セミナー室広がるオートファジーの世界-5 オートファジーによる細胞内侵入性細菌の認識機構前島郁子 *1, 3，吉森保 *1, 2, 3 *1 大阪大学大学院医学系研究科，*2 大阪大学大学院生命機能研究科，*3 科学技術振興機構 CREST 入性細菌の感染経路と，細菌感染におけるオートファはじめにジーの誘導メカニズムについて解説する．病原性細菌がマクロファージなどの貪食細胞によってファゴサイトーシスによって捕らえられ排除されることはよく知られているが，上皮細胞などの非貪食細胞にお細胞内侵入性細菌に対するオートファジーいても細胞内に侵入した細菌を排除する仕組みが備わっエンドサイトーシス／ファゴサイトーシス経路を介している．一つはエンドサイトーシス経路であり，上皮細て侵入してきた細胞内侵入性細菌は，オートファジーに胞にエンドサイトーシスを介して侵入しようとした細菌よる捕獲・分解，オートファジーの回避，もしくはオーは最終的にエンドソームによってリソソームへ運ばれてトファジーを利用して増殖する，の 3 つの運命のどれか分解されることになる．しかし，ある種の細胞内侵入性をたどることになる．オートファジーを回避する細菌と細菌はエンドソーム膜を破って細胞質中に脱出するなどしてはリステリア（細胞内での生き残りを図ろうとすることが知られてい菌（た．2004 年に細胞質中に逃れた溶血性 A 群連鎖球菌殖するものとしては歯周病菌（（Group A ）がオートファジーによって捕獲・分解されることが発見されたことにより，細胞にはエンドサイトーシス経路以外にも細胞内侵入性細菌に対（1）抗する術が備わっていることが明らかとなった．この（2, 3））や赤痢（4）），オートファジーを利用して増（5）），レジオネラ（），腸炎ビブリオ（）やペスト菌（）などが挙げられるが，ここでは主にオートファジーによって捕獲・分解されるものについて述べる．発見により，それまで主に栄養飢餓時の恒常性維持に重細胞内侵入性細菌のオートファジーによる分解経路要であると考えられてきたオートファジーに，生体防御は，1）細胞質内での捕獲・分解，2）エンドソームごと機能という新たな一面が付け加えられることになった．の捕獲・分解，3）ファゴソーム内で捕獲・分解，の 3 このような細胞内に侵入した病原体に対する選択的オーつのパターンに分類される．トファジーはゼノファジー（xenophagy）と命名され，細胞質内で捕獲・分解される細菌としては，上述の溶現在までにオートファジーは細菌，ウイルス，原虫など血性 A 群連鎖球菌に加え，黄色ブドウ球菌が存在する．を標的とし，それらを分解もしくは増殖抑制する能力を A 群連鎖球菌はヒトに急性咽頭炎などを引き起こすグラもつことが明らかになりつつある．本稿では，細胞内侵ム陰性球菌で，上皮細胞にエンドサイトーシス経路を介 680 化学と生物 Vol. 52, No. 10, 2014 サルモネラ産生タンパク質を注入する．エフェクター分子は，宿主タンパク質の機能を真似ることで細胞骨格を構成するアクチンを再構成させ，サルモネラ菌付着周囲の細胞膜の変形を促し，エンドサイトーシスによる菌の取り込みを促進する（8, 9）．サルモネラ菌を含むエンドソームは SCV（ -containing vacuole）と呼ばれ，通常のエンドソームと同様に成熟していくが，リソ図1 ■ ソームとの融合は回避するので菌は分解を逃れる．サル A 群連鎖球菌を隔離するオートファゴソーム（a）オートファゴソームマーカーである LC3 によって取り囲まれている A 群連鎖球菌．飢餓誘導で見られるオートファゴソーム（通常直径 1 μm）よりも巨大なオートファゴソームが形成される．スケールバー：2 μm．（b）細胞質中に脱出した A 群連鎖球菌の菌塊を隔離しているオートファゴソームの電子顕微鏡像．スケールバー：1 μm．モネラは SCV 内で増殖するが，一部の菌は感染初期にして取り込まれ，エンドソーム膜に結合して孔をあけるる（10）．