養液中でホモジナイザ
ー&超音波
Sayes et al.
2005
THF を用いて調製
記載なし
記載なし
ヒト皮膚線維芽細胞（HDF），
ヒト肝がん細胞（HepG2），
ヒト星状膠細胞（NHA）
2.4 × 10-7 ～ 2.4 × 10-3
mg/mL
細胞毒性（LDH 活性，
細胞死，脂質過酸化
反応）
Isakovic et
al. 2006a
THF を用いて調製
（C60(OH)n についても試
験）
平均粒径
(DLS)C60:
96.3 nm，
C60(OH)n: <0.5
nm
極力光
に当たら
ないよう
に試験
ハツカネズミ L929 線維肉腫，
ネズミ C6 神経膠腫，
U251 ヒト神経膠腫細胞系
細胞毒性（細胞生存率
（結晶バイオレット検
定），アポトーシス or
ネクローシス（血球流
計算分析），酸化ストレ
ス）
Isakovic et
al. 2006b
THF を用いて調製
試験中
は照射
なし
ハツカネズミ L929 線維肉腫，
マウスメラノーマ細胞株 B16
ネズミ C6 神経膠腫，
U251 ヒト神経膠腫細胞系
細胞毒性（LDH，アポ
トーシス，ネクローシ
ス），ROS，脂質過酸
化，細胞外シグナル調
節制御キナーゼ
(ERK)）
γ線照射をしなかった THF 調製 C60
ナノ粒子分散液と比べて，γ線を照
射した C60 ナノ粒子分散液は，酸素
ラジカルを発生させず，ネクローシ
スも起さなかった．
Mori et al.
2006
0.1%の Tween80 を含んだ
0.5%(w/v)CMC-Na 水溶液
を加えて懸濁
平均粒径：
γ線照射なし：
41.7 nm（DLS）
99 nm（AFM）
γ線照射あり：
49.6nm（DLS）
183 nm（AFM）
記載なし
C60: 1.6 × 10-5, 3.1 ×
10-5, 6.3×10-5, 1.3×
10-4, 2.5×10-4, 5.0×
10-4 mg/mL
C60(OH)n : 2.5 × 10-2,
5.0 × 10-2, 0.10, 0.20,
0.40, 0.80 mg/mL
1.25×10-4, 2.5×10-4,
5.0 × 10-4, 1.0 × 10-3
mg/mL
記載なし
チャイニーズハムスターの肺細
胞
1.5×10-3～5.0 mg/mL
細胞増殖抑制
Jacobsen et
al. 2008
24kHz の超音波槽で
150W，1 時間超音波処理
記載なし
A549 肺胞上皮細胞
2.78×10-3, 8.33×10-3,
2.5×10-2, 0.10 mg/mL
細胞周期ごとの細胞
数，ROS 生成能
（DFS），
6h，S9mix なし試験では全濃度で
IC50 なし，6h，S9mix あり試験では
2.317 mg/mL で ， 24h 試 験 で は
0.564 mg/mL で細胞増殖が 50%以
上抑制（IC50）
SWCNT と違い，24-72 時間後まで，
どの細胞周期（G1, S, G2/M）でも，
細胞数は陰性対照群と違いはなか
った．ROS 生成もカーボンブラックと
比べて極めて低かった．
MilliQ 水 中 ：
150, 700 nm
培地中： 311
nm
[DLS]
Ⅳ-37
第Ⅳ章 有害性評価
表Ⅳ-8．フラーレンの in vitro 試験
文献
C60 分散液の調製法
Ni et al.
2008
THF を用いて調製
Horie et al.
2010
0.1%CMC 水溶液を用いて
ビーズミルで粉砕・調製
篠原 直秀
(Cont.)
キャラクタ
ライズ
90~100 nm
100~130 nm
（数平均径）
200~210 nm
（光散乱強度
平均径）
光条件
試験対象
濃度・用量
エンドポイント等
結果
照射なしの 24h 暴露時の IC50 は，
6.5×10-5 mg/mL（B16）及び 1.5 ×
10-4 mg/mL （ SMMU-7221 ） で あ っ
た．5.0 ×10-5 mg/mL の C60 でガン
マ線照射をすると，有意にがん細胞
に対する抗増殖作用が確認され
た．
細胞生存率やアポトーシス，ネクロ
ーシスには，最高用量でも影響はな
かった．一方，細胞増殖率について
は，HaCaT で 6.79×10-2 mg/mL 以
上，A549 で 6.58×10-3 mg/mL 以上
で有意な影響が観察された．
また，6.79×10-2 mg/mL 以上で，
HaCaT では 6 時間経過以降，A549
では 24 時間経過後に ROS が有意
に上昇していた．
○，×
（γ 線）
がん細胞 B16，SMMU-7721
7.2×10-7 ～1.44×10-4
mg/mL
細胞生存率，アポトー
シス特性，ROS 生成
能，細胞径
記載なし
ヒト角化細胞 HaCaT
ヒト肺がん細胞 A549
6.6 × 10-3 ～ 0.153
mg/mL
細胞生存率，アポトー
シス，ネクローシス，細
胞増殖率，ROS 生成
能，脂質過酸化
Ⅳ-38
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
4.2. フラーレンの細胞毒性のまとめと議論
in vitro における細胞毒性は，あらゆる物質において用量を高くしていけば，いずれどこかのポ
イントで観察される現象であるといえる．また，細胞を直接暴露させるため，物質の生体内での動態
（移行や代謝）が反映されず，培養環境下での影響と生体中の各組織や臓器での影響は必ずしも同一と
は言えない．しかも，細胞毒性を引き起こす濃度は細胞によっても異なり，培養時間が長ければ毒
性が強く観察されることは自明である．これらのことから，in vitro 試験の使い方としては，個々
の試験結果自体を判断の材料に用いるというよりも，他の物質が対象の細胞に対して細胞毒性を
引き起こす濃度との比較により毒性が強いか弱いかを判断するのが適当と考えられる．
細胞毒性が確認されなかった報告（細胞毒性が出る濃度以下で試験）には，ヒト角化細胞やヒ
ト線維芽細胞（1.44×10-3 mg/mL, Scrivens et al 1994），ヒト角化細胞 HaCaT やヒト肺がん細胞 A549
（0.153 mg/mL, Horie et al. 2010），ヒト白血球（1 mg/mL, Moussa et al. 1995），BAM や HL-60M（0.10
mg/mL, Baierl et al. 1996），マウス BALB/3T3A3 1-1-1 細胞（7.5×10-2 mg/mL, Sakai et al 1999（光非
照射）），MDCK 細胞（0.080 mg/mL, Piotrovsky et al. 2000），肺胞マクロファージ（0.226 mg/m2, Jia
et al. 2005）などがある．一方，細胞毒性が確認されたという報告は，マウス BALB/3T3A3 1-1-1
細胞（1.5×10-2 mg/mL, Sakai et al 1999（光照射）），ヒト皮膚線維芽細胞（2.0×10-5 mg/mL (20ppb),
Sayes et al 2004），チャイニーズハムスター肺細胞（0.564 mg/mL（24 h 試験），Mori et al. 2006）等
が存在している．
これらの中で，Sayes et al. (2004, 2005) の報告では他の報告と比べて遥かに低濃度でグルタチ
オンの上昇がみられている．これは酸化ストレスの負荷を示している．しかし，同種の細胞で，
Scrivens et al. (1994)では細胞毒性が観察されていない．そのため，この Sayes et al. (2004, 2005) の
報告している細胞毒性は，THF を用いて調製した分散液に起因している可能性がある．THF を用
いて調製した C60 分散液は，THF を使用せずに調製した C60 分散液よりもバクテリア（Fortner et al.
2005）や水生生物（Lovern et al. 2006, Zhu et al. 2006）に対してはるかに強い毒性を示していたと
いう報告がある．Henry et al. (2007) は，これらの毒性が，C60 そのものではなく分散液中に残留
していた THF の分解生成物である γ-butyrolactone による脂質過酸化によって引き起こされていた
としている．これは，脂質過酸化が強く見られたとする Sayes et al. (2004, 2005) のヒト線維芽細
胞への試験における毒性メカニズムと類似している．Sayes et al. (2004, 2005) の酸化ストレスが
THF によるものでなかったとしても，C60 による細胞死が認められていることから，C60 による酸
化ストレスは抗酸化系の活性化により抑制される範囲内程度と考えることもできる．
また，光照射下において光非照射下では見られなかった低濃度での細胞毒性が観察されている
（マウス BALB/3T3 細胞（1.5×10-2 mg/mL））．Kamat et al. (1998, 2000) はフラーレンは光照射下
でラット肝ミクロソームに酸化的傷害を与えるとしており，光照射下ではフラーレンの ROS 生成
能により細胞毒性が強くなっている可能性が高いと考えられる．
また，既存の細胞毒性試験の中で C60 粒子の粒径を明記しているのは一部であり，明記してい
ない試験のほとんどがミクロンサイズと考えられる．バクテリアを対象とした試験（Lyon et al.
Ⅳ-39
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
2006）ではナノサイズの C60 粒子が，ミクロンサイズの C60 粒子より毒性が強くなる可能性が示唆
されているが，in vitro 細胞毒性試験においてはサイズと有害性の関係についての報告例はなかっ
た．
５．遺伝毒性
5. 1. フラーレンの遺伝毒性
5.1.1 フラーレン
Sera et al. (1996) は，PVP で包摂して水中分散させたフラーレン C60 を用いて，復帰突然変異試
験を行った．可視光に照射（400-600nm，100W，光源との距離 25cm，20 分間）したときのみ，
ラット肝ミクロソーム存在下のネズミチフス菌株 TA102, TA104（光感受性が高い菌株），YG3003
（光感受性の強い TA102 の修復酵素欠乏変異体）に対して変異原性があった．特に，YG3003 に
対しては変異原性が強いことが認められた．復帰突然変異は，3.0×10-2 mg/plate の試験まで用量依
存性が見られた．突然変異は，β-カロチン（ホスホリパーゼの捕捉剤）やパラブロモフェナシル
臭化物（ホスホリパーゼの阻害剤）の存在下で低下した．この結果から，C60 を可視光で照射する
ことによって一重項酸素が発生することや，その変異原性はラット肝ミクロソーム中の酸化され
たリン脂質が原因であることが示唆された．
Sakai et al. (1999) は，マウスの BALB/3T3 A3 1-1-1 細胞に対する PVP で包摂した C60 の細胞毒性
と発がんイニシエーション活性について調べた．光照射なしの場合には 1.5×10-3～7.5×10-2 mg/mL で細
胞生存率は対照群と違いがなかったが，光照射時には 1.5×10-2 mg/mL で細胞生存率は対照群の 15%
まで低下した．発がんイニシエーション活性については，一般的な二段階細胞形質転換試験でははっき
りしなかったが，改良二段階細胞形質転換試験では可視光照射下の C60 は 1.5×10-2 mg/mL で明らかな
イニシエーション活性を示した．
Babynin et al. (2002) は，アルコールを用いて調製した PVP で包摂した C60 分散液を用いて，復帰
突然変異試験を行った．菌株としては，ネズミチフス菌 （BA13 （hisG46 araD531 gal-uvrB/pKM101））
を用い， 8.0×10-4 mg/mL の条件で光照射なしの試験を， 4.0×10-4 mg/mL で光照射あり（40W，光源と
の距離 1 m，1~3 時間）の試験を行った．その結果，どの試験においても C60 による復帰突然変異は観察
されなかった．既存の文献では光照射下において復帰突然変異が起きているが，この違いについて，筆
者らは，C60 から発生する一重項酸素が試験結果に影響しており，当試験ではミクロソーム分画を用いて
いないことでこの影響が出なかったのではないかと考察している
Dhawan et al. (2006) は，2 通りで分散させたナノサイズの C60 分散液（①エタノール溶液からの
調製 [d=122 nm，ζ 電位＝-31.6 mV, 濃度=4.2×10-7~2.1×10-3 mg/mL]， 長時間攪拌法による調製
[d=178 nm，ζ 電位＝-13.5 mV, 濃度=2.2×10-8~1.1×10-4 mg/mL]）を用いて，ヒトリンパ球への単細
Ⅳ-40
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
胞ゲル電気泳動法（コメット法）により，遺伝毒性を評価した．どちらの分散液についても，フ
ラーレン濃度と遺伝毒性の間には強い相関が見られた．遺伝毒性が見られた最低濃度は水/C60 懸
濁液では 2.2×10-6 mg/mL，エタノール水懸濁液では 4.2×10-6 mg/mL であった．これら二つの濃度
に対するオリーブテールモーメント（OTM）は，それぞれ 1.54 ± 0.24，1.34 ± 0.07 であり，陰性
対照群の OTM の 0.98 ± 0.17 と統計的有意に異なっていた（P<0.05）．この遺伝毒性的反応につい
て筆者らは，C60 コロイド粒子もしくは水和化単分子に起因していると考え，以下に挙げる 3 つの
理由のうち 1 つもしくはその組み合わせにより引き起こされたと仮定している．① C60 粒子から
発生する酸素ラジカルにより細胞膜の透過性が上昇，② C60 粒子が DNA マトリックスに移動，
③ C60 粒子が DNA 損傷を引き起こす．
Mori et al. (2006) は，エームズテストと染色体異常試験を行い，フラーレンの遺伝毒性を評価
し た ． エ ー ム ズ 試 験 は ， ネ ズ ミ チ フ ス 菌 TA100, TA1535, TA98, TA1537 お よ び 大 腸 菌
WP2uvrA/pKM101 を用いて S9mix の存在下および非存在下でプレインキュベーション試験により
行ったところ（1.5×10-3~5.0 mg/plate），フラーレン処理群の異常なコロニー数は，S9 の有無にか
かわらず陰性対照群の 2 倍未満であった．染色体異常試験は，CHL/IU 細胞（チャイニーズハム
スターの肺）を用いて，6 時間（短時間処理アッセイ, S9mix ありなし [0.625~5.0 mg/mL]）もし
くは 24 時間（連続処理アッセイ [0.313~5.0 mg/mL]）の条件で試験が行われた．その結果，染色
体の構造異常および数的異常の細胞の発生率は，どの条件でも 5%未満であった．これらの結果
から，フラーレンは遺伝毒性を有しないと結論付けられた．
本間 (2008) は，0.5%CMC 溶液で懸濁した C60（ほとんどがミクロンサイズ）を用いて，チャ
イニーズハムスター由来の CHL 細胞における染色体異常試験を行った．最高濃度の 5 mg/mL ま
で染色体の構造異常は確認されなかったが，2.5 mg/mL 以上で倍数体細胞の有意な増加が確認さ
れた．この倍数体細胞の出現は，粒子の物理的要因による細胞質分裂阻害の可能性が考えられる
とされている．また，CHL 細胞における小核誘発性に関する試験を行ったが，有意な小核の誘発
はなかった．これらの結果から，C60 の遺伝毒性は極めて軽微だと結論づけている．
Jacobsen et al. (2008) は，超音波槽中で調製した 0.10 mg/mL の C60 分散液を用いてコメット試験
を行った．その結果，DNA 鎖切断は観察されなかった．ただし，ホルムアミドピリミジン-グリ
コシラーゼ（FPG）感度は 1.2 倍に上昇しており，プリン酸化が示唆された．突然変異体につい
ては，陰性対照と違いはなかった（わずかな減少）．これらのことから，カーボンブラックやディ
ーゼル粒子と比べて，in vitro における遺伝毒性は極めて低いと結論している．
Kato et al. (2009) は，C60 PVP 抱合体水溶液をスクアラン中に溶解させ，0.1 μm フィルターでろ過した
ものを用いて微生物復帰突然変異試験（ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）株 TA98, TA100,
TA1535, TA1537，大腸菌株 WP2 uvrA/pKM101）を行った．その結果，代謝活性化系の有無にかか
わらず，すべての菌株のすべての用量（0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0 mg/plate）において，溶媒対照群
の 2 倍以上の復帰変異コロニー数は認められなかった．
Totsuka et al. (2009)は，超音波（10 分）により調製した 0.05%Tween80 水溶液中 C60 分散液（ピ
Ⅳ-41
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
ーク径：234.1 ± 48.9 nm と 856.5 ± 119.2 nm （直径範囲：10.5 to 12,913.9 nm））を用いて，in
vitro コメット試験，in vivo 小核試験，gpt delta トランスジェニックマウスによる変異性試験を行
った．in vitro 小核試験では，全ての濃度（2.0×10-5~0.20 mg/mL）で用量反応的に小核の増加が確
認された（0.20 mg/mL では，10%が小核細胞）．コメット試験の結果では，2.0 mg の C60 投与 3 時
間後にカーボンブラックやカオリンよりも高頻度で C57BL/6J マウスの肺の DNA 損傷が引き起こ
されたのが分かった．ただし，24 時間後には C60 投与群における DNA 損傷は減少した．gpt delta
トランスジェニックマウスに対して，投与群と陰性対照群で体重変化に違いは見られなかった．
gpt delta トランスジェニックマウスの肺に，gpt の変異を増加させたが，Spi-では変異の増加は見
られなかった．ここで起きた変異は塩基転換変異が主なものであり，60%以上の置換が G:C 塩基
対で生じていた．
Xu et al. (2009) は，C60 分散液（1.0×10-4, 1.0×10-3, 1.0×10-2, 3.0×10-2 mg/mL）に暴露させた gpt delta
トランスジェニック（突然変異検出用遺伝子を導入した）MEF 細胞において，red/gam 遺伝子座
における突然変異を測定することで，C60 粒子の遺伝毒性を評価した．試験に用いた C60 粒子のサ
イズに関する記述はない．1.0×10-2 mg/mL においてのみ突然変異頻度は有意に増加（2.6 倍）して
いた（3.0×10-2 mg/mL 等の他の用量では有意差なし）．用量に相関して ONOO・の増加が観察され
（有意な差はなし）
，一酸化窒素合成酵素（NOS）阻害剤により ONOO・は対照群と同程度にな
ったため，ONOO・の生成が遺伝毒性の決定的なシグナル伝達事象である可能性があると結論付
けている．
NEDO プロジェクト（P06041）において，Shinohara et al. (2009b) は，CMC-Na を用いて分散さ
せたナノサイズの C60 を用いて微生物復帰突然変異試験（ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）
株 TA98, TA100, TA1535, TA1537，大腸菌株 WP2 uvrA/pKM101）を行った．その結果，代謝活性化
系の有無，光照射（蛍光灯 5000 lx, 1 h）の有無にかかわらず，すべての菌株のすべての用量（0.050,
0.10, 0.20, 0.40, 1.0 mg/plate）において，溶媒対照群に対して 2 倍以上の復帰変異コロニー数は認
められなかった．染色体異常試験でも，短時間処理法（非代謝活性化系および代謝活性化系），連
続処理法において，構造的染色体異常を有する細胞の出現頻度（ギャップを除く）は，それぞれ
0.5～2.0%と 0～1.0%の範囲であり，すべての用量で陰性対照群と比べて有意な増加は認められな
かった．倍数体の出現頻度に関しても，両処理法ともに有意な増加は認められなかった．また，
（雄，8 週齢，31.7
Tween80 を用いて分散させたナノサイズの C60 を ICR 系 SPF マウス（Crlj:CD1）
～41.4 g）に経口投与（2 回投与）した小核試験（22×2, 45×2, 88×2 mg/kg-bw）においても，2
回目投与 24 時間後，陰性対照群における小核出現頻度が 0.28%であったのに対して，被験物質投
与群の小核出現頻度は 0.18～0.26%であり，いずれの用量群においても陰性対照群と比べて有意
な増加は認められなかった．多染性赤血球についても同様に陰性対照群と比べて有意な減少は認
められなかった．
Ⅳ-42
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
5.1.2. フラーレン誘導体
Babynin et al. (2002)は，3 種類のフラーレン誘導体（① [61]ジメトキシフォスフォニル[61]カルボメトキ
シ-メタノ[60]フラーレン（誘導体１と表記），② [61]ジメトキシフォスフォリル[61]カルベトキシメタノフラーレ
ン[60]（誘導体 2 と表記），③ 1-メチル-2-(3,5-ジトレトブチル-4-ヒドロキシ-フェニル)-3,4-フラオピロリジン
（誘導体 3 と表記））をアルコールを用いて PVP で包摂することで水中分散させた試料を使って，復帰
突然変異試験を行った．菌株は，ネズミチフス菌 （BA13 （hisG46 araD531 gal-uvrB/pKM101））を用い，
0.0002, 0.0004, 0.0008, 0.0012 mg/mL の条件で光照射なしの試験を， 4.0×10-4 mg/mL で光照射あり
（40W，1m の距離，1~3 時間）の試験を行った．その結果，誘導体 2 が光照射下における復帰突然変異
を低減させることが確認された．他の 2 物質については，陰性対照群と有意な違いは見られなかった．
Mrdanovic et al. (2009) は，フラレノール C60(OH)24 を用いて，CHO-K1 細胞を対象とした in vitro
小核試験と染色体異常試験を行った．in vitro 小核試験は，3 時間試験の用量を 55.4, 110.8, 221.6 μM
(6.2×10-2, 0.125, 0.250 mg/mL)，24 時間試験の用量を 27.6, 55.4, 110.8 μM (3.1×10-2, 6.2×10-2, 0.125
mg/mL)として行った．その結果，24 時間後の小核の頻度は，対照群と比べて用量反応的に有意
に低かった．陽性対照の MMC（MitomycinC：マイトマイシン C）にフラレノールを加えて試験
した結果，3 時間後および 24 時間後共に，MMC に溶媒を加えただけの対照群と比べて，用量反
応的に小核の頻度が有意に減少していた．染色体異常試験でも同様の傾向が見られた．
5.2. 遺伝毒性のまとめ
フラーレン C60 が遺伝毒性を示したと報告しているのは，光照射下でのサルモネラ菌株の復帰
突然変異（Sera et al. 1996），染色体異常試験の倍数体の増加（本間 2008），コメットアッセイ
（Dhawan et al. 2006, Totsuka et al. 2009），in vitro 小核試験（Totsuka et al. 2009），突然変異検出用
遺伝子を導入した gpt delta トランスジェニック MEF 細胞における red/gam 遺伝子座における突然
変異（Xu et al. 2009, Totsuka et al. 2009）である．一方，遺伝毒性が見られなかったとしているの
は，復帰突然変異試験（Sera et al. 1996（光非照射下）, Babynin et al. 2002（光非照射下）, Mori et
al. 2006, Shinohara et al. 2009b, Kato et al. 2009），染色体異常試験（Mori et al. 2006, Shinohara et al.
2009b），小核試験（Shinohara et al. 2009b），コメットアッセイ（Jacobsen et al. 2008）である．
Shinohara et al. (2009b) の光照射下の復帰突然変異試験と染色体異常試験において強い遺伝毒
性を示す結果は得られていないが，酸化的損傷修復欠損株を用いた Sera et al. (1996) では光照射
下において遺伝毒性が認められている．光照射下で C60 が DNA のグアニン基を特異的に切断する
という報告は多数あり（Tokuyama et al. 1993, Boutorine et al. 1994），フラーレンが光照射下で一定
の遺伝毒性を有する可能性は十分にありうる．これらの研究結果から，フラーレンによる直接的
な DNA 損傷はおそらくないと考えられるが，ROS を介した DNA 損傷のメカニズムは考えられ
るといえる（Aschberger et al. 2010）．
Ⅳ-43
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-9．フラーレンの遺伝毒性に関する既往の文献
文献
Sera et al.
1996
Sakai et al.
1999
試験物質
C60PVP 抱合体
（PVP のクロロホルム
溶液を介して調製）
粒径
記述なし
実施試験
微生物復帰突然
変異試験
対象細胞等
ネズミチフス菌株 （TA102,
TA104, YG3003）
用量
～0.3 mg/mL
8-OH-dG 測定
（酸素フリーラジ
カルによる DNA
酸化的傷害）
2'-デオキシグアノシン
（2"-dG）
1.0×10-2, 0.1, 1.0,
10 mg
発がんイニシエ
ーション活性測
定
エームズ法
（微生物復帰突
然変異試験）
BALB/3T3 マウスの？？細
胞
1.5×10-3～7.5×10-2
mg/mL
ネズミチフス菌 （BA13
（hisG46 araD531
gal-uvrB/pKM101））
4.0×10-4mg/mL (光
照射)
8.0×10-4 mg/mL（光
照射なし）
EthOH/nC60： 4.2×
10-7, 4.2×10-6, 4.2×
10-5, 2.1×10-4,
4.2×10-4, 1.05×
10-3, 2.14.2×10-3
mg/mL
Aqu/nC60： 2.2×
10-8, 2.2×10-7, 2.2×
10-6, 1.1×10-5, 2.2×
10-5, 5.5×10-5, 1.1×
10-4 mg/mL
3.91×10-2, 7.81×
10-2, 0.156, 0.313,
0.625, 1.25, 2.5, 5.0
mg/plate
3.91×10-2, 7.81×
10-2, 0.156, 0.313,
0.625, 1.25, 2.5, 5.0
mg/mL
C60PVP 抱合体
（PVP のクロロホルム
溶液を介して調製）
C60PVP 抱合体
（PVP のアルコール
溶液を介して調製）
記述なし
Dhawan et
al. 2006
C60 水分散液
(エタノール法
[EthOH/nC60]及び長
時間（12 時間）攪拌
法[Aqu/nC60]）
EthOH/nC60：
121.8 ± 0.8 nm (pH5.6)
153.3 ± 4.1 nm (PBS 中(pH7.4))
Aqu/nC60：
178.0 ± 1.2 nm (pH5.6)
169.1 ± 1.2 nm (PBS 中(pH7.4))
コメット法
（アルカリ）
ヒトリンパ球
Mori et al.
2006
C60，C70 混合物
（0.1%Tween80&0.5
%(w/v) CMC-Na 水
溶液により調製）
記述なし
エームズ法
（微生物復帰突
然変異試験）
記述なし
染色体異常試験
ネズミチフス菌 （TA100,
TA1535, TA98,TA1537)
大腸菌
（WP2uvrA/pKM101）
CHL/IU 細胞 （チャイニーズ
ハムスターの肺細胞）
Babynin et
al. 2002
記述なし
Ⅳ-44
結果
S9 存在下で，C60 は可視光照射下でのみ弱
い変異原性を有していた．C60 の TA102 に対
する変異原性は，用量や可視光照射時間と
相関があったが，陽性対照群のメチレンブル
ーと比較すると低かった．
8-OH-dG の生成は，用量相関性がある．
8-OH-dG の生成は明らかに 25 時間まで増加
し，その後減少した．ミクロソームもしくはリノレ
インの存在下において，8-OH-dG の生成は
明らかに増加．
1.5×10-2 mg/mL で明らかなイニシエーション
活性を示した．
既存の文献と違い，3 時間までの光照射で
4.0×10-4 mg/mL の C60 による遺伝子復帰突
然変異は確認されなかった．また，光照射な
しの条件において， 8.0×10-4 mg/mL の C60
は，陰性対照群と違いは見られなかった．
統計的有意に濃度に比例してヒトリンパ球へ
の DNA 損傷を与えていた（コメット法のパラメ
ーターであるオリーブテールモーメント
（OTM），テール DNA，テール長さによる測
定）同一濃度では，毒性は EthOH/nC60 より
aqu/nC60 で高かった．
異常なコロニー数は，陰性対照群の 2 倍未満
⇒ in vitro では遺伝毒性なしと結論
染色体異常の発生率はどの濃度でも 5%未
満 ⇒ in vitro では遺伝毒性なしと結論
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-9．フラーレンの遺伝毒性に関する既往の文献
(Cont.)
文献
Jacobsen et
al. 2008
試験物質
C60 分散液
（超音波(12 分)で調
製）
粒径
MilliQ 水中： 150, 700 nm
培地中： 311 nm
実施試験
コメット法
対象細胞等
ヒト肺胞上皮細胞 A549
用量
0.10 mg/mL
Kato et al.
2009
C60 PVP 抱合体スク
アラン溶液
（0.1 μm フィルターで
ろ過）
C60 水分散液
（0.05%Tween80 水
溶液，超音波(10 分)
で調製）
記述なし
微生物復帰突然
変異試験
ネズミチフス菌（TA98,
TA100, TA1535, TA1537）
大腸菌（WP2uvrA/pKM101）
0.313, 0.625, 1.25,
2.5, 5.0 mg/plate
ピーク：234.1 ± 48.9 nm と 856.5
± 119.2 nm （ 範 囲 ： 10.5 to
12913.9 nm） [DLS 法]
in vitro 小核試験
ヒト肺胞上皮細胞 A549
コメット法
（アルカリ）
変異試験
C57BL/6J マウス（雄，週齢記
載なし，体重記載なし）
gpt delta トランスジェニックマ
ウス（雄，週齢記載なし，投
与 12 週後の陰性対照群の
体重：31.1 ± 1.8 g）
gpt delta trangenic MEF 細胞
2.0×10-5, 2.0×10-4,
2.0×10-3, 2.0×10-2,
0.20 mg/mL
5.0×10-2, 0.2 mg/匹
（3, 24 時間）
0.2 mg/匹
（単回投与，4 回投
与）（投与 8, 12 週間
後に観察）
1.0×10-4, 1.0×10-3,
1.0×10-2, 3.0×10-2
mg/mL
Totsuka et
al. 2009
Xu A et al.
2009
C60 水分散液
（水攪拌法（60 日））
記述なし
red/gam 遺伝子
座における突然
変異測定
Ⅳ-45
結果
DNA 鎖切断は観察されなかった．ただし，ホ
ルムアミドピリミジン-グリコシラーゼ（FPG）感
度は 1.2 倍に上昇しており，プリン酸化が示
唆された．突然変異体は，陰性対照と違いは
なかった(わずかな減少)．これらから，カーボ
ンブラックやディーゼル粒子と比べて，in
vitro における遺伝毒性は極めて低いと結論
している．
代謝活性化系の有無にかかわらず，すべて
の菌株のすべての用量において，溶媒対照
群に対して 2 倍以上の復帰変異コロニー数
は認められなかった．
in vitro 小核試験では，全ての濃度（2.0×
10-5 ~0.20 mg/mL）で用量反応的に小核の増
加が確認された（0.20 mg/mL では，10％の小
核細胞）．コメット試験の結果，C57BL/6J
マウスの肺に DNA 損傷を引き起こした．
また，gpt delta トランスジェニックマウスの肺
に，gpt の変異を増加させたが，Spi-では変異
の増加は見られなかった．
1.0×10-2 mg/mL においてのみ突然変異頻
度は有意に増加（2.6 倍）．用量に相関して
ONOO・の増加が観察され（有意な差は全く
なし），一酸化窒素合成酵素（NOS）阻害剤
により ONOO・は対照群と同程度まで減少．
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-9．フラーレンの遺伝毒性に関する既往の文献
文献
Shinohara et
al 2009b
試験物質
C60 水分散液
（0.1%CMC-Na 水溶
液）
C60 水分散液
（0.1%Tween80 水溶
液）
粒径
50%ile 40 nm
95%ile 120 nm
50%ile 30 nm
95%ile 80 nm
(Cont.)
実施試験
微生物復帰突然
変異試験
対象細胞等
ネズミチフス菌（TA98,
TA100, TA1535, TA1537）
大腸菌（WP2uvrA/pKM101）
用量
5.0×10-2, 0.10, 0.20,
0.40, 1.0 mg/plate
染色体異常試験
CHL/IU 細胞 （チャイニーズ
ハムスターの肺細胞）
2.5×10-2, 5.0×10-2,
0.10 mg/mL
小核試験
ICR 系 SPF マウス(Crlj:CD1)
（雄，8 週齢，31.7～41.4 g）
経口投与（2 回投与）
22×2, 45×2, 88×2
mg/kg-bw
Ⅳ-46
結果
代謝活性化系の有無，光照射の有無にかか
わらず，すべての菌株のすべての用量にお
いて，溶媒対照群に対して 2 倍以上の復帰
変異コロニー数は認められなかった．
短時間処理法（非代謝活性化系および代謝
活性化系），連続処理法において，構造的染
色体異常を有する細胞の出現頻度（ギャップ
を除く）は，それぞれ 0.5～2.0%および 0～
1.0%の範囲であり，すべての用量群で有意
な増加は認められなかった．また，倍数体の
出現頻度に関しても両処理法ともに有意な増
加は認められなかった．
2 回目投与 24 時間後，陰性対照群における
小核出現頻度が 0.28%であったのに対して，
被験物質投与群の小核出現頻度は 0.18～
0.26%であり，いずれの用量群においても陰
性対照群と比べて有意な増加は認められな
かった．多染性赤血球についても同様に陰
性対照群と比べて有意な減少は認められな
かった．
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
有意性を示す
Sakai et al. 1999
-3
-2
発がんイニシエーション活性試験（1.5×10 ～7.5 ×10 mg/mL）
粒径記載なし
15 ×10-3 mg/mLで明らかなイニシエーション活性を示した．
Xu et al. 2006
-4
-2
粒径記載なし
red/gam遺伝子座における突然変異測定（1.0×10 ～3.0×10 mg/mL）
1.0×10-2 mg/mLにおいてのみ突然変異頻度は有意に増加（2.6倍）．
Dhawan et al. 2006
体積平均径 153.3 ± 4.1 nm（EthOH/nC60 ）
体積平均径169.1 ± 1.2 nm （Aqu/nC60 ）[DLS（動的光散乱測定）]
コメットアッセイ
-7
-3
（4.2×10 ～2.1×10 mg/mL （EthOH/nC60））
-8
-4
（2.2×10 ～1.1×10 mg/mL （Aqu/nC60 ） ）
-6
-6
4.2×10 mg/mL及び2.2×10 mg/mLでオリーブテールモーメント（OTM）が有意に変
化
特定条件下で弱い変異原性
Sera et al. 1996
微生物復帰突然変異試験（～0.3 mg/mL）
粒径記載なし
S9存在下で，可視光照射下でのみ弱い変異原性を有していた．
極めて軽微な毒性を示す
本間ら 2008
染色体異常試験，小核試験
（～5.0 mg/mL）
ミクロン粒子（数%はナノ粒子）
[顕微鏡観察]
C 60 の遺伝毒性は極めて軽微だと結論．
Jacobsen et al. 2008
コメット法
（0.1 mg/mL）
311nm [DLS（動的光散乱測定）]
遺伝毒性は極めて軽微だと結論．
遺伝毒性観察されず
Babynin et al. 2002
エームス試験
-4
（～8×10 mg/mL）
粒径記載なし
遺伝毒性なし．
Kato et al. 2009
粒径記載なし
微生物復帰突然変異試験
（～5.0 mg/mL）
遺伝毒性なし．
Mori et al. 2006
粒径記載なし
エームス試験，染色体異常試験
-2
（3.91×10 ～5.0 mg/plate），（3.91×10 ～5.0 mg/mL）
-2
Shinohara et al.2009
遺伝毒性なし．
体積50%ile径 30～40 nm
体積95%ile径 80～120 nm [DLS（動的光散乱測定）]
微生物復帰突然変異試験，染色体異常試験，小核試験
-2
-2
（5.0×10 ～1.0 mg/plate, 2.5×10 ～0.1 mg/mL, 22 ～ 88 mg/kg-bw）
どの試験においてもC 60の遺伝毒性は観察されず．
10
100
1000
10000
粒径［nm］
図Ⅳ-8．フラーレンの遺伝毒性に関する既往の試験における粒子サイズ
Ⅳ-47
100000
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
６．その他の試験
6.1. 生殖発生毒性
Tsuchiya et al. (1996a)は，PVP を用いて分散した 25, 50, 137 mg/kg の C60 を妊娠 10 日の ICR マウ
ス（N=2）に腹腔内投与し，投与 18 時間後の胎児について観察した．137 mg/kg 投与群では，全
胎児が死亡した．50 mg/kg 投与群では，C60 は明らかに卵黄嚢まで到達しており，50%の胎児で頭
や尾に奇形が見られた．また，妊娠 11 日の ICR マウスの胎児の中脳細胞を用いた試験では，細
胞分化および増殖に対する IC50 は 0.43 mg/mL および 0.47 mg/mL だった．これは，C60 に起因する
活性酸素種による影響と推察されている．Ema et al. (2010)によると，C60 の発生毒性実験結果は、
トリパンブルー（TB）の催奇形性実験の結果と類似している．TB は卵黄嚢に沈着して胚への栄
養供給を妨げることで，奇形を発現することが広く知られており，げっ歯類の妊娠早期における
卵黄嚢の肺への影響供給への重要性がヒトとげっ歯類で異なるため（塩田 1992, 日本トキシコ
ロジー学会教育委員会 2009）、TB の催奇形性はヒトには当てはまらないとされている（Nielsen
et al. 2001）．これらを考え合わせると，上記の研究結果は C60 のヒトに対する発生毒性を示すも
のではないと結論付けることができる．
6.2. 経口暴露毒性
6.2.1
フラーレンの経口毒性試験
Mori et al. (2006) は，単回経口投与したときの LD50 を求めるために，10 mL/kg の少量の賦形剤
（0.1%の Tween80 を含んだ 0.5% (w/v) CMC-Na 水溶液）を加えて懸濁させた C60 分散液 2,000
mg/kg-bw を SD ラット（雄/雌，6 週齢）に投与した．投与後 1～15 日の間で，対照群と投与群の
間に体重変化における差は見られなかった．投与 6 時間後と 2 日後にフラーレンの色のついた糞
が投与群で見られたが，対照群と投与群ともに異常な症状等は一切見られなかった．
NEDO プロジェクト（P06041）において，Shinohara et al. (2009) は，0.1%Tween80 でナノサイ
ズに調製した C60 分散液（50%ile: 30 nm; 95%ile: 80 nm）を ICR 系 SPF マウス (Crlj:CD1)（雄/雌，
7 週齢，29.9～34.6 g/23.1～27.1 g）に 22, 45, 88 mg/kg-bw で二回投与を行い（24 時間間隔），一回
目の投与から 48 時間後までの間に，全てのマウスで，死亡や異常行動等は観察されなかった．
6.2.2 フラーレン誘導体の経口暴露毒性
Chen et al. (1998) は，水溶性が高く生体内でフリーラジカル除去剤や抗酸化剤となると考えら
れている，4～6 個のブチルスルホン酸ナトリウム基を持ったポリアルキルスルホン酸 C60（FC4S:
（雌，5~6 週齢，145±15 g）に
C60((CH2)4SO3Na)4-6）について，SD CD ラット（Crl:CD® (SD)BR)）
対する急性毒性試験を行った．50 mg/mL の水溶液を用いて 2,500 mg/kg での単回投与後 1~12 日
の間，どのラットも異常行動や死亡はみられず，経口暴露による急性毒性はないとしている．
Ⅳ-48
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-10．フラーレン及びフラーレン誘導体の経口毒性に関する既往の文献
文献
Mori et al. 2006
試験物質
C60 a 水分散液
Shinohara et al.
2009
Chen et al. 1998
C60 水分散液
ポリアルキルスルホン酸 C60
C60((CH2)4SO3Na)4-6
粒径
記載なし
b
50%ile 30 nm
95%ile 80 nm
水溶液
対象動物
SD ラット
用量（暴露濃度）
2,000 mg/kg-bw
観察期間
投与後 1-15 日
ICR 系 SPF マウス
(Crlj:CD1)
SD 雌性ラット
22×2, 45×2, 88×2
mg/kg-bw
2,500 mg/kg
a
初回投与後 2 日
エンドポイント等
死亡，異常行動
体重変化
死亡，異常行動
結果
なし
対照群と違いなし
なし
投与後 1-12 日
死亡，異常行動
なし
： 10mL/kg の少量の賦形剤（0.1%の Tween80 を含んだ 0.5%(w/v) CMC-Na 水溶液）を加えて懸濁した．
b
： 論文中に説明はないが，ミクロンサイズの粒子と思われる．
Ⅳ-49
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
6.3 皮膚への影響
Nelson et al. (1993) は，C60 と C70 の混合物（6:1）のベンゼン溶液（1 mg/mL）を CD-1 マウス（雌，
7～9 週齢）の背中の皮膚に塗布して，短期および中期のエンドポイントについて観察した．短期
のエンドポイントは，表皮のオルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）活性と表皮 DNA 合成への影響
とした．表皮の ODC 活性は，200 μg の塗布 6 時間後にわずかに上昇したが，72 時間後には陰性対
照群と全く違いはなかった．表皮 DNA 合成は，全く陰性対照群と違いはなかった．中期エンドポ
イントとして，7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン（DMBA）によりイニシエーションした皮膚
への塗布による腫瘍のプロモーション作用を観察したが，24 週間反復塗布後にも腫瘍形成は見ら
れなかった．
Huczko et al. (1999) は，フラーレンを異なる含有量で含む煤を，アーク放電法の条件を変える
ことで生成し（C60 含有率 0, 0.6, 14.8 wt%），その水中分散液を調製して，2 種類の皮膚への毒性
試験に用いた．30 人の被験者を対象にパッチテストを行い，96 時間後まで皮膚を観察したところ，
全て陰性であった．また，アルビノラビットを用いた改良 draize 法では，0.2 mL の水中分散液を
ラビットの目に滴下し，24, 48, 72 時間後に観察したが，異常な結果は見られなかった．これらの
ことから，フラーレンを含む煤を扱う作業は，皮膚の刺激やアレルギーに関わるリスクはないと
考えられる．
Moriguchi et al (1999)は，ヘアレスマウス（雌，10 週齢，体重記載なし）の背中にトルエンで溶
解させた 1.25 mM の C60 を 100 μL（C60 量で 9.0×10-2 mg）塗布し，30 分後に 35 秒間の UVA 照射
を週 3 回 20 週間，計 60 回行い，さらに 20 週間観察を続けた．急性の影響としての紅斑形成の促
進は UVA 照射 20 週終了後に全てのマウスで認められ，さらに 20 週間後にも 25%のマウスで紅
斑形成がわずかに認められた．一方，皮膚がん発生は誘発されなかった．
Aoshima et al. (2009) は，ニホンシロウサギ（雄，12 週齢）の毛を剃った背中に，0.5 g のポリ
プロピレングリコール中の C60, C70 混合液を塗布した試験（24 時間塗布後 48 時間観察）や，25 mg
の C60 を繰り返し塗布する試験（8 および 15 日後観察）， 100 mg の C60 を角膜に滴下して 24 時
間の UVA 照射を行った試験（4 日間観察）などを行ったが，いずれにおいても C60 による影響は
観察されなかった．また，モルモット（雄，7 週齢）を対象に 50 mg の C60 の皮下への注射を行
った過敏性試験（光照射あり（10 J/cm2，30 分間），光照射なし）や，7.5 mg の C60 の皮膚への塗
布後に長波長の光照射（11.2 J/m2，50 分間）を行った試験に関する接触光毒性試験においても，
C60 による影響は全く見られなかった．また，22 歳～56 歳の男女を対象とした上腕部腹側皮膚パ
ッチテスト（100 mg，24 時間塗布後，1 および 24 時間後観察）も行い，影響が見られなかった．
Ito et al. (2010) は，PVP を用いて水中分散した C60 にアスコルビン酸（AA）を混ぜて ddY マウ
ス（雄，4 週齢）の背中に塗布してから UVB 照射を行い，塗布なしの場合と比較した．その結果，
フラーレン（1%）と AA（2%および 5%）を塗布後に UVB 照射した群では，UVB 照射後の紅班
数や ROS インデックスが，塗布なしの UVB 照射群に比べて有意に減少していた．また，皮膚に
おける炎症も観察されなかった．
Ⅳ-50
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
Kato et al. (2010) は，46, 53, 57 歳のコーカサス女性を起源とする細胞を用いて 3D ヒト皮膚モ
デル（表皮，真皮，受容溶媒）を作成し，250 ppm のリポソーム細胞膜に組み込まれた C60 (76 nm)
（89.7%大豆油，10%ステロール，0.3%フラーレン），0.4 mL（C60 量では 2.4×10-4 mg）に暴露さ
せ，UVA 照射（76 J/cm2）を行った．皮膚への UV 照射によって生じた，コラーゲン type I/IV の
分裂や DNA 鎖切断，核凝縮，核崩壊等が，リポソーム細胞膜に組み込まれた C60 によって明らか
に抑制された．一方，HPLC 分析の結果，C60 を暴露させた表皮から C60 が検出されたが，真皮か
らは検出されなかったため，皮膚静脈を経由して全身へ移行する可能性は低いことが示唆された．
これらのことから，リポソーム細胞膜に組み込まれた C60 は UVA 保護/抗酸化化粧品として有用
なことが示された．
これまでに報告されている論文では，フラーレンの経皮暴露による短期および中期の皮膚に対
する有害性影響は確認されていない．それどころか，UV 照射により引き起こされる皮膚への傷
害を低減させる効果もいくつか報告されている．また，フラーレンの経皮暴露後真皮まで移行す
ることはないとされており，皮膚以外への移行及び有害影響の恐れは小さいと考えられる．
Ⅳ-51
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-11．フラーレンおよびフラーレン誘導体の皮膚への影響に関する既往の文献
文献
Nelson et
al. 1993
試験物質
C60，C70 混合物
（6:1）
[ ベンゼン溶液
1 mg/mL]
光条件
-
試験対象
用量
CD-マウス
0.20 mg
（雌，7-9 週齢，
体重記載なし）
エンドポイント
等
結果
表皮のオルニ
チンデカルボ
キシラーゼ活
性を計測
6 時間後に ODC 活性を
わずかに上昇させてい
るのみ．72 時間後には
ポジコンの TPA のよう
に明らかな上昇はみら
れなかった．
陰性対照群と違いはな
かった．
変化は確認されなかっ
た
急性の影響として，紅斑
形成の促進が認められ
た，皮膚がん発生は誘発
されなかった．
表皮 DNA 合成
の定量
顕微鏡観察
Moriguchi
et al. 1999
C60 トルエン溶液
Huczko et
al. 1999
フラーレンを含
む煤の水中分散
液
塗布 30 分後
に 光 照 射
（UVA）
（14.2 W/m2,
35 秒間）
（3 回/週×20
週間）
-
ヘ ア レ ス マ ウ 9.0 mg×10-2 /a
(1.25 mM×
ス
（雌，10 週齢， 100 μL)
体重記載なし） [30 秒以内]
（3 回/週×20
週間）
ヒト （30 人）
0，0.6，14.8 wt%
アルビノラビ
ット
Aoshima et
al. 2009
C60 & C70 混合物
光（UVA）照
（ポリプロピレ 射あり，光照
ングリコール中） 射なし
ニホンシロウ
サギ
（雄，12 週齢，
体重記載なし）
初期皮膚過敏
性試験： 0.5 g
累積皮膚過敏
性試験： 20 mg
眼 刺 激 性 試
験：100 mg
モ ル モ ッ ト 過敏性試験：
（雄，7 週齢， 50 mg
体重記載なし） 接 触 光 毒 性 試
験： 7.5 mg
ヒ ト （ 男 女 ， 100 mg
22~56 歳）
，
Ito et al.
2010
C60 PVP 包摂体
(0.5wt%)
光 (UVB) 照
射あり
(紅班試験：
700 J/m2 ，
ESR 分 析 ：
5,000 J/m2)
ddY マウス
1.0×10-4, 5.0×
（雄，4 週齢， 10-4, 2.5 × 10-3,
体重記載なし） 1.25 × 10-2
mg/cm2 b
(0.05wt%, 0.2,
1.0,
5.0,
25wt% ， 100
mg/cm2)
Kato et al.
2010
リポソーム細胞
膜に組み込まれ
た C60 (76 nm)
(89.7% 大 豆 油 ，
10%ステロール，
0.3%フラーレン)
光(UVA)照射
あり
(4 J/cm2 を 95
秒間の照射
を 4 日間に
19 回（総量
76J/cm2）)
3D ヒト皮膚モ 2.4 × 10-4
デル（表皮，真 mg/1.77 cmc
皮，受容溶媒）
（ 起 源 は 46,
53, 57 歳のコー
カサス女性）
紅斑形成，皮膚
がん
（暴露終了後
20 週間観察）
皮膚刺激，アレ
ルギー過敏性
[パッチテスト
96 時間観察]
改良 Draize 法
（ウサギの眼
に 0.2 mL の分
散液滴下） [24,
48, 72 時間後]
皮膚過敏性，眼
刺激性試験，
全て陰性反応だった
72 時間後までウサギの
目に異常は観察されな
かった．
眼刺激性試験の，滴下後
に目を洗った群でわず
かに影響が見られたこ
とを除いて，いずれの試
験においても，C60 によ
る影響は見られず．
皮膚光過敏性，
接触光毒性
上腕部腹側皮
膚パッチテス
ト
UVB 照射 48 時
間後の紅班観
察
UV 照射による
DNA 鎖切断等
の影響，真皮や
その下層への
浸透確認
C60（1%）とアスコルビ
ン酸（2%および 5%）を
塗布した群では，塗布な
しの群に比べて，
UVB 照射後の紅班数や
ROS インデックスが有
意に減少していた．ま
た，皮膚の炎症も観察さ
れなかった．
皮膚への UV 照射によっ
て生じた，様々な有害性
影響が，C60 によって明
らかに抑制された．ま
た，C60 を暴露させた表
皮では C60 が検出された
が，真皮では検出されな
かった．
a
： 論文中の 1.25 mM を 100 μL という記述から計算，b： 論文中の 0.05wt%のフラーレン液を 0.2, 1.0, 5.0, 25
w/w%含んだ液を 100 mg/cm2 塗布したという記述から計算，c： 論文中の 400 μL of 16.7 μM から計算，d 論文
中の 500 μL of 200 μg/mL から計算
Ⅳ-52
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
6.4. 腹腔内投与試験・静脈内投与試験
6.4.1 フラーレンの急性・亜急性毒性（腹腔内投与試験）
Moussa et al. (1996) は，2,500, 4,000, 5,000 mg/kg-bw でミクロンサイズ（2 μm 以下の結晶の
10~100 μm の凝集体）の C60 水分散液（0.02%Tween80, 0.02%CMC, 0.9% NaCl）を，スイスマウス
（雄，20±2 g）に腹腔内投与した．その結果，観察期間の最終日である 7 日後まで死亡や異常な
行動は見られなかった．7 日後の時点では最大用量投与群（5,000 mg/kg; N=5）において体重増加
が 49±5%と，対照群の 35±3%に比べて有意に大きく，肝臓と脾臓の重量は対照群と比較してそ
れぞれ 15.5%と 45.0%増加していた．4,000, 5,000 mg/kg-bw は，腹腔内投与による吸収能を超える
投与量であったことから，これ以上の容量での投与の必要がないことが確認された．
Gharbi et al. (2005) は，ミクロンサイズの C60 水分散液による， 250, 500, 2,000 mg/kg-bw での
Wistar ラット（雄，200±10 g）への腹腔内投与試験を行った．投与後 1～21 日の間で，肝臓への
着色以外の顕著な変化は見られず，炎症や線維化はなかった．
Popov et al. (2008) は，C60 を PVP で包摂して可溶化させた水溶液（0.5～0.6% C60）の 10%液および
25%液 1mL を Wistar ラット（雄）に単回腹腔内投与し（投与量を換算すると 3.5, 8.9 mg/kg），投与 3
日後と 7 日後に解剖した．溶媒のみを投与した群（対照群）と C60 投与群の間では，体重変化や
状態の変化に違いはなかった．スクロース α-グルコシダーゼ，α-グルコシダーゼ，膜アラニルア
ミノペプチダーゼが，8.9 mg/kg 投与群の 7 日後で一部上昇が見られた．各組織観察（大脳，心筋，
肺，肝臓，脾臓，腎臓）の結果，PVP 溶液のみを投与したグループのものと比べて，C60 投与群
で異常な所見は見られなかった．これらから，フラーレン/PVP 抱合体は無毒だと結論付けられる
としている．
6.4.2 フラーレン誘導体の急性・亜急性毒性（腹腔内投与試験・静脈内投与試験）
Rajagopalan et al. (1996) は，SD ラット（雄，287±12 g）に水溶性の p,p’-ビス-(2-アミノ-エチル)
ジフェニル C60 のビス(モノスクシンイミド)誘導体（MSAD-C60）を静脈内注射し，急性毒性の観
察を行った．15 mg/kg の用量の MSAD-C60 では影響は見られなかったが，25 mg/kg の用量では息
切れやラットの暴力的行動が観察され，5 分以内に死亡した．対照の DMSO（ジメチルスルホキ
シド）投与群では毒性は観察されなかったことから，MSAD-C60 がこれに関与していると考えら
れるが，50 mg/kg/day の MSAD-C60 を 6 日間連続でマウスに投与しても毒性が見られなかったと
いう報告もあり，著者らは更なる有害性試験を行う必要があるとしている．
（雌，5 週齢，140±10 g）を使っ
Chen et al. (1997) は， 若い SD CD ラット（Crl:CD® (SD)BR）
てポリアルキルスルホン酸 C60（C60((CH2)4SO3Na)4-6）の単回腹腔内投与による，水溶性 C60 の急
性毒性に関する試験を行った．LD50 は 600 mg/kg であった．この化合物は，合成水溶性フラーレ
ンの毒性スクリーニング試験の生物学的マーカーとなる，特異的なファゴリソソーム過負荷腎症
を引き起こした．また，Chen et al.（1998）において，SD CD ラットに対するポリアルキルスルホ
ン酸 C60 の 12 日間連続腹腔内投与試験も行い，6 mg/kg で胸腺重量の減少，60 mg/kg で脾臓・心
Ⅳ-53
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
臓の絶対重量減および肝臓･腎臓･脾臓の相対重量増などが観察されたとしている．さらに，ポリ
アルキルスルホン酸 C60 約 600 mg/kg の腹腔内投与後 30 時間以内に SD CD ラット（Crl:CD®
(SD)BR）
（雌，5～6 週齢，145±15 g）が死亡したことについて，詳細に記述している．ラットに
腹腔内もしくは静脈内投与された物質は，腎臓を経由することによって直ちに取り除かれる（腎
臓は第一の毒性標的器官である）．ポリアルキルスルホン酸 C60 は明らかなリソソームの過負荷に
よるネフローゼ（腎臓疾患）を引き起こし，このファゴリソソーム腎症は，外部および内部皮質
と髄質の間の染色状態の違いにより特定することができた．影響を受けた外部皮質は，尿細管上
皮における大量の巨大液胞の存在や細胞質の凝集などのびまん性変性を示した．単回の腹腔内投
与（500 mg/kg）したラットや静脈内投与（100 mg/kg）したラット，12 日連続の腹腔内投与（6
mg/kg/day）したラットでも，ファゴリソソーム腎症が検出された．
Yamago et al. (1995) は，トリメチレンメタンを付加したカルボン酸フラーレン 200-500 mg/kg
を ddY マウス（雌，18～20 g）に単回腹腔内投与した．投与後に一時的に胴体を伸ばすように身
もだえする不快感や 500 mg/kg では体重減少（1 日後に 5-10%減少）が観察されたが，1 週間後の
時点までに死亡するマウスはいなかった．投与したカルボン酸フラーレンの LD50 は 500 mg/kg i.p.
以上であり，急性毒性はかなり低いことが分かった．
Ueng et al. (1997) は，ポリ水酸化 C60 誘導体を ICR マウス（雄，20~25 g）に腹腔内投与するこ
とにより，フラレノール-1 の急性毒性を測定した．フラレノール-1 の LD50 値は，1,200 mg/kg と
推定された．500，1,000 mg/kg のフラレノール投与では，肝ミクロソーム中のチトクローム P-450
および b5 の含有量，NADPH-チトクローム P-450 還元酵素，ベンゾ[a]ピレン水酸化酵素，7-エト
キシクマリン-O-ジメチラーゼ，アニリン水酸化酵素，エリスロマイシン N-ジメチラーゼの活性
が減少した． 10，100 mg/kg のフラレノール-1 は，これらのモノオキシターゼへの影響は無かっ
た．これらの結果から，フラレノール-1 は in vivo においてミクロソームの酵素レベルを抑制する
ことがわかった．
6.4.3 フラーレンの亜慢性・慢性毒性（腹腔内投与試験）
Satoh et al. (1995) は，CMC で分散させた C60（本文中にはトルエンとトリクロロメチルを用い
て PVP で包摂したという記述もあり，詳細は不明）をモルモット（雌，4 週齢）に 4 週間連続で
腹腔内投与（30 mg/kg）したところ， 観察した器官において薬理学的影響は見られなかった．同
様に Wistar ラット（雄/雌，4 週齢）に 4 週間連続で腹腔内投与（30 mg/kg）した場合でも，観察
した器官において薬理学的影響はなかった．C60 は薬物受容体に直接的な影響は与えず，拮抗作用
もないが，亜慢性暴露では応答性は落ちると結論付けている．
Takagi et al. (2008) は， p53(+/-)トランスジェニックマウス（癌抑制遺伝子である p53 遺伝子を
ノックアウトして癌が起こり易くされたマウス）
（雄，9~11 週齢）に 3 mg/匹で C60 分散液（0.5%
メチルセルロース, 1%Tween80 で分散）を単回腹腔内投与し，投与 25 週後に解剖した結果，腹膜
癒着も線維性肥厚も腫瘍も観察されなかった．腹膜の病変も小さな暗褐色色班が小膜表面にわず
Ⅳ-54
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
かに認められるのみであった．
6.4.4 腹腔内投与試験・静脈内投与試験のまとめ
フラーレンの腹腔内投与試験では，Moussa et al. (1996) における 5,000 mg/kg-bw のミクロンサ
イズ C60 粒子による体重変化と臓器重量変化でのみ投与による影響が観察されていた．腹腔内投
与という特殊条件における試験の結果であるにも関わらず，他の報告では有害性がほとんど認め
られていない．これはフラーレンの毒性の低さを示すものと考えられる．
Ⅳ-55
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-12．フラーレン C60 の腹腔内投与試験
文献
Satoh et al.
1995
試験物質
C60PVP 抱合体
（トルエンとクロロホルムを用
いて，C60 を 0.5%CMC で分
散）
粒径
記載なし
Moussa
al. 1996
C60 水分散液
（0.02%TWEEN80,
0.02%CMC, 0.9% NaCl）
2 μm 以下の
結晶の
10~100 μm の
凝集体
et
対象動物
モルモット（雌，4
週齢，体重記載な
し）
Wistar ラット（雌
雄，4 週齢，体重
記載なし）
スイスマウス
（雄，週齢記載な
し，20±2 g）
用量
30 mg/kg/day を 4 週間
連続
観察項目
アゴニスト活性
観察期間
4 週間連続投与
直後
2,500, 4,000,
mg/kg-bw
死亡，異常行動
体重変化
投与後 1-14 日
5,000
臓器重量変化
Gharbi et al
2005
C60 水分散液
(Tween60 と CMC，NaCl を
用いてステンレスボールミ
ルで調製)
Takagi et al.
2008
C60 水分散液
(0.5%CMC&0.1%Tween80)
Popov et al.
2008
C60PVP 抱合体
30-1650 nm
（1,000-1,650
nm: 7%,
500-1000nm:
43%, 250-450
nm: 28%,
<200 nm:
22%）[SEM観
察]
記載なし
記載なし
Wistar ラット
（雄，週齢記載な
し，200±10 g）
250,
500,
mg/kg-bw
p53(+/-)マウス a
（雄，9-11 週齢，体
重記載なし）
Wistar ラット
（雄，週齢記載な
し，160-180 g）
急性・亜急性毒性
投与後 1-21 日
3.0 mg/匹
肝臓，腎臓，脾臓，肺，消化管
の各臓器における腫瘍の観察
投与 10 日，25 週
間後
3.5, 8.9 mg/kg
体重変化
組織観察（大脳，心筋，肺，肝
臓，脾臓，腎臓）
空腸粘液層，肝臓，腎臓中の
酵素活性（スクロース α--グルコ
シダーゼ，α-グルコシダーゼ，
アルカリンフォスフォラーゼ，膜
アラニルアミノペプチダーゼ，
サイトゾル非特異ジペプチダー
ゼ），たんぱく含有量
投与 3 日，7 日後
a
5,000
： 癌抑制遺伝子である p53 遺伝子をノックアウトして癌が起こり易くされたマウス
Ⅳ-56
結果
影響なし
なし
投与 7 日後に，5 g/kg 投与群で
体 重 増 加 が 49±5% と 対 照 群
（35±3%）に比べて有意に大
投与 7 日後に，5 g/kg 投与群で
肝臓と脾臓の重量は対照群と比
べてそれぞれ 15.5%と 45.0%増
加
肝臓内に色素沈着以外の急
性・亜急性の毒性は見られず．
（炎症や線維化なし）
腹膜癒着も繊維性肥厚も腫瘍も
観察されず．腹膜の病変もほと
んどなし．
溶媒投与群と C60 投与群で，体
重変化や状態の変化に違いは
なし．死亡や異常行動もなし．
8.9mg/kg 投与群の 7 日後で一
部の酵素活性が上昇．組織観
察で異常な所見なし．
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
表Ⅳ-13．フラーレン誘導体の腹腔内投与試験/静脈内投与試験
文献
Yamago et
al. 1995
試験物質
C60 トリメチレンメタン誘導
体
(0.2%Tewwn80/生理食塩)
粒径
粒径記載なし
Rajagopalan
et al. 1996
p,p'-ビス(2-アミノエチル)ジフェニル C60 誘導体
粒径記載なし
Chen et al.
1997
ポリアルキルスルホン酸
C60
C60((CH2)4SO3Na)4-6
粒径記載なし
Ueng et al.
1997
フラレノール-1
C60O5(OH)18
粒径記載なし
Chen et al.
1998
ポリアルキルスルホン酸
C60
C60((CH2)4SO3Na)4-6
粒径記載なし
対象動物
ddY マウス
（雌, 週齢記
載なし,
18-20g)
SD ラット
（雄，週齢記
載なし，287
±12 g）
SD ラット
（雌，5 週
齢，140±10
g）
ICR マウス
（雄，20-25
g）
SD ラット
（雄，
120-150 g）
SD ラット
（雌，5-6 週
齢，145±15
g）
用量
200-500 mg/kg
投与方法
単回腹腔内投与
観察項目
死亡
観察期間
投与後 1 週間
結果
死亡例なし
（LD50：500 mg/kg
i.p.以上）
15, 25 mg/kg
静脈内注射
急性毒性
（息切れ，死亡）
投与後 24 時間
0, 500, 750,
1,000 mg/kg
単回腹腔内投与
臓器重量，各臓器
重量，急性毒性
（ファゴリソソーム
過負荷腎症）
投与後 24 時間
10, 100, 500,
1,000 mg/kg
単回腹腔内投与
急性毒性
酵素活性の低下
（ミクロソーム酵素
レベルの抑制）
投与後 2 週間
25 mg/kg で息切
れ，暴力的行動．
1 匹は 5 分後には
死亡．
500mg/kg お よ び
750mg/kg で 3 日後
に 1 匹ずつ死亡し
たことから，LD50 は
600 mg/kg と結論．
LD50： 1.2 g/kg
500, 1,000 mg/kg
で影響，
10, 100 mg/kg で無
影響
単回腹腔内投
与: 0, 500, 750,
1,000 mg/kg
単回静脈内注
射 : 0, 10, 100
mg/kg
12 日 連 続 腹 腔
内投与: 0.6, 6.0,
60 mg/kg/day
単回腹腔内投与
静脈内注射
12 日連続腹腔内投与
急性毒性，臓器重
量
単回腹腔内投与:
2 週間
単回静脈内注射:2
週間
12 日連続腹腔内
投与: 最終投与後
1日
Ⅳ-57
腹腔内：LD50 ：600
mg/kg
6 mg/kg：胸腺重量
の減少，
60 mg/kg：脾臓・心
臓の絶対重量減
および肝臓･腎臓･
脾臓の相対重量
増など
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
７．まとめ
本章では，フラーレンの有害性に関する情報を収集・整理した．
体内動態に関する情報から，現実の主要な暴露経路である吸入経路による暴露では，肺胞組織
に取り込まれる可能性は示唆されるもの，全身への移行はほとんどないと考えられた．また，肺
での半減期は，気管内投与試験の結果から 16～24 日と考えられる．吸入経路の暴露（吸入暴露試
験，気管内投与試験）では，一部でわずかな一過性の炎症が観察されたのみで，持続性の炎症は
観察されなかった．また，その他の臓器での影響を示唆する証拠は得られなかった．ただし，1.0
mg/lung を投与したラットでは，わずかではあるが有意に 3 ヶ月後まで好中球数の増加が観察さ
れた．細胞毒性試験の結果では，ナノサイズの粒子がミクロンサイズの粒子よりも強い有害性を
持つ可能性を示唆したものもある．経口暴露，経皮暴露においては，有害性を示す証拠は得られ
なかった．
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Ⅳ-68
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
Appendix Ⅳ-1 クリアランス式の導出
dA
・・・　(i)
 CVr  k1 A  k12 A dt
dI
 k12 A  k 2 I　・・・　(ii)
dt
(i)(ii)式にラプラス変換を適用すると，
CVr
 k1  k12 A
s
sI   I (0)  k12 A  k 2 I 　sA  A(0) 
ここで，A’と I’は A と I をラプラス変換したものである．
t=0 で A(0)=a，I(0)=i なので，
CVr
 k1  k12 A ・・・　(iii) s
sI   i  k12 A  k 2 I  ・・・　(iv) sA  a 
(iii)を変形して，
As  k1  k12  
CVr
a
s
A 
CVr
a

