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マイクロチャネル微小血管モデルのマイクロマシーニングと血球細胞の

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マイク口チャネル微小血管モデルのマイク口マシーニングと
血球細胞の変形・凝集能の画像解析システムに関する研究
研究責任者
慶応義塾大小理_L/戸部物理情報上フ:科
教 授 南 谷 晴 之
、
i
三導体微細加工技術を利刑して、微小で精巧なアクチ
1
. はじめに
血液を循環させる血管系のうち、顕微鏡レベルの血液
ユエータやセンサを作製する試みは、マイクロマシンあ
循環系は微小循環と呼ばれ、細動脈や制静脈などで構成
るいはマイクロメカニクスとして広く知られている。従
され、その最小単位が毛細血管である。この循環系を流
来までに、シリコン基板にプラズマエ
壬
動し酸素代謝を担うのが赤血球であるが、赤血球の直 f
を開けてミリボアフィルタ状にしたものや多数の溝状の
は約 811mて、あり、変形しないと毛細血管を通過しえない
マイクロチャネルを成形したものなどが開発され 1)- 3i 、
関係にある。赤血球の変形・凝集能は毛細血管レベルの
これに血液を流し、赤血球の流動変形能を測定している
血流動態を左右する重要な因子であり、組織への際素放
例がみられる。しかし、シリコン基板のものでは、 i
走路
出に大きな影響を与えるとともに血管傷害にも深く関わ
る
ハ
方、血小板は直径数 μmの小さな血球細胞であり、
y チング法で小孔
を流れる血球細胞の可視化は不可能で赤血球自体の変形
状態を解析することができず、流路の流人出端の圧力差、
止血作用を主な役割として偽足の形成、血管損傷部位へ
流出 Eと流出時間を測定してサンプル全体のレオロジカ
の粘着・凝集、作用物質の放出、凝同充進、巾栓形成な
ルな特性を議論しているに過ぎなかった。
どに関与している。
本研究では、今まで困難であったクリスタルガラス基
本研究では、赤血球と血小板が微小血管内で示す挙動
板表面にドライエ y チング加工を施し、幅 4~20 ,u m 、深
を直視し、その動態、を解明するためにマイクロチャネル
さ 5~ IO ,u m 、長さ 50~200μm 、チャネル数が20~50+ の
微小血管モデルと血流動態可視化用の耐像解析システム
マイクロチャネル微小血管モデルを成形した。ドライエ
を構築した。構築したシステムを用いて、血球細胞が低
ッチングは深さ方向のみの異 )
j性エッチングが可能、平
ずり応力下でどのような変形、凝集、粘着、等を行うか、
L通りの微細加工が可能で、、また
岡的にはパターンの、h
細胞を覆う膜タンパクや膜脂質層の組成と変性によって
極々のデサ、インのものをリソグラフィーにより加工でき
それらの )
J学・化学作用が L、かに変化するか、また血中
る。図 lは、クリスタルガラス基板上に成形された直線
化学成分と血小板血栓形成過程の関係など、赤血球及び
状マイクロチャネル微小血管モデルである。このガラス
血小板の生理機能と血流動態、に与える諸因子の閑係を明
基板マイクロチャネルをカバーグラスで覆い、アクリル
らかにした。本報告では、赤血球と血小板の変形・凝集
アルミ巨体ホルダー内に設置・密閉し、接続したシリコ
特性の解析結果について、また病態として糖尿病を対象
に健常コントロール群との対照実験結果について述べる。
ンチューブを介して、遠沈分離した赤血球浮遊 i
夜を静水
五
! (10-3
0cmH)
'0
) をかけてチャネル内に流動させる。
亦血球浮遊液は、このチャネルを図 2のように流れるが、
チャネル幅が狭いので赤血球は変形して流路を通過する。
なお、
系ではラ y トの微小循環を対象に、