一方，オートファジー能を欠損させたマウス線溶血毒素ストレプトリジン O（SLO）を分泌することに維芽細胞では細胞内でのサルモネラの過剰増殖が起こるより，エンドソーム膜を破壊し，細胞質中へと脱出すことから，オートファジーがサルモネラの増殖抑制に重る．オートファゴソーム形成に必須のオートファジー関要であることがわかる．サルモネラは SCV を抜け出し連遺伝子（autophagy-related gene）Atg5 を欠損した細て細胞質中に脱出することがあるため，連鎖球菌や黄色胞に A 群連鎖球菌を感染させたところ，正常細胞ではブドウ球菌のように，そのような菌がオートファジーの多数観察された巨大なオートファゴソームに包まれた菌標的になっていると考えられていた．しかし，光‒電子が全く観察されず，また細胞内での菌の増殖が抑制され相関顕微鏡法（CLEM）を用いた解析によって，オートなかったことから，細胞質中に脱出した A 群連鎖球菌ファゴソームマーカーである LC3 に包まれているサルはオートファジーによる分解を受けていることが示されモネラを電子顕微鏡で観察したところ，ほとんどのサルた（1）（図 1）．モネラは一重膜の SCV に包まれたままの状態で，二重 SCV を破って細胞質中へ抜け出し，そこで増殖することもある．マウス繊維芽細胞を用いた実験では，感染後 1 時間で細胞内に侵入したサルモネラの約 40% がオートファゴソームによって包み込まれることが報告されてい）は，ヒトの膜構造体であるオートファゴソームによって捕獲されて皮膚表面などに存在する常在菌で，通常は無害であるがいることが判明した（11）．さらに，オートファゴソーム化膿症や重篤化した場合には髄膜炎や敗血症を引き起この標的になるのは，損傷した膜のマーカーとなる Galec- すことが知られている．この黄色ブドウ球菌も A 群連 tin-3（後ほど説明）が集積した SCV のみであることが鎖球菌と同様に，細胞内で巨大なオートファゴソームに判明した．つまり，エンドソーム内に取り込まれたサル黄色ブドウ球菌（（6）包み込まれ，分解されることが報告されている．興味モネラは III 型分泌装置を突き刺すことでエンドソーム深いことに，A 群連鎖球菌や黄色ブドウ球菌を捕獲する膜を損傷させ，それが引き金となって（サルモネラの細ために形成されるオートファゴソームは飢餓時に誘導さ胞質中への脱出を待たずに）オートファジーを誘導してれるもの（通常直径約 1 μm）よりもはるかに巨大なもいると考えられる．のとなる．この A 群連鎖球菌の感染で誘導される巨大 3 つ目のグループであるファゴソームごと分解されるなオートファゴソームは，通常サイズのオートファゴ細菌としては，結核菌（ソーム同士が次々と融合することで形成され，その融合があげられる．結核菌はマクロファージなどのファゴのステップには飢餓誘導性のオートファゴソームの形成ソーム内に取り込まれた後，通常はファゴソームとリソには必要でない Rab7 が関与していることが示されていソームの融合を阻害することで分解を免れ，増殖する．（7））マクロファージが結核菌を取り込んだだけではオートる．次に損傷したエンドソームごと捕獲・分解される細菌としては，食中毒の原因菌であるサルモネラ（ serovar. Typhimurium）が挙げられる．サルモネラはグラム陰性桿菌の一種で，腸管粘膜上皮に付ファジーは誘導されないが，飢餓条件下に置かれた場合に，飢餓によって誘導されたオートファジーがファゴソームを包み込み，結核菌を分解することが報告されている（12）．着すると注射針のような III 型分泌装置を突き刺し，宿主細胞内に Sop, Sip などのエフェクター分子と呼ばれる化学と生物 Vol. 52, No. 10, 2014 681 モネラを包む SCV がユビキチン化されていることが明オートファジーによる細胞内細菌の認識機構らかとなった．また，ユビキチン活性化酵素である E1 飢餓によって誘導されるオートファジーが非選択的に酵素阻害剤によって，細胞内のユビキチン化反応を阻害細胞内成分を隔離・分解するのに対し，細菌感染で誘導したところ，Galectin-3 陽性のエンドソーム膜上へのユされるオートファジーは細胞内に侵入した菌のみを特異ビキチンとオートファゴソーム形成に必須の 6 つの Atg 的に標的として隔離する選択的なものである．