Step 2_人工遺伝子合成サービス GeneArtTM人工遺伝子合成 ご注文マニュアル 2015年8月版 The world leader in serving science 1 目次 人工遺伝子合成サービス設定の開始・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P3 １．配列の入力・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P4 ２．配列の編集・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P9 ３．配列の最適化・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P19 配列の概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P25 設定終了・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P29 複数の人工遺伝子合成配列情報の入力方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P30 Large Order Assistantの利用・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・P31 設定済みサービスの複製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P32 個別入力・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P33 2 人工遺伝子合成サービス設定の開始 人工遺伝子合成サービスの内容を設定するには、追加したアイコンをクリッ クして開始します。 クリックして サービス内容の 設定を開始しま す。 3 1. 配列の入力 必須項目の入力 配列情報を入力します。サンプル名、配列の種類、配列（塩基配列・アミノ酸 配列）、生物学的安全性レベルを入力します。 入力した配列を編集・最適化することなく、そのまま合成をご希望の方は配 列の概要へ進み、内容を確認後、「保存」をクリックして下さい。 「*」で示されているのは必須入力項目です。 サンプル名 塩基配列かアミノ酸配列の一種類を入力 Biosafety Confirmation の日本語訳が次ページ にあります。 4 赤枠内の情報を入力し ます。配列の種類は DNAかアミノ酸配列の どちらか一種類を入力 し、選択します。 Biosafety Confirmation / バイオセーフティ確認書 Webオーダーポータル上のドロップダウンメニューで、顧客がバイオセーフティレベル1またはバイオセーフティレ ベル2のいずれを選択するかにかかわらず、顧客は対象DNAを、適用される国内法令および国際法令（ドイツ 遺伝子工学法（「Gentechnikgesetz」）およびドイツ生物学的安全中央委員会（「ZKBS」）のステートメント（随 時の修正を含む）を含むが、これらに限られない）に必ず従って使用することを、ここに確認する。 注：顧客の選択にかかわらず、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社は、バイオセ ーフティ評価を行う。顧客がバイオセーフティレベル1を選択したが、ライフテクノロジーズ・コーポレーションま たはその関連会社による評価では、依頼されたDNAがバイオセーフティレベル2を要するとされた場合、顧客 は、バイオセーフティレベル2の要件に従って修正した見積書を送付し、審査を受ける。 Webオーダーポータル上のドロップダウンメニューで、顧客がバイオセーフティレベル2を選択した場合には、顧客 がライフテクノロジーズ・コーポレーションまたはその関連会社に発注した各注文に基づき作成を依頼したDNA （各注文に基づく顧客のためのライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社によるサ ービスの遂行中に受け取ったプラスミド、核酸配列、アミノ酸配列および／または中間体、ならびに顧客のため のライフテクノロジーズおよび／またはその関連会社によるサービスの遂行により得られた最終成果物を含む が、これらに限られない）（「対象DNA」）は、バイオセーフティレベル1の環境で取り扱うことができること、また、 当該対象DNAの作成、取扱いおよび発送には、特別な安全対策を要しないことを、顧客はここに、さらに確認 する。この場合、顧客は、対象DNAをライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社に 提供した時点において顧客が実際に知っていたすべての関連する物質取扱い情報を、ライフテクノロジーズ・ コーポレーションおよび／またはその関連会社に提供する。 上記にかかわらず、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社は、顧客に交付した注 文確認書を、バイオセーフティ上の理由により、いつでも撤回することができ、これにより顧客に対して責任を 負うことはないものとする。 5 1. 