光学顕微鏡概論 京都大学大学院生命科学研究科 生命科学特論E 2010年4月27日 オリンパス株式会社 ライフサイエンス国内営業部教育研修グループ 田中隆明 目次 光学顕微鏡とは 基本機能・構造 種類 光学顕微鏡の原理 レンズによる結像 顕微鏡の能力 対物レンズ レンズの収差 対物レンズの種類 油浸対物レンズと水浸対物レンズ 各種観察法 蛍光法 位相差法 微分干渉法 参考文献「ビデオ顕微鏡 参考文献「ビデオ顕微鏡 共立出版」 共立出版」 2 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学顕微鏡とは 光学顕微鏡とは 3 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 顕微鏡の基本機能 1.倍率 見やすい大きさで見える 2.分解能 見たい部分が十分に精細に見える 3.コントラスト 見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 4 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 倍率 見やすい大きさで見える 肉眼観察 実体顕微鏡観察 千円札 5 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 分解能 見たい部分が十分に精細に見える 珪藻標本 開口絞り(コンデンサ絞り)による分解能の違い 6 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 分解能 見たい部分が十分に精細に見える 細部が見えている 7 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 細部がつぶれている コントラスト 見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 微分干渉観察 8 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差観察 コントラスト 見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 染色体検査:蛍光観察 9 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted コントラスト 見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 角閃石系アスベスト(アモサイト):鋭敏色観察 10 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 顕微鏡の基本構造 1.試料の拡大像を結像させる構造 結像位置、結像倍率を所定の値にする 視野絞り⇒試料面⇒中間像(1次像)⇒網膜(ヒトの眼) が共役関係 2.試料の像にコントラストをつける構造 瞳の結像関係を使いて光変調を行い、像に明暗や色のコントラストを つける 光源⇒開口絞り(コンデンサ瞳)⇒対物瞳⇒アイポイント が共役関係 共役関係とは 共役関係とは レンズを介して物体と像との レンズを介して物体と像との 関係になっていること 関係になっていること 11 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 顕微鏡の基本構造 アイポイント <眼の瞳位置> 12 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 顕微鏡の種類 用途による分類・・・観察対象 生物顕微鏡、金属顕微鏡、実体顕微鏡、測定顕微鏡 (レーザー顕微鏡、電子顕微鏡・・・) 形による分類・・・標本に合わせた形 正立型顕微鏡、倒立型顕微鏡 観察法による分類・・・観察・検出する方法 明視野、暗視野、位相差、微分干渉、 (偏光、蛍光、レリーフコントラスト、 分散染色) 13 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 用途による分類 生物顕微鏡 プレパラート標本や培養容器中の試料観察 標本を光が透過する 14 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 用途による分類 金属顕微鏡 半導体検査用顕微鏡 金属や半導体、ICなど不透明な試料観察 標本で光が反射する 15 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 用途による分類 実体顕微鏡 試料を立体的に観察 16 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 用途による分類 実体顕微鏡 左右別の光軸があり、 内向きの角度がつけ てあるので立体視で きる ガリレオタイプ 17 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted グリノータイプ 用途による分類 測定顕微鏡 座標表示 xyz 測長機構 試料をXY座標上で計測する 18 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 形による分類 生物用 19 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 正立型顕微鏡 金属用 形による分類 生物用 20 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 倒立型顕微鏡 金属用 明視野観察:染色した組織切片 100x 40x 20x 10x 4x 2x 1.25x 21 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 暗視野観察:サルモネラ菌 22 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 暗視野観察:無染色の藻類 アオミドロ 23 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差観察:無染色の肺組織(中皮腫) アスベスト小体 