では，こ複合体の局在化が抑制されたことから，ユビキチン化はの選択性はどのようにして獲得されているのだろうか？オートファジーのマシナリーを細菌へリクルートするたオートファジーが選択的に隔離する対象は細菌だけではめに重要な役割を果たしていると考えられる．トランスなく，ミトコンドリアやペルオキシソームといった細胞フェクション試薬によってエンドソーム膜が損傷するメ内小器官や凝集性タンパク質も標的に含まれる．これらカニズムは明らかにはなっていないが，サルモネラの場がオートファゴソームマーカーである LC3 に取り囲ま合は III 型分泌装置によってエンドソーム膜を損傷させれるときにはユビキチン化されていることから，ユビキるため，その膜がユビキチン化されることでオートファチンは選択的オートファジー全般における重要なタグのジーによる認識を受けていると考えられる．サルモネラ一つであるとみなされ，ユビキチン化された対象物にユだけでなく，A 群連鎖球菌や黄色ブドウ球菌のように細ビキチンと LC3 の両方に結合可能な p62, NBR1, NDP52 胞質中に脱出するような菌の場合，脱出した菌体自身がやオプティニューリンなどのアダプター分子が結合する認識されている可能性と菌周囲に付着した脱出したエンことで LC3 がリクルートされ，オートファゴソームがドソーム膜の残骸が認識されている可能性が考えられ（13〜17）る．また，宿主の膜成分を認識するという点から，エンしかし，ユビキチンが細胞内侵入性細菌に対するオートドサイトーシス経路を利用する菌だけでなく，ファゴサファジーにおいてどのような役割を果たしているのか，イトーシスを利用する菌でも同様のことが起こっているユビキチン化されている基質が何なのかは不明のままでのかもしれない．形成されるアダプターモデルが提唱されている．（18）あったが，これらの疑問に対して藤田らはサルモネでは，オートファジーはどのようにしてユビキチン化ラとラテックスビースの系を用いて一つの解答を示しされた基質を認識しているのだろうか？た．デルでは基質上のユビキチンに，p62 などのアダプターアダプターモ上述のようにサルモネラの一部は細胞質中に脱出する分子が結合すると LC3 のリクルートが起きると考えらため，むき出しになった菌表層タンパク質が直接ユビキれている．しかし，オートファジー能に必須であるチン化されるか，あるいはユビキチン化タンパク質が菌 Atg7 欠損細胞では LC3 の局在は起こらないにもかかわに付着することでオートファジーの標的になると考えららず，ほかの Atg タンパク質のリクルートと隔離膜の部れてきた．しかし，トランスフェクション試薬でコー分的な形成が観察された（11）．このことから，アダプティングし，エンドサイトーシスで取り込まれるようにターモデルだけでは基質の認識機構の説明は不十分であしたラテックスビースを細胞に取り込ませたところ，エることが示唆される．オートファジーに必須の 6 つの機能的ンドソーム膜に包まれたビース周囲にユビキチンと p62, Atg 複合体；1）Uncoordinated 51-like kinase 1（ULK1） LC3 が局在する様子が観察され，さらにこの LC3 陽性の複合体，2）ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ複エンドソーム膜は Galectin-3 陽性であることが明らかと合体，3）Atg9L，4）WIPI 複合体，5）Atg5-12-16L1 複なった（18）．Galectin-3 は細胞質中に存在するβ-ガラクト合体，そして，6）LC3 結合系の各因子を欠損させた細シド結合性のレクチンの一種で，エンドソーム膜が損傷胞を用いて，菌感染による損傷エンドソーム膜への Atg した場合にのみ膜内腔側に存在する糖鎖と結合するたの局在化の階層構造を網羅的に解析したところ，ULK1 め，膜損傷のマーカーとされている．