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田村隆明講師 プレゼン資料

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光学顕微鏡概論
京都大学大学院生命科学研究科
生命科学特論E
2010年4月27日
オリンパス株式会社
ライフサイエンス国内営業部教育研修グループ
田中隆明
目次
光学顕微鏡とは
基本機能・構造
種類
光学顕微鏡の原理
レンズによる結像
顕微鏡の能力
対物レンズ
レンズの収差
対物レンズの種類
油浸対物レンズと水浸対物レンズ
各種観察法
蛍光法
位相差法
微分干渉法
参考文献「ビデオ顕微鏡
参考文献「ビデオ顕微鏡 共立出版」
共立出版」
2
2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学顕微鏡とは
光学顕微鏡とは
3
2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
顕微鏡の基本機能
1.倍率
見やすい大きさで見える
2.分解能
見たい部分が十分に精細に見える
3.コントラスト
見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える
4
2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
倍率
見やすい大きさで見える
肉眼観察
実体顕微鏡観察
千円札
5
2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
分解能
見たい部分が十分に精細に見える
珪藻標本
開口絞り(コンデンサ絞り)による分解能の違い
6
2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
分解能
見たい部分が十分に精細に見える
細部が見えている
7
2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
細部がつぶれている
コントラスト
見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える
微分干渉観察
8
2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
位相差観察
コントラスト
見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える
染色体検査:蛍光観察
9
2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
コントラスト
見たいもの、見つけたいものが明暗や色ではっきり見える
角閃石系アスベスト(アモサイト):鋭敏色観察
10 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
顕微鏡の基本構造
1.試料の拡大像を結像させる構造
結像位置、結像倍率を所定の値にする
視野絞り⇒試料面⇒中間像(1次像)⇒網膜(ヒトの眼) が共役関係
2.試料の像にコントラストをつける構造
瞳の結像関係を使いて光変調を行い、像に明暗や色のコントラストを
つける
光源⇒開口絞り(コンデンサ瞳)⇒対物瞳⇒アイポイント が共役関係
共役関係とは
共役関係とは
レンズを介して物体と像との
レンズを介して物体と像との
関係になっていること
関係になっていること
11 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
顕微鏡の基本構造
アイポイント
<眼の瞳位置>
12 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
顕微鏡の種類
用途による分類・・・観察対象
生物顕微鏡、金属顕微鏡、実体顕微鏡、測定顕微鏡
(レーザー顕微鏡、電子顕微鏡・・・)
形による分類・・・標本に合わせた形
正立型顕微鏡、倒立型顕微鏡
観察法による分類・・・観察・検出する方法
明視野、暗視野、位相差、微分干渉、
(偏光、蛍光、レリーフコントラスト、 分散染色)
13 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
用途による分類
生物顕微鏡
プレパラート標本や培養容器中の試料観察
標本を光が透過する
14 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
用途による分類
金属顕微鏡
半導体検査用顕微鏡
金属や半導体、ICなど不透明な試料観察
標本で光が反射する
15 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
用途による分類
実体顕微鏡
試料を立体的に観察
16 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
用途による分類
実体顕微鏡
左右別の光軸があり、
内向きの角度がつけ
てあるので立体視で
きる
ガリレオタイプ
17 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
グリノータイプ
用途による分類
測定顕微鏡
座標表示
xyz
測長機構
試料をXY座標上で計測する
18 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
形による分類
生物用
19 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
正立型顕微鏡
金属用
形による分類
生物用
20 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
倒立型顕微鏡
金属用
明視野観察:染色した組織切片
100x
40x
20x
10x
4x
2x
1.25x
21 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
暗視野観察:サルモネラ菌
22 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
暗視野観察:無染色の藻類
アオミドロ
23 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