s s  k1  k12  s  k1  k12 

CVr
k1  k12
1
1
 
 s s  k1  k12

a
 
・・・　(v) 



s
k
k
1
12

ラプラス変換を元に戻すと，
A
CVr
CVr k1  k12 t

e
 ae k1  k12 t
k1  k12 k1  k12
式(iv)を変形して，式(v)を代入すると，
Ⅳ-69
第Ⅳ章 有害性評価
I 
篠原 直秀
k12 A  i
s  k2

k12 CVr
k12 a
i


s  k 2 ss  k1  k12  s  k 2 s  k1  k12  s  k 2
k12 CVr

1
1
1
k12 CVr
k12 CVr
k1  k12 k1  k12  k 2 
k 2 k1  k12 
k 2 k1  k12  k 2 


s
s  k2
s  k1  k12
k12 a
k12 a
k  k  k 2 k1  k12  k 2
i
 1 12


s  k2
s  k1  k12
s  k2
ラプラス変換を元に戻すと，
I  k12 CVr
1
1
1
 k12 CVr
e  k 2t  k12 CVr
e k1  k12 t
k1  k12 k1  k12  k 2 
k 2 k1  k12 
k 2 k1  k12  k 2 
k a
k12 a
 12
e  k 2t 
e k1  k12 t  ie  k 2t
k1  k12  k 2
k1  k12  k 2
Ⅳ-70
第Ⅳ章 有害性評価
篠原 直秀
Appendix Ⅳ-2．水生生物等への影響
Oberdöster E (2004) は，THF を用いて調製した 0.5 mg/L の C60 分散液（30~100 nm）中で 48
時間飼ったオオクチバスの脳に脂質過酸化が起きていた報告した．しかし，THF を用いた C60 分
散液は，THF を使用せずに分散させた液よりも毒性が強いと，バクテリア（Fortner et al. 2005）
，
ミジンコ（Lovern et al. 2006, Zhu et al. 2006），ラーバルゼブラフィッシュ（Henry et al. 2007）など
で報告されており，THF の分解生成物である γ-ブチロアクトンが分散液中に残留していることが
この毒性の原因とされている（Henry et al. 2007）．水中攪拌法による C60 分散液を用いた淡水や海
水中の無脊椎動物（ミジンコやカイアシ）に対する 48 時間もしくは 96 時間の暴露試験も行われ
ており，それぞれ最高濃度である 35ppm 及び 22.5ppm でも半数致死濃度（LC50）に達しなかった
（Oberdörster E et al. 2006）．ただし，ミジンコへの 21 日暴露試験では，2.5, 5.0ppm で脱皮までの時間
や繁殖速度に遅れが観察された．Shinohara et al. (2009a) は，NEDO プロジェクト（P06041）において，
コイ（C. carpio）に対するナノサイズの C60 分散液（4.5 mg/L，50%ile: 35 nm）の 48 時間暴露試験を行った
ところ，脳における脂質の過酸化は見られなかったとしている．また，脳への移行も見られなかっ
た．Seki et al. (2008) は，硬化ひまし油と氷砂糖を用いてらいかいすることで調製した C60 分散液
を用いて水生生物への有害性試験を行った．魚類濃縮度試験では，魚から C60 は検出されず（<0.122
μg/g），濃縮倍率は 5.8 倍以下であった．魚類やミジンコに対する LC50 は確認できず，LC50 はそ
れぞれ 2.15 mg/L 及び 2.25 mg/L 以上であった．一方，藻類生長試験では，0.0452 mg/L で生長阻
害が確認され，無影響濃度（NOEC: No Observed Effect Concentration）は 0.0178 mg/L であった．
また，水攪拌法で生成した粒径の小さな C60 凝集体（~2 nm）は，粒径の大きな C60 凝集体（142 nm）
と比べて，抗バクテリア活性が大きかったという報告もある（Lyon et al. 2006）．
Ⅳ-71
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
第Ⅴ章
許容暴露濃度（PL：時限）の決定
本章では，第Ⅳ章で整理した有害性情報を元に，フラーレンの NOAEL（No Observed Adverse
Effect Level: 無毒性量）を推定する．また，推定した NOAEL に対する不確実性係数を決定した
上で，10 年程度の内に見直しを検討することを前提とした，15 年の暴露を対象とした許容暴露濃
度である許容暴露濃度（PL：時限）を導出・提案した．また，ナノ粒子の有害性は環境中の凝集
体の大きさにより肺胞沈着率が異なることから，粒径別の許容暴露濃度（PL）を提示することと
した．本章は，Shinohara et al. (In print)を改変・加筆したものである．
１．許容暴露濃度（PL：時限）の概念の提案
一般に，化学物質への暴露によるリスクの判定を行うためには，ヒトや実験動物に対する有害
性影響の見られない最大濃度である無毒性量（NOAEL）など，暴露量（暴露濃度）と比較すべき
値を設定する必要がある．また，これを超えてはいけないという許容暴露濃度は，この NOAEL
を不確実性係数で割ることにより求めることができる．NOAEL の設定のためには，まず評価の
エンドポイントとなる有害性影響を設定する必要がある．そこで，前述の既存の有害性試験にお
いて確認されている有害性影響と，フラーレンやナノ粒子の特性から想定される有害性影響の中
から，ヒトで起こりうる暴露経路において，最も低濃度の暴露で起こる有害性影響をエンドポイ
ントとして選択することとした．
許容暴露濃度については，フラーレンを含むナノ材料についての有害性情報，特に長期暴露に
よる有害性影響についての知見が限られていることから，現時点で生涯暴露を想定した許容暴露
濃度を導出・提案することは適切ではないと判断した．その上で，本評価書では，今後の科学的
知見の集積の後に 10 年程度の内に見直しを行うことを前提として，15 年程度の暴露期間を想定
した許容暴露濃度を導出・提案することとした．この許容暴露濃度を，通常の生涯暴露（70 年）
や全就労期間暴露（45 年）についての許容暴露濃度と区別するために，許容暴露濃度（PL：時限）
Ⅴ-1
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
と表記することとした．ここで，PL は“Period Limited”、時限は“時限付き”の略である．
２．評価エンドポイントの設定
暴露経路については，基本的に吸入経路による暴露で観察される有害影響を対象として評価を
進めることが妥当だと考えられる．第Ⅳ章１節で取り上げた体内動態の試験結果からは，フラー
レンのナノ粒子を吸入暴露した場合に肺以外の組織へフラーレンが移行するという報告はなく，
肺における有害性影響を評価のエンドポイントとして設定するのが妥当と考えられる．
既存の研究において，フラーレンの肺における有害性影響としては，肺における炎症が取り上
げられており，肺組織に観察される炎症，BALF 中の総細胞数，好中球数，サイトカイン量など
が有害性指標として計測されている．これらは，肺における炎症に関連する指標であり， BALF
中の好中球数とサイトカイン量は炎症が起きると増加するものである．本評価においても，EC
（2010）等における評価と同様に，肺において観察される炎症をエンドポイントとすることとし
た．このエンドポイントについて，NOAEL を求める際には，肺の病理組織観察における炎症の
有無について注目した．また，BALF 中の好中球数やサイトカイン量についても，炎症反応を裏
付ける応答であるため，補足的情報として取り扱った．
また，前述のように，気管内投与試験における 1 日後の応答は，肺中に異物を大量に注入した
ことによる過剰反応であり毒性学的意味は小さいとする考え方がある．そのため，本評価書では，
気管内投与の 1 日後の肺組織中の炎症や BALF 中の好中球数やサイトカイン量は，判断に用いな
いこととした．
３．NOAEL の決定
3.1. はじめに
現実で想定される暴露が少なくとも 15 年にわたることを考慮し，ラットにおいて少なくとも 3
ヶ月以上の観察を有する試験である Morimoto et al. (2010) 及び Sayes et al. (2007) の吸入暴露試験
及び気管内投与試験の結果を用いて，吸入暴露時のヒトに対する NOAEL を求めることとした．
より短期の吸入暴露試験（Baker et al. 2008）の結果は，補足的な考察に用いることにした．また，
C60 の投与試料の調製時に有害性が考慮される有機溶媒を用いているものは，評価に用いる試験結
果から外すこととした．
また，米国 EPA は，「ナノマテリアルの TSCA（Toxic Substances Control Act：有害物質規制法）
Ⅴ-2
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
インベントリステータス－一般的アプローチ」という文書において，低溶解性粒子（Respirable,
PoorlySoluble Particulates：RPSP）を一定量取り扱う事業者に対して，ラットへの 90 日間の吸
入暴露試験と 90 日間の観察をし，肺毒性の観察を行うことを義務付ける方向性を示している．そ
こで，上記の 28 日間吸入暴露試験（Morimoto et al.2010）や気管内投与試験（Morimoto et al. 2010,
Sayes et al. 2007）の結果を，肺内保持量を用いて 90 日暴露試験の結果と等価となる NOAEL に
換算することとした．．
その上で，肺胞表面積による補正や暴露時間の補正を行って，ヒトの労働環境及び一般環境に
おける NOAEL を求めた．参考までに，肺沈着率を考慮して，粒径別の NOAEL についても計算
した．
また，既存の有害性試験において，粒子状物質の肺への影響に性差があるかどうかはこれまで
に知見がない．一方，これまでフラーレンを対象にした肺への有害性を評価した論文では，ほと
んどが雄を対象とした試験である．本評価書においては，対象とした有害性影響が肺における炎
症反応であり，生殖発生毒性などと比べて性差の影響を受けにくいと考えられるため，性差はな
いものとして取り扱うこととした．
3.2. ラットにおける吸入暴露時の NOAEL の導出
3.2.1
ラットに対する吸入暴露試験における NOAEL
0.030
の C60 粒子を 6 h/day，5 day/week，4 週間の吸入暴露の
0.025
結果，3 ヶ月後まで肺における持続的な炎症や肺胞洗
浄液（BALF）中の炎症関連マーカーの変動は観察さ
れていない．
）から，ラットの肺への有害性影響に関す
る 28 日間吸入暴露試験における C60 の NOAEL は 0.12
肺中 C60 存在量 [mg]
Morimoto et al. (2010) の結果（平均 96 nm, 0.12 mg/m3
0.015
0.010
0.005
観察期間を有する試験が存在しないことから，現時点
0.000
粒子濃度 0.12 mg/m3 となるが，これは相当に安全側の
28日間吸入暴露試験
(Shinohara et al. 2010)
0.020
mg/m3 と考えることができる．これより高濃度で長期
での NOAEL はこの試験に用いられた気中フラーレン
90日間吸入暴露試験
（外挿）
0
30
60
90
120
150
180
210
240
経過時間 [day]
図Ⅴ-1．28 日間吸入暴露試験の 90 日
間吸入暴露試験への外挿
値であるとも考えられる．Baker et al. (2008) の試験は，
10 日間の暴露後に 7 日間観察をしたものであり，暴露期間や観察期間が短いものの，気中粒子濃
度 2.22 mg/m3 で有害影響が見られていない．
前述のように， 0.12 mg/m3 の C60 に対する 28 日間吸入暴露試験において，3 ヶ月後まで有害影
響は観察されていない（Morimoto et al. 2010）．Shinohara et al. (2010) における C60 ナノ粒子の肺か
らのクリアランス率の中で，肺中保持量が最も近い 0.1 mg/rat の時のクリアランス速度定数（k1, k12,
k2: 0.047, 0.0028, 0.0042 /day）と沈着率（0.14）を用いて，0.12 mg/m3 の C60 への暴露が 90 日間（6
hour/day, 5 days/week）続いた時の肺内保持量を求めると，0.019 mg/lung となった（28 日間では
Ⅴ-3
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
0.013 mg/lung）．気管内投与試験では，これをはるかに上回る 0.1～0.7 mg/lung の肺内保持量に対
しても，6 ヶ月間に渡って肺における持続的な有害影響がみられていない．これらのことから，
0.12 mg/m3 の C60 への暴露が 90 日間続いたとしても，有害影響は生じないと推定される．これま
でに，肺における持続的な有害影響が観察された吸入暴露試験が存在しないことを考え合わせる
と，吸入暴露試験から導き出される C60 ナノ粒子の吸入暴露に対する NOAEL は，0.12 mg/m3 と判
断できる．
3.2.2
ラットに対する気管内投与試験における NOAEL
Morimoto et al. (2010) の気管内投与試験では，0.1 mg/lung (0.33 mg/kg)及び 0.2 mg/lung (0.66
mg/kg)の気管内投与において投与後 6 ヶ月間に渡り，肺における炎症の組織観察及び好中球や炎
症性サイトカインの上昇は見られなかったが，1.0 mg/lung (3.3 mg/kg)の気管内投与では投与後 3
ヶ月後まで，わずかではあるが好中球の有意な上昇が観察された．また，Sayes et al. (2007) では，
0.7 mg/lung (3.0 mg/kg)の気管内投与試験において 3 ヶ月後まで肺における炎症の組織観察及び好
中球の上昇は見られなかった．これらのことから，C60 ナノ粒子の気管内投与試験における NOAEL
は 0.7 mg/lung，1.0 mg/lung を LOAEL と判断した．
3.2.3
気管内投与試験にもとづくラットにおける吸入暴露時の NOAEL の推定
ナノサイズで安定した C60 ナノ粒子を気中に発
1.00
導き出される C60 ナノ粒子の NOAEL は，安全側
のマージンが大きすぎる可能性がある．そこで，
本研究では，気管内投与試験の結果を用いて，90
日間の吸入暴露試験結果と等価となる NOAEL を
求めることとした．
0.80
肺中 C60 存在量 [mg]
子の吸入暴露試験がないため，吸入暴露試験から
90日間吸入暴露試験
（外挿）
気管内注入試験
(Shinohara et al. 2010)
0.90
生させることは困難であり，高濃度の C60 ナノ粒
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
0
30
吸入暴露試験と気管内投与試験の両試験におい
て，最大となる肺保持量が等しい時にその有害性
も 等 し く な る と 仮 定 し ， 90 日 間 暴 露 試 験 （ 6
60
90
120
150
180
210
240
経過時間 [day]
図Ⅴ-2．気管内投与試験の 90 日間吸入
暴露試験への外挿
hour/day, 5 days/week）における最大肺内 C60 保持量が 0.7 mg になる吸入暴露濃度を求めることと
した．本計算には，Shinohara et al. (2010) における C60 ナノ粒子の肺からのクリアランス率の中で，
肺中保持量が最も近い 1.0 mg/rat の時のクリアランス速度定数（k1, k12, k2: 0.029, 0.0001, 0.00044
/day）を用いた．また，粒径に関しては，吸入暴露試験データの揃っている Shinohara et al. (2010)
及び Morimoto et al. (2010) に合わせて，個数基準の幾何平均粒径が 96 nm（GSD 2.0）と仮定して，
沈着率として 0.14 を用いて計算を行った．呼吸量については，Shinohara et al. (2010) 及び Morimoto
et al. (2010) のラット体重 300 g に合わせて，0.27 m3/day とした．
Ⅴ-4
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
dA
 CVf  k1 A  k12 A dt
dI
 k12 A  k 2 I　dt
(t  0: A  A0 , I  I 0 )
(1)
(2)
ここで，A は肺コンパートメント 1 中保持量，I は肺コンパートメント 2 中保持量，C は暴露濃度，
V は呼吸量，f は沈着率である．
表Ⅴ-1．計算に用いたパラメータ
パラメータ
k1
k12
k2
粒径
沈着率
ラット体重
呼吸量
使用数値
0.029 /day
0.0001 /day
0.00044 /day
GM: 96 nm
0.14
300 g
0.27 m3/day
GSD: 2.0
その結果，暴露最終日の肺内保持量 0.7 mg となる吸入暴露試験（6 h/day，5 day/week）の暴露
濃度は，3.1 mg/m3 と計算された．このことから，90 日間のラット吸入暴露試験における C60 ナノ
（ここで，ラットの呼吸量や沈着率等を Sayes et al.
粒子の等価 NOAEL を，3.1 mg/m3 と判断した．
(2007) に合わせて，0.22 m3/day 及び 0.18 として計算した場合には，2.9 mg/m3 となる．）
参考までに，薬物動態学などで良く用いられる AUC（Area Under Curve）が，吸入暴露試験と
気管内投与試験で等しくなるときに，両試験における有害性が等しくなると仮定した場合には，
NOAEL は 1.2 mg/m3 と計算された．（ここで，ラットの呼吸量や沈着率等を Sayes et al. (2007) に
合わせて，0.22 m3/day 及び 0.18 として計算した場合には，1.1 mg/m3 となる．）ただし，粒子の吸
入暴露に対して AUC を用いた評価を行っている例がこれまでになく，粒子による有害性影響が
AUC ベースで等価になるとの論拠もないことから，AUC による換算は参考値として示すのみと
する．
3.3. ヒトに対する吸入暴露時の NOAEL の導出
3.3.1
作業環境中におけるヒトに対する吸入暴露時の NOAEL
前述したラットに対する等価 NOAEL (equivalent NOAELrat) である 3.1 mg/m3 に，暴露期間
や 種 差 に 関 す る パ ラ メ ー タ の 補 正 を 行 っ て ， 作 業 環 境 中 の ヒ ト に 対 す る NOAEL
(NOAELhuman_work)を，次ページの式により導出した．
NOAELhuman  work  NOAELrat 
tr
t work