24 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察:無染色の培養細胞 NG108細胞 25 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 偏光観察:臨床検査(アミロイド検査) コンゴーレッド染色 腎臓血管 26 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 簡易偏光観察 偏光観察:臨床検査(痛風検査) 関節液中の尿酸ナトリウム:鋭敏色観察 27 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光観察:3重染色培養細胞 核、微小管、アクチン繊維 28 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted レリーフコントラスト観察:ART(生殖補助医療) ICSI(Intracytoplasmic sperm injection) 卵細胞質内精子注入法 29 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 分散染色観察:アスベスト分析 建材成分中のクリソタイル(蛇紋岩系) 浸液1.55の分散色 30 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学顕微鏡の原理 光学顕微鏡の原理 31 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:眼の識別能力 250mm:明視距離 眼による結像 網膜への投影 32 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 眼の2点識別能力 視細胞の大きさに依存する 光学原理:レンズによる結像 実像の結像 虚像の結像 (網膜上には実像) 33 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:レンズによる結像 網膜上の実像 中間像(1次像) 試料 34 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 虚像 参考:無限遠補正光学系とは 平行光束部分 35 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:顕微鏡の能力 分解能 標本上で分解して見える2点間の最小寸法 対物レンズの開口数と波長で決まる 倍率 対物レンズの倍率、接眼レンズの倍率、撮影レンズの倍率がある コントラスト 開口絞りの開度で決まる、観察法で決まる 焦点深度 開口数、倍率、眼の分解能で決まる 像の明るさ 開口数と倍率で決まる 36 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:開口数numerical aperture 乾燥系対物レンズ 乾燥系対物レンズの開口数 NA=sinα 実用最大:0.95 油浸系対物レンズ 液浸系対物レンズの開口数 NA=nsinβ 実用最大:1.49 n:浸液の屈折率 オイル:1.516 水 :1.33 37 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:分解能resolving power 分解能δ=0.61λ/NA 分解能δ=0.61λ/NA 開口数と波長にのみ依存する 開口数と波長にのみ依存する 38 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:回折像 直径 エアリーの円盤(disk) 全光量の84% 直径=1.22λ/NA 1光点の回折像 39 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 回折像の強度分布曲線 光学原理:2光点の回折像 2光点を2光点像と識別 できる 2光点像と完全に識別 できる 40 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 「ビデオ顕微鏡:共立出版」 光学原理:Rayleighの分解能 この間隔に対応す る物体側の距離 レーレー(Rayleigh)の分解能 レーレー(Rayleigh)の分解能 δ=0.61λ/NA δ=0.61λ/NA <条件) 2光点の強度が等しい 2光点の光線がインコヒー レントである くびれ 41 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted くびれを考慮すると、 0,61⇒0.5としてよい 参考:CCDの画素サイズと分解能 CCD面 対物レンズ+撮影レンズによる CCD上への結像倍率:M δ ⊿ ⊿=Mxδ 42 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 参考:CCDの画素サイズと分解能 光軸 ⊿ CCD面 1画素を⊿と同じとすると2点分 解できない場合がある 43 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 1画素は⊿の1/2以下が 必要 光学原理:有効倍率 500NA<ME<1000NA ME:有効な倍率(対物倍率×接眼倍率) NA:対物開口数 開口数と倍率の関係 開口数と倍率の関係 1000NA以上の倍率をばか倍率、 1000NA以上の倍率をばか倍率、 または無効倍率と呼ぶ または無効倍率と呼ぶ 44 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:横倍率と縦倍率 縦倍率は、横倍率の2乗 ⇒空気中かつ横倍率が1以外のとき、物体と像とは相似にならない n’ n X Z’ Z X’ 拡大光学系 X' X Z ' n' 縦倍率α = = β2 Z n 横倍率β= 球の像は長楕円体 球の像は長楕円体 一般に「倍率」とは横倍率を言う 一般に「倍率」とは横倍率を言う 45 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:横倍率と縦倍率 縦倍率は、横倍率の2乗 ⇒横倍率が1以外のとき、物体と像とは相似にならない n n’ X Z’ Z X’ 縮小光学系 X' X Z ' n' 縦倍率α = = β2 Z n 横倍率β= 46 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 球の像は長楕円体 球の像は長楕円体 光学原理:コントラスト・・・照明の条件による違い a 開口絞り全開 b 開口絞り80% c 開口絞り最小 aは分解能は良いが、コントラストが悪い aは分解能は良いが、コントラストが悪い bは分解能とコントラストのバランスがよい bは分解能とコントラストのバランスがよい cはコントラスとは良いが分解能が悪い cはコントラスとは良いが分解能が悪い 注) %は対物開口数に対する照明開口数の割合 47 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:焦点深度 焦点深度 開口数、倍率、眼の分解能で決まる 開口数、倍率の反比例する ・開口数が大・・・焦点深度 小 ・高倍率ほど・・・焦点深度 小 48 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:焦点深度 NA0.30 対物20X NA0.50 アカガシ切片 同じ倍率でもNAが違うと焦点深度は違う 49 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学原理:像の明るさ 像の明るさ・・・開口数と倍率で決まる 一般に、開口数の自乗に比例し、倍率の自乗に反比例する 対物40X NA0.75 NA1.0 落射蛍光顕微鏡の像の明るさは 落射蛍光顕微鏡の像の明るさは 開口数の4乗に比例、倍率の自乗に逆比例 開口数の4乗に比例、倍率の自乗に逆比例 50 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted Ptk2細胞 光学原理:像の明るさ NA0.75 対物40X NA0.50 マウス腎臓切片 同じ倍率でもNAが違うと明るさが違う 51 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ 対物レンズ 52 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ レンズの収差 幾何光学的光線収差 アッベの5収差と2つの色収差 計 7収差 (波面収差) 対物レンズの種類 対物レンズの表示 収差による分類 観察法による分類 付属機構・・・補正環 絞り 油浸対物レンズと水浸対物レンズ 特徴と用途 53 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズの収差:球面収差 レンズの光軸に近い光線と光軸から離れた光線が、1点に集光しない <球面収差による像の悪化> <球面収差による像の悪化> ・補正環対物レンズの調整不足 ・補正環対物レンズの調整不足 ・液浸対物レンズの浸液間違い ・液浸対物レンズの浸液間違い ・カバーガラス厚条件の間違い ・カバーガラス厚条件の間違い 54 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 球面収差:液浸対物レンズの浸液間違い 油浸レンズをドライで使用 培養細胞:蛍光観察 55 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 球面収差:液浸対物レンズの浸液間違い 油浸レンズをドライで使用 染色組織切片:明視野観察 56 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ:色収差 軸上色収差 波長ごとに焦点位置が異なる現象 倍率色収差 波長ごとに倍率が異なる現象 屈折率が波長によって 屈折率が波長によって 異なることによる現象 異なることによる現象 屈折率 屈折率 大⇒屈折角 大⇒屈折角 大 大 白色光線 入射 ガラスプリズム nn紫紫>n >n緑緑>n >n赤赤 57 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ:色収差 色収差補正不足 コントラストの境界に 色にじみが出る 58 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 色収差:ガラス表・・・基準波長の屈折率とアッベ数 nd:λ587.56nmの屈折率 (nd − 1) アッベ数 υ d = (nF − nC ) 59 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted nF:λ486.13nmの屈折率 nC:λ656.27nmの屈折率 屈折率と分散 60 2010/4/16 nd 大 nd 小 No data copy / No data transfer permitted ndは同じ νd 小 νd 大 軸上色収差とその補正原理:光学ガラスの特性 凸レンズと凹レンズの組合わせで打ち消す 61 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 色収差の例 スーパーアポクロマート 100× アポクロマート100× 焦点面 (μm) 1.0 0.5 0 400 500 -0.5 62 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 600 700 波長(nm) 800 900 1000 焦点深度 対物レンズの表示 開口数 名称 UPlanApo 100x/1.35 Oil Iris 倍率 ∞/0.17 浸液 オイル:Oil 水:W グリセリン:Gly 多重:Imm、MI 絞り付 カバーガラス厚 鏡筒長:無限遠 カラーリングコード(倍率) カラーリングコード(浸液) 63 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 同焦点距離、作動距離(WD) 胴付き面 同焦点距離 (胴付き面~試料面) 45mm 試料面 64 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 作動距離 (先玉~試料面) 対物レンズの収差による分類 65 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズの観察法による分類 66 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 付属機構による分類 絞り付き スプリング付き 補正環付き 67 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 補正環付き対物レンズの像 補正不十分 (球面収差) 補正環付き: 補正環付き: 高NA乾燥系対物、培養用対物、 高NA乾燥系対物、培養用対物、 高NA水浸対物に付属 高NA水浸対物に付属 68 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物40x:蛍光 絞り付き対物レンズの像 適正に調整 対物100x:蛍光 絞り付き:高NA対物に付属 絞り付き:高NA対物に付属 69 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ カバーガラス厚条件 対物レンズ先端(先玉)レンズと試料との間にあるものは、対物レンズの 一部と同じ⇒レンズの指定条件から外れると球面収差が発生 対物レンズ先端部 カバーガラス用対物 表示:「0.17」「-」 70 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 空気または浸液 ノーカバー用対物 表示「0」「-」 対物レンズ:油浸レンズと水浸レンズ 油浸対物レンズ 対物先端とカバーガラスの間を、指定のイマージョンオイルで満たす ⇒カバーガラス直下の標本にピントを合せた時、最高の分解能・コントラ ストで観察できる 水浸対物レンズ 浸液が水である ⇒カバーガラス・タイプとノーカバータイプの2種類ある カバー対物 71 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ノーカバー対物 対物レンズ:油浸レンズと水浸レンズ 油浸対物 カバーガラス直下が最も カバーガラス直下が最も よく見える よく見える 油浸オイル 生細胞 と 培養液 水浸対物 水 30~40μm以上 対物かぶつかる範囲ま 対物かぶつかる範囲ま で良好な像が見える で良好な像が見える 72 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ:油浸レンズと水浸レンズ 油浸対物 球面収差が発生 球面収差が発生 水浸対物 球面収差なし 球面収差なし 73 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 観察法の種類・特徴 74 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 各種観察法 各種観察法 75 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 各種観察法 3つの特徴 蛍光顕微鏡 :蛍光色素、蛍光たんぱく質の蛍光で試料を観察する ⇒蛍光の発光を利用 位相差顕微鏡 :無染色(透明)試料の形態を、濃淡のコントラスト(位相差コントラスト) で観察する ⇒直進光と±1次回折光の干渉を利用 微分干渉顕微鏡 :無染色(透明)試料の形態を、立体的なコントラストで観察する ⇒偏光2光束シアリング干渉を利用 76 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 各種観察法の特徴 位相差観察 微分干渉観察 明視野観察 蛍光観察 77 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 倒立顕顕微鏡の構成 透過用 ハロゲンランプハウス コンデンサ 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 対物レンズ 蛍光フィルタ 蛍光用投光管 78 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕微鏡 蛍光顕微鏡 79 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 項目 蛍光顕微鏡の特徴 蛍光顕微鏡の構成 蛍光観察の原理 励起法の種類 蛍光フィルタ 蛍光用対物レンズ 光源 80 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕微鏡の特徴 ・高感度で検出力が高い 特異性が高い検出が可能 検出対象が分解能以下の大きさでも検出可能~たんぱく質1個も可 ・発光、消光の時間分解能が高い ・定量的な分析にも応用できる・・・細胞内イオン濃度測定など 蛍光の明るさの変化、色(波長)の変化を検出できる ・複数の対象を同時に検出・可視化できる 多重染色で観察できる 81 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕顕微鏡の構成 透過用 ハロゲンランプハウス 蛍光フィルタ コンデンサ 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 蛍光用対物レンズ 蛍光フィルタ 蛍光用投光管 82 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕微鏡の構成 高輝度光源 蛍光フィルタ 蛍光用対物レンズ 83 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光観察の原理:蛍光とは 発蛍光には、光の吸収が必要: absorption ⇒ emission 励起光照射後すぐに発光し、照射を止めるとすぐに消光する 10−6 蛍光は励起光より波長が長い 非常に微弱な光(励起光の強度の 約 ) 褪色または消光する 紫外線によって生ずる自家蛍光に対する注意が必要である 1光子励起のモデル図 励起状態 励起光 基底状態 84 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光 蛍光色素の特性の例 λEX:495nm