10VIVO
系ではヒトおよびラ
y
10v
I
tr
o
ト採取血を本研究で新規に開発し
たマイクロチャネル微小血管モデルに流動させた状態で
行った。
静水圧の増加にともないチャネル内の流速は増加する。
このホルダーを顕微鏡鏡筒下に置き、適切倍率で個々の
細胞を観測するとともに以下の掲像系にてイメージング
2
. マイクロチャネル微小血管モデルのマイク口マシーニング
を行うことができる。 従来、血球細胞の変形能や透過性
1
9
を測定する装置には膜フィルタやガラスピペット法があ
2000フレームまで阿像メモリに記憶される。録画面像を
るが、再使用が不可能であること、~);、シリコン・マ
1
/
3
3の低速で再生し、標準ビデオレートの V T Rに再録
イクロマシン・フローチャネルではチャネル中の細胞の
1
/
1
0
0
0秒)
画したとこれは、高速度ビデオの 1フレーム (
挙動が可視化できないなどの問題点があった c いずれの
が標準ビデオの lフレーム(1/
3
0秒)に対応することになる υ
場合も血球の通過孔とその周辺で細胞がトラ
y プされる
したがって、亦血球などの有形成分による巾液の濃淡パ
(詰まる)可能性が高く、正確な特性を測定できない場
ターンが明瞭に撮像でき、同所的なrfI
L
流速度を算出する
合がある c 本システムではそのような問題点が皆無であ
ことが u
j能となった。本システムの特徴は、測定の自動
ることが最大の特長である。
化であり、各フレーム画像の前処理、対象となる血球細
3
. 血球細胞の動態解析用撮像システム及び
速の作一菜を白動的に行えるようにしである。従来、オフ
胞の移動量の算出、ビデオ画像、のフレーム送りなどのー
画像処理システムの構築
/
1
0
ラインで多大な解析時間を必要としていたものが、 1
細動脈、細静脈内の血流状態やマイクロチャネル微小
以下の処用!時間で終えることが可能となった。解析肘コ
[
[
1球細胞の挙動を可視化する撮像システ
血管モデル内の 1
ンビュータに 512x512画素、 256階誹l
に量子化した連続フ
ムとその取得画像から流速や形態変化を解析する画像処
レーム画像を 2枚取り込み、ノイズ処理、平滑化などの
前処理によって│由i
像鮮明化を行い、つぎの演算処理を行
ン百三三事
e
w
ったハ同 2に示すようなパラシュート状に変形しながら
11
皇室勺 f
A
流動する赤血球に対して、移動速度の算出には独自に開
発した阿像相関法を適用した。すなわち、 2枚の画像濃
三: ;星雲塾協
淡パターンの 2次心相互相関関数を算出し、相関値最大
の移動部位を求め、対象物体の移動量を算出するもので
.
主二五二斗 5
ある
‘恥
⑤
・
‘
"
、
宅益
ついてはフレーム毎に各々定義した幾何学量に基づき変
咽旬
形能を算出する。赤血球細胞については、パラシュート
幽'
•
、
.
.
.
.'‘.
.、透a
宅
厳
ミ
憲
この移動量を 2枚の画像のフレーム間隔(時間)で
除すれば、移動速度が求まるつまた、細胞の変形状態に
D
e
f
o
n
n
a
t
i
o
nI
n
d
e
x
:DI)を
状に変形した細胞の変形指数 (
;)とめ、赤血球変形能を定量化した。
司
図 1 マイクロチャネル微小巾管モデル
4
. 赤血球の変形能と局所弾性特性の測定
開尿病と高脂血症を対象にヒト及びラットの赤血球変
も
D伽 mationlndex=
形能の低ト内子を )
J学的特性、生化学的特性から分析す
るとともに数種の薬理効果を健常例を C
o
n
t
r
o
l群として比
較愉討したこ本報告では紙面の都合上、糖尿病に関する
じ[
結果のみを示す。図 3は、ヒト健常群と糖尿病群の赤血
球の変形指数と流速の関係を示したものである。精尿病
iDM) 群の血糖値は、 2
4
2
.
2士4
3
.