BWh
day r
fr
q

 r 
day work f h _ work q work BWr
6 5 0.0758 0.27 73
3
 3.1[mg/m


]  
8 5 0.0913 36 0.3
3
 3.5 [mg/m
]
Ⅴ-5
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
ここで，tr [hour/day] は想定した暴露試験における 1 日当たりの暴露時間，twork [hour/day] はヒト
の作業環境における 1 日当たりの暴露時間，dayr [day/week] は想定した暴露試験における 1 週間
当たりの暴露日数，daywork [day/week] はヒトの作業環境における 1 週間当たりの暴露日数，fr
[dimensionless] はラットの肺胞領域における沈着率，fh_work [dimensionless] は軽作業時のヒトの肺
胞領域における沈着率，qr [m3/day] はラットの呼吸量，qh_work [m3/day] は軽作業時のヒトの呼吸
量，BWr [kg] はラットの体重，BWh [kg] はヒトの体重である．fr と fh_work は MPPD モデルを用
いて粒径の GM 96 nm，GSD2.0 の粒子（かさ密度 1.2 g/cm3）に対して，一回換気量 1.84 mL 及び
1 分あたりの呼吸頻度 102 回/min と一回換気量 1250 mL 及び 1 分あたりの呼吸頻度 20 回/min
（ICRP
1994, US.EPA 2004）として求めた値（0.0758，0.0913），qr と qh_work は Bide et al. (2000) の式によ
る計算値（0.27 m3/day）と軽作業時の呼吸量（36 m3/day（ICRP 1994）），BWr と BWh は 0.3 kg
（Morimoto et al. 2010）および 73 kg（US.EPA 2004）を用いた．その結果，作業環境中のヒトに
対する C60 ナノ粒子の NOAEL は，3.5 mg/m3 と計算された（ここで，NOAELrat やラットの呼吸量
や体重等を Sayes et al. (2007) に合わせて，2.9 mg/m3, 0.22 m3/day 及び 0.23 g として計算した場合
にも，同じく 3.5 mg/m3 となる．）．日本人の体重は平均 60 kg とされているが，日本人についての
呼吸頻度や一回換気量の情報がないことから，ここではそれらの情報が揃っている欧米人を対象
として，その体重である 73 kg を用いた．ただし，呼吸量や肺重量は体重に比例するとされてい
ることから，結果としては日本人に対する値も同程度になると考えられる．
本来は，粒子の吸入暴露毒性は，沈着部位である肺胞表面積に比例すると考えることが妥当で
はある．しかし，肺胞表面積データは各有害性試験に対応して取られてはおらず，ラットの種類
や週齢，個体によっても大きく異なるものである．それに対して，体重は有害性試験それぞれに
対応してデータが取られている．これらのことから，本評価においては，体重を元にしたヒト/
ラット換算を実施した．ちなみに，肺胞表面積や肺重量のヒト/ラット比（肺胞表面積：57.22
）を用いて作業環境中のヒトに対する C60 ナノ
m2/0.2972 m2，肺重量：1100 g/1.4 g（US.EPA 2004）
粒子の NOAEL を求めると，2.8 mg/m3 および 11 mg /m3 となった．
以上から，幾何個数平均粒径 96 nm（GSD 2.0）のフラーレン C60 粒子の，ヒト（労働環境）で
の NOAEL は 3.5 mg/m3 と計算された．
3.3.2
一般環境におけるヒトに対する吸入暴露時の NOAEL
前述したラットに対する NOAEL (NOAELrat) である 3.1 mg/m3 に，暴露期間や種差に関する
パラメータの補正を行って，一般環境中のヒトに対する NOAEL (NOAELhuman_env)を，以下の式
により求めた．
NOAEL　human _ env  NOAELrat 
3
 3.1[mg/m
]
tr
t env

BWh
day r
fr
q

 r 
day env f h _ env q env BW r
6 5 0.0758 0.27 73
 


24 7 0.107
20 0.3
3
 1.3 [mg/m
]
Ⅴ-6
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
ここで，tenv [hour/day] はヒトの一般環境における 1 日当たりの暴露時間（24 時間），dayenv
[day/week] はヒトの一般環境における 1 週間当たりの暴露日数（7 日間），fh_env [dimensionless] は
日常生活におけるヒトの肺胞領域における沈着率，qh_env [m3/day] は日常生活におけるヒトの呼吸
量である． fh_env は MPPD モデルを用いて粒径の GM 96 nm，GSD2.0 の粒子（かさ密度 1.2 g/cm3）
に対して一回換気量を 925 mL 及び 1 分あたりの呼吸頻度 15 回/min（ICRP 1994）として求めた値
（0.107），qh_env は日常生活におけるヒトの呼吸量として安静時と軽作業時の中間的な値（20
m3/day）を用いた．
その結果，一般環境中のヒトに対する C60 ナノ粒子の NOAEL は，1.3 mg/m3 と計算された．ま
た，参考までに体重でなく肺胞表面積や肺重量のヒト/ラット比（肺胞表面積：57.22 m2/0.2972 m2，
肺重量：1100 g/1.4 g）を用いて作業環境中のヒトに対する C60 ナノ粒子の NOAEL を求めると，
1.0 mg/m3 および 4.1 mg /m3 となった．よって，幾何個数平均粒径 96 nm（GSD 2.0）のフラーレ
ン C60 粒子の，ヒト（一般環境）での NOAEL は 1.3 mg/m3 と計算された．
3.4.
NOAEL の意義
前述のように導出された NOAEL である 3.5 mg/m3（労働環境），1.3 mg/m3（一般環境）は，Sayes
et al. (2007) で試験された粒子濃度 0.7 mg/lung の気管内投与試験と Morimoto et al. (2010) や
Shinohara et al. (2010) の気管内投与試験に基づいて算出された．この NOAEL を不確実性係数で
割ることにより，許容暴露濃度を求めることができる
また，NOAEL 算出の基となった Sayes et al. (2007) の粒子は，凝集体の粒径分布が 160±50 nm
（測定法は明記されず）であるが，写真から判断すると結晶の大きさとしては 100 nm 以下のも
のが多数存在していると思われる．また，Morimoto et al. (2010) や Shinohara et al. (2010) の試験
に用いられた試料中の粒子径は，分散液中で 33 nm（DLS 動的光散乱測定による体積平均径）
，そ
れを噴霧して作成された気中粒子として 96 nm（SMPS 走査型移動度粒径測定による幾何平均値）
であった．Sayes et al. (2007) の粒子径は多少大きいが，一次粒子サイズとしてはナノサイズの粒
子を用いて得られた試験結果であり，凝集体としてもナノサイズのものを多く含んだ試料で行わ
れた試験だといえる．
サイズの違いによる有害性の強さの違いは，必ずしも十分に明らかとはなっていないが，有害
性への影響の違いには二つの側面がある．一つは，粒子サイズによって肺胞への沈着率が違って
くるという側面，もう一つは，粒子サイズによって，単位重量あたりの有害性が違う可能性があ
るという側面である．後者については，特に，有害性に寄与する暴露の指標としては粒子表面積
が適当であるという議論がある（Oberdörster G et al. 2000, 2005，Donaldson et al. 2001）
．ここで導
出した NOAEL のサブミクロン～ミクロンサイズの粒子への適用に関しては，サブミクロン～ミ
クロンサイズのフラーレン粒子としてどのようなものを想定するかによって若干議論が異なる．
大別して二つの種類のサブミクロン～ミクロンサイズ粒子が想定しうる（図Ⅴ-3）；a) ナノサイ
ズの結晶が凝集したもの：比表面積はナノサイズ粒子と同じ，b) 一つの結晶としてサブミクロン
Ⅴ-7
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
～ミクロンサイズであるもの：ナノサイズ粒子に比べて比表面積が小さい．a)については，仮に
有害性が粒子表面積に依存するならば，比表面積は同等であるから，沈着率の違いのみ考慮すれ
ばよい．一方，b)については，有害性が粒子の重量に依存するとすれば，単に沈着率の違いを考
慮するのみでよいが，仮に有害性が粒子表面積に依存するならば，単位重量あたりの有害性はナ
ノサイズ粒子に比べて小さいことになる．すなわち，ここで導出された NOAEL を b)のタイプの
粒子に適用した場合には，沈着率の違いを考慮したとしても，リスクの判定は安全側となる．ナ
ノサイズとサブミクロン～ミクロンサイズの C60 粒子の有害性を比較した情報としては，以下の
二つがある．同程度の濃度のナノサイズの C60 粒子とサブミクロン～ミクロンサイズの C60 粒子の
短期の吸入暴露試験（Baker et al. 2008）においては，どちらにおいても有害影響が確認されなか
った．また，in vitro 試験においてナノサイズの C60 粒子の方がサブミクロン～ミクロンサイズの
C60 粒子より抗バクテリア活性が強く表れたという報告もある（Lyon et al. 2006）．ただし，これら
の結果だけでは，粒子サイズに依存した C60 粒子の有害性の違いは判断できない．今後，b)のタ
イプの粒子の有害性の強さを評価するための知見が十分に蓄積すれば，サブミクロン～ミクロン
サイズのフラーレン粒子に対する NOAEL を別途設定することも可能となりえるため，今後の課
題であると言える．
粒子の凝集サイズによる沈着率の違いが起こす有害性影響については，沈着率を用いて粒径別
の許容暴露濃度（PL：時限）を導出することとした（後述）．b)のタイプのサブミクロン～ミクロ
ンサイズ粒子についても特段の補正等は行わず，安全側の評価である旨のコメントを付すにとど
めた．
(a)
ナノサイズの粒子
(b)
ナノサイズ粒子の凝集体と
してのミクロンサイズの粒子
一つの結晶としての
ミクロンサイズの粒子
沈着率は同等
比表面積は同等
図Ⅴ-3
3.5.
2 種類のミクロンサイズのフラーレン粒子の概念図
凝集体の粒径別 NOAEL の算出
前項で記したように，粒子の肺胞への沈着率は，粒径によって変動する．そのため，参考まで
に，粒径別の沈着率を用いて，粒径別の作業環境中のヒトに対する NOAEL を以下の式により求
めた．
Ⅴ-8
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
NOAELhuman _ worl , d  x
 NOAELhuman _ work , d  96 nm , GSD 2.0 
 3.5 mg/m 3 
f d  96 nm , GSD 2.0
fd x
0.0913
fd  x
ここで，NOAELhuman_work, d=x [mg/m3] は粒径 x nm の粒子に対するヒトの作業環境における NOAEL，
NOAELhuman_work, d=96, GSD2.0 [mg/m3] は粒径 96 nm，GSD2.0 の粒子に対するヒトの作業環境における
NOAEL（3.5 mg/m3），fd=96nm, GSD2.0 [-] は粒径 96 nm，GSD2.0 の粒子のヒト肺胞沈着率（MPPD モ
デルで算出，0.0913），fd=x [-] は粒径 x nm の粒子のヒト肺胞沈着率（MPPD モデルで算出）であ
る．
同様に，粒径別の一般環境中のヒトに対する NOAEL を以下の式により求めた．
NOAELhuman _ env , d  x
 NOAELhuman _ env , d  96 nm , GSD 2.0 
 1.3 mg/m 3 
f d  96 nm , GSD 2.0
fd  x
0.107
fd  x
ここで，NOAELhuman_env, d=x [mg/m3] は粒径 x nm の粒子に対するヒトの一般環境における NOAEL，
NOAELhuman_env, d=96, GSD2.0 [mg/m3] は粒径 96 nm，GSD2.0 の粒子に対するヒトの一般環境における
NOAEL（1.3 mg/m3），fd=96nm, GSD2.0 [-] は粒径 96 nm，GSD2.0 の粒子のヒト肺胞沈着率（MPPD モ
デルで算出，0.107），fd=x [-] は粒径 x nm の粒子のヒト肺胞沈着率（MPPD モデルで算出）である．
得られた粒径別の NOAEL を図Ⅴ-4 に示す．
10.0
一般環境
NOAEL [mg/m 3 ]
8.0
作業環境
6.0
4.0
2.0
0.0
10
100
1,000
10,000
粒径 [nm]
図Ⅴ-4．粒径別の作業環境および一般環境に対する NOAEL
Ⅴ-9
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
４．不確実性係数の決定
実験動物とヒトの種間差（体内動態や感受性の違い）や，暴露期間の違いや個体差の大きさが
データの不確実性を生むことから，リスク評価に対してそれぞれどの程度影響しうるかを数値化
したものが不確実性係数である．因子ごとの不確実性係数を掛け合わせたものを，リスク判定に
おける不確実性係数とする．これを超えてはいけないという許容暴露濃度（PL：時限）は，この
NOAEL を不確実性係数で割ることにより求めることができる．不確実性係数の決定にあたって
の考え方については，「ナノ材料リスク評価書 -リスク評価の考え方」に詳細を記している．
ラットとヒトの体内動態や感受性の種差は，一般的に TK（トキシコキネティクス）と TD（ト
キシコダイナミクス）の差として表わされる．体内動態に関わる TK については，本評価書にお
ける評価エンドポイントとした肺における炎症に関わる有害性影響は局所的影響であり肺保持量
のみに依存すると考えられ，ヒトとラットの沈着率の違いは NOAEL 算出において既に考慮され
ている．C60 粒子の沈着率についてのデータは、複数の既存文献とモデル推定結果に基づいてお
り．不確実性は小さいものと考えることができる．このことから，TK に対する不確実性係数は 1
とした．
また，動物とヒトの感受性の違いである TD については，U.S. EPA (2002) は 1～3 を，WHO
や EC は 2.5（IPCS 1994, ECHA 2008）を一般の化学物質に対して提案している．本評価書でエン
ドポイントとした肺への毒性については，ラット，マウス，ハムスターに対する TiO2 の 13 週間
吸入暴露試験（Bermudez et al. 2002, 2004）や F344 ラットとカニクイザルに対するディーゼル排
気や炭塵の 24 ヶ月間吸入暴露試験の結果から，ラットが他のげっ歯類や哺乳類よりも過敏な応答
を示すことが分かっている（Borm et al. 2006）．また，肺における慢性炎症についての実験結果か
らは、ラットの感受性がヒトより強いため，TD を 1 とすることは，近年一般的に認められる傾
向にある（ILSI
2000）．このことから，ヒトに比べてラットの方が粒子への暴露に対する肺の感
受性が強いと判断できるため，TD についての不確実性係数を 1 とした．
一方，本評価書では，粒子の肺への沈着速度が等価とする補正を行って，ラットの NOAEL か
らヒトの NOAEL へ外挿している．これは，保持量が等価とする外挿と比べて必ずしも安全側の
推計にはなっていない．また，ラットとヒトの体重比を介した NOAEL の外挿を行っているが，
一般的な肺胞表面積比を用いた場合には，本評価書で導出した NOAEL の 0.8 倍の NOAEL にな
る．これらの不確実性を考慮して，ラット-ヒト間の NOAEL の外挿に関わる不確実性係数として
3 を適用することにした．
EC は，暴露期間の違いに由来する不確実性について，亜急性暴露試験から慢性暴露の影響を
推定する際の不確実性係数を 6 に，亜慢性暴露試験から慢性暴露の影響を推定する際の不確実性
係数を 2 にすることを提案している（ECHA 2008）．ちなみに，ECHA (2008)では，亜急性とは急
性と慢性の中間で 28 日間，亜慢性も同様にこちらは 90 日間と定義されている．また，ECETOC
Ⅴ-10
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
（European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals）は，呼吸器系の局所影響に対して，
亜急性暴露試験や亜慢性暴露試験から亜慢性暴露や慢性暴露の影響を推定する際の不確実性係数
を 1 とすることを提案している（ECETOC 2010）．Sayes et al. (2007) や Morimoto et al. (2010) の試
験は気管内投与後に 3 ヶ月間～2 年間の観察をしており，その結果を本評価では 3 ヶ月間の吸入
暴露試験結果に外挿している．本評価では，この試験結果を用いて，10 年程度の間に修正を検討
するという条件付きの指標を求めることとしている．また，気管内投与試験の結果から吸入試験
の結果への外挿時に，AUC が等価とした場合には得られる NOAEL は，肺中保持量から求めた
場合の 1/3 であった，これらのことを考え合わせて，暴露期間や気管内投与試験から吸入暴露試
験への外挿を考え合わせた不確実性係数は 3 とした．
個体差については，労働環境における暴露では労働に携わる人は健康であり，感受性が高い群
に属さないとの考えから，不確実性係数は 1 とする．一般環境における有害性の個体差（個人差）
は 10 とする．
これらを掛け合わせると，吸入暴露試験に基づく NOAEL から求めたヒトの作業環境における
暴露に対する NOAEL の不確実性係数積は 9 となる．また，ヒトの一般環境における暴露に対す
る NOAEL の不確実性係数積は，90 となる．
表Ⅴ-2．REACH および ECETOC における暴露期間に関わる不確実性係数
全身影響
REACH
(ECHA 2008)
局所影響（呼吸系）
ECETOC
REACH
ECETOC
(ECETOC 2010)
(ECHA 2008)
(ECETOC 2010)
亜急性から亜慢性
3
3
3
1
亜慢性から慢性
2
2
2
1
亜急性から慢性
6
6
6
1
５．許容暴露濃度（PL：時限）の決定
5.1. 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
第Ⅳ章３節で求めた作業環境及び一般環境におけるヒトの NOAEL を，前節で求めた不確実性
係数で割ることにより，許容暴露濃度（PL：時限）を得ることができる．その結果，幾何平均 96
nm (GSD2.0)の C60 粒子の作業環境中の許容暴露濃度（PL：時限）は 0.39 mg/m3，一般環境中の許
容暴露濃度（PL：時限）は，1.4×10-2 mg/m3 となった．
前述のように，作業環境中もしくは一般環境中において同じ濃度であっても，気中での粒子サ
イズ（二次粒径）が異なっていれば，肺胞まで到達する粒子の量は異なる．そのため，粒径別の
Ⅴ-11
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
肺胞沈着率により求められる粒径別の許容暴露濃度（PL：時限）を，以下の式で提案することと
した．
OEL( PL) work , n  x , GSD  y  0.39 
f work , d  96 nm, GSD  2.0
f work , d  x , GSD  y
AAQC( PL) env, n  x , GSD  y  0.014 
 0.39 
f env, d  96 nm, GSD  2.0
f env, n  x , GSD  y
0.0913
f work , d  x , GSD  y
 0.014 
0.107
f env, d  x , GSD  y
ここで，OEL(PL)は作業環境における許容暴露濃度（時限）を，AAQC(PL)は一般環境における許
容暴露濃度（時限）を，f は肺胞沈着率を表している．d=x,GSD=y 及び d=96nm,GSD=2.0 は幾何
個数平均径 x 幾何標準偏差 y の粒子及び幾何個数平均径 96 nm 幾何標準偏差 2.0 の粒子を示して
いる．肺胞沈着率は，MPPD モデルで求めることとする．代表的な沈着率を，表Ⅴ-3 に示す．
5.2. 他機関の指針値等との比較
European Community（EC：欧州共同体）の Joint Research Centre（JRC：共同研究センター）で
は，2008 年から 2009 年に，ENRHES（Engineered Nanoparticles - Review of Health & Environmental
Safety）プロジェクトを実施し，C60，CNTs，金属，および金属酸化物のナノ材料を対象として，
製造/使用/暴露・有害性・生態毒性・疫学・リスク評価に関する工業ナノ粒子の包括的な科学的
知見のレビューを行っている．その中で、各ナノ材料に対する労働者の Derived-No-Effect-Levels
表Ⅴ-3．MPPD モデルで計算される粒径別の沈着率（GSD=1.0 の場合）
粒径 [nm]
20
50
100
200
500
1,000
作業環境
0.283
0.395
0.309
0.190
0.110
0.069
0.081
一般環境
0.201
0.343
0.311
0.203
0.122
0.081
0.107
10.000
一般環境
許容暴露濃度 (PL) [mg/m 3 ]
沈着率 [-]
10
作業環境
1.000
0.100
0.010
0.001
10
100
1,000
粒子径[nm]
図Ⅴ-5．粒径別の許容暴露濃度（PL）
Ⅴ-12
10,000
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
（DNEL：導出無影響量）を求め，提案している．C60 については，急性毒性に対する DNEL とし
て 44.4 μg/m3，慢性毒性に対する DNEL として 0.27 μg/m3 という値が示されている．
本評価書における許容暴露濃度との違いについて，以下に整理する．本評価書では、肺におけ
る炎症をエンドポイントとし、指標としては肺の組織観察結果と肺胞洗浄液（BALF）中の好中
球数の増加として、気管内投与試験の結果の 0.7 mg/rat を NOAEL とした．一方，EU の DNEL は，
遺伝子発現解析の結果での炎症関連遺伝子の亢進をエンドポイントとして，吸入暴露の 0.12
mg/m3 を有害性影響ありとして，NOAEL を求めた．本評価書では，遺伝子発現解析の結果は，実
際の有害性影響を見ているものではないと考え，有害性影響として採用しなかった．
また、不確実性係数については、DNEL では、種内差 2.5，種差 5，亜急性から慢性への外挿 6
から、75 を不確実性係数としているのに対し，本評価書における不確実性係数は，NOAEL の種
間外挿 3，気管内投与試験から吸入曝露への外挿 3，個人差（作業環境）1，個人差（一般環境）
10 から，9（作業環境）と 90（一般環境）を不確実性係数とした点が異なっている．
６．まとめ
本章では，リスク評価のための NOAEL および不確実性係数を決定し，許容暴露濃度（PL：時
限）を決定した．
リスク評価のための NOAEL を設定するにあたっては，暴露経路として吸入経路を想定し，肺
での炎症反応を評価エンドポイントとした．その上で，得られる情報の中から Sayes et al. (2007)
の気管内投与試験と Morimoto et al. (2010)の吸入暴露試験結果を用い，幾何平均 96 nm (GSD2.0)
の C60 粒子の NOAEL は，労働環境において 3.5 mg/m3，一般環境において 1.3 mg/m3 と算出され
た．リスクの判定に用いる不確実性係数の値は，労働環境において 9，一般環境において 90 とす
るのが適当であると考えた．その結果，幾何平均 96 nm (GSD2.0)の C60 粒子の作業環境中の許容
暴露濃度（PL：時限）は 0.39 mg/m3，一般環境中の許容暴露濃度（PL）は，1.4×10-2 mg/m3 とな
った．粒経別の沈着率を考慮した，実環境で粒径分布が分かっている際に用いることのできる作
0 .0913
業環境中の許容暴露濃度（PL）は 0 .39 
mg/m3，一般環境中の許容暴露濃度（PL）
f work , d  x , GSD  y
0.107
は 0.014 
mg/m3 となった．
f env , d  x , GSD  y
Ⅴ-13
第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
７．参考文献
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第Ⅴ章 許容暴露濃度（PL：時限）の決定
篠原 直秀
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Ⅴ-15
第Ⅵ章
リスクの判定
篠原 直秀
第Ⅵ章
リスク評価
本章では，これまでに述べた暴露評価（第Ⅲ章），有害性評価（第Ⅳ章），許容暴露濃度（PL）
の決定（第Ⅴ章）の結果を踏まえて，フラーレンへの暴露によるリスクの判定を行う．本章は，
Shinohara et al. (submitted)を改変・加筆したものである．
１． 評価方法
本評価書では HQ（Hazard Quotient：ハザード比）による判断方法を用いる．HQ とは，暴露さ
れる濃度を基準値や指針値などで割ったものである．
HQ 
C exp osure
（Ⅵ-1）
OEL( PL) or AAQC( PL)
Cexposure: 推定暴露濃度，OEL (PL): 作業環境中の許容暴露濃度（時限付き），
AAQC (PL): 一般環境中の許容暴露濃度（時限付き）
この HQ の値が，１を超えているかどうかによりリスクの判定を行う．HQ が１を下回ってい
る場合には「リスクの懸念は小さく，対策をとる必要はない」と判断でき，逆に HQ が１を上回
っている場合には，より詳細な有害性評価や暴露評価が推奨されると判断する．
また，本評価書では，粒径による沈着率の違いを反映させるため，粒径範囲 d で区分けし，そ
れぞれについて HQd を算出し，次式により足し合わせた HQtotal を 1 と比較することとした．
HQtotal   HQd
（Ⅴ-2）
d
リスク評価を行う対象は，１）フラーレン製造現場の作業環境における暴露濃度，２）フラー
レン二次製品製造現場における暴露濃度，３）一般環境（工場近傍）における暴露濃度とした．
Ⅵ-1
第Ⅵ章
リスクの判定
篠原 直秀
２．暴露濃度
ここでは，第Ⅲ章で評価したフラーレン製造現場の作業環境，フラーレン二次製品製造現場，
一般環境（工場近傍）における暴露濃度について，リスク評価で用いる吸入性粉じん（10,000 nm
より小さい粒子）を対象として再度示す．
2.1.
フラーレン製造現場の作業環境における暴露濃度
既存文献の現場調査結果から求めたフラーレン製造現場の作業環境におけるフラーレンの濃度
は，10 - 50 nm のものでは 1.2 ×10-4mg/m3，50 - 100 nm のものでは 1.2 × 10-3 mg/m3，100 - 2,000 nm
のものでは 1.2 × 10-3 mg/m3，2,000 - 10,000 nm のものでは 6.0 ×10-2 mg/m3 と考えることができる．
これらの値は，フラーレン以外の粒子も含んだ作業環境中の濃度の上限値であり，平均的な暴露
濃度はより小さいものと考えられる．
2.2.
フラーレン二次製品製造現場における取扱いでの暴露濃度
巻き上がり性試験データと 2 ボックスモデルを用いて推定した作業環境におけるフラーレンへ
の暴露濃度は，10 nm – 100 nm，100 – 1,000 nm，1,000 nm - 10,000 nm の範囲の粒子の濃度は，9.4
× 10-11，2.0 × 10-5，4.2 × 10-3 mg/m3 となった．
2.3.
一般環境（工場近傍）における暴露濃度
巻き上がり性試験結果を用いて，2010 年の生産量の推計値である年間 40 t のフラーレンを取り
扱う事業所の工場周辺における大気中濃度を推定したところ，4.8 × 10-10 μg/m3 と計算された．
この値は，大気中濃度が高濃度に算出される気象条件を設定した 1 ボックスモデルによる簡易
な計算であるが，作業環境よりはるかに低い濃度となった．その他の地域での一般環境中濃度は，
これよりもずっと小さな値であると考えられる．
３．粒径別許容暴露濃度（PL）
GM（幾何平均粒径） x nm （GSD：幾何標準偏差 y）の粒子に対するフラーレン C60 粒子のヒ
0 .0913
ト（作業環境）の許容暴露濃度（PL）は 0 .39  f
mg/m3 である．また，同様に一般環
work , d  x , GSD  y
0.107
境における許容暴露濃度（PL）は，0.014 
mg/m3 である．
f env , d  x , GSD  y
このように，粒子サイズの違いで肺胞への沈着率が異なる．しかし，暴露評価で得られた暴露
濃度は，一定の粒径範囲に対するデータであるため，それぞれの粒径範囲に対応する許容暴露濃
Ⅵ-2
第Ⅵ章
リスクの判定
篠原 直秀
度（PL）を求める必要がある．それぞれの粒径範囲で，重量濃度分布が粒径に対して一様に分布
すると仮定して，それぞれの粒径範囲に対応する許容暴露濃度（PL）を求めた．その結果，実測
に基づく C60 製造現場の作業環境暴露評価における粒子の粒径範囲区分は，10-50 nm，50-100 nm，
100-2,000 nm，2,000-10,000 nm であり，その沈着率を MPPD モデルで求めて個数基準で平均値を
取ったところ、0.37，0.25，0.093，0.035 と計算された．このことから，それぞれの粒径範囲区分
のための許容暴露濃度（PL）は，10-50 nm の粒子のものは 7.6×10-2 mg/m3，50-100 nm の粒子で 0.11
mg/m3，100-2,000 nm の粒子で 0.30 mg/m3，2,000-10,000 nm の粒子で 0.80 mg/m3 と計算された．
一方，推定により行った C60 を扱う作業現場の作業環境暴露評価および工場周辺の一般大気環
境については，暴露評価におけるナノサイズの粒子の粒径範囲区分は 10-100 nm，100-1,000 nm，
1,000-10,000 nm であり，それら粒子のヒト肺胞への沈着率は 0.30，0.085，0.042 および 0.29，0.10，
0.069 と計算された．このことから，それぞれの粒径範囲区分のための許容暴露濃度（PL）は，10-100
nm，100-1,000 nm，1,000-10,000 nm の粒子範囲に対して，作業現場で 9.3×10-2，0.33，0.67 mg/m3，
一般大気環境で 4.1×10-3, 1.2×10-2, 1.7×10-2 mg/m3 と計算された．これらの結果と推定暴露濃度を合
わせて，表Ⅵ-1 にまとめた．
表Ⅵ-1
暴露評価に対応した粒径範囲区分ごとの許容暴露濃度（PL）と推定暴露濃度のまとめ
暴露条件
粒径 [nm]
許容暴露濃度（PL） 推定暴露濃度[mg/m3]
[mg/m3]
作業環境中暴露
有害性試験に基づく
GM 96
0.39
作業環境中暴露
GSD 2.0
フラーレン製造現場の
10-50
7.6×10-2
1.2 ×10-4
作業環境における
50-100
0.11
1.2 ×10-3
暴露濃度
100-2,000
0.30
1.2 ×10-3
2,000-10,000
0.80
6.0 ×10-2
フラーレン二次製品製
10-100
9.3×10-2
9.4×10-11
造現場における
100-1,000
0.33
2.0×10-5
作業環境暴露濃度
1,000-10,000
0.67
4.2×10-3
GM 96, GSD 2.0
1.4×10-2
一般環境（工場近傍）に
10-100
4.1×10-3
1.5×10-15
おける暴露
100-1,000
1.2×10-2
3.2×10-10
1,000-10,000
1.7×10-2
6.9×10-9
一般環境中暴露
有害性試験に基づく
一般環境中暴露
Ⅵ-3
第Ⅵ章
リスクの判定
篠原 直秀
４．リスクの判定
表Ⅴ-4 の情報に基づき，HQ と１との比較による各暴露条件のリスク判定を行った．この判定
結果は，工学的対策や呼吸用保護具を適用していないケースでの推定値である．仮にフラーレン
の排出速度を 10 分の 1 にするような工学的対策（除去率 90%のドラフトチャンバーやグローブボ
ックスの使用等）を講じたり，あるいは，防護係数 10 の呼吸用保護具を装着したりするならば，
暴露濃度は各対策に合わせて 1/10 になる．それらを併用した場合には，暴露濃度は 100 分の 1 に
なると考えられる．
4.1 フラーレン製造現場の作業環境におけるリスクの判定
粒径範囲ごとの HQ は以下のように計算される．
HQ1050nm 
Exposure1050 nm 1.2 ×10 -4

