光学顕微鏡概論 京都大学大学院生命科学研究科 生命科学特論E 2010年４月２７日 オリンパス株式会社 ライフサイエンス国内営業部教育研修ｸﾞﾙｰﾌﾟ 田中隆明 目次 光学顕微鏡とは 基本機能・構造 種類 光学顕微鏡の原理 レンズによる結像 顕微鏡の能力 対物レンズ レンズの収差 対物レンズの種類 油浸対物レンズと水浸対物レンズ 各種観察法 蛍光法 位相差法 微分干渉法 参考文献「ビデオ顕微鏡 参考文献「ビデオ顕微鏡 共立出版」 共立出版」 2 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学顕微鏡とは 光学顕微鏡とは 3 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 顕微鏡の基本機能 １．倍率 見やすい大きさで見える ２．分解能 見たい部分が十分に精細に見える ３．コントラスト 見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 4 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 倍率 見やすい大きさで見える 肉眼観察 実体顕微鏡観察 千円札 5 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 分解能 見たい部分が十分に精細に見える 珪藻標本 開口絞り（コンデンサ絞り）による分解能の違い 6 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 分解能 見たい部分が十分に精細に見える 細部が見えている 7 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 細部がつぶれている コントラスト 見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 微分干渉観察 8 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差観察 コントラスト 見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 染色体検査：蛍光観察 9 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted コントラスト 見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 角閃石系アスベスト（アモサイト）：鋭敏色観察 10 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 顕微鏡の基本構造 １．試料の拡大像を結像させる構造 結像位置、結像倍率を所定の値にする 視野絞り⇒試料面⇒中間像（1次像）⇒網膜（ヒトの眼） が共役関係 ２．試料の像にコントラストをつける構造 瞳の結像関係を使いて光変調を行い、像に明暗や色のコントラストを つける 光源⇒開口絞り（コンデンサ瞳）⇒対物瞳⇒アイポイント が共役関係 共役関係とは 共役関係とは レンズを介して物体と像との レンズを介して物体と像との 関係になっていること 関係になっていること 11 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 顕微鏡の基本構造 アイポイント ＜眼の瞳位置＞ 12 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 顕微鏡の種類 用途による分類・・・観察対象 生物顕微鏡、金属顕微鏡、実体顕微鏡、測定顕微鏡 （レーザー顕微鏡、電子顕微鏡・・・） 形による分類・・・標本に合わせた形 正立型顕微鏡、倒立型顕微鏡 観察法による分類・・・観察・検出する方法 明視野、暗視野、位相差、微分干渉、 （偏光、蛍光、レリーフコントラスト、 分散染色） 13 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 用途による分類 生物顕微鏡 プレパラート標本や培養容器中の試料観察 標本を光が透過する 14 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 用途による分類 金属顕微鏡 半導体検査用顕微鏡 金属や半導体、ICなど不透明な試料観察 標本で光が反射する 15 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 用途による分類 実体顕微鏡 試料を立体的に観察 16 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 用途による分類 実体顕微鏡 左右別の光軸があり、 内向きの角度がつけ てあるので立体視で きる ガリレオタイプ 17 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted グリノータイプ 用途による分類 測定顕微鏡 座標表示 xyz 測長機構 試料をＸＹ座標上で計測する 18 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 形による分類 生物用 19 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 正立型顕微鏡 金属用 形による分類 生物用 20 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 倒立型顕微鏡 金属用 明視野観察：染色した組織切片 １００ｘ ４０ｘ ２０ｘ １０ｘ ４ｘ ２ｘ １．