位相差観察:無染色の肺組織(中皮腫)
アスベスト小体
24 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
微分干渉観察:無染色の培養細胞
NG108細胞
25 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
偏光観察:臨床検査(アミロイド検査)
コンゴーレッド染色
腎臓血管
26 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
簡易偏光観察
偏光観察:臨床検査(痛風検査)
関節液中の尿酸ナトリウム:鋭敏色観察
27 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
蛍光観察:3重染色培養細胞
核、微小管、アクチン繊維
28 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
レリーフコントラスト観察:ART(生殖補助医療)
ICSI(Intracytoplasmic sperm injection)
卵細胞質内精子注入法
29 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
分散染色観察:アスベスト分析
建材成分中のクリソタイル(蛇紋岩系)
浸液1.55の分散色
30 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学顕微鏡の原理
光学顕微鏡の原理
31 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:眼の識別能力
250mm:明視距離
眼による結像
網膜への投影
32 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
眼の2点識別能力
視細胞の大きさに依存する
光学原理:レンズによる結像
実像の結像
虚像の結像
(網膜上には実像)
33 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:レンズによる結像
網膜上の実像
中間像(1次像)
試料
34 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
虚像
参考:無限遠補正光学系とは
平行光束部分
35 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:顕微鏡の能力
分解能
標本上で分解して見える2点間の最小寸法
対物レンズの開口数と波長で決まる
倍率
対物レンズの倍率、接眼レンズの倍率、撮影レンズの倍率がある
コントラスト
開口絞りの開度で決まる、観察法で決まる
焦点深度
開口数、倍率、眼の分解能で決まる
像の明るさ
開口数と倍率で決まる
36 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:開口数numerical aperture
乾燥系対物レンズ
乾燥系対物レンズの開口数
NA=sinα
実用最大:0.95
油浸系対物レンズ
液浸系対物レンズの開口数
NA=nsinβ
実用最大:1.49
n:浸液の屈折率
オイル:1.516
水
:1.33
37 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:分解能resolving power
分解能δ=0.61λ/NA
分解能δ=0.61λ/NA
開口数と波長にのみ依存する
開口数と波長にのみ依存する
38 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:回折像
直径
エアリーの円盤(disk)
全光量の84%
直径=1.22λ/NA
1光点の回折像
39 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
回折像の強度分布曲線
光学原理:2光点の回折像
2光点を2光点像と識別
できる
2光点像と完全に識別
できる
40 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
「ビデオ顕微鏡:共立出版」
光学原理:Rayleighの分解能
この間隔に対応す
る物体側の距離
レーレー(Rayleigh)の分解能
レーレー(Rayleigh)の分解能
δ=0.61λ/NA
δ=0.61λ/NA
<条件)
2光点の強度が等しい
2光点の光線がインコヒー
レントである
くびれ
41 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
くびれを考慮すると、
0,61⇒0.5としてよい
参考:CCDの画素サイズと分解能
CCD面
対物レンズ+撮影レンズによる
CCD上への結像倍率:M
δ
⊿
⊿=Mxδ
42 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
参考:CCDの画素サイズと分解能
光軸
⊿
CCD面
1画素を⊿と同じとすると2点分
解できない場合がある
43 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
1画素は⊿の1/2以下が
必要
光学原理:有効倍率
500NA<ME<1000NA
ME:有効な倍率(対物倍率×接眼倍率)
NA:対物開口数
開口数と倍率の関係
開口数と倍率の関係
1000NA以上の倍率をばか倍率、
1000NA以上の倍率をばか倍率、
または無効倍率と呼ぶ
または無効倍率と呼ぶ
44 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:横倍率と縦倍率
縦倍率は、横倍率の2乗
⇒空気中かつ横倍率が1以外のとき、物体と像とは相似にならない
n’
n
X
Z’
Z
X’
拡大光学系
X'
X
Z ' n'
縦倍率α = = β2
Z n
横倍率β=
球の像は長楕円体
球の像は長楕円体
一般に「倍率」とは横倍率を言う
一般に「倍率」とは横倍率を言う
45 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:横倍率と縦倍率
縦倍率は、横倍率の2乗
⇒横倍率が1以外のとき、物体と像とは相似にならない