 1.6 ×10 -3
AEL( PL )1050 nm 7.6 ×10 -2
HQ50100nm 
Exposure50100 nm 1.2 ×10 -3

 1.1×10 -2
AEL( PL )50100 nm
0.11
HQ1002 ,000 nm 
Exposure1002 ,000 nm 1.2 ×10 -3

 4.0 ×10 -3
AEL( PL )1002 ,000 nm
0.30
HQ2 ,00010 ,000nm
Exposure2 ,00010 ,000nm 6.0 ×10 -2


 7.5 ×10 -2
AEL( PL )2 ,00010 ,000 nm
0.80
これらを合わせて，全体としての HQtotal は以下のように計算された．
HQtotal  HQ 1050 nm  HQ 50100 nm  HQ 100-2,000 nm  HQ 2,00010,000 nm
 1.6  10 -3  1.1  10 -2  4.0  10 -3  7.5  10 -2
 9.2  10 -2
HQtotal  9.2  10 -2  1
フラーレン製造作業現場における暴露濃度は，HQtotal が 1 よりも小さくなり，リスクの懸念は
ないことが確認された．
4.2 フラーレン二次製品製造現場における取扱いでのリスクの判定
粒径範囲ごとの HQ は次のように計算される．
Ⅵ-4
第Ⅵ章
リスクの判定
HQ10100nm 
篠原 直秀
Exposure10100nm 9.4  10 11

 1.0  10 9
2
AEL( PL )10100nm 9.3  10
HQ1001,000nm 
Exposure1001,000nm
AEL( PL )1001,000nm
HQ1,00010,000nm 
2.0  10 5
 6.1  10 5
0.33

Exposure1,00010 ,000nm
AEL( PL )1,00010,000nm

4.2  10 3
 6.3  10 3
0.67
これらを合わせて，全体としての HQtotal は以下のように計算された．
HQtotal  HQ 10100nm  HQ 1001,000nm  HQ1,00010,000nm
 1.0  10 9  6.1  10 5 6.3  10 3
 6.4  10 3
HQtotal  6.4  10 3  1
フラーレン二次製品を製造現場における樹脂への添加といった作業における推定暴露濃度は，
HQtotal が 1 よりも小さくなり，リスクの懸念はないことが確認された．
4.3 一般環境（工場近傍）におけるリスクの判定
粒径範囲ごとの HQ は以下のように計算される．
HQ10100nm 
Exposure10100nm 1.5  10 15

 3.7  10 12
3
AEL( PL )10100nm 4.1 10
HQ1001,000nm 
Exposure1001,000nm
AEL( PL )1001,000nm
HQ1,00010,000nm 
3.2  10 10