２５ｘ 21 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 暗視野観察：サルモネラ菌 22 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 暗視野観察：無染色の藻類 アオミドロ 23 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差観察：無染色の肺組織（中皮腫） アスベスト小体 24 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察：無染色の培養細胞 ＮＧ１０８細胞 25 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 偏光観察：臨床検査（アミロイド検査） コンゴーレッド染色 腎臓血管 26 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 簡易偏光観察 偏光観察：臨床検査（痛風検査） 関節液中の尿酸ナトリウム：鋭敏色観察 27 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光観察：3重染色培養細胞 核、微小管、ｱｸﾁﾝ繊維 28 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted レリーフコントラスト観察：ＡＲＴ（生殖補助医療） ＩＣＳＩ（Intracytoplasmic sperm injection） 卵細胞質内精子注入法 29 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 分散染色観察：アスベスト分析 建材成分中のクリソタイル（蛇紋岩系） 浸液1.55の分散色 30 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学顕微鏡の原理 光学顕微鏡の原理 31 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：眼の識別能力 250mm：明視距離 眼による結像 網膜への投影 32 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 眼の2点識別能力 視細胞の大きさに依存する 光学原理：レンズによる結像 実像の結像 虚像の結像 （網膜上には実像） 33 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：レンズによる結像 網膜上の実像 中間像（1次像） 試料 34 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 虚像 参考：無限遠補正光学系とは 平行光束部分 35 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：顕微鏡の能力 分解能 標本上で分解して見える2点間の最小寸法 対物レンズの開口数と波長で決まる 倍率 対物レンズの倍率、接眼レンズの倍率、撮影レンズの倍率がある コントラスト 開口絞りの開度で決まる、観察法で決まる 焦点深度 開口数、倍率、眼の分解能で決まる 像の明るさ 開口数と倍率で決まる 36 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：開口数numerical aperture 乾燥系対物レンズ 乾燥系対物レンズの開口数 NA＝sinα 実用最大：0.95 油浸系対物レンズ 液浸系対物レンズの開口数 NA=nsinβ 実用最大：1.49 n:浸液の屈折率 オイル：1.516 水 ：1.33 37 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：分解能resolving power 分解能δ＝0.61λ／NA 分解能δ＝0.61λ／NA 開口数と波長にのみ依存する 開口数と波長にのみ依存する 38 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：回折像 直径 エアリーの円盤（disk) 全光量の84% 直径＝1.22λ／NA １光点の回折像 39 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 回折像の強度分布曲線 光学原理：２光点の回折像 2光点を2光点像と識別 できる 2光点像と完全に識別 できる 40 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 「ﾋﾞﾃﾞｵ顕微鏡：共立出版」 光学原理：Rayleighの分解能 この間隔に対応す る物体側の距離 ﾚｰﾚｰ（Rayleigh）の分解能 ﾚｰﾚｰ（Rayleigh）の分解能 δ＝0.61λ／ＮＡ δ＝0.61λ／ＮＡ ＜条件） ２光点の強度が等しい ２光点の光線がインコヒー