n
n’
X
Z’
Z
X’
縮小光学系
X'
X
Z ' n'
縦倍率α = = β2
Z n
横倍率β=
46 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
球の像は長楕円体
球の像は長楕円体
光学原理:コントラスト・・・照明の条件による違い
a 開口絞り全開
b 開口絞り80%
c 開口絞り最小
aは分解能は良いが、コントラストが悪い
aは分解能は良いが、コントラストが悪い
bは分解能とコントラストのバランスがよい
bは分解能とコントラストのバランスがよい
cはコントラスとは良いが分解能が悪い
cはコントラスとは良いが分解能が悪い
注) %は対物開口数に対する照明開口数の割合
47 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:焦点深度
焦点深度
開口数、倍率、眼の分解能で決まる
開口数、倍率の反比例する
・開口数が大・・・焦点深度 小
・高倍率ほど・・・焦点深度 小
48 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:焦点深度
NA0.30
対物20X
NA0.50
アカガシ切片
同じ倍率でもNAが違うと焦点深度は違う
49 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
光学原理:像の明るさ
像の明るさ・・・開口数と倍率で決まる
一般に、開口数の自乗に比例し、倍率の自乗に反比例する
対物40X
NA0.75
NA1.0
落射蛍光顕微鏡の像の明るさは
落射蛍光顕微鏡の像の明るさは
開口数の4乗に比例、倍率の自乗に逆比例
開口数の4乗に比例、倍率の自乗に逆比例
50 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
Ptk2細胞
光学原理:像の明るさ
NA0.75
対物40X
NA0.50
マウス腎臓切片
同じ倍率でもNAが違うと明るさが違う
51 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
対物レンズ
対物レンズ
52 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
対物レンズ
レンズの収差
幾何光学的光線収差
アッベの5収差と2つの色収差 計 7収差
(波面収差)
対物レンズの種類
対物レンズの表示
収差による分類
観察法による分類
付属機構・・・補正環 絞り
油浸対物レンズと水浸対物レンズ
特徴と用途
53 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
対物レンズの収差:球面収差
レンズの光軸に近い光線と光軸から離れた光線が、1点に集光しない
<球面収差による像の悪化>
<球面収差による像の悪化>
・補正環対物レンズの調整不足
・補正環対物レンズの調整不足
・液浸対物レンズの浸液間違い
・液浸対物レンズの浸液間違い
・カバーガラス厚条件の間違い
・カバーガラス厚条件の間違い
54 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
球面収差:液浸対物レンズの浸液間違い
油浸レンズをドライで使用
培養細胞:蛍光観察
55 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
球面収差:液浸対物レンズの浸液間違い
油浸レンズをドライで使用
染色組織切片:明視野観察
56 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
対物レンズ:色収差
軸上色収差
波長ごとに焦点位置が異なる現象
倍率色収差
波長ごとに倍率が異なる現象
屈折率が波長によって
屈折率が波長によって
異なることによる現象
異なることによる現象
屈折率
屈折率 大⇒屈折角
大⇒屈折角 大
大
白色光線 入射
ガラスプリズム
nn紫紫>n
>n緑緑>n
>n赤赤
57 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
対物レンズ:色収差
色収差補正不足
コントラストの境界に
色にじみが出る
58 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
色収差:ガラス表・・・基準波長の屈折率とアッベ数
nd:λ587.56nmの屈折率
(nd − 1)
アッベ数 υ d =
(nF − nC )
59 2010/4/16
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nF:λ486.13nmの屈折率
nC:λ656.27nmの屈折率
屈折率と分散
60 2010/4/16
nd
大
nd
小
No data copy / No data transfer permitted
ndは同じ
νd
小
νd
大
軸上色収差とその補正原理:光学ガラスの特性
凸レンズと凹レンズの組合わせで打ち消す
61 2010/4/16
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色収差の例
スーパーアポクロマート
100×
アポクロマート100×
焦点面 (μm)
1.0
0.5
0 400
500
-0.5
62 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
600
700
波長(nm)
800
900
1000
焦点深度
対物レンズの表示
開口数
名称
UPlanApo
100x/1.35 Oil Iris
倍率
∞/0.17
浸液
オイル:Oil
水:W
グリセリン:Gly
多重:Imm、MI
絞り付
カバーガラス厚
鏡筒長:無限遠
カラーリングコード(倍率)
カラーリングコード(浸液)
63 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
同焦点距離、作動距離(WD)
胴付き面
同焦点距離
(胴付き面~試料面)
45mm
試料面
64 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
作動距離
(先玉~試料面)
対物レンズの収差による分類