8m
g
/
d
l、C
o
n
t
r
o
l群のrfIL
糖値は 1
4
0
.
6士 21
.3m
g
/
d
1である c 両者とも低ずり速度(低
+
一
一
一
一
一
L一
一
一
一
一
+
流速)では急激に変形能が増加する傾向がみられ、中ず
1
)速度ではさらに変形能がI
目加するが、変形の度合は少
同 2 チャネル│付を流れる赤血球及び変形指伐の定義
なくなり、高ずり速度では変形特性の飽和傾向がみられ
理システムの構築を行った。赤血球なと、血球細胞をミク
た)糖尿病赤血球は健常例に比べて変形能が小さく、中
ロレベルで日j視化するためには、 200-500倍(対物レン
ずり速度から変形飽和特性を示し、とくに高ずり速度で、
ズ40-100
倍)程度の高倍不での観察が必要である
は大幅に低下している。細胞膜の弾性変化から安形しに
J
しか
し、高倍率の顕微鏡悦野内では、標準ビデオレートの 30
くくなっているものと考えられる。血色素と血中のブド
フレーム/秒の撮像では血球単体の動きが確認できないハ
ウ糟が結介した g
l
y
c
o
s
y
l
a
t
e
dhemoglobin (HbA1
c
) は、がJ
1
個々の
1
2
0日の赤血球寿命内の平均的な血糖値を反映する lつ
血球細胞を識別できる 1000フレーム/秒で撮像した。取
の重要な指標 (
l
E常値は 6
(
]
'O以ド)であり、糖尿病におい
得画像は 512x512画素のイメージサイズでフレーム毎に
ては健常者に比べて HbA1cの増加が認められる c 図4は
そこで高感度-高速度ビデオシステムを用いて、
20
流速 2
.
5mm/s以上の赤血球変形能と HbAlcの関係を示し
が赤血球内へのソルピトール蓄積を抑制することによる
たものであり、糖尿病群である HbAlcが6.4%以 Lの変形
ものであり、逆に変形能低下が赤血球膜の硬化のみなら
能は有意に低下する傾向が認められた。また、凶 5は同
ず赤血球内の代謝変化によっておこることを示唆してい
様に糖尿病患者の赤血球内ソルビトール濃度と変形能の
る
。
関係およびHbA1cと変形能の関係を示したものであり、
これらの結果を踏まえて原子間力顕微鏡を用いて赤血
両者ともその濃度の増加にともなって変形能が低下して
球のミクロな弾性特性を解析した。原子問力顕微鏡は、
いる。糖尿病赤血球変形能に対する薬理効果を調べた結
カンチレバーの先端に付けた微小プロープ(探針)が対
果、糖尿病群にアルドース還広酵素阻害剤 (ARI)を投与
1nm
程度)に働
象表面の原子、分子に近接してこの間 (
すると変形能は上昇し、健常値に近づく。これは、 ARI
くファンデルワールス力によるカンチレバーの携みから
表面性状を観測する装置である 4)。本研究では、生物
2
乏し
用にカンチレバーのパネ定数を柔らくし、溶液中に j
でも使用できるプローブを導入した。ヒトまたはラット
1
.
5
の採取血から分離した赤血球をプラスチックディッシュ
(
d
i
s
h
) に入れ、 PBS緩衝液中に静置して生理状態に保っ
o
た。その細胞表面にプロープを近接させ、さらに法線方
1
向に押し込むことにより、カンチレバーの擦みから求ま
る細胞膜の反力とプローブの変位量から、いわゆるフォ
0
.
5
ースカーブが得られる。本システムの変位検出分解能は
0
.
1nm、フォース検出分解能は 0
.
8pNで、ある。図 6は赤血
0
o
1
2
3
4
RBCv
e
l
o
c
i
t
y[mm/s]
球のミクロ弾性を表すフォースカーブを示したものであ
5
i
s
h底面の硬さを表したもの、健常赤血球
る。国には、 d
図 3糖尿病群の赤血球変形指数と流速の関係
(
C
o
n
t
r
o
l
) 、健常赤血球をグルタールアルデヒドで硬化
させたもの (GA) および糖尿病赤血球 (DM) のフォー
スカーブを示した。ブオースカーブの傾きが急峻で、ある
1
.