配列の入力 オプション１ 標準のクローニングベクターの場合、薬剤耐性マーカー指定無しは無料にな ります。アンピシリン・カナマイシンを指定する場合、追加料金（￥7,000）が必 要となります。 エクスプレスクローニングサービスでは、発現ベクターに直接クローニングで きます。詳細は次ページをご参照ください。 TSE-Freeでは、TSE（伝染性海綿状脳症因子）を含まない培地とプレートを用 いて全ての実験を行います。最終納品物にはTSE-Freeの証明書が付きます。 合成予定配列が薬剤耐性遺伝子、ori（複製起点）、毒性遺伝子を含む場合 、該当する事項を選択してください。 6 1. 配列の入力 オプション2 エクスプレスクローニングサービスにチェックを入れて ください。続いてドロップダウンリストからご希望のベ クターをご選択ください。 また適切な付加配列をご選択ください。 注意！合成予定配列の長さ・合成難易度等によっては本サービスを利用で きない場合があります。その場合は、エラーメッセージに従って、配列の編集 ・修正・コドン最適化を行って下さい。それでもご利用いただけない場合は、 チェックを外し、通常のサブクローニングとしてご注文ください。 ご選択可能なベクターの種類 7 No. ベクター 生物種 プロモーター タグ 安定株樹立用の選択 マーカー 誘導因子 プラスミド選択用のマーカー 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pcDNA3.3-TOPO pcDNA3.4-TOPO pET100/D-TOPO pET151/D-TOPO pRSET A pFastBac1 pYes2.1V5-His TOPO pcDNA3.1（+） pDONR221 哺乳類 哺乳類 大腸菌 大腸菌 大腸菌 昆虫バキュロウイルス 出芽酵母 哺乳類 なし CMV CMV T7 & lac operator T7 & lac operator T7 Polyhedrin GAL1 CMV なし なし なし N末6xHis & Xpress N末6xHis & V5 N末6xHis & Xpress なし C末V5 & 6xHis なし なし Neomycin Neomycin none none none none URA3 Neomycin none none none IPTG IPTG IPTG none galactose none none Ampicillin Ampicillin Ampicillin Ampicillin Ampicillin Ampicillin & Gentamicin Ampicillin Ampicillin Kanamycin N末端タグ C末端タグ none none none none 6xHis & Xpress none 6xHis & V5 none 6xHis & Xpress none none none none V5 & 6xHis none none none none 1. 配列の入力 オプション3 ご質問･ご要望を入力する際は左枠にチェックを入れて下さい。入力画面が 現れます。入力は英語でのみ可能です。なお入力するとGeneArt担当者の確 認が必要となり、追加料金が発生します。必要な方のみ入力して下さい。 追加サービスでは、人工遺伝子合成と組み合わせるサービスを選択します。 例えばサブクローニングを選択すると、人工合成した遺伝子を、別なベクター にサブクローニングできます。なお、すでにプロジェクト内のドラッグ＆ドロップ で追加済みの場合は不要です。 ご質問・ご要望をここに英語で入力します （有料、日本語不可） 8 2. 配列の編集 ORF候補の選択 「ORF」では、コドン最適化の対象領域であるORFを選択します。自動処理に より複数のORF候補が表示されます。ご希望のORFにチェックを入れて選択し ます。なお最適化を行わない場合はORFを選択する必要はありません。 最適化を行うORF領域 にチェックを入れて選 択します。 ここをクリックすると、 他のORF候補が表示 されます。 チェックを入 れた領域が 水色で表示 されます。 選択したORFは Feature Mapに表 示されます。 9 2. 配列の編集 任意のORFの選択 右タブの「ORFの指定」をクリックすると、任意のORF領域を指定できます。 最適化を行わない場合はORFを選択する必要はありません。 クリックすると、任意のORF領域 を指定できます。 最初と最後の 位置を指定し、 「適用」をクリッ クします。 10 指定した領 域が水色で 表示されま す。 2. 配列の編集 5’付加配列 制限酵素配列（1） 5’側のクローニング用制限酵素認識配列や付加配列を指定します。すでに 付加してある場合、候補が自動的に表示されます。もし、ご希望のものが表 示されていない場合は、「新規配列の付加」をクリックします。 新しい画面が 現れます 候補がここに表示されます。本画面で はまだ付加されていないので、表示さ れません。 11 2. 配列の編集 5’付加配列 制限酵素配列（2） 新しい画面で ドロップダウンリストをクリックします。制限酵素やatt配列のリ ストが開きます。ご希望のものを選択し、「配列の付加」をクリックします。 BamHIを選択し、開始コ ドンのAにあたる1番目の 塩基の前に付加します。 12 2. 