65 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
対物レンズの観察法による分類
66 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
付属機構による分類
絞り付き
スプリング付き
補正環付き
67 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
補正環付き対物レンズの像
補正不十分
(球面収差)
補正環付き:
補正環付き:
高NA乾燥系対物、培養用対物、
高NA乾燥系対物、培養用対物、
高NA水浸対物に付属
高NA水浸対物に付属
68 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
対物40x:蛍光
絞り付き対物レンズの像
適正に調整
対物100x:蛍光
絞り付き:高NA対物に付属
絞り付き:高NA対物に付属
69 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
対物レンズ カバーガラス厚条件
対物レンズ先端(先玉)レンズと試料との間にあるものは、対物レンズの
一部と同じ⇒レンズの指定条件から外れると球面収差が発生
対物レンズ先端部
カバーガラス用対物
表示:「0.17」「-」
70 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
空気または浸液
ノーカバー用対物
表示「0」「-」
対物レンズ:油浸レンズと水浸レンズ
油浸対物レンズ
対物先端とカバーガラスの間を、指定のイマージョンオイルで満たす
⇒カバーガラス直下の標本にピントを合せた時、最高の分解能・コントラ
ストで観察できる
水浸対物レンズ
浸液が水である
⇒カバーガラス・タイプとノーカバータイプの2種類ある
カバー対物
71 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
ノーカバー対物
対物レンズ:油浸レンズと水浸レンズ
油浸対物
カバーガラス直下が最も
カバーガラス直下が最も
よく見える
よく見える
油浸オイル
生細胞
と
培養液
水浸対物
水
30~40μm以上
対物かぶつかる範囲ま
対物かぶつかる範囲ま
で良好な像が見える
で良好な像が見える
72 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
対物レンズ:油浸レンズと水浸レンズ
油浸対物
球面収差が発生
球面収差が発生
水浸対物
球面収差なし
球面収差なし
73 2010/4/16
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観察法の種類・特徴
74 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
各種観察法
各種観察法
75 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
各種観察法 3つの特徴
蛍光顕微鏡
:蛍光色素、蛍光たんぱく質の蛍光で試料を観察する
⇒蛍光の発光を利用
位相差顕微鏡
:無染色(透明)試料の形態を、濃淡のコントラスト(位相差コントラスト)
で観察する
⇒直進光と±1次回折光の干渉を利用
微分干渉顕微鏡
:無染色(透明)試料の形態を、立体的なコントラストで観察する
⇒偏光2光束シアリング干渉を利用
76 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
各種観察法の特徴
位相差観察
微分干渉観察
明視野観察
蛍光観察
77 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
倒立顕顕微鏡の構成
透過用
ハロゲンランプハウス
コンデンサ
蛍光用高輝度ランプハウス
接眼レンズ
対物レンズ
蛍光フィルタ
蛍光用投光管
78 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
蛍光顕微鏡
蛍光顕微鏡
79 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
項目
蛍光顕微鏡の特徴
蛍光顕微鏡の構成
蛍光観察の原理
励起法の種類
蛍光フィルタ
蛍光用対物レンズ
光源
80 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
蛍光顕微鏡の特徴
・高感度で検出力が高い
特異性が高い検出が可能
検出対象が分解能以下の大きさでも検出可能~たんぱく質1個も可
・発光、消光の時間分解能が高い
・定量的な分析にも応用できる・・・細胞内イオン濃度測定など
蛍光の明るさの変化、色(波長)の変化を検出できる
・複数の対象を同時に検出・可視化できる
多重染色で観察できる
81 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
蛍光顕顕微鏡の構成
透過用
ハロゲンランプハウス
蛍光フィルタ
コンデンサ
蛍光用高輝度ランプハウス
接眼レンズ
蛍光用対物レンズ
蛍光フィルタ
蛍光用投光管
82 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
蛍光顕微鏡の構成
高輝度光源
蛍光フィルタ
蛍光用対物レンズ
83 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
蛍光観察の原理:蛍光とは
発蛍光には、光の吸収が必要: absorption ⇒ emission
励起光照射後すぐに発光し、照射を止めるとすぐに消光する
10−6
蛍光は励起光より波長が長い
非常に微弱な光(励起光の強度の 約
)
褪色または消光する
紫外線によって生ずる自家蛍光に対する注意が必要である
1光子励起のモデル図
励起状態
励起光
基底状態
84 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
蛍光
蛍光色素の特性の例
λEX:495nm
λEM:519nm
Fluorescence
Emission
Absorption
(Excitation)
Alexa Fluor 488
85 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