ラテックスビーズ複合体，Atg9L，Atg5-12-16L 複合体はそれぞれ独立ににはタンパク質成分は存在しないため，ビーズ周囲で起ユビキチン化された損傷エンドソームに局在すること，きたユビキチン化は損傷したエンドソーム膜上で起きて Atg5 欠損細胞では損傷エンドソームへの LC3 の局在化いるものであることが示唆される．実際，ビーズを単離が有意に減少したことから，LC3 のリクルートは Atg5- すると周囲のエンドソーム膜上のトランスフェリンレセ 12-16L1 複合体に依存していることが明らかとなった．プターなどのタンパク質がユビキチン化されていることまた，リクルートのタイミングを見ると，LC3 より先にが確認されている．サルモネラを感染させた場合でも同すべての Atg タンパク質が局在化していた（18）．つまり，様の結果が得られたことから，菌体表面ではなく，サルエンドソーム膜が損傷によってユビキチン化されると， 682 化学と生物 Vol. 52, No. 10, 2014 細胞膜 WIPI1 菌 LC3 図 2 ■ オートファジーによる細胞内侵入性細菌の認識モデル Atg14L エンドサイトーシス／ファゴサイトーシス Atg16L ULK1 Atg9L1 ユビキチンエンドソーム膜の損傷（a）（b） LC3 p62 p62 Ub Ub p62 LC3 Ub p62 LC3 Ub p62 Ub p62 Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub （a）従来のアダプターモデル．エンドソーム／ファゴソーム膜から脱出した細菌がユビキチン化されると，そこに p62 などのアダプター分子が結合することで LC3 がリクルートされ，菌周囲にオートファゴソームが形成されると考えられてきた．しかし，最近の研究により，細菌によって損傷を受けたエンドソーム膜のユビキチン化が引き金となって，Atg16L 複合体，ULK1 複合体，Atg9L1 がそれぞれ独立にリクルートされることでオートファゴソーム形成が起こることが判明した（b）．アダプター分子による LC3 のリクルートよりも先に ULK1 複合体，Atg9L，Atg5-12-16L1 複合体のリクルートが起こっていることが示唆される（図 2）．これらの因子が基質にリクルートされるメカニズムだが，少なくとも Atg5-12-16L 複合体については，変異体を用いた実験の結果より，Atg16L1 が C 末端側の WD リピートドメインでユビキチンと，さらに N 末端側の coiled-coil ドメインで ULK1 複合体の構成因子である FIP200 とそれぞれ直接結合することによってユビキチン化された基質にリクルートされているものと思われる．損傷したリソソームに対するオートファジー図 3 ■ オートファゴソームによって隔離される損傷リソソーム尿酸を投与した正常マウスの腎臓（尿細管）細胞内では，一重膜のリソソームが二重膜のオートファゴソームによって隔離されている様子が多数観察された．矢頭：オートファゴソーム，アスタリスク：リソソーム，Mt：ミトコンドリア．スケールバー：1 μm．細菌感染／ビースのトランスフェクションによって損傷したエンドソーム膜だけでなく，リソソーム膜も損傷れている像が多数観察された（図 3）．腎尿細管特異的時にはオートファジーの標的となることが報告され，リに Atg5 を欠損させたマウスではリソソームのユビキチソファジー（lysophagy）と命名された（19, 20）．リソソーン化は見られたもののオートファゴソームによる隔離はムをシリカや薬剤，光刺激などを用いて実験的に損傷さ観察されず，腎組織の傷害が悪化したことから，オートせたところ，Galectin-3 で標識された損傷リソソームにファジーによる損傷リソソームの除去は高尿酸血症によユビキチン，p62，Atg タンパク質が集積し，リソソーる腎障害の病態悪化を抑制するのに重要であることが示ム膜周囲にオートファゴソームが形成されている様子がされている．電子顕微鏡レベルで観察された．