6
ほど対象が硬いことを表すコこれらのフォースカーブか
らHookeの法則およびH
e
r
t
zモデルを用いて算出した赤血
•
c
i
i1
.
2
E
S
"
'0.8
。
球中心部のパネ定数とヤング率をまとめたのが図 7であ
る
園
GA硬化赤血球は正常赤血球に比べて明らかに硬く
なっており、パネ定数、ヤング半とも高債を示す。また、
•
糖尿病赤血球の弾性も正常 C
o
n
t
r
o
l群に比べて有意に高値
を示した。糖尿病においては赤血球の細胞膜の糖化変性
により膜弾性の低下が起こり、また浸透圧抵抗性を示し
0.
4
4
6
8
1
0
1
2
1
4
H
b
A
1
c[%]
図 4 流速2.5mm/s以上の赤血球変形能と HbA1cの関係
1
.4
が{氏上するものと考えられる。
2
5
0
~
ー
。
置
0
.
8
。
nunununUハU
nυadnUFO
{
E
C
Y
O
E
H
Z
SちEgo-一
志
百
211
'
"
"
"1
.2
0
.
6
て細胞内粘度が上昇するとともに流動性が低下し、その
結果、赤血球そのものが変形しにくく硬くなり、変形能
5
0
1
0
20
30
40
S
o
r
b
i
t
o
J[
n
m
o
l
l
g
Hb]
図 5糖尿病群の赤血球変形能とソルビ卜ール値の関係
o
1
0
0
200
3
0
0
4
0
0
5
0
0
6
0
0
d
i
s
p
l
a
c
e
m
e
n
t0
1c
a
n
t
i
l
e
v
e
r
[
n
m
]
図 6 原子間力顕微鏡から得られるフォ
スカーブ
2
1
キ
2
励起光の照射開始時聞を起点にして血小板粘着開始時間
3
c
(
T
i
)、血栓成長時間 (To-Ti)、血管閉塞時間 (To)を血栓形
3
0
2
'
"
<n
55
成の一次許価指標としたし Tiは血管内皮傷害と血小板粘
<n
着能の活性化を反映する指標、 To-Tiは血小板粘着と血
ロ
ヲ
口3
c
z
E
0
〉
c
o
n
t
r
o
l DM
GA
(N=48)(N=145XN=20)
国8は血小紋粘着に始まり、血佳成長、血管閉塞に主
る過科をラット腸間膜の微小血管て、観測したものである。
'
a
.
"
E
Z
長10
孟
(
/
)
P
"
O
.
O
I(
v
s
.c
o
n
t
r
o
l
)
0.
4
15
O
小松凝集能および〉疑問系の活性化を反映する指標、 Toは
c
o
n
t
r
o
l DM
GA
(
対
立 48XN=145XN=20)
図 7 赤血球中心部のバネ定数とヤング率による弾性評価
血小板凝集により l
J
(
l
栓が進行し血管が完全に閉塞するま
での指標を表す,~同 9 は励起光強度に付するそれぞれの
指標の関係を示したものである。健常 Control群では、光
照射開始より 30 秒 ~4 分 (Ti) で血小板粘着が始まり、血住
以 l
二のように、糖尿病では健常群に比べて赤血球変形
成長時間 (To-Ti)として 1-15 分の経過がみられ、 2~20 分
(
1
1流ずり速度の増加とともに布意に低下するが、そ
能が1
で定全に血管閉塞に至る c 照射エネルギーを高めると各
れは血中の糖濃度に関連する HbAlcおよび赤血球内ソル
J
1i'僚の時間は同様に短くなることがわかるハ
ピトールの増加と相関しているつまた、原了間))顕微鏡