レントである くびれ 41 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted くびれを考慮すると、 0,61⇒0.5としてよい 参考：ＣＣＤの画素サイズと分解能 ＣＣＤ面 対物レンズ＋撮影レンズによる ＣＣＤ上への結像倍率：Ｍ δ ⊿ ⊿＝Ｍｘδ 42 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 参考：ＣＣＤの画素サイズと分解能 光軸 ⊿ ＣＣＤ面 1画素を⊿と同じとすると2点分 解できない場合がある 43 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 1画素は⊿の１/２以下が 必要 光学原理：有効倍率 ５００ＮＡ＜ＭＥ＜１０００ＮＡ ＭＥ：有効な倍率（対物倍率×接眼倍率） ＮＡ：対物開口数 開口数と倍率の関係 開口数と倍率の関係 1000ＮＡ以上の倍率をばか倍率、 1000ＮＡ以上の倍率をばか倍率、 または無効倍率と呼ぶ または無効倍率と呼ぶ 44 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：横倍率と縦倍率 縦倍率は、横倍率の２乗 ⇒空気中かつ横倍率が１以外のとき、物体と像とは相似にならない n’ n X Z’ Z X’ 拡大光学系 X' X Z ' n' 縦倍率α = ＝ β２ Z n 横倍率β＝ 球の像は長楕円体 球の像は長楕円体 一般に「倍率」とは横倍率を言う 一般に「倍率」とは横倍率を言う 45 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：横倍率と縦倍率 縦倍率は、横倍率の２乗 ⇒横倍率が１以外のとき、物体と像とは相似にならない n n’ X Z’ Z X’ 縮小光学系 X' X Z ' n' 縦倍率α = ＝ β２ Z n 横倍率β＝ 46 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 球の像は長楕円体 球の像は長楕円体 光学原理：コントラスト・・・照明の条件による違い a 開口絞り全開 b 開口絞り80％ c 開口絞り最小 aは分解能は良いが、コントラストが悪い aは分解能は良いが、コントラストが悪い bは分解能とコントラストのバランスがよい bは分解能とコントラストのバランスがよい cはコントラスとは良いが分解能が悪い cはコントラスとは良いが分解能が悪い 注） ％は対物開口数に対する照明開口数の割合 47 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：焦点深度 焦点深度 開口数、倍率、眼の分解能で決まる 開口数、倍率の反比例する ・開口数が大・・・焦点深度 小 ・高倍率ほど・・・焦点深度 小 48 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：焦点深度 NA0.30 対物20X NA0.50 アカガシ切片 同じ倍率でもNAが違うと焦点深度は違う 49 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理：像の明るさ 像の明るさ・・・開口数と倍率で決まる 一般に、開口数の自乗に比例し、倍率の自乗に反比例する 対物40X NA0.75 NA1.0 落射蛍光顕微鏡の像の明るさは 落射蛍光顕微鏡の像の明るさは 開口数の４乗に比例、倍率の自乗に逆比例 開口数の４乗に比例、倍率の自乗に逆比例 50 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted Ptk2細胞 光学原理：像の明るさ NA0.75 対物40X NA0.50 マウス腎臓切片 同じ倍率でもNAが違うと明るさが違う 51 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ 対物レンズ 52 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ レンズの収差 幾何光学的光線収差 アッベの５収差と２つの色収差 計 ７収差 （波面収差） 対物レンズの種類 対物レンズの表示 収差による分類 観察法による分類 付属機構・・・補正環 絞り 油浸対物レンズと水浸対物レンズ 特徴と用途 53 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズの収差：球面収差 レンズの光軸に近い光線と光軸から離れた光線が、１点に集光しない ＜球面収差による像の悪化＞ ＜球面収差による像の悪化＞ ・補正環対物レンズの調整不足 ・補正環対物レンズの調整不足 ・液浸対物レンズの浸液間違い ・液浸対物レンズの浸液間違い ・カバーガラス厚条件の間違い ・カバーガラス厚条件の間違い 54 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 球面収差：液浸対物レンズの浸液間違い 油浸レンズをドライで使用 培養細胞：蛍光観察 55 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 球面収差：液浸対物レンズの浸液間違い 油浸レンズをドライで使用 染色組織切片：明視野観察 56 