正常な NIH3T3 細胞では Galectin-3 陽性の損傷リソソーム数が経時的に減少し 24 時間以内に消失したのに対し，オートファジー能欠今後の展望損細胞では損傷リソソームの減少はほとんど見られな宿主細胞は日々侵入を試みてくる多種多様な細菌からかったことから，損傷リソソームの隔離・排除にオートオートファジーを利用してその身を守っている．このファジーが重要な役割を果たしていることが示唆されオートファジーを介した宿主細胞対細菌の攻防の機構解た．また，野生型マウスにリソソーム膜を損傷する尿酸明は，2004 年に発見されて以来活発な研究の対象であ結晶の形成を引き起こす高尿酸血症を誘発させたとこり続けている．これまでの研究では，細胞質中に脱出しろ，腎臓の尿細管細胞においてリソソーム膜がユビキチた細菌がユビキチン化されているとする説が有力であっン化され，選択的にオートファゴソームによって隔離さたが，損傷されたエンドソーム膜ごとオートファジーの化学と生物 Vol. 52, No. 10, 2014 683 標的になっている証拠が示されつつある．この場合，オートファジーは菌の有無とは関係なく，ただ損傷したエンドソーム膜を処理しようとして発動し，結果的に菌の除去にも貢献しているだけなのかもしれない．さまざまな細菌がエンドソーム膜を損傷する機能をもっていること，そのような菌体表面の分子には共通性が乏しいこと，エンドソームだけでなくリソソーム膜も損傷時にはオートファジーの標的になることもこの説を支持するのではないだろうか．最新の研究によって，従来のアダプターモデルにかわるオートファジーの基質認識機構の一部も解明されてきており，その全容の解明が待たれる．生体内において，リソソーム膜の損傷は尿酸結晶だけでなくコレステロール結晶や 2 型糖尿病を引き起こすヒト IAPP，アミロイドタンパク質，活性酸素種などによっても起こることが知られている．このことから，リソファジーが糖尿病や動脈硬化などの生活習慣病や炎症性疾患の抑制に広範に機能している可能性が示唆されており，リソファジーの分子メカニズムおよびこれら疾患との関連について解析が進むことで新たな予防治療法の開発につながることが期待される．文献 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) 684 I. 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Isaka : , 32, 2336 (2013). プロフィル前島郁子（Ikuko MAEJIMA）＜略歴＞ 2007 年日本獣医生命科学大学獣医学部獣医学科卒業／獣医師免許取得後一年間動物病院に勤務した後，吉森研に博士課程の学生として弟子入りさせていただき一から鍛えてもらう．学位取得後，半年間ポスドクとして在籍の後，4 月からは群馬大生体調節研細胞構造分野（佐藤研）で新しいテーマに取り組む予定です＜研究テーマと抱負＞リソファジーの分子メカニズムと 2 型糖尿病などの生活習慣病との関連について研究中です＜趣味＞読書，映画鑑賞吉森保（Tamotsu YOSHIMORI）＜略歴＞大阪生まれだが東京都立竹早高校卒で，東京弁と大阪弁のバイリンガル． 1981 年大阪大学理学部生物学科卒業／同大学院医学研究科に進み，細胞工学センター初代センター長の岡田善雄先生に師事．関西医科大学の助手となり，その間にドイツハイデルベルクの EMBL に 2 年間留学．一貫してメンブレントラフィックの細胞生物学的研究に従事（2013 年のノーベル医学生理学賞はこの分野の大御所に）．オートファジー研究のパイオニアである大隅良典先生（現東工大）が，1996 年に基礎生物学研究所にて研究室を立ち上げられたときに助教授として招かれ，オートファジー研究を開始した．2002 年後国立遺伝学研究所教授として独立，大阪大学微生物病研究所教授を経て現在，同大学院医学系研究科教授と生命機能研究科教授を兼任．あちこちを転々としてきた流浪の人生．別名 Prof. A. Hill． Copyright © 2014 公益社団法人日本農芸化学会化学と生物 Vol. 52, No. 10, 2014