配列の編集 5’付加配列 制限酵素配列（3） 付加したBamHIは黄色の背景と赤線で表示されます。最適化配列から自動 的に除外されます。また保護の設定がされるので、最適化を行っても配列は 変更されません。 赤線と黄色の背景で表示されます 13 自動的に保護されます 自動的に除外されます 2. 配列の編集 5’付加配列 任意の配列の付加 リストにない任意の配列を付加する場合には、付加する位置と配列を入力し 、「配列の付加」をクリックして下さい。 例として、開始コドンのAの前に、GCCACCを付加します。 ２．開始コドンの前に GCCACCが挿入されます １．付加配列（GCCACC)と付加部位（ 開始コドンのA）を入力し、「配列の付 加」ボタンをクリックします。 14 2. 配列の編集 3’付加配列 3’側の付加配列を選択し、挿入します。方法は5’付加配列と同じです。例とし て、Eco RIを1147番目の塩基の前に挿入します。 EcoRIを選択し、ストップ コドンの直後になる 1147番目の前に付加し ます。 15 自動的に保護されます 赤線と黄色の 背景で表示さ れます 自動的に除外されます 2. 配列の編集 配列の挿入 左のタブは塩基の挿入です。ご希望の配列を挿入します。なお赤線で示され ている付加配列は修正できません。修正する場合は設定した画面に戻って 行って下さい。 挿入後にUndoのやり直しはできません。削除タブで挿入配列を削除してくだ さい。さらに修正時にBackSpaceキーを押さないで下さい。画面が消えてしま います。 ここに挿入配列を入力します 16 挿入位置と挿入用 の塩基配列を入力し 、「挿入」をクリックし ます。 2. 配列の編集 配列の削除 中央のタブは塩基の削除です。ご希望の範囲を指定し、削除します。なお赤 線で示されている付加配列は修正できません。修正する場合は設定した画 面に戻って行って下さい。 削除後にUndoのやり直しはできません。挿入タブで削除した配列を挿入して ください。さらに修正時にBackSpaceキーを押さないで下さい。画面が消えてし まいます。 削除する範囲を入力 し、「削除」をクリック します。 17 2. 配列の編集 コドンとアミノ酸の置換 右のタブはコドンとアミノ酸置換用の画面です。希望のアミノ酸部位を指定し 、ドロップダウンリストから選択します。なお赤線で示されている付加配列は 修正できません。修正する場合は設定した画面に戻って行って下さい。 修正後にUndoのやり直しはできません。さらに修正時にBackSpaceキーを押 さないで下さい。画面が消えてしまいます。 リストから候補を選択し、 「置換」をクリックします。 18 3. 配列の最適化 制限酵素認識配列の保護 最適化で保護する配列を選択します。保護する塩基配列は最適化後も変更 ありません。検出されたものが自動的に表示されます。 候補配列が表示されない場合は「+表示範囲を広げる」をクリックして下さい。 リストに表示されない配列を保護する場合は、「任意の配列の保護」をクリッ クして下さい。 チェックを 入れて選 択します。 保護した制限酵素 認識配列は、赤線で 表示されます。 19 保護する配列は、 Feature Mapに表 示されます。 3. 配列の最適化 任意の配列の保護 最適化で任意の配列を保護する場合は、その範囲を入力し、「保護」をクリッ クします。保護した範囲の塩基配列は最適化後も変更ありません。 最初と最後の位置を入 力し、「保護」をクリックし ます。 保護した範囲の配列は、 赤線で表示されます。 保護した範囲の配列は、 Feature Mapに表示され ます。 20 3. 配列の最適化 除外する制限酵素配列 最適化後の配列中に含めたくない配列を、リストの中から選択します。 リストは部分表示されています。全表示するには一番下にある「+表示範囲を 広げる」をクリックして下さい。 リストにない任意の配列を除外する場合は、右タブの「任意の配列」をクリッ クして下さい。 チェック を入れて 選択しま す。 21 除外する配列は、 Feature Mapに表 示されます。 3. 配列の最適化 除外する任意の配列 最適化後に含みたくない任意の配列を指定します。配列の名前と配列を入 力し、「除外する」をクリックします。除外した配列は最適化後の配列には含ま れません。 配列の名前と配列を 入力し、「除外する」を クリックします。 22 除外する配列は、 Feature Mapに表 示されます。 3. 配列の最適化 生物種の選択と最適化の実行 最適化タブを開き、コドン最適化用生物種のドロップダウンリストから、ご希 望の生物種を選択します。ご希望のものがない場合は、一番下にある「Other 」を選択します。専用入力枠が現れるので、そこに学名を入力します。最適化 を希望しない場合は「Non optimized」を選択します。生物種を選択し、「最適 化」をクリックすると、自動的に開始します。 青くなった「最適化」ボタンをク リックして最適化を開始します 。 生物種によってはコザック配 列を付加できます。 最適化タブを開き、コドン 最適化用生物種のリストを 開きます。 23 ご希望の生物種を 選択します 3. 配列の最適化 コドン最適化用生物種一覧表 リストにある生物種の一般名と付加できるコザック配列は下記の一覧表を参 照して下さい。 