蛍光観察の原理:フィルタ暗視野法
光源
励起フィルタ
励起光
励起フィルタ:
照明光から励起光の波長のみ
透過
蛍光
吸収フィルタ:
蛍光の波長のみ透過
励起光は反射
励起波長と蛍光波長の違いを利用
励起波長と蛍光波長の違いを利用
86 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
吸収フィルタ
蛍光顕微鏡の原理:フィルタ暗視野法
87 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
励起法の種類
・励起光の波長帯域(色)によって大まかに呼び分ける
呼び名
励起波長帯
U励起
紫外線
V励起
紫色
BV励起
青紫色
励起法は蛍光フィルタ
B励起
青色
励起法は蛍光フィルタ
(励起フィルタ、吸収フィルタ)
(励起フィルタ、吸収フィルタ)
G励起
緑色
で組合せで決まる
で組合せで決まる
Y励起
黄色
・励起波長帯の幅で3つの呼び名がある
呼び名
狭帯域:Narrow band
広帯域:Wide band
超広帯域:Super wide band
88 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
記号
W
N
SW
励起波長帯と観察波長帯の例
WU
NU
V
WBV
NBV
SWB
WB
NB
WIB
NIB
SWG
WG
NG
WIG
WIY
NUA
WIBA
NIBA
400
89 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
500
600
nm
蛍光フィルタの働き
対物、標本側
光源側
ダイクロイックミラー
:励起光を反射、蛍光を透過
励起光が僅かに漏洩
吸収フィルタ
:蛍光を透過、励起光を反射
励起フィルタ
:励起光のみ透過
90 2010/4/16
No data copy / No data transfer permitted
観察側
蛍光フィルタの波長特性図例:広帯域U励起
励起フィルタ「BP-330-385」の特性
ダイクロイックミラー「DM400」の特性
透過率
吸収フィルタ「BA420」の特性
蛍光色素、蛍光たんぱく質の
蛍光色素、蛍光たんぱく質の
光学特性との適合性チェック
光学特性との適合性チェック
に利用する。
に利用する。
波長
91 2010/4/16
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注)フィルタの呼称はメーカーにより異なる
励起法の例 1
励起波長:372nm 蛍光波長:456nm
細胞の核をDAPIで染めてU励起観察
400
500
U励起フィルタを使用
92 2010/4/16
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600
nm
励起法の例 2
励起波長:495nm 蛍光波長:519nm
細胞の微小管をAlexa488で染めてB励起観察
400
500
B励起フィルタを使用
93 2010/4/16
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600
nm
励起法の例 3
励起波長:550nm 蛍光波長:580nm
細胞のアクチンをロダミンで染めてG励起観察
(Rhodamine Phalloidin)
400
500
G励起フィルタを使用
94 2010/4/16
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600
nm
励起法の例 4
Alexa488
PI
励起:495nm
蛍光:519nm
励起:530nm
蛍光:615nm
細胞の核をPIで、微小管をAlexa488で染めてB励起観察
400
500
B励起フィルタを使用
95 2010/4/16
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600
nm
蛍光用対物レンズ
・色収差はセミアポクロマート、アポクロ
マート級以上
・・・色が画像の重要な要素
・高開口数
・・・明るい像の条件
・・・油浸対物レンズと水浸対物レンズ
の使い分け
・広い波長帯で透過率が高い
・・・適用する励起波長、蛍光波長の波
長帯が広い
・(レンズ自体の)自家蛍光が少ない
・・・よいコントラストの条件
96 2010/4/16
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蛍光用対物レンズに望ましい分光透過率特性
97 2010/4/16
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蛍光顕微鏡用光源
一般的に水銀ランプ、
一部キセノンランプ、
ハロゲンランプ
98 2010/4/16
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位相差顕微鏡
位相差顕微鏡
99 2010/4/16
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項目
位相差顕微鏡の特徴
位相差顕微鏡の構成
位相差観察の原理
ポジティブ(ダーク)コントラストと ネガティブ(ブライト)コントラスト
100 2010/4/16
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位相差顕微鏡の特徴
無染色標本の観察
・・・細胞の観察
厚い試料の観察には向かない
・・・数μm以上になるとハローが強くなる
薄い試料の形態観察で検出感度が高い
ハロー
位相差像
101 2010/4/16
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上皮細胞
微分干渉像
位相差顕顕微鏡の構成
透過用
ハロゲンランプハウス
位相差コンデンサ
ユニバーサルコンデンサ
蛍光用高輝度ランプハウス
接眼レンズ
位相差対物レンズ
蛍光フィルタ
蛍光用投光管
102 2010/4/16
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位相差顕顕微鏡の構成
ユニバーサルコンデンサ
リングスリット切換え用
ターレット
103 2010/4/16