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ：色収差 軸上色収差 波長ごとに焦点位置が異なる現象 倍率色収差 波長ごとに倍率が異なる現象 屈折率が波長によって 屈折率が波長によって 異なることによる現象 異なることによる現象 屈折率 屈折率 大⇒屈折角 大⇒屈折角 大 大 白色光線 入射 ガラスプリズム nn紫紫＞n ＞n緑緑＞n ＞n赤赤 57 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ：色収差 色収差補正不足 コントラストの境界に 色にじみが出る 58 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 色収差：ガラス表・・・基準波長の屈折率とアッベ数 nd：λ587.56nmの屈折率 (nd − 1) ｱｯﾍﾞ数 υ d = (nF − nC ) 59 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted nF：λ486.13nmの屈折率 nC：λ656.27nmの屈折率 屈折率と分散 60 2010/4/16 nd 大 nd 小 No data copy / No data transfer permitted ndは同じ νd 小 νd 大 軸上色収差とその補正原理：光学ガラスの特性 凸レンズと凹レンズの組合わせで打ち消す 61 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 色収差の例 ｽｰﾊﾟｰｱﾎﾟｸﾛﾏｰﾄ 100× ｱﾎﾟｸﾛﾏｰﾄ100× 焦点面 （μm） 1.0 0.5 0 400 500 -0.5 62 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 600 700 波長(nm) 800 900 1000 焦点深度 対物レンズの表示 開口数 名称 ＵＰｌａｎＡｐｏ １００ｘ／１．３５ Ｏｉｌ Ｉｒｉｓ 倍率 ∞/０．１７ 浸液 オイル：Ｏｉｌ 水：Ｗ ｸﾞﾘｾﾘﾝ：Ｇｌｙ 多重：Ｉｍｍ、ＭＩ 絞り付 ｶﾊﾞｰｶﾞﾗｽ厚 鏡筒長：無限遠 ｶﾗｰﾘﾝｸﾞｺｰﾄﾞ（倍率） ｶﾗｰﾘﾝｸﾞｺｰﾄﾞ（浸液） 63 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 同焦点距離、作動距離（ＷＤ） 胴付き面 同焦点距離 （胴付き面～試料面） 45ｍｍ 試料面 64 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 作動距離 （先玉～試料面） 対物レンズの収差による分類 65 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズの観察法による分類 66 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 付属機構による分類 絞り付き スプリング付き 補正環付き 67 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 補正環付き対物レンズの像 補正不十分 （球面収差） 補正環付き： 補正環付き： 高NA乾燥系対物、培養用対物、 高NA乾燥系対物、培養用対物、 高NA水浸対物に付属 高NA水浸対物に付属 68 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物40x：蛍光 絞り付き対物レンズの像 適正に調整 対物100ｘ：蛍光 絞り付き：高NA対物に付属 絞り付き：高NA対物に付属 69 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ カバーガラス厚条件 対物レンズ先端（先玉）レンズと試料との間にあるものは、対物レンズの 一部と同じ⇒レンズの指定条件から外れると球面収差が発生 対物ﾚﾝｽﾞ先端部 カバーガラス用対物 表示：「0.17」「－」 70 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 空気または浸液 ノーカバー用対物 表示「0」「－」 対物レンズ：油浸レンズと水浸レンズ 油浸対物レンズ 対物先端とカバーガラスの間を、指定のイマージョンオイルで満たす ⇒カバーガラス直下の標本にピントを合せた時、最高の分解能・コントラ ストで観察できる 水浸対物レンズ 浸液が水である ⇒カバーガラス・タイプとノーカバータイプの2種類ある カバー対物 71 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ノーカバー対物 対物レンズ：油浸レンズと水浸レンズ 油浸対物 カバーガラス直下が最も カバーガラス直下が最も よく見える よく見える 油浸オイル 生細胞 と 培養液 水浸対物 水 30～40μm以上 対物かぶつかる範囲ま 対物かぶつかる範囲ま で良好な像が見える で良好な像が見える 72 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ：油浸レンズと水浸レンズ 油浸対物 球面収差が発生 球面収差が発生 水浸対物 球面収差なし 球面収差なし 73 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 