血小十反粘蒜および血管閉塞時間の関系には正の相関がみ
l
Ul流速度と
で測定された赤血球のミクロ弾性の結果からも細胞膜の
られる、すなわち、微小 J
i
l
l管内の壁ずり速度が大きくな
惰化変性によるヤング不の増加すなわち硬くなることが
ると血小板の粘着は容易でなく、血小板凝集から血栓形
確認された。このため、硬く変形しにくくなった亦血球
が血管墜の損傷を促進する可能性が大である
5
. 血小板の凝集・粘着能の測定と血栓形成の薬理的
制御
赤血球変形能の低下と弾性変化(硬化
i
土、微小血管
内で高ずり応力を発生させ、血管壁の損傷を議会する可
励起光照射から 3
分後
励起光照射荊
能性が高く、それにともない血小板の粘着・凝集の促進
と血小板血栓・血管閉塞への免展が考えられるへとくに
精尿病においては、微小循環レベルの紺│小血管痕
(microangiopathy) の発生頻度が高く、その軽減は臨床
上の大きな課題である c
本研究では、血小板の凝集、粘着、血松形成が健常
Control群に比べて糖尿病群で容易に起こることを精尿病
ラ y トの m
VIVO実験によって明らかにした)実験では光
励起光照射から 5
分後
j'l'生酸素
感受性物質とレーザ光の光化学反応で発生する J
励起光照射から 1
1分後
(血流遮断 (VSD))
による急性の血栓形成 j
去を導入し:;i (j、各種ずり速度
図 8光化学反応による微小血管内の血小板血栓
印A
ハ
U
↑
22
qL
化、血管閉塞時間などを両像解析から求めたと
一.ト叩川剛
一
・
←
斗
着・血栓形成による血管閉塞部の面積、 I
O
l管径の経時変
o
o
To・T,
今
フィリン用に水銀ランプ G励起連続光 (540nm)を別いた c
照射部位の血流動態をビデオカメラで撮像し、血小仮粘
↑
一
Q-switchedNd:YAG-SHノfルスレーサ、一 (532nm)を、ホト
mnununununU
0ζ0
0000
nuauaUA
脈 と 細 静 脈 ) に 照 射 し た 。 励 起 光 源 に は ZnCP!ll用に
0
トの尾静脈より投与し、対物レン
川
y
{11
四
回 ωコ﹄
{
U
@
ω
]£呈O﹂
EO﹂£﹄OωE-
ンを Wistar系雄性ラ
ズを通 Lて励起光を対象組織の微小山管(腸間肢の細動
︼
一
受性物質のポルフィリン誘導体ZnCPIlIまたはホトフィリ
会
光感
ハ
unununununu
nukunURdnUF3
種の影響と血栓抑制に関わる薬理効果を検証した
3224141
{
U
ω }
師C
E潟22Eち ωE
H
cω
一
数値的に評価した。また、血小板血栓に関わる活性酸素
T,
n
u
A
w
n
r
下における血ノト板の変形流動、血管内皮損傷部位への粘
着・凝集、血栓形成のプロセスを可視化し、その科度を
0
~
~
~
L
ighti
n
t
e
n
s
i
t
y[mW/mm2]
*
0
~
~
~
L
ig
h
ti
n
t
e
n到ty[mW
的1m
つ
図 9 糖尿病による血小板血栓への影響
成に至る H
F問が延長する。静脈系の 1
(
1管に比べ、動 11
(
系
6園まとめ
(
1
1管ではずり速度が速いために I
(
I
L衿開始・成長 U
.
)問な
の1
~(研究では、血液細胞の赤血球と血小恨の機能解析に
!