 2.7  10 8
2
1.2  10
Exposure1,00010,000nm
AEL( PL )1,00010,000nm

6.6  10 9
 3.9  10 7
1.7  10 2
これらを合わせて，全体としての HQtotal は以下のように計算された．
HQtotal  HQ 10100 nm  HQ 1001,000 nm  HQ 1,00010 ,000nm
 3.7  10 12  2.7  10 8  3.9  10 7
 4.2  10 7
HQtotal  4.2  10 7  1
Ⅵ-5
第Ⅵ章
リスクの判定
篠原 直秀
将来フラーレンを大規模（年間 40 t）に取り扱う工場の近傍における暴露濃度は，HQtotal が１
よりもはるかに小さくなり，リスクの懸念はないことが確認された．また，99.97%除去できる
HEPA フィルター除塵装置が故障して全量が排出される場合でも，HQtotal は 1.4×10-3 となり，1 よ
りもはるかに小さくなり，リスクの懸念はないことが確認された．
５．まとめ
フラーレン製造現場および二次製品製造のための取扱い作業現場の（推定）暴露濃度は，第Ⅲ
章で評価した現状および想定した暴露状況において，HQ を用いて評価を行った結果，リスクの
懸念はないことが確認された．ここでの暴露濃度の推定は，粉じんに対する防護を実施していな
い作業環境濃度に基づくものであったが，実際の作業現場では，防塵マスクの装着が実行されて
いるケースが多く，ここで推定された数値よりも現実の暴露濃度は低く，HQ はより小さくなる
と考えられる．また，一般環境中でのフラーレンへの暴露によるリスクは，フラーレンを大規模
に取り扱う工場の近傍において除塵装置が故障していたとしてもリスクの懸念はないことが確認
された．
６．参考文献
Shinohara N, Gamo M, Nakanishi J (Submitted). Risk assessment of fullerene C60. Risk analysis.
Ⅵ-6
第Ⅶ章
おわりに
篠原 直秀
第Ⅶ章
おわりに
１．本評価書のまとめ
本評価書では，そのユニークな構造と特性から，ナノ材料として将来様々な応用が期待されて
いるフラーレンを取り上げてリスク評価を行った．
フラーレンの内，本評価書で取り上げた C60 は，単独では直径が約 1 nm の分子であるが，常温
で固体であり，有機溶媒に溶解させるか修飾するなどして水溶化させなければ，単独の分子とし
ては存在しない．
フラーレンは，メガネやボーリングの球などの樹脂への添加剤や，金属への添加剤，潤滑油へ
の添加剤，化粧品等に応用されているが，現時点ではその量は必ずしも多くはない．今後，太陽
電池電極材や燃料電池電極材の樹脂添加剤，医薬品関連原料などに応用が期待される分野として，
研究開発が進められている．本評価書では，化粧品や医薬品といった意図的な接触・摂取を行う
用途は除外し，粉体の性状を有した C60 への製造プロセス等における暴露を評価対象としている．
フラーレン誘導体については，本評価書での評価の対象から外したが，必要と思われる情報につ
いては整理して示した．
フラーレンの製造プロセスや，現在実用化されている二次製品のライフサイクルを概観し，以
下の 3 点についてリスク評価を行った．
１）フラーレン粉体の袋詰め等を伴う製造現場での暴露
２）樹脂や金属への添加作業（フラーレン加工現場）での比較的少量の取扱いによる暴露
３）近い将来に大規模に取り扱う工場が現れることを想定した工場近隣一般環境での暴露
現在フラーレンが使用されている製品の使用中の暴露量については，定性的な評価ではあるが，
極めて低いことが予想された．暴露濃度は，１）については現場での測定データに基づいた推定
を行い，２）と３）については，巻き上がり性試験結果とモデル計算を行って推定した．推定値
は，現実にありうる範囲でのワーストケースを採用した．例を挙げると，粉体の取扱いにおいて
は通常防じんマスク等の装着が行われるが，ここではマスク装着による防護効果を加味しない労
Ⅶ-1
第Ⅶ章
おわりに
篠原 直秀
働環境における濃度を暴露濃度とした．また，巻き上がり性試験は，粉体をまき散らすような激
しい取扱いに相当すると考えられ，現実の取扱いでの粉じんの排出係数はずっと小さい可能性が
ある．
フラーレンの有害性評価における評価エンドポイントには，現実に起こりうる主要な暴露経路
が吸入経路であることと，体内動態に関する情報から吸入暴露したフラーレンは全身への移行が
ほとんどないと考えられることから，肺での炎症反応を採用した．吸入経路の暴露による有害性
試験の結果から，NOAEL（No Observed Adverse Effect Level: 無毒性量）を決定した．
吸入経路の暴露試験（吸入暴露試験，気管内投与試験）として現在得られている情報から，吸
入暴露試験では全く有害性影響が観察されていないことが確認された．気管内投与試験の結果か
ら求めた NOAEL に，暴露期間の違い等を反映して労働環境と一般環境とで別の値を設定し，粒
子サイズによる肺胞への沈着率の違いを反映して粒径別の補正を行うことにした．その結果，労
働環境および一般環境における NOAEL は，3.5 mg/m3 および 1.3 mg/m3 となった．また，労働
環境および一般環境における不確実性係数についても検討し，それぞれ 9 および 90 と設定した．
この NOAEL と不確実性係数を用いて粒径別の沈着率の補正を行った結果，労働環境及び一般環
0 .0913
境 に お け る 許 容 暴 露 濃 度 （ PL ： 時 限 ） を 求 め た と こ ろ ， 0 .39  f
mg/m3 お よ
work , d  x , GSD  y
0.107
mg/m3 となった．
び 0.014 
f env , d  x , GSD  y
リスクの判定は，HQ（Hazard Quotient：ハザード比）を用いて行った．すなわち，HQ が１
.
より大きくなるか小さくなるかによってリスクを判定するという方法である．その結果，上記１）
２）３）のいずれも，リスクの懸念はないことが確認された．
２．今後の課題
本リスク評価書における結果は，フラーレンやフラーレン二次製品を製造する作業現場及びそ
の近傍における吸入暴露によるヒト健康への影響のリスクについて適応できるものである．評価
の中で想定した現状や近い将来での暴露状況および，得られている有害性情報の範囲において，
リスクの懸念はないという判断は確かなものであると考えられる．ただし，今後，各方面での新
たな用途開発が進み，用途と量の両面でフラーレンの使用が拡大するにつれて，本評価書の枠組
みにおいて「リスクの懸念はない」とは判断できないような暴露濃度が懸念されるようになるか
もしれない．用途開発や市場化を行う事業者は，そのような事態をなるべく早期に予測し，より
精緻な有害性評価や暴露評価の実施を検討することが望まれる．
また，有害性に関する新たな知見が得られたり解析が進んだりすることによって，信頼性の高
い NOAEL を得ることにより許容暴露濃度を見直すことが適当と判断されることもあり得る．よ
り厳しい許容暴露濃度を適用すべきであると判断されることもあり得るが，より高い値に見直さ
れる可能性も十分にある．
本評価書では，医薬品や化粧品に対してのリスク評価は対象外としたが，今後これらの用途で
の使用量が大きく増大する可能性があり，使用法に応じた形での経口・経皮暴露に対するリスク
Ⅶ-2
第Ⅶ章
おわりに
篠原 直秀
評価が必要である．また，特にこれらの用途では環境中への排出が非常に大きくなることから，
生態系への影響についても把握し，リスク評価を行うことが望まれる．
また，フラーレンを様々な分野で活用していくために，多くのフラーレン誘導体が開発されつ
つある．これらの誘導体に対しては，実用化後にリスク評価を行った場合，リスクがありと判定
されれば，有害性の面でもコスト面でも非常に損失が大きい．このことから，開発と並行して簡
便なリスク評価を実施し，最終製品として実用化する段階で詳細なリスク評価をするというスキ
ームの確立が望まれる．
本評価結果を見ても，工業製品として使用されるフラーレンについては，作業環境においても
一般環境においても，リスクの懸念は小さいことから，産業界は使用を不安視する必要はなく，
研究開発者とともに有効に活用していくべきだと考えている．ただし，使用方法や使用量，誘導
体の種類などによってはリスクが生じる可能性があることは頭の片隅に置き，安全性に関しても
過信せずに，開発・実用を進めてほしい．一般消費者においては，工業製品として使用されてい
るフラーレンを使用中に摂取する可能性が極めて小さいことから，製品化されている工業製品に
ついて有害性やリスクについて懸念する必要はないだろう．
本評価書での解析により，フラーレンのリスクが適切に管理されつつ，多方面でのイノベーシ
ョンが実現されることを期待する．
最後に，本リスク評価書は，2011 年 7 月 22 日までにとりまとめられた最終報告版である．
Ⅶ-3
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
第Ⅷ章
外部レビュアーのコメントと筆者らの対応
本評価書の公開に先立ち，
（独）産業技術総合研究所外部の専門家に本評価書のレビューを依頼
し，それぞれの専門の立場から多くのコメントを頂いた．本章では，各レビュアーのコメント全
てとそれぞれのコメントに対する筆者らの対応結果について記載した．
本評価書では，以下の 5 名のレビュアーの方々（五十音順，敬称略）に評価書原案（外部レビ
ュー版）のレビューを依頼した．
伊藤潤平
三井化学株式会社 環境・安全センター
市原学
名古屋大学大学院医学系研究科
櫻井治彦
中央労働災害防止協会
高橋道人
病理ピアレビューセンター
谷口武俊
電力中央研究所
センター長
環境労働衛生学分野
准教授
労働衛生調査分析センター技術顧問
医学博士
研究参事/東京大学大学院工学系研究科
客員教授
なお，次ページ以降に示す各レビュアーのコメントにあるページおよび行番号は，評価書原案
（外部レビュー版）のものであり，本評価書のページおよび行番号とは異なる．また，誤字脱字
や単位の誤り等についての簡単なご指摘に関しては，指摘に沿った修正を行った上で，本章にお
いては省略することとした．
Ⅷ-1
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
伊藤潤平レビュアーからのコメントと筆者らの対応
人健康リスクを評価するに，吸入経路で暴露した場合の有害性評価を肺に限定する過程で議論・
考察を補強した方が良いと考えます．
第 IV 章
有害性評価，2．体内動態の項
IV13－14
13
C 標識した「構造不明の炭素ナノ粒子」を用いた吸入暴露試験において，ナノ粒子が脳に移行
することを示唆する文献（Oberdӧrster G et al., 2004）に対し，Shinohara 等の吸入暴露試験（NEDO
プロジェクト
P06041）では脳における組織重量当たりの C60 濃度が検出限界以下であることか
ら脳への移行を排除している．
Oberdӧrster 等は 13C 標識した炭素ナノ粒子（<100nm，0.16mg/m3）を 6 時間ラットに吸入暴露
し，嗅球における組織重量当たりの炭素濃度が 3.5×10-4～4.3×10-4mg/g と，肺中における組織重量
当たりの炭素濃度の 25%～73%であったとしている．この結果は本経路の暴露においてナノ粒子
は構造不明ではあるが，鼻粘膜から嗅球を経由し，脳への移行が有ることを示している．
一方，Shinohara 等は C60 ナノ粒子（平均 96nm，0.13mg/m3）をラットに 1 日 6 時間，週 5 日間，
4 週間吸入暴露し，脳における組織重量当たりの C60 濃度が検出限界以下（＜8.9×10-6mg/g）であ
り，肺中おける組織重量当たりの C60 の濃度の＜0.17％としている．このことからフラーレンナノ
粒子の吸入暴露時の嗅球を経由した脳への移行もほとんどないと考えても良いと判断している．
異なる結果について，それが何に由来するのか考察を丁寧にしたほうが良いと考えます．
・ 「構造不明のナノ粒子」と C60 ナノ粒子との挙動が異なると見るのか，異なるとすればその
理由をどう考えているのか
【対応】
異なるかどうかはこれらの結果からだけで判断できません。と言いますのは、Oberdörster の研
究対象の物質が何であるか分からないからです。ただ、はっきり言えることは、彼の研究におい
て検出された炭素濃度は 350 ng/g であり，Shinohara et al.の検出限界は 8.9 ng/g であり，フラーレ
ン自体は彼らの研究で得られただけの量が脳へ移行していることはないということです．
・ 構造不明のナノ粒子中に C60 ナノ粒子は存在しないのか，あるいはごく微量なのか
【対応】
構造不明の炭素ナノ粒子は、アルゴン中で黒鉛電極に放電させて製造しているため、C60 等のフ
ラーレンが含有されている可能性は全くゼロではありませんが、誰にも分かりません。講演会で
の質問に対し、Oberdörster 自身が分からないと答えています。
Ⅷ-2
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
・ フラーレンナノ粒子は特殊であり単なるナノ粒子と挙動が違うのか，そうであればその理由
はどう考えているのか
【対応】
異なるかどうかはこれらの結果からだけで判断できません。ただし、既存の研究等を考え合わ
せると、タンパクの吸着量はナノ粒子の種類ごとに違いがあり、そのことから細胞への取り込ま
れやすさや血中への移行しやすさなどが異なる可能性があると考えております。
・ 暴露時間と脳における組織重量当たりのナノ粒子濃度との関連性をどう考えるのか
C60 ナノ粒子を短期間（Oberdӧrster 等と同様 6 時間）吸入暴露した場合，脳における組織重量
当たりの濃度は変化するのか
【対応】
脳への移行がある場合には，暴露時間が長くなれば脳における組織重量当たりの濃度は上昇す
ると考えられます．しかしながら，Shinohara et al. の研究では長時間の暴露後に検出されておら
ず，移行していないと考えられる．
・ 長期間暴露ではクリアランスのメカニズムで結果的に脳における組織重量当たりの濃度が低
くなり，移行があったとしても観察されなかった可能性がある．考察が必要ではないか．
【対応】
Oberdörster et al.の短時間暴露後は 1，2，3，7 日後で測定を行っており、1 日後から 7 日後まで、
脳内の濃度に変化は見られないことから、脳からのクリアランスは進んでいないことか示唆され
ております。本評価書の長時間暴露後は 3 日後に測って、検出下限以下であり，このことからも
脳への移行がほとんどなかったと言うことができます．検出されていないことに対して，いろい
ろと仮説を立てて議論することはしないことにいたしました．
6.2 遺伝毒性のまとめ
IV-42
29-33行の部分，「フラーレンによる直接的なDNA損傷は恐らくないと考えられるが，
ROSを介したDNA損傷のメカニズムは考えられるといえる．」とあるが，活性酸素生成能を有
する比較的安定な3C60が吸入される確率について，知見があれば記載し，暴露の可能性が仮にある
場合，DNA損傷による肺に対するリスクを記述・考察したほうが良いと考えます．
【対応】
3
C60 は比較的安定ですが、その寿命は数十マイクロ秒程度であり、体内まで入ることはないと
考えられます。
Ⅷ-3
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
① EU の DNEL（急性 44.4 μg/m3、慢性 0.27 μg/m3）と等価 NOAEL（90 日間 3.1 mg/m3）は乖離
している。過小評価していると取られる可能性がるため、算出方法などの違いに関して何ら
かの説明した方が良い。
【対応】
EU の DNEL と我々の許容暴露濃度の違いは、エンドポイントの違いと不確実性係数の違いの
二点に起因しております。
我々は、肺における炎症をエンドポイントとし、指標としては肺の組織観察結果と肺胞洗浄液
（BALF）中の好中球数の増加として、気管内投与試験の結果の 0.7 mg/rat を NOAEL といたしま
した。一方、EU の DNEL は、遺伝子発現解析の結果での炎症関連遺伝子の亢進をエンドポイン
トとして、吸入暴露の 0.12 mg/m3 を有害性影響をありとして、NOAEL を求めております。我々
は、遺伝子発現解析の結果は、実際の有害性影響を見ているものではないと考えております。
また、不確実性係数については、DNEL では、種内差 2.5，種差 5，亜急性から慢性への外挿 6
から、75 を不確実性係数としております。我々の不確実性係数は，NOAEL の種間外挿 3，気管内
投与試験から吸入曝露への外挿 3，個人差（作業環境）1，個人差（一般環境）10 から、9（作業
環境）と 90（一般環境）を不確実性係数としております。
上記の解説を、本文中に追加いたします。
② リスク評価にあたり性差を考慮しなかった理由を補足した方が良いと思われる。
【対応】
まず、今回の実験を始める時点で、わが国での吸入試験実施するための capacity、さらには 5
年間のプロジェクトの中で、TiO2、CNT などの試験をしなければならない状況の中で、動物試験
の数を限定しなければならなかったという制約条件があります。他の既存の有害性試験において
も，粒子状物質の肺への影響に性差があるかどうかは、これまでに知見はありません．本評価で
対象とした有害性影響が肺における炎症反応であり，生殖発生毒性などと比べて性差の影響を受
けにくいと考えられるため，性差はないものとして取り扱いました．
③ Ⅳ-65-19～20 で“ヒトに比べてラットの方が粒子への暴露に対する肺の感受性が強いと判断で
きる”とあるが、反論は予想される。したがって、TD については、“実験結果からは 1 と考
えられるが、安全面から 3 を選択した”でも良いのではないか？
仮に変更した場合でも、
MOE との比較において問題はないと考える。
【対応】
肺における慢性炎症についての実験結果からは、ラットの感受性がヒトより強いため，TD を 1
とすることは，ILSI (2000)などでも取り上げられており，一般的に認められていると考え，TD の
1 は変更いたしませんでした．
Ⅷ-4
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
④ 二次製品製造現場における推定暴露濃度がフラーレン製造現場におけるそれに比べて低いと
感じる。投入時の巻き上がりなど、フラーレン製造現場とほぼ同等のように感じられるので、
過小評価ととられないか？
補足説明の追加を検討されたらどうか。
【対応】
ご指摘の通り、二次製品製造現場における推定暴露濃度がフラーレン製造現場におけるそれに
比べて低くなっております。これは、フラーレン製造現場における推定暴露濃度が、フラーレン
以外の粒子も含めた粒子濃度に基づいて算出されていることによります。このことについて、追
加の補足説明を加えました。
個別コメント
Ⅲ-4/14
“ボーリング球の数が今後増える可能性は低いとされている”の根拠を明示し
た方が良い（ゴルフクラブについては明示されている）。
【対応】
ご指摘に従い、情報源である（A 社，私信 2007）を追記いたしました。
Ⅲ-8/3-4
表面積研磨時に排出量が小さいとする根拠が不明確。
【対応】
ご指摘に従って，以下の文章を追加いたしました。
“表面研磨時の排出に関しては、研磨される
総量が小さいため、樹脂や金属に交じって排出されるフラーレンの排出も極めて小さいと考えら
れ，評価対象からははずした．”
Ⅲ-16/27
空気を流しながら振とうさせ
←
振とう回数を記載する方が良い。
【対応】
振とう回数は、約 2,500rpm でしたので、追記いたしました。また、他の評価書に合わせて、
“振
とう”ではなく、“攪拌”に修正いたしました。
Ⅲ-18/24
「その意味で、現実にありえるワーストケースの評価となっている」
←
ど
うしてワーストケースの評価なのかが分かりにくい。説明をもう少し加える方が良い。
【対応】
巻き上がり性試験では、実際の取扱時よりも、粉体が舞いやすい条件で試験をしております。
また、試験に用いている量と工場で取扱されると想定できる量に大きな違いがないことから、現
Ⅷ-5
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
実にありえるワーストケースの評価となっております。「とは言え，」という表現が、分かりにく
くしておりましたので、削除いたしました。また、文章を修正いたしました。
Ⅲ-21/9-16
製造工場の暴露が樹脂加工工場に比較して、特に 10-100nm の暴露濃度が極端に
小さい(107～108)が、推定値の信頼性は大丈夫か？
【対応】
製造工場における 10-100nm の粒子へ暴露が、加工工場での暴露より極端に大きくなっているの
は、元にしている試験がフラーレンそのものを測定しているのではないことに起因しております。
製造工場における 10-100nm の粒子はバックグラウンドも高く、顕微鏡観察でもフラーレン粒子と
確認されていないことから、フラーレン以外の粒子である可能性が非常に高い。ただし、安全側
の観点から、暴露濃度推定ではその値を用いることにしており、そのために、フラーレン粒子の
みを用いた巻き上がり性試験結果に基づく樹脂加工工場における暴露濃度と比べて、極端に高い
濃度になりました。これらについて、ご指摘の点が分かりやすくなるように、本文中に説明を追
加いたしました。
Ⅳ-3/33 雄,9 週令,約 300 g に違和感を感じます。Wistar では 13 週令くらいの体重に相当しません
か？
【対応】
雄の Wistar rat の体重として、大きすぎることはないと考えております。日本チャールスリバー
株式会社が公表している長期飼育モニタリングデータのリンクを以下に示します。ご参照くださ
い。http://www.crj.co.jp/pdf/info_common/100/8315215/survival_data_WI_mar_2009.pdf
Ⅳ-18/24
沈着率は 0.18 および 0.14 とあるが、求め方が良く分からない。沈着率は、8.2.1
（Ⅳ-59、2 行およびⅣ-60、10 行)で NOAEL を求めるのに必要な重要な値である。より、丁寧に
求め方を示したほうが良い。
【対応】
Appendix（Ⅳ-78，79）に網掛けで示した２式による肺保持量と実測値との差の二乗和が最も小
さくなるように、最適な沈着率を求めました．このことについて，説明を追加いたしました．
IV-20/5～8
"肺組織の炎症度は、３日後に一過性の増加が確認されたが、それ以降は陰性対
照と同レベルであった。
Ⅷ-6
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
・・・その他の臓器での所見以外はどの項目でも有意な増加が確認された。
→病理組織学的/科学的な記述に再考のこと。よく読むとオカシイ・不鮮明な文章。"
【対応】
ご指摘の通り，病理組織学的に不明瞭・不正確な記述が含まれておりましたので，修正いたし
ました。
IV-21/4～5
・・・増加率は非常にわずかと言える→より「定量的」な記述とすべき。
【対応】
ご指摘に従い、以下のように修正いたしました．“陽性対照の酸化ニッケル投与群（0.2 mg/rat）
の増加率の 1/10 以下とわずかであった．”
IV-21/9
血中の炎症反応（白血球数・・・）は表現不適→炎症と関連する血液細胞の変
化、とすべき。
【対応】
ご指摘に従い、修正いたしました．
IV-21/35
マクロファージ炎症たんぱく→炎症学的には「ケモカイン」の用語の方が適切。
【対応】
ご指摘に従い、“ケモカイン”に修正いたしました。
IV-22/22
「上気道」→上部気道。どこからどこを言っているのか？
投与法によるが、
気管内投与であるから当然のこと上部気道も暴露される。記述を再考されたい。
【対応】
ご指摘の通り、気管内投与試験では、上部気道も暴露されるため、本記述を削除いたしました。
また、別の個所においても、“上気道”と記していた箇所を“上部気道”に修正いたしました。
IV-23/25
血管の膨張→血管の「拡張」
【対応】
ご指摘に従い、“血管の拡張”に修正いたしました。
Ⅷ-7
第Ⅷ章
IV-23/30
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
・・・粒子の代謝のために？→貪食処理の細胞反応として
【対応】
ご指摘に従い、“貪食処理の細胞反応”に修正いたしました。
IV-23/35
・・・重度の肺損傷？→
間質反応
【対応】
ご指摘に従い、“間質反応”に修正いたしました。
IV-67/4
有意な有害性とあるが、必ずしも全てが定量的に有意差検定をして評価してい
ないため、“有意な”を削除しては？
【対応】
ご指摘の通り、既存の経口暴露，経皮暴露においては，必ずしも全てが定量的に有意差検定を
しているわけではないことから、“有意な”を削除いたしました。
V-3/4-20
Ⅳ章では、粒径が 96nm の粒子の NOAEL を求めた。ここでは、粒径範囲ごとの
NOAEL を算出しているが、V 章はリスク評価の章である。Ⅳ章 8 項にまとめるべきではないか。
【対応】
ここでは、暴露評価結果に合わせた粒径ごとの NOAEL の算出をしていることから、リスク評
価の章に残すことにしました。
V-3/10
沈着率が示されているが、MPPD モデル（3.1.2)で求めたのか、実測値から求め
たのかが、分からない。NOAEL 算出に使用する重要な値なので、求め方を示すべきである。
【対応】
ご指摘に従い、求め方を以下のように明記いたしました。
“沈着率を MPPD モデルで求めて個
数基準で平均値を取ったところ、・・・”
Ⅷ-8
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
市原学レビュアーからのコメントと筆者らの対応
はじめに，今回の評価書を読ませていただき，リスク評価のための多大な努力をされたことに深
い敬意を感じます．文献収集とその評価，独自データの提示，さらにリスク評価に際しての練ら
れた論理について，大きな感銘を覚えました．私が読み，率直に感じた点，気づいた点を率直に，
ここに述べたいと思います．
二酸化チタン評価書とほぼ同様の論理構成となっています．個々のコメントは以下の通りです．
１）IV-5 4 行目
クリアランスされない - 排泄されない，という言い方のほうが良いかもし
れません．
【対応】
ご指摘に従って，“排泄されない”に修正いたしました．
２）IV-65，66
個体差の問題，二酸化チタン評価書へのコメント１０）を参照してください．
“二酸化チタン評価書へのコメント１０）疫学では Health Worker Effect という言葉で，健康な
ものが脱落せず働き続けることが知られています．炎症，そしてそれに引き続く癌に至るプロセ
スには癌抑制遺伝子など，さまざまな因子が関与していることから，かならずしも，日常的な健
康さと，最終的な癌になりやすさ，が平行している，と言えるかどうか，わからないと思います．
”
【対応】
感受性の個人差について、詳細に見れば病気毎に違いがあり、通常の病気の健全さとがんに対
する健全さとの間に、集団としての違いがあるということはあるかも知れません。しかし、肺の
炎症反応は初期の生体反応であり重篤な影響を示すものではないということから，一般の労働者
を高感受性群とみなさないことは妥当だと考えております．
３）IV-47，6 行目 “卵黄嚢”―――二次卵黄嚢のことを意味していないかどうか，農学系の生
物学者にコメントをいただくのが良いと思います．
【対応】
日本トキシコロジー学会教育委員会編集の「新版
トキシコロジー」では、げっ歯類では内反
した卵黄嚢が広く胚を包むようになっているとされており、二次卵黄嚢に相当する部位は存在し
ないと考えてよいと思われます。
４）IV-47，11 行目
卵黄嚢胎盤は有袋類で発達し，真獣類であるヒト，マウスでは漿尿膜胎盤
Ⅷ-9
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
が発達している，と理解しています．むしろ，マウスとヒトはこの点では近いわけなので，ここ
での論理展開については再考を要すると思います．
【対応】
確かに，有袋類と比較するとげっ歯類とヒトは近いといえますが，以下のようにげっ歯類とヒ
トでは卵黄嚢の持つ働きが大きく異なっております．C60 の発生毒性実験結果は、トリパンブルー
（TB）の催奇形性実験の結果と類似しております。TB は卵黄嚢に沈着して胚への栄養供給を妨
げることで、奇形を発現することが広く知られております（塩田 1992,
日本トキシコロジー学
会教育委員会 2009）。その上で、げっ歯類の妊娠早期における卵黄嚢の肺への影響供給に対する
重要性はヒトと異なるため（塩田 1992, 日本トキシコロジー学会教育委員会 2009）、TB の催奇
形性はヒトには当てはまらないとされております（Nielsen ei al. 2001）。
５）フラーレンの許容暴露濃度を，結果的には気管内投与実験を基に決めていますが，10 年後の
見直しの時点では，やはり吸入曝露実験を基に評価することを展望として示したほうが良いので
はないかと思います．肺だけでなく，長期暴露による肝臓，脳，生殖器への影響，そして，発達
影響について，吸入曝露による評価が最終的には必要になってくるように思えます．
【対応】
フラーレンがどの程度使われるのか，どういう形体で、何に使われるのかによって、今後の試
験の必要性は変わってくると考えています．そもそも、フラーレンは大きな結晶体で、ナノ粒子
になる要素が低いです．今回のリスク評価の結果においても，マージンが大きく，有害性評価の
精度を上げる重要性は，現状では高くないと思われます．そのことも考え、使われ方をみつつ，
詳細な試験の『実施を検討するのが合理的だと考えます．
Ⅷ-10
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
櫻井治彦レビュアーからのコメントと筆者らの対応
許容暴露濃度の決定に関する部分を中心としてレビューした結果，下記のコメントを提出いた
します．
関連する文献情報を十分に収集・解析し，詳細な考察を介して結論を導き出しており，特に，
気管内投与試験のデータを用いて許容暴露濃度を提案している点を高く評価します．
（１）Ⅳ－59 ページ，25－26 行で，
「吸入ばく露試験と気管内投与試験の量試験において，最大
となる肺保持量が等しい時にその有害性も等しくなると仮定し・・・・」と基本的な仮定を設け
ています．しかしこの仮定が適切であるかどうかには，かなりの不確実性があると思われます．
吸入暴露では，肺保持量は上に凸の曲線を描きながら上昇し，暴露終了時点で最大の保持量に
なります．他方，気管内投与試験では，最初の一回注入時に肺保持量は最大値を示し，その後上
に凹の曲線を描きながら減少して，暴露終了時には最小値になります．AUC は大きく異なるし，
比較的高い保持量を維持する期間も吸入試験のほうが長いはずです．これらのことを考えると，
両者における有害性が同等であるという一般的な想定には無理があると思われます．もっともそ
れを考慮して， Ⅳ－65 ページ，33－34 行に，
「暴露期間や気管内投与試験から吸入試験への外
挿を考え合わせた不確実性係数は 3 とした」と書かれているのは，妥当性ありと認めます．
【対応】
ご指摘の通り、肺保持量ベースでの等価有害性の仮定には不確実性があります。ただし、国際
的にも保持量ベースでの議論も始まっており、他に妥当と言える仮定がないことから、肺保持量
を用いた仮定を適用しました。その上で、AUC との比較から不確実性係数３を取っております。
今後の国際的議論の中で、この換算や不確実性についても、方向性が定まっていくものと考えて
おります。
（２）上記の暴露期間については，フラーレンの肺における蓄積を推定し，90 日において平衡濃
度にどの程度近づいているかを推定しておけばなお良いと思われます．Ⅳ－15 ページに，26 日，
29 日，14 日，22 日，16～24 日等の半減期の記載があり，それほど長くないので，90 日ばく露
で十分平衡に近い値になっていることも考えられます．データはかなり多く得られているような
ので，比較的精度の高い推定が可能でしょう．
【対応】
1 日 6 時間、週 5 日間の暴露を続けた場合の肺保持量保持量は次ページの図のようになり、90
日後の保持量は平衡保持量の 71%でした．
Ⅷ-11
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
（３）Ⅳ－65 ページ，35 行に「本報告書では，粒子の肺への沈着速度が等価とする補正を行っ
て，ラットの NOAEL からヒトの NOAEL へ外挿した」と記載されています．これは，「体重あ
たり肺胞沈着速度が等しければラットとヒトで用量が等価であるとみなす」という想定に基づい
ているのでしょう．この想定は，肺胞沈着速度が等しければ，ばく露期間の長さに関係なく等し
い毒性影響を示すという意味に受け取れますが，そのような現象が一般に成立することは考え難
いことです．本報告書で行おうとしているのは，試験動物の NOAEL のヒトへの外挿ですが，暴
露期間が等価であることが前提となっています．すなわち，同じ 13 週暴露における外挿です． 13
週の暴露終了時までの肺胞沈着量の総量を体重で除した値が等しければ，用量が等価であると想
定していることに他なりません．要するにクリアランスを考慮しないで，総沈着量を用量の指標
としていることになります．したがって，沈着速度ではなく，総沈着量という言葉を使うほうが
適切と考えます．
なお，Ⅳ－66 ページ 1 行で，「これは，沈着量が等価とする外挿と比べて必ずしも安全側の推
計にはなっていない」と書かれていますが，
「保持量が等価とする外挿と比べて・・・・」が正し
いと思われます．なお，この点を考慮してラット・ヒト間の NOAEL の外挿に関わる不確実性係
数を 3 としたことには同意できます．
【対応】
ご指摘の通り，本評価書では，
「体重あたり肺胞沈着速度が等しければラットとヒトで用量が
等価であるとみなす」という仮定を，暴露期間が等価であることを前提としたラット-ヒト間の外
挿において行っております．ただし，ラットとヒトの沈着率や呼吸量などは異なる値を用いてい
ることから，総沈着量は同じではありません．そのため，
“総沈着量”という用語は使用いたしま
せんでした．
後者の指摘に対しては，ご指摘に従って，“保持量”に修正いたしました．
Ⅷ-12
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
（４）本報告書では Shinohara et al.(2010)のデータの他，MPPD モデルによる推計も用いて，
種間外挿によるデフォルトの不確実性係数のうち，トキシコキネティックスに関わる部分を 1 と
しているわけですが，これらの推計の信頼性の程度，およびそれを考慮しても不確実性係数を 1
まで減少させることの妥当性について議論を追加していただければ幸いです．なお，ラット‐ヒ
ト間の NOAEL の外挿に関わる不確実性係数として，別途 3 が適用されているので結果としては
妥当と思われますが，トキシコキネティックスに関する不確実性係数のうちに含めてないために，
わかりにくくなっています．
Ⅳ－60，24 行以下の式において，種差に関するパラメータの補正が行われていますが，この部