観察法の種類・特徴 74 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 各種観察法 各種観察法 75 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 各種観察法 ３つの特徴 蛍光顕微鏡 ：蛍光色素、蛍光たんぱく質の蛍光で試料を観察する ⇒蛍光の発光を利用 位相差顕微鏡 ：無染色（透明）試料の形態を、濃淡のコントラスト（位相差コントラスト） で観察する ⇒直進光と±１次回折光の干渉を利用 微分干渉顕微鏡 ：無染色（透明）試料の形態を、立体的なコントラストで観察する ⇒偏光２光束シアリング干渉を利用 76 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 各種観察法の特徴 位相差観察 微分干渉観察 明視野観察 蛍光観察 77 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 倒立顕顕微鏡の構成 透過用 ハロゲンランプハウス コンデンサ 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 対物レンズ 蛍光フィルタ 蛍光用投光管 78 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕微鏡 蛍光顕微鏡 79 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 項目 蛍光顕微鏡の特徴 蛍光顕微鏡の構成 蛍光観察の原理 励起法の種類 蛍光フィルタ 蛍光用対物レンズ 光源 80 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕微鏡の特徴 ・高感度で検出力が高い 特異性が高い検出が可能 検出対象が分解能以下の大きさでも検出可能～たんぱく質1個も可 ・発光、消光の時間分解能が高い ・定量的な分析にも応用できる・・・細胞内イオン濃度測定など 蛍光の明るさの変化、色（波長）の変化を検出できる ・複数の対象を同時に検出・可視化できる 多重染色で観察できる 81 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕顕微鏡の構成 透過用 ハロゲンランプハウス 蛍光フィルタ コンデンサ 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 蛍光用対物レンズ 蛍光フィルタ 蛍光用投光管 82 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕微鏡の構成 高輝度光源 蛍光フィルタ 蛍光用対物レンズ 83 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光観察の原理：蛍光とは 発蛍光には、光の吸収が必要： absorption ⇒ emission 励起光照射後すぐに発光し、照射を止めるとすぐに消光する 10−6 蛍光は励起光より波長が長い 非常に微弱な光（励起光の強度の 約 ） 褪色または消光する 紫外線によって生ずる自家蛍光に対する注意が必要である １光子励起のモデル図 励起状態 励起光 基底状態 84 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光 蛍光色素の特性の例 λEX：495nm λEM：519nm Fluorescence Emission Absorption （Excitation） Alexa Fluor 488 85 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光観察の原理：フィルタ暗視野法 光源 励起フィルタ 励起光 励起フィルタ： 照明光から励起光の波長のみ 透過 蛍光 吸収フィルタ： 蛍光の波長のみ透過 励起光は反射 励起波長と蛍光波長の違いを利用 励起波長と蛍光波長の違いを利用 86 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 吸収フィルタ 蛍光顕微鏡の原理：フィルタ暗視野法 87 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 励起法の種類 ・励起光の波長帯域（色）によって大まかに呼び分ける 呼び名 励起波長帯 Ｕ励起 紫外線 Ｖ励起 紫色 ＢＶ励起 青紫色 励起法は蛍光フィルタ Ｂ励起 青色 励起法は蛍光フィルタ （励起フィルタ、吸収フィルタ） （励起フィルタ、吸収フィルタ） Ｇ励起 緑色 で組合せで決まる で組合せで決まる Y励起 黄色 ・励起波長帯の幅で３つの呼び名がある 呼び名 狭帯域：Narrow band 広帯域：Wide band 超広帯域：Super wide band 88 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 記号 W N SW 励起波長帯と観察波長帯の例 WＵ NU Ｖ WＢＶ NBV SWB WＢ NB WIB NIB SWG WＧ NG WＩＧ WIY NUA WIBA NIBA ４００ 89 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ５００ ６００ ｎｍ 蛍光フィルタの働き 対物、標本側 光源側 ダイクロイックミラー ：励起光を反射、蛍光を透過 励起光が僅かに漏洩 吸収フィルタ ：蛍光を透過、励起光を反射 励起フィルタ ：励起光のみ透過 90 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 観察側 蛍光フィルタの波長特性図例：広帯域Ｕ励起 励起ﾌｨﾙﾀ「BP-330-385」の特性 ﾀﾞｲｸﾛｲｯｸﾐﾗｰ「DM400」の特性 透過率 吸収ﾌｨﾙﾀ「BA420」の特性 蛍光色素、蛍光たんぱく質の 蛍光色素、蛍光たんぱく質の 光学特性との適合性チェック 光学特性との適合性チェック に利用する。 