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位相差観察の原理
原理図
照明側
リングスリット
ユニバーサルコンデンサ
位相差コンデンサ
試料面
位相板
観察側
104 2010/4/16
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位相差対物レンズ
位相差観察の原理
照明光がリングスリットに入射する
リングスリット
リング状の2次光源から照明
光が標本を照明する
位相差
コンデンサ
試料
位相差
対物レンズ
位相板
細胞
細胞を通過する際に、±1次回
折 光 と 直 進 光 と に 分か れ る。
±1次回折光は直進光より位相
が1/4波長遅れる。
直進光はフェーズプレートで位相が
変わり、±1次回折光と1/2波
長の位相ずれとなる。
3本の光線が、中間像位置で
干渉し、像に明暗のコントラストが
つく
中間像位置
105 2010/4/16
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位相差観察の原理
ポジティブ(ダーク)コントラスト
直進光と回折光の位相差が1/2波長
(逆位相)の場合、像の輝度は低くなり、
明るい視野に試料のコントラストが黒く見
える
⇒主に形態観察用
ネガティブ(ブライトコントラスト)
直進光と回折光の位相差が同位相の
場合、像の輝度は高くなり、暗い視野に
試料のコントラストが明るく見える
⇒主に試料の計数用
気中アスベスト
(グリーンフィルタ使用)
106 2010/4/16
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参考:コントラストの呼び名と特性
ポジティブ
形態観察向き
ネガティブ
計数向き
PLL
DLL
PL
DL
PM
DM
NLL
BLL
NL
BL
NM
BM
PH・・・オリンパス
DH・・・ニコン
NH・・・オリンパス
BH・・・ニコン
ハロー
弱い
強い
コントラスト
弱い
強い
厚い(太い)試料向き
107 2010/4/16
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薄い(細い)試料向き
微分干渉顕微鏡
微分干渉顕微鏡
108 2010/4/16
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項目
微分干渉顕微鏡の特徴
微分干渉顕微鏡の構成
微分干渉観察の原理
シアリング量と分解能、コントラスト(立体感)
コントラストの方向性
109 2010/4/16
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微分干渉顕微鏡の特徴
無染色標本の観察
・・・細胞~プランクトン
位相差でハローの強い厚い試料も観察で
きる
位相勾配の検出感度が高い
試料自体に光学的異方性があると本来
のコントラストで観察できない
上皮細胞
110 2010/4/16
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線虫
培養細胞
微分干渉顕顕微鏡の構成
透過用
ハロゲンランプハウス
ポラライザ
ユニバーサルコンデンサ
微分干渉プリズム素子
蛍光用高輝度ランプハウス
接眼レンズ
微分干渉対物レンズ
微分干渉プリズム
蛍光用投光管
111 2010/4/16
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アナライザ
微分干渉顕顕微鏡の構成
ユニバーサルコンデンサ
微分干渉プリズム素子
切換え用ターレット
112 2010/4/16
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ポラライザ
微分干渉顕顕微鏡の構成
微分干渉プリズム
スライダ
113 2010/4/16
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微分干渉観察の原理
原理図
照明側
ポラライザ
ユニバーサルコンデンサ
微分干渉プリズ素子
試料面
微分干渉用
対物レンズ
微分干渉プリズム
観察側
114 2010/4/16
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アナライザ
微分干渉スライダ
微分干渉観察の原理
ポラライザ
直線偏光にする
ユニバーサ
コンデンサ
微分干渉プリズム
素子
振動方向が直交する2本
の直線偏光に分ける
細胞
細胞を通過する際に、2
本 の 光線に位相差が生
ずる
試料
微分干渉用
対物レンズ
シア量
位相差のある光線を1本にあ
わせる(楕円偏光になる)
微分干渉
スライダ
対物側微分干渉
プリズム
アナライザ
中間像位置
115 2010/4/16
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位相差に応じた干渉効果
により、像に明暗や色の
コントラストが付く
微分干渉観察の原理
シア量: 大きい ⇒ コントラスト大、分解能 低
小さい ⇒ コントラスト小、分解能 高
位相勾配が小さい(薄い)試料 ⇒ シア量 大が適する:高コントラストプリズム
位相勾配が大きい(厚い)試料 ⇒ シア量 小が適する:高分解能プリズム
116 2010/4/16
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微分干渉観察の原理:シア量とコントラスト
標準シア量
シア量 小
厚い試料:線虫
117 2010/4/16
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微分干渉観察の原理:シア量とコントラスト
標準シア量
シア量 大
薄い試料:培養細胞
118 2010/4/16
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微分干渉観察の原理:コントラストには方向性がある
2光束が
ずれた方向
コントラストが低い
ボルボックス
119 2010/4/16
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コントラストが高い
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