学名 Non optimized Arabidopsis thaliana Bacillus subtilis Bos taurus Brassica napus Caenorhabditis elegans Caulobacter crescentus CB15 Chlamydomonas reinharditii Cricetulus griseus Drosophila melanogaster Escherichia coli Glycine max Homo sapiens Hordeum vulgare Lycopersicon esculentum Mus musculs Nicotiana benthamiana Nicotiana tabacum Olyctolagus cuniculus Oryza sativa Pichia pastoris Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Spodoptera frugiperda Synechococcus elongatus Vaccinia virus Zea mays Other 24 一般名 最適化なし シロイヌナズナ 枯草菌 牛 セイヨウアブラナ 線虫（C.elegans) C. crescentus CB15株 クラミドモナス（Engineering Kits, A14258） チャイニーズハムスター、CHO細胞 キイロショウジョウバエ 大腸菌 大豆 ヒト 大麦 トマト マウス ベンサミアナタバコ タバコ ウサギ イネ ピキア酵母 出芽酵母 分裂酵母 ヨトウガ、Sf9細胞、Sf21細胞 シアノバクテリア（Engineering Kits, A14259） ワクシニアウイルス トウモロコシ その他 +コザック配列 なし なし なし GCCACC なし なし なし なし GCCACC GCCACC なし なし GCCACC なし なし GCCACC なし なし GCCACC なし AAAA AAAA AAAA GCCACC なし なし なし なし 配列の概要 合成予定配列の確認 配列の概要で、合成予定配列の内容と解析結果を確認できます。最適化し た場合は最適化配列が表示されます。また解析結果と塩基配列をダウンロ ードできます。解析結果はCodon Quality Distribution、Codon Quality Plot、GC Contentが示されます。問題がなければ「保存」をクリックして下さい。 クリック！ 解析結果、合成予定塩 基配列をダウンロード できます。 25 配列の概要 最適化後の解析結果(1) 「Codon Quality Distribution」 では、コドンクオリティーに基づくコドンの割合が 示されています。コドンクオリティーの値は、各アミノ酸で最も使用頻度の高 いコドンを100に設定し、他のコドンをそれに応じて相対的に設定したもので す。青が最適化前で黄色が最適化後です。 青：最適化前 26 黄：最適化後 配列の概要 最適化後の解析結果(2) 「Codon Quality Plot」では、塩基配列の各ポジションにおけるコドンクオリティ ーを示してます。コドンクオリティーの値は、各アミノ酸で最も使用頻度の高い コドンを100に設定し、他のコドンをそれに応じて相対的に設定したものです。 青が最適化前で黄色が最適化後です。 青：最適化前 27 黄：最適化後 配列の概要 最適化後の解析結果(3) 「GC Content」では、各ポジションの前後20bpから成る40bpのGC含量を示し てます。青が最適化前で黄色が最適化後です。 青：最適化前 28 黄：最適化後 人工遺伝子合成サービス 設定終了 人工遺伝子合成サービスの設定が終了しました。アイコン内の緑色のチェッ クマークは、必要な情報が全て入力されたことを表しています。 29 複数の人工遺伝子合成配列情報の入力方法 複数の人工遺伝子合成の配列情報を入力するには、次の方法があります。 1. Large Order Assistantの利用 2. 設定済みサービスの複製 3. 個別入力 30 １．Large Order Assistantの利用 Large Order Assistantを利用すると、最大50本の配列を一度に入力できます。 Large Order Assistant アイコンをドラッグ＆ドロップします。 31 ２．設定済みサービスの複製 1. 人工遺伝子合成サービスを設定します。 2. 編集メニューからコピーを選択します。 3. 「新規ターゲットの追加」を開き、「ここにドロップ、、」の編集メニューから貼り 付けを選択します。 4. 同じサービス内容が複製されます。 5. ２ 配列の編集を利用して、修正・変更します。 A.赤枠の上にマウ スを重ねます 32 B.編集メニュー が現れます C.「コピー」を 選択します D.「ここにドロッ プ、、」の編集メ ニューから「貼り 付け」を選択し ます。 E.同じ設定内容の アイコンが複製さ れました。ご希望 に応じて修正・変 更します。 ３．個別入力 Gene Synthesisのアイコンを本数分ドラッグ＆ドロップします。 ターゲットごとに配列情報等を入力します。 ターゲット ごとに入力 します ご希望の本数分（ここで は2本なので2回）ドラッ グ＆ドロップします。 33
© Copyright 2024 Paperzz