に利用する。 波長 91 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 注）ﾌｨﾙﾀの呼称はﾒｰｶｰにより異なる 励起法の例 １ 励起波長：３７２nm 蛍光波長：４５６nm 細胞の核をDAPIで染めてU励起観察 ４００ ５００ U励起ﾌｨﾙﾀを使用 92 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ６００ ｎｍ 励起法の例 ２ 励起波長：４９５nm 蛍光波長：５１９nm 細胞の微小管をAlexa488で染めてB励起観察 ４００ ５００ B励起ﾌｨﾙﾀを使用 93 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ６００ ｎｍ 励起法の例 ３ 励起波長：５５０nm 蛍光波長：５８０nm 細胞のｱｸﾁﾝをﾛﾀﾞﾐﾝで染めてG励起観察 （Rhodamine Phalloidin） ４００ ５００ G励起ﾌｨﾙﾀを使用 94 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ６００ ｎｍ 励起法の例 ４ Alexa488 PI 励起:495nm 蛍光:519nm 励起:530nm 蛍光:615nm 細胞の核をPIで、微小管をAlexa488で染めてB励起観察 ４００ ５００ B励起ﾌｨﾙﾀを使用 95 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ６００ ｎｍ 蛍光用対物レンズ ・色収差はセミアポクロマート、アポクロ マート級以上 ・・・色が画像の重要な要素 ・高開口数 ･･･明るい像の条件 ・・・油浸対物レンズと水浸対物レンズ の使い分け ・広い波長帯で透過率が高い ・・・適用する励起波長、蛍光波長の波 長帯が広い ・（レンズ自体の）自家蛍光が少ない ･･･よいコントラストの条件 96 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光用対物レンズに望ましい分光透過率特性 97 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕微鏡用光源 一般的に水銀ランプ、 一部キセノンランプ、 ハロゲンランプ 98 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差顕微鏡 位相差顕微鏡 99 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 項目 位相差顕微鏡の特徴 位相差顕微鏡の構成 位相差観察の原理 ポジティブ（ダーク）コントラストと ネガティブ（ブライト）コントラスト 100 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差顕微鏡の特徴 無染色標本の観察 ・・・細胞の観察 厚い試料の観察には向かない ・・・数μｍ以上になるとハローが強くなる 薄い試料の形態観察で検出感度が高い ハロー 位相差像 101 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 上皮細胞 微分干渉像 位相差顕顕微鏡の構成 透過用 ハロゲンランプハウス 位相差コンデンサ ユニバーサルコンデンサ 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 位相差対物レンズ 蛍光フィルタ 蛍光用投光管 102 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差顕顕微鏡の構成 ユニバーサルコンデンサ リングスリット切換え用 ターレット 103 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差観察の原理 原理図 照明側 リングスリット ﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｺﾝﾃﾞﾝｻ 位相差ｺﾝﾃﾞﾝｻ 試料面 位相板 観察側 104 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差対物ﾚﾝｽﾞ 位相差観察の原理 照明光がﾘﾝｸﾞｽﾘｯﾄに入射する ﾘﾝｸﾞｽﾘｯﾄ ﾘﾝｸﾞ状の２次光源から照明 光が標本を照明する 位相差 ｺﾝﾃﾞﾝｻ 試料 位相差 対物ﾚﾝｽﾞ 位相板 細胞 細胞を通過する際に、±1次回 折 光 と 直 進 光 と に 分か れ る。 ±1次回折光は直進光より位相 が1/4波長遅れる。 