分のみで計算すると 1.52 となります．つまり，ヒトはラットより体重当たりの肺沈着量が少ない
からヒトの NOAEL をラットの 1.52 倍にすることとしています．なお，更に暴露時間の補正によ
り 4 分の 3 とし，トータルで 1.13 倍となっています．ヒトとラットにおける肺沈着量と肺胞面積
が正確に測定されているならば問題ないのですが，モデルによる推定値やデフォルト値などを用
いざるを得ないことによる不確実性についても評価し，議論を追加することを希望します．その
結果，上記の不確実性係数 3 になるとすれば，了解できます．
なお，体重当たりとするより，肺胞表面積当たりとするほうが妥当性が高いと思われますが，
ラットとヒトの肺胞面積比は体重比より大きいので，肺胞面積当たりで計算すると，1.52 より小
さい値になると考えます．これも含めて上記の不確実性係数 3 になると判断されたとすれば，了
解できます．
トキシコキネティックスに関する種間外挿の不確実性係数のデフォルト値が 3～4 とされてい
るのに対し，この報告書で 3 を採用したとすればあまり変わらないことになります．しかし，ト
キシコキネティックスを詳細に検討したことにより，ヒトがラットより呼吸器への沈着が少ない
ことを定量的に評価し，許容暴露濃度設定の精度を高める面で一定の成功を収めたと評価します．
【対応】
体重を用いた理由は，本文中にも示したように，情報量が多く不確実性が小さいためです．実
際，対象とした有害性試験でも全て体重が記載されております．
ラット-ヒト間の外挿の不確実性係数を 3 とした点については，トキシコキネティクスとトキシ
コダイナミクスのどちらにも関連する部分が入っていることから，トキシコキネティクスに合わ
せることはしませんでした．ただし，論じる位置を種差の直後に移動させて，分かりやすくいた
しました．また，ラット-ヒト間の外挿の不確実性の中に，肺表面積比でなく体重比を用いたこと
による不確実性についても含めていることを明記いたしました．
Ⅷ-13
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
高橋道人レビュアーからのコメントと筆者らの対応
全体的な評価書の構成について，図および表を１頁大に縦に挿入する場合，上部を右に配置して
いるが，「二酸化チタン」では上部を左に配置している．整合性を取るべきである．
【対応】
ご指摘に従い、フォーマットを修正いたしました。
IV-23 頁：4.4. 肺の炎症生成メカニズム
2 行目「気管及び」
：気管にも沈着するが，ここでは気管に限らず気管支，細気管支などを含め
た「気道」ではないでしょうか？
【対応】
ご指摘に従い、「気道」に修正いたしました。
IV-23 頁：下から 4 行目，
「貪食中もしくは」：削除する（現実的でない表現）
【対応】
ご指摘に従い、「貪食中もしくは」を削除いたしました。
IV-47 頁：4 行目，
「Slc マウス」という系のマウスはいないので「SLC から購入したマウス」とい
う意味でしょうか？出来れば系を特定して記載した方がよい．
【対応】
ご指摘のように、購入先を示す SLC でした。原論文中には、SLC-ICR mouse と表記 s れており
ましたが、誤解などを避けるために「ICR マウス」と表記することにいたしました。
IV-53 頁：5 行目，「ターゲット器官」は「毒性標的器官」とする．
【対応】
ご指摘に従い、「毒性標的器官」との表記に変更いたしました。
IV-53 頁：28 行目，
「気管，心房，回腸」，30 行目，
「胃底，輸精管，子宮」に影響はなかった，と
しているが，主要臓器でないこれらの特定器官を名指しする意味が不明である．
Ⅷ-14
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
【対応】
原論文のままに記述しておりましたが、ご指摘の通り、主要臓器ではないことから、それぞれ
の個所を、「観察した器官において」との表記に変更いたしました。
IV-53 頁：35 行目，「繊維性」を「線維性」に修正．繊維は fabric に用い，生体には後者．
【対応】
ご指摘に従い、「線維性」に修正いたしました。
Ⅷ-15
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
谷口武俊レビュアーからのコメントと筆者らの対応
１．ナノ材料リスク評価書に共通するコメント
①
工業ナノ材料の生産現場における職業人の当該ナノ粒子の吸入暴露による健康リスクに焦点
を絞っているとはいえ，今後国内外の産業界，規制行政庁，学術界に有用な情報を提供する
成果物であると評価したい．
理由：
ナノテクノロジーは世の中を変える，いわゆる tranformational 技術のひとつで，新興（emerging）
技術の代表格として研究開発，実用化，市場開拓競争がグローバルに繰り広げられているが，一
方において過去の新規技術の社会導入に際しての数多くの挫折や障害を教訓として，リスク評
価・管理，規制が後追い的とはいえ，ほぼ初期の段階から強く意識され模索・試行されている．
このような状況のなか，OECD 工業ナノ材料安全部会のスポンサーシップ・プログラムに参加し，
米国・カナダと共同し Phase1 Testing のエンドポイント（Nanomaterial Information/Identification,
Physical-Chemical Properties and Material Characterization, Environmental Fate, Environmental
Toxicology, Mammalian Toxicology, Material Safety）に関する既存情報の収集・評価，試験実施計画
の作成・実施，そしてこれらの文書作成としても，本リスク評価書が提供されることの意義は極
めて大きい．
②
本ナノ材料リスク評価書の位置づけ，研究アプローチ・方法論の特徴そして限界を明確にす
るうえで，評価書と対として刊行される「ナノ材料リスク評価書策定に際しての考え方」，あ
るいはその概要を各リスク評価書に組み入れることが望ましい．
理由：
本評価書は今後のナノ材料のリスク評価・管理の起点にもなり，関係者に様々な影響を及ぼし，
議論を巻き起こす可能性を有しているとレビュアーとしては考えている．それ故，本評価書の位
置づけについては，CRM の化学物質詳細リスク評価書とは異なるものと考える．
IRGC（International Risk Governance Council）が提唱しているリスクガバナンスの枠組み（図 1
がコアの部分：Pre-assessment, Risk Appraisal, Tolerability & Acceptability Judgment, Risk Management,
Risk Communication）を援用すれば，本プロジェクトの内容は主に Pre-assessment フェーズに力点
がおかれていると考える．Pre-assessment は，Problem framing（問題枠組み設定），Early warning and
monitoring（新たなハザードの系統的な検知と監視），Screening（ハザードやリスクのスクリーニ
ングおよび異なった評価・管理ルートの選定）
，Determination of scientific conventions（科学的なリ
スク評価のために要する定義や仮定等の確認，試験・計測方法やリスク評価手法の選択）から成
るが，これらの評価作業は知識生成と行動の決定・実行において起点となるものでリスクガバナ
ンスの観点からは極めて重要である．
「ナノ材料リスク評価書策定に際しての考え方」には，ナノ材料の何が問題か，社会の中でど
Ⅷ-16
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
のような懸念が言われているかについて整理し，それを問題枠組みとし，ナノ粒子の凝集状態の
未知性も踏まえ，ナノサイズ粒子の有害性，ヒト健康リスクを評価すべく，試験試料の分散に関
する基本的考え方や in vitro 試験と in vivo 試験を組み合わせた二軸アプローチによる有害試験の
考え方などが示されている．これはまさに Pre-assessment の要件である．
本リスク評価書は，暴露評価，有害性評価そして許容暴露濃度導出そしてリスク判定という一
連の評価を含むが，Pre-assessment を踏まえ当該ナノ材料について Risk Appraisal フェーズの Risk
Assessment を一部試行した初期のリスク評価書と位置づけた方がよいと思う．したがって，可能
であればナノ材料リスク評価というタイトルも変えることを検討してはどうか．
「ナノ材料有害性試験のための試料調整方法と計測方法」
（2011 年 1 月）が刊行されると聞い
ているが重要な成果であると評価したい．
Ⅷ-17
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
科学技術のリスクガバナンスとは，政治的，社会的，法的，倫理的，科学的そして技術的な文
脈を考慮し，様々な利害関係者が相応の役割と責任をもち，協働してリスクに関する社会的判
断や調整を行い，リスクと付き合っていくことである．
【対応】
リスク評価書策定についての考え方の概要を入れた場合，逆に誤解を生む場合もあると考え，
含めないことにいたしました．別冊の「ナノ材料リスク評価書策定に際しての考え方」を読んで
いただくことで，理解を深めていただければと考えております．
本評価書は，新規材料を対象として，現状の情報の中でできる詳細なリスク評価を行うととも
に，いくつかの新たな概念や手法も提案するものになっております．この点からしても，一連の
初期リスク評価書とは考え方も大きく異なっております．そのため，タイトルについては，変更
しないことにいたします．
各評価書の総括では，(1) 科学的な評価の観点に加え，順応的管理の観点からみた今後に残さ
③
れた問題点や課題，(2)本リスク評価書および結果の，規制当局，産業界，研究開発者そして
一般公衆へのインプリケーション，をまとめてほしい．
理由：
言うまでもなく，一流の研究論文・報告には研究結果の弱点を自ら記すことが求められる．残
された問題点や課題を示すことは現在のリスク評価の到達点を明らかにする意味でも重要と考え
る（TiO2 リスク評価書には記載されているが，現状の到達点が明確にはわからない）．また，ナノ
テクノロジーのような科学的な不確実性と意図（利用形態）の不確実性が大きい技術のリスク問
Ⅷ-18
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
題に対しては，科学的な知見を獲得・蓄積すべく研究活動が並行して行われているなかで，当該
新興技術の将来展開ポテンシャルへの期待を踏まえつつ，そのリスクや社会的影響を研究開発段
階から評価し，継続的に監視し，適時，評価更新作業を行い社会的な判断や管理活動に反映させ
ていく順応的管理が求められる．
本プロジェクトは，規制の枠組み策定とともに事業者の自主的リスク管理への適用を念頭に実
施されたと思う．しかし，問題枠組みの設定（Framing）において明示的に規制当局と事業者とい
うステークホルダーの問題認識や懸念が考慮されたか不明であるため，評価結果の解釈について
の多義性・曖昧性を少なくするうえでも，各ステークホルダーへのインプリケーションは示した
方が望ましいと考える．なお，一般公衆へのインプリケーションについては，本リスク評価書は
工業ナノ材料の生産現場での職業人のナノ粒子吸入暴露による健康リスクと限定的なリスク評価
であるため不要との意見があるかもしれないが，社会のリスク認知は多様であることやメディア
による議題設定効果やリスク情報の社会的増幅現象についても考慮しておくことは重要と考える．
【対応】
ご指摘に従って，まとめの章において可能な限り，(1) 科学的な評価の観点に加え，順応的管理
の観点からみた今後に残された問題点や課題，(2)本リスク評価書および結果の，規制当局，産業
界，研究開発者そして一般公衆へのインプリケーションを追加いたしました．
④
リスク評価書の構成（章立て，用語）は基本的に同じにすることが望ましい．
理由：
第Ⅰ章には評価書の目的と範囲，評価書の構成は両評価書とも用語は異なるが記載されている
が，フラーレンの評価書には，2.ナノ材料を取り巻く状況，が記載されている．この記載につい
ては②で指摘した点と合わせて検討してほしい．
また，フラーレン評価書では第Ⅳ章有害性評価のなかで許容暴露濃度の導出が記載されている
が，二酸化チタン評価書では別に章をたて論じられている．これらは，特段の理由がなければ同
じ構成にすることが望ましい．リスクの判定，リスク評価という用語も統一した方が望ましい．
フラーレン個別
①
第Ⅰ章はじめに，については上記④でコメントしたので検討していただきたい．
【対応】
ご指摘に従って，許容暴露濃度の導出を二酸化チタンと同様に別章にいたしました．
②
Ⅱ-16 の 19 行の窒素吹付け，23 行の窒素風船付き，は後者が誤字では．
Ⅷ-19
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
【対応】
どちらも正しいですが、前者の後にただの“ロータリーエバポレーター”があったので、誤解
を避けるために、“窒素風船付きロータリーエバポレーター”と変更いたしました。
③
表Ⅲ-1～4 の，“定期的事象”，“不定期的事象”という用語は不適切．定常的，非定常的事象が
適切ではないか．
【対応】
ご指摘の通り，
“定期的事象”，
“不定期的事象”という用語は不適切でした．ただし，これらの
事象は，
“定常的”、
“非定常的”という表現は誤りですので，
“高頻度・定期”，
“低頻度・不定期”
に変更いたしました。
④
第Ⅲ章 3 で，測定事例について整理され述べられているが，NEDO プロジェクトによる測定
については別途節を設け記述するのがよいのではないか．
理由：
NEDO プロジェクトでは，既存の測定事例の調査から，それらの制約条件や課題などを踏まえ
製造現場での測定調査を実施したとすれば，その測定調査の結果だけでなく，リスク評価を行う
うえでの暴露評価において，特に作業現場での測定には何が重要な事項であるかを示し，その測
定方法などの工夫や現状での問題点や今後の課題についても記述することが重要と考える．
【対応】
ご指摘に従い、別項目立てして記述するように変更いたしました。
第Ⅲ章 5 のタイトルは，“フラーレン製造工場近傍の一般環境中“とした方が誤解を招かない
⑤
のではないか．
【対応】
ご指摘に従い、“フラーレン製造工場近傍の一般環境中“といたしました。
⑥
上記④と同様，第Ⅳ章の 2,3,4,5,6,7 に既存研究の整理のなかで示されている NEDO プロジェ
クトによる in vivo，in vitro 試験結果については別途節を設け記述するのがよいのではないか．
また，有害性に関する既往試験と NEDO プロジェクトによる試験での粒子サイズを比較した
図（Ⅳ-1，Ⅳ-6，Ⅳ-7）はどのような意図で掲載しているのか，これらの図からのインプリケ
ーションを記述すべきではないか．関連して，Ⅳ-62 の 29 行～63 の 25 行の文書は，ここに
Ⅷ-20
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
記載するより，別途項をおこし記述するのがよいのではと思う．
理由：
NEDO プロジェクトでは，有害性試験のための試料はどの程度のサイズにするか（分散化する
か），in vivo 試験での粒子サイズに着目して実施しているのであるから，何らかの考察は必要であ
ろう．
【対応】
NEDO プロジェクトの成果については、付録において、詳細な記述を追加いたしました。
第Ⅳ章の構成について，2.体内動態は 5.細胞毒性の前にするのがよいのではないか．
（当該分
⑦
野の非専門家のコメントですが）
【対応】
吸入暴露による有害性において，肺にのみ注目できるという話が，体内動態の話を整理した結
果出てくることから，構成は変更しないことに致しました．
Ⅳ-65 の 4 行目の“因子ごと････”から 9 行目までは削除してよいのではないか．
⑧
【対応】
リスク評価に明るくない読者に対しての発信という観点もあるため，一般的な説明となってお
りますが，残すことに致しました．
⑨
本リスク評価書へのコメントではありませんが，Ⅱ-14 で述べているフラーレンの医薬品
（MRI 造影剤，C 型肝炎ウィルス増殖抑制剤，エイズウィルス増殖抑制剤）などへの応用開
発が進められる今，是非，技術リスクガバナンスの観点から新たなリスク研究の展開を期待
しています．
理由：
社会が複雑化し多様な利害関係者が存在する時代にあって，Transformation には様々な便益とと
もにリスクが伴います．ナノテクノロジーの研究開発・社会での利活用にあたっては，ナノテク
ノロジーの定義問題もあるが，既存材料・製品の（静的・定常的な）機能改善を目的とした工業
ナノ粒子やナノチューブなどの第一世代のナノテク製品・生産プロセスの EHS リスク問題に留ま
らず，DDS や超小型センサチップなど動的・進化的機能をもつナノ構造・デバイスという第二世
代ナノテク製品，さらには人工臓器やマルチスケールのケミカル・バイオアセンブリーといった
第三世代の統合的ナノシステム，Converging(IT+Bio+Nano)技術へと研究開発活動が指向されるこ
とから，EHS リスク問題に加え，ELSI(ethical, legal and safety issues)，HDI(human development
Ⅷ-21
第Ⅷ章
外部レビュアーからのコメントと筆者らの対応
篠原 直秀
implications)，PSI(political and security issues)への関心・懸念が提起されている．自然科学，工学，
社会科学を統合した新たなリスク評価アプローチが求められているので，RISS には大いに期待し
ています．
【対応】
ご期待に添えるよう，今後，新たなリスク評価への取り組みを進めていきたいと思っておりま
す。
Ⅷ-22
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix
C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
本評価書の作成に当たり，NEDO プロジェクト（P06041）
「ナノ粒子の特性評価手法の研究開発」
では，フラーレンに関わる様々な試験を行ってきた．最終的に本評価書で取り上げなかったもの
も含め，Appendix として掲載することとした．
掲載する Appendix は，以下の 10 件である．
Appendix 1．毒性試験に使用する水中フラーレン分散液のビーズミルを用いた調製 遠藤茂寿ら
Appendix 2．フラーレンエアロゾル粒子の発生と暴露試験 島田学ら
Appendix 3．フラーレンの経気道的暴露による有害性試験 森本泰夫ら
Appendix 4．非侵襲的 ESR による C60 ナノ粒子によるマウスへの肺還元能の評価
Appendix 5．フラーレンの肺沈着量とクリアランス速度の評価
篠原直秀ら
Appendix 6．フラーレン暴露によるラット肺中の網羅的遺伝子発現の解析
Appendix 7．フラーレンの遺伝毒性について
横山秀克ら
藤田克英ら
篠原直秀ら
Appendix 8．安定したフラーレン C60 培地分散液による細胞応答の評価 堀江祐範ら
Appendix 9．水溶液及び細胞培養液中の C60 の粒径分布とキャラクタリゼーション 加藤晴久ら
Appendix 10． フラーレンはコイの脳への脂質過酸化能を有するか？
Appendix-1
篠原直秀ら
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix 1. 毒性試験に使用する水中フラーレン分散液のビーズミルを用いた調製
遠藤茂寿，丸順子，内田邦夫，山本和弘，中西準子（産業技術総合研究所）
ビーズミルによるフラーレン-水系分散液の調製法について検討した．原料は，燃焼法で生成したフ
ラーレンを更に昇華精製したもの（SU，フロンティアカーボン製）である．分散剤には，Tween 80
を用い，エンドトキシン除去フィルターを通した超純水で調整した分散媒に懸濁した．一連の分散操
作は，フラーレンの酸化を抑制するために窒素雰囲気で行うことを原則とした．
分散媒の調製は，次の手順によった．
①
純水を 100℃以下で加熱し，水中から気泡の発生がなくなったことを確認した後，急冷却時に
窒素，あるいはアルゴンガスをバブリングし，純水中の酸素を置換する．
②
窒素気流中において，窒素置換した純水と分散剤を混合し，所定濃度に調製する．
③
作成した分散媒は，窒素雰囲気に保管する．
分散液の調製手順を以下に示す．
①
窒素を供給したブローブボックス内において，一定量，秤量採取したフラーレンを瑪瑙乳鉢に
入れ，分散媒を適当量，滴下し，乳棒で 30 分間，手解砕する．
②
フラーレンが分散媒に十分馴染んでからビーカーに試料を移し，分散媒を添加し，所定量
（200-500 mL）のスラリーを調製する．なお，分散時の粒子濃度は．0.1-5 mg/mL であるが，
その調整は最終的に媒体ミルへの仕込み時に分散媒の添加量を調整することで行った．
③
媒体攪拌ミル（UAM-15，寿工業）に仕込み，分散処理した．
④
一定時間，分散処理した懸濁液を 8 kG/16 kG で遠心分離し，その上清を回収し，分散液とした．
⑤
回収した粒子の評価をチタニアと同様に行った．
なお，作業はできる限り紫外線の照射を避けた状態で行った．例えば，①では，蛍光灯を消灯し，ま
た，③では供給ラインを遮光した．さらに，③での脱酸
素条件であるが，当初はスラリータンクを大気解放で運
転したが，窒素気流を 4-5 L/min でパージしながら調製
を行った．
図 Appendix 1-1 に種々の条件で水中分散したフラー
レンの質量基準 50%径 x50 と分散時間の関係を示す．
DB=50 m のビーズによる強い分散では x50=50 nm の分
散が可能であった．
この場合，100 nm 以下の粒子は 80%
であった．また，分散条件が弱くなると 300 nm 程度の
粒子が得られた．ビーズミルに供給した原料の一次粒子
の大きさは 1 m 以上であり，本プロセスは，解砕では
なく粉砕プロセスである．従って，チタニアのような一
図 Appendix 1-1 ビーズミル粉砕した C60 のメ
次粒子がナノメートルオーダーである粒子の処理と異
ディアン径の変化と TEM 写真
Appendix-2
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
なり，微細ビーズが分散にとって必ずしも有利とは言えない結果と
なった．
図 Appendix 1-2 に DB=50 m のビーズにより v=15 m/s で 30
分間分散処理した粒子の制限視野電子線回折像を示す．回折像から，
生成した C60 粒子は格子定数 1.42 nm の面心立方構造 fcc を保持し
た C60 結晶であることがわかる．しかし，長時間の粉砕では無定型
化が起きることから，強い粉砕条件の下にいても短時間の処理で結
晶構造を保持した 100 nm 以下である C60 の一次粒子が得られること
図 Appendix 1-2 粉砕 C60 の制
限視野電子線回折像
がわかった．
上記の分散による酸化フラーレンの生成について検
討した結果を図 Appendix 1-3 に示す．窒素気流中の 30
分間の手解砕では，約 0.5%の酸化フラーレン（C60-nO）
が生成した．また，窒素パージをしない条件でのビーズ
ミルによる 120 分間の分散では，約 5%の酸化フラーレ
ンが生成した．この時の分散媒中の酸素濃度は 1.5-2.2
mg/L であった．窒素パージ条件で，酸素濃度が 1.5-2.2
mg/L であった時にはパージをしない場合同様な酸化フ
ラーレン生成が起きたが，分散媒中の溶存酸素濃度を
図 Appendix 1-3 ビーズミル粉砕におけるフラ
0.17 mg/L にした場合には，C60O を 0.5 %以下に抑える
ーレンの酸化と嫌気化による酸化抑制効果
ことができた．このことから，プロセスの脱酸素化とと
もに，溶媒中の脱酸素化を図ることでフラーレンの酸化を抑制できることがわかった．
(Endoh et al., Advanced Powder Technology 21: 507-512, 2010.)
Appendix-3
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
Appendix 2.
篠原 直秀
フラーレンエアロゾル粒子の発生と暴露試験
島田学，Wang W-N，奥山喜久夫（広島大学大学院）
明星敏彦，大藪貴子，森本泰夫，田中勇武（産業医科大学）
遠藤茂寿，内田邦夫，榎原研正，桜井博，山本和弘，
中西準子（産業技術総合研究所）
ICR マウスへの鼻部暴露試験に用いた装置を図 1 に示す．粒径約 30 nm の C60 粒子と Tween80
分散剤をそれぞれ 0.017 wt%，0.05 wt%含む水系分散液を加圧型噴霧器で液滴化し，ディフュージ
ョンドライヤで水分を除去することで，C60 エアロゾル粒子を得た．エアロゾル粒子は，清浄空気
と混合し 45 L/min の流量で，マウス約 20 匹を対象とした鼻部暴露装置に流通させた．マウスの
鼻の位置におけるエアロゾル粒子をサンプリングして，微分型静電分級装置と凝縮粒子カウンタ
で構成された粒子スペクトロメータ（Model 1000XP, MSP, MN, USA）で，電気移動度径分布をイ
ンライン計測した．また，ガスフィルタと静電式粒子捕集器で粒子を捕集して，形態観察，質量
濃度計測，炭素分析に供した．図 2 と図 3 に，エアロゾル粒子の走査型電子顕微鏡（FE-SEM, S-5200,
Hitachi High-Technologies, Tokyo）写真と電気移動度径分布を示す．粒子はおおよそ球形で，分散
剤の固化物を質量比で約 75 %含む C60 粒子の凝集体であった．3 時間の暴露試験時間中の電気移
動度径分布は安定であり，粒子の個数基準幾何平均径，個数濃度，C60 の質量濃度は，それぞれ，
86 nm，1.6 × 105 cm-3，0.35 mg/m3 であった．
図 Appendix2-1
図 Appendix2-2 フラーレンエアロゾル粒子
の走査型電子顕微鏡写真
鼻部暴露試験の装置図
図 Appendix2-3
鼻部暴露試験時のフラーレンエアロゾル粒子の電気移動度径分布
Appendix-4
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Wister ラットへの全身暴露試験に用いた装置を，図 4 に示す．鼻部暴露試験と同様に発生させ
た液滴を含む空気を，加熱と清浄空気希釈によって乾燥促進して得たエアロゾル粒子を，100
L/min の流量で，ラット約 30 匹を入れた暴露用容器（容積約 0.5 m3）に流通させた．容器内のエ
アロゾルを適宜サンプリングして，鼻部暴露試験のときと概ね同じ装置，方法で，電気移動度径
分布，形態観察，質量濃度計測，炭素分析を行った．暴露試験は，1 日あたり 6 時間，1 週あたり
5 日間，計 4 週間行った．容器内のエアロゾル粒子の形態は，本質的に図 2 と同じであった．6 時
間の試験中の電気移動度径分布では，図 5 に例示したように変化が小さかった．粒子の個数基準
の幾何平均径と個数濃度の経日変化を図 6 に，質量濃度の経日変化を図 7 に，それぞれ示す．試
験期間にわたって，エアロゾル粒子を安定的に供給できたことがわかる．粒子の個数基準径，個
数濃度，C60 としての質量濃度の，試験期間での平均値は，それぞれ，96 ± 5 nm，(4.1 ± 0.4) × 104 cm-3，
0.12 ± 0.03 mg/m3 であった．
図 Appendix2-4
0.2
0.2
4
6x10 4
6×10
0.18
0.18
4
5x10 4
5×10
0.16
0.16
0.14
0.14
4
4x10 4
4×10
0.12
0.12
3×10
3x104 4
0.1
0.1
2x104 4
2×10
0.08
0.08
1x104 4
1×10
0.06
0.06
Number Conc. [particles/cm3]
Average Diameter, Dp [m]
図 Appendix2-5 全身暴露試験時のフラーレ
ンエアロゾル粒子の電気移動度径分布
全身暴露試験の装置図
00
22
44
66
88
10
10
12
12
14
14
16
16
18
18
Time [day]
図 Appendix2-6 全身暴露試験時のフラーレン
エアロゾル粒子の平均径と個数濃度の経日
変化
図 Appendix2-7 全身暴露試験時のフラーレ
ンエアロゾル粒子中の C60 の質量濃度の経
日変化
(Shimada et al., Environmental Science & Technology 43: 5529-2234, 2009.)
Appendix-5
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix 3. フラーレンの経気道的暴露による有害性試験
森本泰夫，廣橋雅美，大神明，大藪貴子，明星敏彦，西 賢一郎，
角谷力，轟木基，山本誠，村上昌宏，田中勇武（産業医科大学）
島田学，Wang W-N（広島大学大学院），山本和弘，藤田克英，
遠藤茂寿，内田邦夫，篠原直秀，中西準子（産業技術総合研究所）
フラーレンの経気道的暴露による有害性を評価するために，ナノレベルに分散したフラーレンを
用いて気管内注入試験，吸入暴露試験を行い，フラーレンの有害性を検討した．
1)フラーレンの気管内注入試験
Tween80 を 0.1%含む蒸留水懸濁液において，DLS にてフラーレンの質量基準 50%径が 33 nm で
あったことより，フラーレンの粒子サイズがナノレベルであることを確認した．
フラーレン 0.1mg，0.2mg，1mg を蒸留水（Tween80 を 0.1%含む）に懸濁して，ラットに単回気
管内注入した．陰性対照群には蒸留水(Tween 80 を 0.1%含む)，比較対照群として酸化ニッケル
ナノ粒子（比表面積:104.6 m2/g，質量基準 50%径：26 nm）を注入した．注入後 3 日目，1 週間，
1 ヶ月，3 ヶ月，6 ヶ月に解剖を行った．検討項目は，BALF の炎症細胞，肺組織の CINC1-3 の
発現であった．結果に関しては，比較対照物質である酸化ニッケル及び，陰性対照群と比較し
て検討した．
1) ラット肺湿重量では，比較対照である酸化ニッケル注入群で，3 日から 3 ヶ月まで，増加
したのに対し，フラーレン注入群では，1 週間後の 0.1mg，0.2mg，1mg 注入群において
のみ陰性対照群に比較して増加が認められた．
2) BALF における総細胞数は，フラーレン注入群では，1mg 注入のみ 3 日から 1 週間まで一
過性の増加を認めたが，それ以外のフラーレン注入群では，陰性対照群とほとんど差異
が認められなかった．好中球数(PMN)に関しても，フラーレン 1mg 注入群のみ，1 ヶ月ま
で持続的増加を示したが，経時的には減少しており 1 ヶ月，3 ヶ月後では極軽度の増加と
なった．一方，比較対照の酸化ニッケル注入群では総細胞数や好中球(PMN)などの炎症細
胞が 3 ヶ月まで増加した．
3) 肺組織における好中球ケモカイン cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC)ファ
ミリーの蛋白濃度に関しては，CINC-1 では，フラーレン 1mg 注入群で，3 日，軽度では
あるが 1 週間，3 ヶ月，0.1mg および 0.2mg 注入群では，1 ヶ月後に軽度上昇した．CINC-2
では，フラーレン 1mg 注入群では，3 日，1 週間，軽度ではあるが 3 ヶ月，低用量である
フラーレン 0.1mg 注入群で，3 日目に上昇を認めた．一方，酸化ニッケル注入群では，
CINC-1，CINC-2 とも 3 日から 3 ヶ月まで持続的に濃度上昇を認めた．CINC-3 では，フ
ラーレン，酸化ニッケルとも急性期に一過性の濃度上昇のみであった．
4) 肺組織における CINC ファミリーの遺伝子発現に関しては，CINC-1 では酸化ニッケルが
持続的に発現亢進を示し，フラーレン注入群は酸化ニッケルほどではないが発現亢進し，
Appendix-6
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
CINC-2 に関しては，酸化ニッケルは一過性の発現亢進，一方，フラーレンは逆に低下し
た．CINC-3 に関しては，CINC-1 と同様に酸化ニッケルは持続的発現亢進を示し，フラー
レンは，酸化ニッケルよりレベルは低いが発現が亢進した．
5) 肺の病理組織学的検討においては，フラーレン 1mg 注入群で，一過性で，軽度な肺胞マ
クロファージなどの炎症細胞出現が主な所見であった．低用量群では著明な変化は認め
られなかった．比較対照である酸化ニッケル注入群は，好中球や肺胞マクロファージの
持続的な浸潤を認めた．他の所見として，いずれの群において granuloma，線維化，気腫
性変化などは認められなかった．
２）フラーレン吸入暴露試験
ラットに 1 ヶ月間（1 日 6 時間，週 5 日間，4 週間の吸入暴露を実施した．なお，フラーレン
の暴露チャンバー内における平均粒子重量濃度は 0.5 ± 0.1 mg/m3（Tween を含む）であり，個数
濃度は 4.1 × 104 particles/cm3 であった．また，暴露期間中のフラーレン平均個数基準 50％径は
96 nm とほぼ一定していた．酸化ニッケル比較対照群の暴露チャンバー内の平均粒子重量濃度は
0.2 ± 0.1 mg/m3, 個数濃度は 9.2 × 104 particles/cm3 であり，個数基準 50％径は 59 nm であった．
非暴露群については，同一のチャンバー内に清浄空気のみを暴露した．暴露終了後，3 日目，1
ヶ月，3 ヶ月に解剖を行った．
1） ラットの体重変化（体重の成長曲線）は，フラーレン吸入群および比較対照物質の酸化
ニッケル吸入群と非暴露群の 3 群間で差異は認められなかった．
2） ラット肺湿重量および乾燥重量では，フラーレン吸入群の肺湿重量は，非暴露群と差異
は認められなかったのに対し，比較対照群である酸化ニッケル吸入群では 3 日後，1 ヶ月
後に有意に増加した．
3） BALF において，フラーレン吸入群では，非暴露群とほとんど差異を認めなかったが，比
較対照の酸化ニッケル吸入群では総細胞数が 3 ヶ月まで，
好中球が 1 ヶ月まで増加した．
4） 肺組織における CINC ファミリーの蛋白濃度は，CINC-1，CINC-2 ともフラーレン吸入群
においては亢進を認めなかったが，比較対照の酸化ニッケル吸入群では 3 日，1 ヶ月と亢
進を認めた．CINC-3 では，フラーレンも酸化ニッケルも一定の傾向を示さなかった．
5） 肺組織における CINC ファミリーの遺伝子発現に関しては，CINC-1，CINC-2 ともフラー
レンでは発現が低下し，酸化ニッケルでは 3 日，1 ヶ月後に亢進した．CINC-3 では，酸
化ニッケルが 3 日目で亢進したが，フラーレンでは発現亢進は認められなかった．
6） 肺組織の病理学的所見に関しては，フラーレン吸入群では，極軽度の炎症細胞浸潤を一
過性に認め，酸化ニッケルでは好中球や肺胞マクロファージの炎症細胞浸潤を認めた．
以上，ナノレベルに分散されたフラーレンの気管内注入試験，吸入暴露試験の結果よりフラーレ