λEM:519nm Fluorescence Emission Absorption (Excitation) Alexa Fluor 488 85 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光観察の原理:フィルタ暗視野法 光源 励起フィルタ 励起光 励起フィルタ: 照明光から励起光の波長のみ 透過 蛍光 吸収フィルタ: 蛍光の波長のみ透過 励起光は反射 励起波長と蛍光波長の違いを利用 励起波長と蛍光波長の違いを利用 86 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 吸収フィルタ 蛍光顕微鏡の原理:フィルタ暗視野法 87 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 励起法の種類 ・励起光の波長帯域(色)によって大まかに呼び分ける 呼び名 励起波長帯 U励起 紫外線 V励起 紫色 BV励起 青紫色 励起法は蛍光フィルタ B励起 青色 励起法は蛍光フィルタ (励起フィルタ、吸収フィルタ) (励起フィルタ、吸収フィルタ) G励起 緑色 で組合せで決まる で組合せで決まる Y励起 黄色 ・励起波長帯の幅で3つの呼び名がある 呼び名 狭帯域:Narrow band 広帯域:Wide band 超広帯域:Super wide band 88 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 記号 W N SW 励起波長帯と観察波長帯の例 WU NU V WBV NBV SWB WB NB WIB NIB SWG WG NG WIG WIY NUA WIBA NIBA 400 89 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 500 600 nm 蛍光フィルタの働き 対物、標本側 光源側 ダイクロイックミラー :励起光を反射、蛍光を透過 励起光が僅かに漏洩 吸収フィルタ :蛍光を透過、励起光を反射 励起フィルタ :励起光のみ透過 90 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 観察側 蛍光フィルタの波長特性図例:広帯域U励起 励起フィルタ「BP-330-385」の特性 ダイクロイックミラー「DM400」の特性 透過率 吸収フィルタ「BA420」の特性 蛍光色素、蛍光たんぱく質の 蛍光色素、蛍光たんぱく質の 光学特性との適合性チェック 光学特性との適合性チェック に利用する。 に利用する。 波長 91 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 注)フィルタの呼称はメーカーにより異なる 励起法の例 1 励起波長:372nm 蛍光波長:456nm 細胞の核をDAPIで染めてU励起観察 400 500 U励起フィルタを使用 92 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 600 nm 励起法の例 2 励起波長:495nm 蛍光波長:519nm 細胞の微小管をAlexa488で染めてB励起観察 400 500 B励起フィルタを使用 93 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 600 nm 励起法の例 3 励起波長:550nm 蛍光波長:580nm 細胞のアクチンをロダミンで染めてG励起観察 (Rhodamine Phalloidin) 400 500 G励起フィルタを使用 94 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 600 nm 励起法の例 4 Alexa488 PI 励起:495nm 蛍光:519nm 励起:530nm 蛍光:615nm 細胞の核をPIで、微小管をAlexa488で染めてB励起観察 400 500 B励起フィルタを使用 95 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 600 nm 蛍光用対物レンズ ・色収差はセミアポクロマート、アポクロ マート級以上 ・・・色が画像の重要な要素 ・高開口数 ・・・明るい像の条件 ・・・油浸対物レンズと水浸対物レンズ の使い分け ・広い波長帯で透過率が高い ・・・適用する励起波長、蛍光波長の波 長帯が広い ・(レンズ自体の)自家蛍光が少ない ・・・よいコントラストの条件 96 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光用対物レンズに望ましい分光透過率特性 97 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕微鏡用光源 一般的に水銀ランプ、 一部キセノンランプ、 ハロゲンランプ 98 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差顕微鏡 位相差顕微鏡 99 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 項目 位相差顕微鏡の特徴 位相差顕微鏡の構成 位相差観察の原理 ポジティブ(ダーク)コントラストと ネガティブ(ブライト)コントラスト 100 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差顕微鏡の特徴 無染色標本の観察 ・・・細胞の観察 厚い試料の観察には向かない ・・・数μm以上になるとハローが強くなる 薄い試料の形態観察で検出感度が高い ハロー 位相差像 101 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 上皮細胞 微分干渉像 位相差顕顕微鏡の構成 透過用 ハロゲンランプハウス 位相差コンデンサ ユニバーサルコンデンサ 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 位相差対物レンズ 蛍光フィルタ 蛍光用投光管 102 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差顕顕微鏡の構成 ユニバーサルコンデンサ リングスリット切換え用 ターレット 103 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差観察の原理 原理図 照明側 リングスリット ユニバーサルコンデンサ 位相差コンデンサ 試料面 位相板 観察側 104 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差対物レンズ 位相差観察の原理 照明光がリングスリットに入射する リングスリット リング状の2次光源から照明 光が標本を照明する 位相差 コンデンサ 試料 位相差 対物レンズ 位相板 細胞 細胞を通過する際に、±1次回 折 光 と 直 進 光 と に 分か れ る。 ±1次回折光は直進光より位相 が1/4波長遅れる。 直進光はフェーズプレートで位相が 変わり、±1次回折光と1/2波 長の位相ずれとなる。 3本の光線が、中間像位置で 干渉し、像に明暗のコントラストが つく 中間像位置 105 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差観察の原理 ポジティブ(ダーク)コントラスト 直進光と回折光の位相差が1/2波長 (逆位相)の場合、像の輝度は低くなり、 明るい視野に試料のコントラストが黒く見 える ⇒主に形態観察用 ネガティブ(ブライトコントラスト) 直進光と回折光の位相差が同位相の 場合、像の輝度は高くなり、暗い視野に 試料のコントラストが明るく見える ⇒主に試料の計数用 気中アスベスト (グリーンフィルタ使用) 106 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 参考:コントラストの呼び名と特性 ポジティブ 形態観察向き ネガティブ 計数向き PLL DLL PL DL PM DM NLL BLL NL BL NM BM PH・・・オリンパス DH・・・ニコン NH・・・オリンパス BH・・・ニコン ハロー 弱い 強い コントラスト 弱い 強い 厚い(太い)試料向き 107 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 薄い(細い)試料向き 微分干渉顕微鏡 微分干渉顕微鏡 108 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 項目 微分干渉顕微鏡の特徴 微分干渉顕微鏡の構成 微分干渉観察の原理 シアリング量と分解能、コントラスト(立体感) コントラストの方向性 109 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉顕微鏡の特徴 無染色標本の観察 ・・・細胞~プランクトン 位相差でハローの強い厚い試料も観察で きる 位相勾配の検出感度が高い 試料自体に光学的異方性があると本来 のコントラストで観察できない 上皮細胞 110 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 線虫 培養細胞 微分干渉顕顕微鏡の構成 透過用 ハロゲンランプハウス ポラライザ ユニバーサルコンデンサ 微分干渉プリズム素子 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 微分干渉対物レンズ 微分干渉プリズム 蛍光用投光管 111 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted アナライザ 微分干渉顕顕微鏡の構成 ユニバーサルコンデンサ 微分干渉プリズム素子 切換え用ターレット 112 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted ポラライザ 微分干渉顕顕微鏡の構成 微分干渉プリズム スライダ 113 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察の原理 原理図 照明側 ポラライザ ユニバーサルコンデンサ 微分干渉プリズ素子 試料面 微分干渉用 対物レンズ 微分干渉プリズム 観察側 114 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted アナライザ 微分干渉スライダ 微分干渉観察の原理 ポラライザ 直線偏光にする ユニバーサ コンデンサ 微分干渉プリズム 素子 振動方向が直交する2本 の直線偏光に分ける 細胞 細胞を通過する際に、2 本 の 光線に位相差が生 ずる 試料 微分干渉用 対物レンズ シア量 位相差のある光線を1本にあ わせる(楕円偏光になる) 微分干渉 スライダ 対物側微分干渉 プリズム アナライザ 中間像位置 115 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差に応じた干渉効果 により、像に明暗や色の コントラストが付く 微分干渉観察の原理 シア量: 大きい ⇒ コントラスト大、分解能 低 小さい ⇒ コントラスト小、分解能 高 位相勾配が小さい(薄い)試料 ⇒ シア量 大が適する:高コントラストプリズム 位相勾配が大きい(厚い)試料 ⇒ シア量 小が適する:高分解能プリズム 116 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察の原理:シア量とコントラスト 標準シア量 シア量 小 厚い試料:線虫 117 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察の原理:シア量とコントラスト 標準シア量 シア量 大 薄い試料:培養細胞 118 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉観察の原理:コントラストには方向性がある 2光束が ずれた方向 コントラストが低い ボルボックス 119 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted コントラストが高い
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