直進光はﾌｪｰｽﾞﾌﾟﾚｰﾄで位相が 変わり、±1次回折光と1/2波 長の位相ずれとなる。 3本の光線が、中間像位置で 干渉し、像に明暗のｺﾝﾄﾗｽﾄが つく 中間像位置 105 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差観察の原理 ポジティブ（ダーク）コントラスト 直進光と回折光の位相差が１/２波長 （逆位相）の場合、像の輝度は低くなり、 明るい視野に試料のコントラストが黒く見 える ⇒主に形態観察用 ネガティブ（ブライトコントラスト） 直進光と回折光の位相差が同位相の 場合、像の輝度は高くなり、暗い視野に 試料のコントラストが明るく見える ⇒主に試料の計数用 気中アスベスト （グリーンフィルタ使用） 106 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 参考：コントラストの呼び名と特性 ポジティブ 形態観察向き ネガティブ 計数向き ＰＬＬ ＤＬＬ ＰＬ ＤＬ ＰＭ ＤＭ ＮＬＬ ＢＬＬ ＮＬ ＢＬ ＮＭ ＢＭ ＰＨ・・・オリンパス ＤＨ・・・ニコン ＮＨ・・・オリンパス ＢＨ・・・ニコン ハロー 弱い 強い コントラスト 弱い 強い 厚い（太い）試料向き 107 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 薄い（細い）試料向き 微分干渉顕微鏡 微分干渉顕微鏡 108 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 項目 微分干渉顕微鏡の特徴 微分干渉顕微鏡の構成 微分干渉観察の原理 シアリング量と分解能、コントラスト（立体感） コントラストの方向性 109 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉顕微鏡の特徴 無染色標本の観察 ・・・細胞～プランクトン 位相差でハローの強い厚い試料も観察で きる 位相勾配の検出感度が高い 試料自体に光学的異方性があると本来 のコントラストで観察できない 上皮細胞 110 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 線虫 培養細胞 微分干渉顕顕微鏡の構成 透過用 ハロゲンランプハウス ポラライザ ユニバーサルコンデンサ 微分干渉プリズム素子 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 微分干渉対物レンズ 微分干渉プリズム 蛍光用投光管 111 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted アナライザ 微分干渉顕顕微鏡の構成 ユニバーサルコンデンサ 微分干渉プリズム素子 切換え用ターレット 112 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ポラライザ 微分干渉顕顕微鏡の構成 微分干渉プリズム スライダ 113 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察の原理 原理図 照明側 ポラライザ ユニバーサルコンデンサ 微分干渉ﾌﾟﾘｽﾞ素子 試料面 微分干渉用 対物ﾚﾝｽﾞ 微分干渉ﾌﾟﾘｽﾞﾑ 観察側 114 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ｱﾅﾗｲｻﾞ 微分干渉スライダ 微分干渉観察の原理 ﾎﾟﾗﾗｲｻﾞ 直線偏光にする ﾕﾆﾊﾞｰｻ ｺﾝﾃﾞﾝｻ 微分干渉ﾌﾟﾘｽﾞﾑ 素子 振動方向が直交する2本 の直線偏光に分ける 細胞 細胞を通過する際に、2 本 の 光線に位相差が生 ずる 試料 微分干渉用 対物ﾚﾝｽﾞ シア量 位相差のある光線を1本にあ わせる（楕円偏光になる） 微分干渉 ｽﾗｲﾀﾞ 対物側微分干渉 ﾌﾟﾘｽﾞﾑ ｱﾅﾗｲｻﾞ 中間像位置 115 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差に応じた干渉効果 により、像に明暗や色の ｺﾝﾄﾗｽﾄが付く 微分干渉観察の原理 シア量： 大きい ⇒ コントラスト大、分解能 低 小さい ⇒ コントラスト小、分解能 高 位相勾配が小さい（薄い）試料 ⇒ シア量 大が適する：高コントラストプリズム 位相勾配が大きい（厚い）試料 ⇒ シア量 小が適する：高分解能プリズム 116 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察の原理：シア量とコントラスト 標準シア量 シア量 小 厚い試料：線虫 117 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察の原理：シア量とコントラスト 標準シア量 シア量 大 薄い試料：培養細胞 118 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察の原理：コントラストには方向性がある ２光束が ずれた方向 コントラストが低い ボルボックス 119 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted コントラストが高い
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