ンによる持続的炎症・線維化能は低いことが認められた．
(Morimoto et al., Particle and Fibre Toxicology 7 (4): 1-18, 2010.)
Appendix-7
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix 4. 非侵襲的 ESR を用いた C60 ナノ粒子によるマウスへの肺還元能の評価
横山秀克，小野泰蔵（産業技術総合研究所）
森本泰夫，明星敏彦，田中勇武（産業医科大学）
島田学，Wei-Ning Wang（広島大学）
遠藤茂寿，内田邦夫（産業技術総合研究所）
本研究では，ナノ物質の吸入暴露を受けたマウスの肺の還元能を計測し，生体影響評価を行っ
た．還元能計測には電子スピン共鳴(ESR)法を用いた．還元能を in vivo で評価する手法は今のと
ころ ESR 法しか存在しない．また局所(すなわち肺)の ESR 信号を得るための手法として，
Region-selected intensity determination(RSID)法を用いた．これは選択領域の ESR 信号強度の時間変
化を簡便に取得できる新たな計測手法であり，従来の画像法のような，積分，画像再構築，画素
値の読み取りといった，煩雑な画像処理を必要としない．
実験動物には ICR マウス(体重 30g 雄)を用いた．マウスは対照群と暴露群とに分け，暴露群に
対して，工業用ナノ粒子の吸入暴露を 3 時間行った．工業用ナノ粒子には酸化ニッケルとフラー
レンを用いた．酸化ニッケルは個数基準の平均一次粒子径が約 20 nm の粒子を 0.5 mg/ml 濃度で分
散した噴霧液に調整し，
フラーレンは個数基準の動的光散乱平均径が約 20 nm の粒子を 0.15 mg/ml
の濃度で分散した噴霧液(分散剤 Tween80 を 0.5 mg/ml 含む)に調整した．この噴霧液を加圧式噴霧
器で噴霧，空気流量 45l/min でマウス用鼻部曝露装置に供給した．鼻部曝露装置から暴露空気をサ
ンプリングし，気中分散粒子としての粒径分布を，静電分級法と凝縮核計数法で計測した．その
結果，個数基準の幾何平均粒子径は 61nm(酸化ニッケル)および 86nm (フラーレン)であり，個数濃
度は 2.5×105cc-1(酸化ニッケル)および 1.6×105cc-1 (フラーレン)であることが確認された．このよ
うに，2 種類の工業用ナノ粒子の暴露の条件は，平均粒径および個数濃度において概ね同様な値
になるように調整されている．以上の暴露実験は産業医科大学(北九州)で行い，同大学で 13 日間
飼育を行った後，対照群と暴露群両群のマウスを名古屋の実験動物飼育施設に空輸し，翌日，産
総研中部センター(名古屋)に移送し，ESR 計測を行った．
ESR 装置には共振周波数 700MHz のループギャップ共振器(内径 41mm，軸長 10mm)と磁場勾配
コイル(最大磁場勾配 100mT/m)を装備したものを用いた．RSID 法では，領域選択のために，試料
空間の中心から磁場勾配方向における選択領域までの距離から求めた磁場強度を主磁場から差し
引く．その条件下で一定の強度の磁場勾配を印加しながらスペクトルを取得し，3 次元空間内で
磁場勾配の方向を系統的に回転させてからスペクトル取得を繰り返し，磁場勾配下で得られた全
スペクトルを平均加算する．このスペクトルを磁場勾配が無い状態で計測したスペクトルを用い
てデコンボリューションし，得られたスペクトルの中央高が選択領域の信号強度となる．肺の位
置は従来法による画像を用いて決定した．
麻酔下のマウスにニトロキシドラジカル 3-carbamoyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine- 1-oxyl を尾静
注後，ただちに鼻側端より 35mm の位置が ESR 共振器中心になるように固定して，ESR 計測を経
Appendix-8
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
時的に繰り返した．
すべてのマウスにおいて，選択領域の信号強度は指数関数的減衰を示したので，半減期を減衰
速度の指標として用いた．酸化ニッケル暴露マウスで得られた半減期は，対照群の値に対して，
有意に延長していた(p<0.01)．一方，フラーレン暴露マウスで得られた半減期は，その対照群の値
との間に有意な差異は認められなかった．標的部位における半減期は主にその部位における還元
能を反映するため，本研究の実験条件において，酸化ニッケル暴露は肺の還元能低下をきたすが，
フラーレン暴露ではそのような機能障害は見られないことを示唆している．酸化ニッケルナノ粒
子の暴露を受けたラットの肺組織に軽度の炎症性変化が見られることが報告されている．多くの
炎症反応が酸化ストレスをもたらすことを考えると，本研究の結果はこの先行研究結果と矛盾し
ない．
(Yokoyama et al., Journal of Magnetic Resonance Imaging 29: 1432-1437, 2009.)
Appendix-9
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix 5. フラーレンの肺沈着量とクリアランス速度の評価
篠原直秀，中里哲也，田村守孝，遠藤茂寿，福井浩子，山本和弘，
田尾博明，吉田康一，中西準子（産業技術総合研究所）
森本泰夫，明星敏彦（産業医科大学），島田学（広島大学大学院）
Endoh et al. (2010)や Shimada et al. (2009)で示された調製法で調製したフラーレン C60 の分散液／
エアロゾルを気管内注入／吸入暴露させた Wistar rat（8 週齢もしくは 9 週齢）の肺中フラーレン
保持量を HPLC により測定した．
１）HPLC による生体内フラーレン分析法の確立
組織試料に重量の 3 倍量の生理食塩水を添加してホモジナイズした試料に，0.01M の SDS 及び
0.1M の酢酸を試料溶液の 2.5 倍量程度を各々加えて混合した．次に，トルエンを試料溶液の 2.5
倍量程度加え，2 分間振とう後，15 分間超音波処理を行い，遮光下で 5 時間振とうした．2000g
で 10 分間の遠心分離を行い，上澄みのトルエン溶液相を分取した．残さ液に，トルエン 5 mL を
加え，5 分間振とう後，15 分間超音波処理を行い，2000g で 10 分間の遠心分離を行い，上澄みの
トルエン溶液相を分取する操作を 2 度繰り返す．集めたトルエン溶液相を，窒素吹き付けにより
濃縮した．この濃縮溶液中の C60 を，HPLC-UV により定量した．
本手法による標準物質及び組織への添加試料の分析精度は，1.8%及び 3.0%以下であった．試料
に対する検出限界および定量限界は，8.9 及び 29 μg/g であった．現実に取りうる添加量での添加
回収率は，おおむね 90%以上であった．
２）気管内注入及び吸入暴露後の肺内 C60 保持量
体積基準の幾何平均粒径が約 30 nm の C60 を 0.1 mg，0.2 mg，1 mg で気管内注入した Wistar ラ
ットを，16 時間後，3 日後，7 日後，30 日後，90 日後，180 日後に解剖し，肺内 C60 保持量の分
析を行った．
また，体積基準の幾何平均粒径が約 96nm の C60 を 0.12 mg/m3 で吸入暴露させた Wistar
ラットを， 3 日後及び 30 日後に解剖し，肺内 C60 保持量の分析を行った．
100.0
1200
本評価書
(実測値)
0.1 mg投与 (実測値)
0.2 mg投与 (実測値)
80.0
本評価書
(フィッティング)
1.0 mg投与 (実測値)
800
0.1 mg投与 (フィッティング)
0.2 mg投与 (フィッティング)
600
1.0 mg投与 (フィッティング)
400
200
肺中C60 保持量 [μg]
肺中C60 保持量 [μg]
1000
Baker et al. 2008
(実測値)
60.0
Baker et al. 2008
(フィッティング)
40.0
20.0
0
0.0
0
30
60
90
120 150 180 210 240
投与後経過時間 [日]
0
10
20
30
40
50
60
70
暴露開始後経過時間 [日]
図 Appendix 5-1. 肺中保持量の実測値とフィッティング曲線 (左図：吸入暴露試験，右図：気管内投与試験)
Appendix-10
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
その結果，気管内注入試験におけるラットの肺中 C60 保持量は，0.1 mg 投与群の 7, 30, 90, 180
日後で 7.1×10-2, 2.7×10-2, 5.2×10-3, 2.9×10-3 mg/肺，0.2 mg/匹投与群の 18 時間後及び 30, 90, 180 日後
で 0.21, 6.2×10-2, 1.7×10-2, 1.5×10-2 mg/肺，1.0 mg/匹投与群の 18 時間後，及び 3, 7, 30, 90, 180 日後
で.0, 1.0, 1.1, 0.48, 9.1×10-2, 2.2×10-2 mg/肺であった(図 Appendix 5-1 (左図))．4 週間の吸入暴露試験
後のラットの肺中 C60 保持量は，暴露終了 3 日後及び 1 ヶ月後で 1.0×10-2, 5.1×10-3 mg/肺だった(図
Appendix 5-1 (右図))．
３）二段階クリアランスモデルによる沈着率及びクリアランス係数の導出
C60 の気管内投与後の肺保持量の減衰は，90 日以上で一段階減衰速度式を適用すると実測値と
乖離が見られ，二段階減衰速度式でうまくフィッティングできたことから，肺胞からのクリアラ
ンスには，速い相と遅い相が存在していると考えられる．そのため，図 Appendix5-2 に示すよう
な 2 段階のクリアランスモデルを用いて保持量の結果を解析することにした．
気管内注入試験における肺保持量にモデルを最小二乗法によりフィッティングした結果（図
Appendix 5-1 (左図)），クリアランス速度定数 k1, k12, k2 は，0.029 – 0.047, 0.00044 – 0.0034, and 0 –
0.0042 /day と求められた．また，このクリアランス係数を用いて，吸入暴露試験における肺保持
量にモデルを最小二乗法によりフィッティングした結果（図 Appendix 5-1 (右図)），肺沈着率は 0.14
と導出された．
４）気管内注入及び吸入暴露後の肺以外の臓器への C60 移行量
脳や肝臓においては，C60 は検出下限以下（<8.9×10-6 mg/g）であり，肺から他の臓器への移行
は確認されなかった．
濃度 C，呼吸量 V ，沈着率 f
初期保持量 A0
コンパートメント １
(保持量 A)
k1
排出１
（速いクリアランス）
k12
初期保持量 I0
コンパートメント２
(保持量 I)
k2
排出２
（遅いクリアランス）
図 Appendix 5-2. 2 段階クリアランスモデルにおいて想定したメカニズム
(Shinohara et al., Toxicological Sciences 118: 564-573, 2010.)
Appendix-11
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix 6. フラーレン暴露によるラット肺中の網羅的遺伝子発現の解析
藤田克英，遠藤茂寿，内田邦夫，中里哲也，稲田征治，田尾博明，山本和弘，
福井浩子，堀江祐範，吉田康一，岩橋均，中西準子（産業技術総合研究所）
森本泰夫，大神明，明星敏彦，田中勇武（産業医科大学）
島田学，Wei-Ning Wang（広島大学大学院）
フラーレンの経気道的暴露によるラット肺への分子レベルでの影響評価を目的に，分散した C60
フラーレンを用いて気管内注入試験および吸入暴露試験を行い，肺中の網羅的遺伝子発現解析を
実施した．
１）フラーレンの気管内注入試験
ラット（9 週齢，Wistar 系雄性）に，陰性対照群として 0.1% Tween-80 を含む蒸留水，およびこ
れに懸濁した 0.1mg，0.2mg，1.0mg フラーレンの計４群にそれぞれ 0.4mL，単回気管内注入した．
注入後３日目，１週間，１ヶ月，３ヶ月，６ヶ月に解剖を行い，右肺組織を除去し，破砕均質化
した後，抽出したトータル RNA の濃度および品質の測定後，Cyanine 3-CTP を用いた 1 色法によ
るラベル化の後，Whole Rat Genome Oligo Microarray（Agilent）によりハイブリダイゼーションを
行った．スキャンイメージを数値化した後，GeneSpringGX（Agilent）により網羅的遺伝子発現解
析を行った．
この結果，100μg および 200μg フラーレン投与群において，いずれも炎症性細胞遊走因子
（Chemokine）や走化性（Chemotaxis），さらに炎症反応（Inflammatory response），酸化スト
レス，アポトーシスに関与する遺伝子の顕著な高発現は示されなかった．一方，1.0mg フラーレ
ン投与群においては，炎症反応に関与するいくつかに遺伝子の顕著な高発現が投与後１週間から
１ヶ月に認められたが，６ヶ月後では陰性対照群とほぼ同等のレベルに落ち着いた．また，Matrix
metallopeptidase 12（Mmp12）や，Matrix metallopeptidase 7 （Mmp7: Matrilysin）をコードする遺伝
子の顕著な高発現が投与直後に認められ，注入後 3 ヶ月で陰性対照群と同等のレベルまで落ち着
いた．以上より，フラーレンは濃度依存的に，ラット肺組織に投与直後に炎症を引き起こし，そ
の減少と共に徐々に修復傾向となることが示唆された．ただし，同濃度のナノスケールの酸化ニ
ッケルに比べ，その程度は低いものと考える．さらに，フラーレンの投与用量と遺伝子発現比と
の関係から，フラーレン投与後に関与する候補マーカー遺伝子を同定することができた．注入後
１週間および６ヵ月後に，投与用量と発現比で正の相関が認められたのは，それぞれ 89 個と 21
個の遺伝子であり，これらの多くは炎症反応に関与する遺伝子であった．また，89 個と 21 個に
共通する遺伝子は，Ccl17, Ctsk, Cxcl2, Cxcl6, Lcn6, Orm1, Rnase9, Slc26a4, Spp1, Mmp7, Mmp12 であ
った．これらは，フラーレン投与後に関与するマーカー遺伝子として重要であると考える．
(Fujita K et. al., Toxicology, 274: 34-41, 2010)
Appendix-12
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
２）フラーレンの吸入暴露試験
ラット（9 週齢，Wistar 系雄性）に 1 ヶ月間（1 日 6 時間，週 5 日間，4 週間）の吸入暴露を実
施した．フラーレンの暴露チャンバー内における平均粒子重量濃度は 0.5 ± 0.1 mg/m3（Tween-80
を含む）であり，個数濃度は 4.1 × 104 個/cm3 であった．また，暴露期間中のフラーレン平均個
数基準 50％径は，96 nm であった．一方，比較対照群のナノスケール酸化ニッケル暴露チャンバ
ー内の平均粒子重量濃度は 0.2 ± 0.1 mg/m3，個数濃度は 9.2 × 104 個/cm3 であり，個数基準 50％
径は 59 nm であった．また，同一のチャンバー内に清浄空気のみを暴露したラットについて陰性
対象群とした．暴露終了後，3 日目，1 ヶ月に解剖を行い，右肺組織を除去し，破砕均質化した後，
抽出したトータル RNA の濃度および品質の測定後，Cyanine 3-CTP を用いた 1 色法によるラベル
化の後，Whole Rat Genome Oligo Microarray（Agilent）によりハイブリダイゼーションを行った．
スキャンイメージを数値化した後，GeneSpringGX（Agilent）により網羅的遺伝子発現解析を行っ
た．
フラーレン吸入曝露後の３日および１ヶ月では，陰性対照群に対して２倍以上に誘導される遺
伝子数は少なく，これらが有意に分類されるカテゴリーは，刺激に対する応答（Response to
stimulus）や免疫システム（Immune system process）であったが，比較対照群のナノスケール酸化
ニッケル暴露により高発現され分類された，外界からの刺激に対する応答（Response to external
stimulus）や炎症反応（Inflammatory response）などの関連性に比べて極めて低かった．炎症や酸化
ストレス，アポトーシスなどに関与する個別の遺伝子の顕著な誘導についても認められなかった．
以上の網羅的遺伝子発現の結果から，実施した吸入曝露条件において，フラーレンの肺組織に対
する遺伝子レベルでの影響は，ナノスケール酸化ニッケルの暴露に比べて小さいと考える．
(Fujita K et. al., Toxicology, 258: 47-55, 2009)
Appendix-13
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix 7. フラーレンの遺伝毒性について
篠原直秀，遠藤茂寿，丸順子，中西準子（産業技術総合研究所）
松元郷六（残留農薬研究所）
フラーレン C60 の分散液を用いて，復帰突然変異試験（光照射あり/なし），染色体異常試験（光
照射あり/なし），小核試験を行い，いずれも結果は．陰性であった．
１）分散液の調製とキャラクタリゼーション
復帰突然変異試験及び染色体異常試験用の分散液は，窒素雰囲気下，数 mL の 0.1%CMC-Na 水
溶液中で C60 粉末を乳鉢で 30 分間粉砕して混合させた後，0.1%CMC-Na 水溶液を約 500mL 追加
して，ビーズミル中で 50 μm のジルコニアビーズを用いて 90 分間粉砕・分散させた．8000g で 30
分間遠心分離した上澄み液を，3000g で 30 分間限外濾過することにより濃縮して，約 2.0 mg/mL
の試験原液を調製した．小核試験用の分散液は，Endoh et al. (2010)の方法で調製したものを，3000g
で 30 分間限外濾過することにより濃縮して，約 2.0 mg/mL の試験原液を調製した．45 μm 滅菌済
みフィルターでろ過滅菌後，試験に使用した．
Tween80 で調製した分散液の C60 濃度は，全ての群の試験液に対して，ロータリーエバポレータ
ーで乾固後にトルエン 5 mL で抽出して，HPLC で分析した．CMC-Na で調製した分散液では，ロ
ータリーエバポレータでの乾固後の抽出効率が悪かったことから，Tween80 で調製した分散液で
作成した検量線を用いて，UV 吸光光度計により濃度を求めた．DLS で求めた体積基準の 50%径
は．Tween80 調製液で約 33 nm，CMC-Na 調製液で約 50 nm であった．
２）復帰突然変異試験
ネズミチフス菌 (Salmonella typhimurium ) TA100，TA1535，TA98，TA1537 株と大腸菌
(Escherichia coli ) WP2 uvrA/pKM101 株を用いて試験を行った．適切な用量を設定するために 50,
100, 200, 400, 1000 μg/プレートの用量で用量設定試験を行った結果，光照射の有無/代謝活性化系
（S9 mix）の有無にかかわらず，全ての用量において生育阻害が観察されなかったため，50, 100,
表 Appendix 7-1．試験に用いた陽性対照物質
光照射なし
菌　株
光照射あり
代謝活性化なし
代謝活性化あり
代謝活性化なし
代謝活性化あり
[mg/plate]
[mg/plate]
[mg/plate]
[mg/plate]
TA100
AF-2 (0.01)
2-AA (1.0)
MB (1.0)
MB (8.0)
TA1535
NaN3 (0.5)
2-AA (2.0)
MB (0.5)
MB (4.0)
AF-2 (0.005)
2-AA (2.0)
MB (0.5)
MB (2.0)
TA98
AF-2 (0.1)
2-AA (0.5)
MB (2.0)
MB (8.0)
TA1537
9-AA (80)
2-AA (2.0)
PF (1.0)
PF (2.0)
WP2 uvrA /pKM101
Appendix-14
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
200, 400, 1,000 μg/プレートの 5 用量で本試験も実施した．光照射ありの試験は，培養前に 4500～
5000 lux の照度で 1 時間の照射を行った．用いた陽性対照物質を表 Appendix 7-1 に示す．
用量設定試験および本試験において，WP2 uvrA/pKM101 株の最高用量（1000 μg/プレート）で
復帰変異コロニー数が増加する傾向が見られたが，その増加量は僅かであった．光照射の有無/代
謝活性化系（S9 mix）の有無にかかわらず，全ての菌株のすべての用量において溶媒対照群に比
べて 2 倍以上の復帰変異コロニー数は認められなかった．以上の結果から，光照射のないフラー
レンの細菌に対する突然変異誘発性は陰性であると判断した．
３）染色体異常試験
チャイニーズハムスター肺由来の CHL/IU 細胞株を用いた染色体異常誘発性試験を光照射有無
の条件下で行った．光照射下の試験は，被験物質添加 1 時間後から 1 時間 4500～5000 lux の照度
で 1 時間の照射を行い，その後被験物質処理を続けた．短時間処理法及び連続処理法による染色
体異常試験では，ラット薬物代謝活性化系（S9 mix）存在下および非存在下で細胞増殖抑制試験
に基づき，12.5, 25, 50, 100 μg/mL の 4 用量もしくは 25, 50, 100, 200 μg/mL の 4 用量を設定した．
染色体観察の結果，可視光照射や S9 mix の有無にかかわらず，すべての用量において異常細胞の
有意な増加は認められなかった．また，倍数体の出現頻度に関しても有意な増加は認められなか
った．以上から，チャイニーズハムスター肺由来の CHL/IU 細胞株を用いた試験において，代謝
活性化系の有無にかかわらず，構造的あるいは数的染色体異常を誘発しないものと判断した．
４）小核試験（in vivo）
フラーレンの in vivo 染色体異常誘発性を検索するために，ICR 系（Crlj:CD1）マウスを用い，
骨髄細胞における小核試験を実施した．被験物質は 1% Tween 80 水溶液に均一に懸濁させて用い
1 日 1 回，24 時間間隔で 2 回の強制経口投与を行った．
用量を設定するために雌雄のマウスを用いて行った毒性試験において，20，40 および 78 mg/kg
の 3 用量のいずれにおいても死亡例の発生はなく，毒性に性差は認められなかったため，小核試
験は雄動物を用いて 22，45 および 88 mg/kg の 3 用量で実施した．陰性対照群には被験物質投与
液の調製に用いた媒体を 2 回強制経口投与し，陽性対照群にはマイトマイシン C を 10 mg/kg で 1
回強制経口投与した．1 用量群あたり 5 匹の動物に投与し，最終投与 24 時間後にすべての動物か
ら骨髄塗抹標本を作製した．
標本観察の結果，フラーレンのいずれの用量群でも陰性対照群と比べて小核を有する多染性赤
血球の出現頻度に有意な増加は認められなかった．一方，陽性対照群では，小核を有する多染性
赤血球の出現頻度に明らかな増加が認められた．以上の結果より，本実験条件下では，ICR 系
（Crlj:CD1）マウスの骨髄細胞において，フラーレンの小核誘発性（染色体異常誘発性）は陰性
であると判断した．
(Shinohara et al., Toxicology Letters 191: 189-196, 2009.)
Appendix-15
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix 8. 安定したフラーレン C60 培地分散液による細胞応答の評価
堀江祐範，西尾敬子，加藤晴久，篠原直秀，中村文子，藤田克英，
衣笠晋一，遠藤茂寿，山本和弘，二木鋭雄，吉田康一，
岩橋均（産業技術総合研究所），山元修（鳥取大学）
近年，化粧品などへの利用が進んでいる，フラーレン C60 の細胞影響を検討した．化学的な分
散剤を用いない，均一で安定した C60 倍地分散液による細胞影響を検討した．この分散液を培養
細胞に投与し，細胞に対する影響を検討した．
フラーレン C60 を HaCaT および A549 細胞に投与し，MTT 法および AnnexinV-FITC／PI 染色
により細胞生存率への影響を検討した．この結果，いずれの細胞でも C60 投与による細胞生存率
への影響は認められなかった．クローン形成法により細胞増殖に対する影響を見ると，C60 投与細
胞で濃度依存的に細胞増殖が阻害された．次に，C60 による細胞内酸化ストレスに対する影響を
細胞内 ROS レベルは C60 投
DCFH により C60 細胞の細胞内ストレスを経時的に測定したところ，
与 HaCaT 細胞において濃度依存的および経時的に上昇した．さらに，リアルタイム PCR により
抗酸化関連遺伝子の発現を調べた．肺における抗酸化に機能する酵素タンパク質 HO-1 の発現を
調べたところ，HaCaT 細胞では有意な上昇が見られた．一方，A549 では C60 投与による HO-1 遺
伝子の上昇は認められなかった．さらに，C60 投与細胞における DNA 損傷をコメットアッセイ
により測定した．C60 の投与により，濃度依存的な DNA の傷害がみられた．また，C60 投与 24 時
間後の HaCaT 細胞を TEM で観察した結果，C60 凝集体の細胞内への取り込みが観察された．
これらの結果は，C60 の投与は細胞の増殖に影響し，細胞死に対しての影響はごく小さいこと
を示唆する．しかし，細胞死が起こらないものの，細胞内では影響が生じていた．C60 投与細胞で
は，経時的に ROS レベルが上昇し，脂質酸化物の増加も認められた．また，HaCaT では抗酸化
に機能する HO-1 の発現上昇も認められた．これらの結果は，C60 の投与により細胞が酸化ストレ
ス状態にあることを示唆する．C60 の細胞内への取り込みは認められたが，核内への移行は見られ
なかったことから，DNA 損傷は C60 の直接的な反応というよりも，酸化ストレスの誘導による間
接的な影響である可能性が高い．酸化ストレスが細胞の生存率に影響していないこと，抗酸化系
の発現が見られることから，C60 は細胞に酸化ストレスを引き起こすものの，細胞の防御範囲内で
あると考えられる．今回酸化ストレスが認められた C60 はこれまでの知見に比べ高濃度である．
この結果，高濃度条件において細胞内酸化ストレスの亢進と DNA 損傷，コロニー形成の阻害が認
められたが，生存率に対する影響はなかった．この結果は C60 の潜在的な細胞影響を示唆する．in
vivo でのさらなる検討が必要である．
(Horie et al., Journal of Biochemistry 148: 289-298, 2010.)
Appendix-16
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix9. 水溶液及び細胞培養液中の C60 の粒径分布とキャラクタリゼーション
（１） 水溶液中の C60 会合体の粒径分布計測とその特異な UV-Vis 吸収特性
加藤晴久，中村文子，高橋かより，衣笠晋一（産業技術総合研究所）
フラーレン（C60）は，現炭素のみで構成されている材料であるにもかかわらず，水溶液中にお
いて水分子と超分子的な状態を保つことでコロイド溶液として安定に存在することが報告されて
いる．そこで本研究では水溶液中に分散する C60 会合体の粒径分画を流動場分離法で実施し，そ
の分画試料ごとの UV-Vis 吸収特性について検討を行った．
C60 水分散液は既報の方法に基づき調整した．調整された試料について動的光散乱法を用いた粒
径計測を行ったところ，少なくとも 1 ヶ月間安定に分散されていることが明らかとなった．調整
された試料溶液は黄色透明溶液で，1 カ月経過後も沈殿など生じない安定な分散液であった．当
分散試料について流動場分離法と多波長検出器ならびにオンライン静的光散乱検出器を組み合わ
せることにより水溶液中の粒径分布計測を実施した．動的光散乱装置は大塚電子製 DLS7000（35
mW He-Ne レーザー）を使用し，流動場分離装置としては Postnova 製 AF2000 システムを使用
した．チャネル内のメンブンレンは分子量 1000 のカットオフを持つセルロースメンブレン
（(Z-MEM-AQU-427N)）を使用し，多波長検出器として Agilent Technologies inc.製の 1200
Series DAD 検出器を使用した．またオンライン静的光散乱検出器として Wyatt 製の多角度光散
乱検出器（MALS：DAWN HELEOS）を使用し検討を行った．
水中に分散された C60 は有機溶媒中に溶解している際の吸収スペクトルとは大きく異なり，2
つの強い吸収ピークとショルダーが存在していた．動的光散乱法により，当 C60 会合体の光散乱
強度平均粒径は 180 nm 程度と求まった．調整条件を変化させたところ，調整される分散液中の
C60 会合体の光散乱強度平均粒径は 100 nm から 250 nm 程度に変化した．このように調整された
C60 会合体を流動場分離法による分画を行ったところ，会合体の粒径分布は約 80 nm～250 nm の
0
0
3
m
n
3
1
1
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2
3
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5
2
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0
3
5
2
0
2
5
1
図 Appendix 9-1．水中に分散されたフラーレン C60 二次
図 Appendix 9-2．水中に分散されたフラーレ
粒子粒径分布の FFFF-MALS による測定例
ン C60 二次粒子粒径に依存した吸収スペクトル
の変化の例
Appendix-17
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
ブロードな単峰分布を持っており（図 Appendix 9-1），会合体の粒径が大きくなると共に吸収ピ
ークはレッドシフトし，また吸収帯強度が大きく変化していく現象を確認した（図 Appendix 9-2）．
(H. Kato et.al, Physical Chemistry Chemical Physics 11: 4946-4948, 2009.)
(2) 細胞培養液中のタンパク質・フラーレン会合体のキャラクタリゼーション
加藤晴久，篠原直秀，中村文子，堀江祐範，藤田克英，
遠藤茂寿，岩橋均，衣笠晋一（産業技術総合研究所）
材料サイズがナノ化することによる危険性が危惧されており（ナノリスク問題），その有害性試
験が盛んに行われている．ナノ粒子の有害性評価において評価対象の信頼性あるキャラクタリゼ
ーションは非常に重要であり，そのキャラクタリゼーション項目としては粒径，粒子濃度，表面
状態，表面電荷など様々な要素が挙げられる．一方で細胞毒性評価を実施する際，ナノ粒子は細
胞培養液中のタンパク質と会合体を形成し，細胞培養液中のタンパク質の欠如や構造の変化を引
き起こし，これらの要素が毒性へ寄与する可能性がある．そこで本研究では流動場分離法
（Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation ：AFFFF)，動的光散乱法（DLS），静的光散乱
法（SLS），磁場勾配核磁気共鳴法（PFG-NMR）を用いることで，実際に毒性評価されるナノ粒
子分散液の多角的なキャラクタリゼーション方法を検討することを目的とした．
本研究では流動場分離装置として AF2000 FFF システム (Postnova, Germany)を使用し，メ
ンブレンフィルターに cellulose membrane (Z-MEM-AQU-427N)，粒子サイズ検出器として静的
光散乱法原理に基づいた Wyatt 社製 EOS（HELEOS）システムを用いた．PFG-NMR 測定は
Varian UNITYINOVA 600A (14.1 T)を使用して行った．プローブは H-F{X} diffusion probe
(DSI-V218, Doty Scientific)を使用し，測定温度 298.15 K で行った．原理の異なる 3 種類の動的
光散乱計測装置として大塚電子製 DLS7000 システム（35 mW ：He-Ne レーザー，ホモダイン
法，90 度散乱計測），大塚電子製 FPAR1000 システム（5 mW ：658 nm 半導体レーザー，ホモ
ダイン法，90 度又は 160 度後方散乱計測），マイクロトラック製 Nanotrac UPA 151 システム
（3mW ：780 nm 半導体レーザー，ヘテロダイン法，後方散乱計測）を使用し，各装置間，解析
法間における計測値の違いを標準不確かさとして評価した．
検討対象として細胞培養液中に分散された異なる粒子濃度の C60，C70 フラーレン ナノ粒子分
散液を使用した．培地中における分散安定性評価については，経時の粒径変動による会合性評価，
検出散乱光強度と粒径変動を考慮した重力沈降性評価を行い，粒子分散液より試験試料採取時の
in situ 粒子分散液評価法の確立を目指した検討を行った． 表 Appendix 9-1 に評価されたように
粒子の 4 日間における粒径変動不確かさ（utime）ならびに散乱光強度変化評価パラメータ（I/I0）
（評価法の詳細は
day）
H. Kato et. al, Toxicol. in vitro, 2009, 23, 927. 参照のこと），における変
Appendix-18
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
動は観測されず，分散液は粒径変動や重力沈降が生じていない非常に安定な分散液であることが
評価された．
表 Appendix 9-1.フラーレン試料の細胞培養液中の分散サイズと分散性評価結果
Concentration
(mg/mL)
0.15
0.068
0.014
0.0066
0.025
0.013
0.0054
0.0025
Particles
C60
C70
d (nm)
u time (nm) (I/I 0 ) day
219.3
211.6
211.7
213.4
215.2
213.3
217.0
216.8
0.8
1.6
2.5
2.5
2.9
1.5
3.8
3.3
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
また静的光散乱の角度依存性を見ることで倍地中に分散されている二次粒子の形状を推定する
方法を確立した．一例として，倍地中に分散されたフラーレン C60 の散乱強度の角度依存性を図
Appendix 9-3 に示す．実測された角度依存性とモデル形状から計算された角度依存性とを比較す
ることで，二次粒子がどのようなモデル形状で記述されるかが評価できる．ここでは，C60 二次粒
子は球でも棒でもなくランダムコイル状態（“ヌンチャク”モデル）であることが示唆される．
0
1
8
6
( )