Jられ
らびに血管閉塞時間ともに布意に延長する結果が f
焦点をあて、細胞の変形・凝集能を凶i
象解析するために
た
J
光感受↑生物質の投与濃度を増加すると l
i
j
Jらかに濃度
U
l
令
官
マイクロマシーニングによるマイクロチャネル{般小 f
依存的にいずれの指標も合意に時!日!の短縮がi
Zめられたわ
モデルと血球細胞の変形-ィ疑集能の l
同[象解析システムの
光感受性物質の投与と光!日1
射を行わない群、J'
e
感受性物
構築を行ったコあわせて原子問力顕微鏡を用いた赤血球
質投与のみの毒性検討群、)¥:;1照射のみによる光エネルギ
のミクロ弾性測定と光化学反応で誘起される血小板血恰
ー検討群では、血小板粘着・凝集、血栓成長、血管 r~J 、
¥
,
1
形成 j
邑梓の l
由i
i
象解析を行ったハ構築したシステムを用い
はほとんど見られず、光感受性物質の毒性も
なかった
I
t
n題になら
」方、糖尿病計では、凶 9に不したように 1
(
1
1
て、血球細胞が低ずり応力 Fでどのような変形、凝集、
粘持、写を行い、微小術環レベルの│包流動態にとのよう
小板粘着開始時間はた照射からユo
秒 ユ分、血栓!記長時間
な影響をワえるか、細胞を覆う膜タンパクや膜脂質層の
、 I
l
I
I
管問零時間は l
分30秒 -9分であり、 l
i
(
l
松形
は 1~ 7分
組成と変性によってそれらの))学・化学作用がいかに変
o
n
t
r
o
l群に比べて昌:しく速く起こることがわか
成が健常 C
化するか、とくに糖尿病疾患において血中化学成分や刻 1
るご光感交↑生物質の濃度、照射光エネルギ一、血流速度
胞膜の局所粘弾性とこれらの関係や血管内皮傷害と血小
o
n
t
r
o
l群と同等であることから、 I
f
f
L小紋粘着・
とも健常 C
板血栓形成過科の解析など、赤血球及び血小板の生理機
凝集が速く、血栓成長が急激で、血管閉主主が早期に起こ
能と血流動態に与える諸肉子の関係を定量的に明らかに
(
1
1i
全性を示したものとして注 I
!
ることは糖尿病による易 [
した乙
される
光化学反応で、産生される活性酸素による血管内
本報告ーでは、精尿病と健常例の比較検討を主体にして
皮傷害とともに血小板膜破壊-脱頼粒-作用物質の放 1
'
,
研究成果を述べたが、紙而の都合上、マイクロチャネル
が促進され、これに続いてカスケード的に [
l
l
L小牧粘着能
への内皮細胞培養モデル、血液性状や血球構造物質の牛
の元進、;疑問系の促進、血栓成長、血管閉塞へ至る活性
化学的分析結果、赤血球の酸素・物質代謝の定量解析結
化メカニズムが{動いており、とくに糖)ぷ病微小循環では
果、栴尿病における易血栓性の諸国子の分析と薬理制御
I
血流遮断が',
1
.期に起こるものと与えられるこ
の結果などについては吉及できなかった υ 今後の研究成
l
予告牛する活性酸素は王に '02 (→重工良自主:;t)であるが、
果の蓄積をもって新たに報告する機会を持ちたい。
この一重瓜酸素は反止、性が高いことから、 I
(
[
L中で 1
'
1
[
1
(
1
球
などと反!んして他の活性酸素を生成している υ 他の活性
酸素種は、
0:,、l-I三 0、
,
: Ol-Iなとである
これらの
謝辞
本研究は財 i
司法人中谷電子計測技術振興財団の多大な
活性酸素が血栓形成・血管問主主に与える影響をそれそ'iL
研究助成により行われたものであり、ここに深く感謝申
の活性酸素消去斉J
I (スカベンジャー)を用いて検討したけ
し上げます、
スカベンシャーとして 10:,に対して Lーヒスチジン 50mg
士
、jして SO D (スーノ fーオキシドシスム
/
kgを
、 O2 に
参考文献
kgを
、 H 己 O 2に対してカタラーゼ 3mg
/
kg
ターゼ) 3mg/
1
)KikuchiY.,Da,
Q
.andF
u
j
i
n
o
.
T
.
:V
a
r
i
a
t
i
o
ni
nr
e
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谷下一夫:原子間力顕微鏡による糖尿病赤血球の弾性
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