4
1
-
2
P
0
4
3
2
1
0
>
2
Q
<
2
S
図 Appendix 9-3．培地（DMEM+FBS10％）中に分散されたフラーレン C60 二次粒子の散乱関数 P(θ)の逆数の角度依
存性．黒点（●）：実測点，破線(- -)：球形粒子，実線（－）：棒状粒子，点線(・・・)：ランダムコイル．
(H. Kato et.al, Molecular BioSystems 6: 1238-1246, 2010.)
Appendix-19
Appendix_C60 のリスク評価に関わる NEDO プロジェクトの成果
篠原 直秀
Appendix 10. フラーレンはコイの脳への脂質過酸化能を有するか？
篠原直秀，宮内亜里砂，遠藤茂寿，蒲生昌志，米澤 義堯，
中西準子（産業技術総合研究所），松本建（三菱安全科学研究所）
フラーレン C60 のナノ粒子の分散液にコイ（Cyprinus carpio）を暴露させ，脳への脂質過酸化が
引き起こされるかどうかを確認した．
１）分散液の調製とキャラクタリゼーション
Endoh et al. (2010)の方法に従って，窒素雰囲気下，数 mL の 0.1%Tween80 水溶液中で C60 粉末を
乳鉢で 30 分間粉砕して混合させた後，0.1%tween80 水溶液を約 500mL 追加して，ビーズミル中で
50 μm のジルコニアビーズを用いて 30 分間粉砕・分散させた．8000g で 30 分間遠心分離した上澄
み液を試験原液とした．濃度は，ロータリーエバポレーターで乾固後にトルエン 5 mL で抽出して，
HPLC で分析した．DLS で求めた体積基準の 50%径及び 95%径は．約 36 nm 及び約 95 nm だった．
濃縮が必要な場合には，3000g で 30 分間限外濾過を行った．
２）in vitro 試験
解剖前 24 時間餌を与えなかったコイを，氷冷により麻酔し，尾部から血液採取後，イエロ-ラ
ンプ下で解剖した．脳に 4 倍量の緩衝液を加えてホモジナイズし，試験に使用した．たんぱく濃
度は 7.8 mg-protein/mL であった．4 通りに混合した液（① MES + Tween80，② brain tissue + MES
+ Tween80，③ MES + C60 + Tween80，④ brain tissue + MES + C60 + Tween80）中で，光照射下/非照
射下で 1.5 時間培養した後，クロロホルムで脂質抽出後，LPO アッセイ（鉄-チオシアネート法）
を行った．
③液（ ⇔ MES+C60+Tween80）と④液（Brain tissue+MES+C60+Tween80）の結果を比較すると，
光照射下では，有意に LPO 濃度が上昇していた （P < 0.05）．また，光非照射下でも微増が見ら
れたが，統計的有意差はなかった．C60 がコイの脳に到達した場合には，透過光により脳内で脂質
過酸化が起こる可能性が示唆された．
３）in vivo 試験
56L 止水型水槽で，C60 分散液（4.5 mg/L）中で，48 時間コイを飼育した．イエローランプ下で
解剖し，ホモジナイズ後，たんぱく質測定及びクロロホルムによる脂質抽出をし，LPO アッセイ
を行った．
暴露したコイの脳における LPO 濃度は，陰性対象群（N=7）で 0.082 nmol/mg-protein，暴露群
（N=7）で 0.094 nmol/mg-protein であり，有意な違いはなかった．このことから，Oberdӧrster (2004)
が報告したオオクチバスの脳における脂質過酸化は，コイにおいては生じないことが確認された．
(Shinohara et al., Environmental Science & Technology 43: 948-953, 2009.)
Appendix-20
略語集
略語集
-AADMER
Atmospheric
Dispersion
Model
for 暴露・リスク評価大気拡散モデル
Exposure and Risk Assessment
AlkP
Alkaline phosphate
アルカリ性リン酸塩
APS
aerodynamic particle sizer
エアロダイナミックパーティクル
サイザー
AUC
Area under curve
(濃度)曲線下面積
BALF
bronchoalveolar lavage fluid
気管支肺胞洗浄液
BAM
bovine alveolar macrophage
ウシ肺胞マクロファージ
BSI
British Standards Institution
英国規格協会
CAT
catalase
カタラーゼ
CMC
carboxymethylcellulose
カルボキシメチルセルロース
CNC
condensation nucleus counter
凝縮核粒子計数器
CNT
carbon nanotube
カーボンナノチューブ
CPC
condensation particle counter
凝縮粒子計数器
drug delivery system
ドラッグデリバリーシステム
-B-
-C-
-DDDS
略語集-1
略語集
DLS
Dynamic Light Scattering
動的光散乱測定
DMA
differential mobility analyzer
微分型移動度分析器
DMSO
dimethyl sulfoxide
ジメチルスルホキシド
ECHA
European Chemical Agency
欧州化学物質庁
EFTEM
energy-filtering
-E-
transmission
electron エネルギーフィルター透過型電子
microscope
顕微鏡
EPR
Enhanced permeability and retention effect
EPR
Electron Paramagnetic Resonance
電子常磁性共鳴
Glutathione peroxidase
グルタチオンペルオキシターゼ
HDF
Human Dermal Fibroblasts
ヒト皮膚線維芽細胞
HEPA
high efficiency particulate air filter
高性能エアフィルター
HMM
Human Monocyte-derived Macrophages
ヒト単球由来マクロファージ
HO-1
heme oxygenase-1
ヘムオキシゲナーゼ-1
HPLC
high performance liquid chromatography
高速液体クロマトグラフィー
50% inhibitory concentration
50％抑制濃度
-F-
-GGPx
-H-
-IIC50
略語集-2
略語集
ID50
50% inhibitory dose
50%抑制量
IL
interleukin
インターロイキン
ISO
International Organization for Standardization
国際標準化機構
LC50
50% Lethal concentration
半数致死濃度
LD50
50% Lethal Dose
半数致死量
LDH
lactate dehydrogenase
乳酸脱水素酵素
LUMO
lowest unoccupied molecular orbital
最低空軌道
MDCK
Madin-Darby canine kidney
イヌ腎臓由来
MEF
Mouse Embryonic Fibroblast
マウス胎児線維芽
MMC
MitomycinC
マイトマイシン C
MOE
margin of exposure
暴露マージン
MPPD
multiple path particle dosimetry
MRI
magnetic resonance imaging
核磁気共鳴画像法
MTP
Micro total protein
マイクロ総タンパク
MWCNT
multi-walled carbon nanotube
多層カーボンナノチューブ
-J-
-K-
-L-
-M-
略語集-3
略語集
-N-
NEDO
New
Energy
and
Industrial
Technology 独立行政法人新エネルギー・産業技
Development Organization
術総合開発機構
NHA
Normal Human Astrocytes
神経星状膠細胞
NiO
nickel oxide
酸化ニッケル
NIOSH
National Institute for Occupational Safety and 国立労働安全衛生研究所(米国)
Health
NMSP
Nanoscale Materials Stewardship Program
ナノスケール材料スチュワードシ
ッププログラム
NOAEL
no observed adverse effect level
無毒性量
NOEC
No observed effect concentration
無影響濃度
ODC
ornithine decarboxylase
オルニチンデカルボキシラーゼ
OECD
Organization for Economic Co-operation and 経済協力開発機構
-O-
Development
OPC
optical particle counter
光散乱式粒子計数器
OTM
olive tail moment
オリーブテールモーメント
PAH
polycyclic aromatic hydrocarbons
炭化水素
PL
Period Limited
時限付き
PMx
particulate matter x
直径 x[um]以下の微粒子
PVP
Polyvinylpyrrolidone
ポリビニルピロリドン
-P-
-Q略語集-4
略語集
-RREACH
Registration, Evaluation, Authorisation 化学物質の登録，評価，認可，制限
and Restriction of Chemicals
に関する規則
RNS
reactive nitrogen species
活性窒素種
ROS
Reactive Oxygen Species
活性酸素種
RPSP
Respirable, PoorlySoluble Particulates
低溶解性粒子
SEM
scanning electron microscope
走査型電子顕微鏡
SMPS
scanning mobility particle sizer
走査型移動度粒径測定器
SWCNT
single-walled carbon nanotube
単層カーボンナノチューブ
TD
toxicodynamics
トキシコダイナミックス
TEM
transmission electron microscope
透過型電子顕微鏡
THF
tetrahydrofuran
テトラヒドロフラン
TiO2
titanium dioxide
二酸化チタン
TK
toxicokinetics
トキシコキネティックス
TNF
tumor necrosis factor
腫瘍壊死因子
TOFMS
time of flight mass spectrometry
飛行時間型質量分析法
uncertainty factor
不確実性係数
-S-
-T-
-UUF
略語集-5
略語集
U.S.EPA
United States Environmental Protection Agency
米国環境保護庁
X-ray photoelectron spectroscopy
X 線光電子分光法
-V-
-W-
-XXPS
-Y-
-Z-
略語集-6
本書の内容は、（独）新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）受託研究
である「ナノ粒子特性評価手法の研究開発」（P06041）の成果です。

潤ちゃんのお絵描き塾 その3

1 用語の定義

3章 イオン結合とイオン結晶 - 名城大学 農学部 有機物性化学研究室

第 2章 極限

4A01-4A09 気相

PDF 6P - 一般財団法人 日本消防設備安全センター