作成日時：2014年6月10日実験プロトコル題名文責「ペン型」電動ピペット：pipettyによる細胞コロニーのピックアップ小此木 1. 概要「ペン型」電動ピペット：pipettyはピペッティングや吸引-排出をペン持ちで行えるユニークな構造を持つ。これまでのマイクロピペットチップを用いた細胞コロニーピックアップにおいて、直径1mm以下の細胞コロニーをチップ先端で突いて引き剥がすことは、ピペットを握り持つため細やかな動きができず困難であった。今回、従来のピペットではできなかった細やかな動きを「ペン型」電動ピペット：pipettyを用いることで実現し、細胞のピックアップを簡便に行う方法を紹介する。 2. 背景性質が均一な細胞を回収する方法として細胞コロニーピックアップがある。この方法は細胞の形状の差異を位相差顕微鏡により識別し、その特徴的な形状をもつ細胞コロニーをマイクロピペットチップやスクレイパーなどを用いて培養皿より引きはがして回収する方法である。この方法は特殊な器材や試薬を必要としないことから研究者に広く用いられている。特にマイクロピペットチップを用いて細胞を引きはがす方法は、実験室が予てより所持する器材を利用するためその手軽さが利点である。マイクロピペットチップを用いた細胞コロニーピックアップは、そのチップをマイクロピペットに装着して行われる。そのため、マイクロピペットを握り持ちした状態で直径1mm以下の細胞コロニーをチップ先端で突いて引き剥がすのが困難であった。また、マイクロピペットをペン持ちして細胞コロニーを剥がした場合は、その後マイクロピペットを握り持ち直す必要があり、持ち直している間に剥がれた細胞コロニーを顕微鏡の視界から見失うことがあった。弊社が開発した「ペン型」電動ピペット：pipettyはピペッティングや吸引-排出をペン持ちで行えるユニークな構造を持つ。そのため、従来のマイクロピペットではできなかった「ペン持ちして細胞コロニーを剥がし」と「持ち替えずに引き剥がした細胞コロニーの吸引回収-播種」ができる。今回、その細胞コロニーのピックアップ方法を紹介する。 3. pipettyを用いるメリット・ペン持ちができるので細胞ピッキングがしやすい - 従来の握り持ちでは作業がしにくい培養液の持ち込みが定量的・ - 手動で細胞を吸引した場合、細胞と共に持ち込まれる培養液の量が実験ごとにまちまち 4. 細胞コロニーピックアップの対象・遺伝子を導入した動物細胞の安定発現株の樹立・ ES-iPS細胞など幹細胞の培養における形態による分化-未分化細胞の選抜・培養中に突然変異した細胞（多核化など）と正常細胞をふるい分け 5. 実験方法：細胞のピックアップ 1 2 3 4 5 細胞培養皿をCO２インキュベーターから取り出し顕微鏡ステージに設置する 20μ Ｌ容量pipettyにチップを装着し、顕微鏡を見ながらチップの先で細胞コロニーを細かく何度かつつくコロニーが遊離し始めたらチップの先をコロニーの近傍におき、pipettyの吸入吐出ボタンを押して吸い取る培養液を注いだ新しい培養皿を用意し、チップの先を培養液中につけ、pipettyのの吸入吐出ボタンを押して細胞コロニーを排出するピックアップを終了した培養皿と細胞コロニーを排出した培養皿をCO２インキュベーターに戻す図1. pipettyの外観図2. pipettyを用いた細胞コロニーのピックアップの様子 a) ペン型電動ピペット：pipettyを用いた細胞コロニーのピックアップの様子 b) チップ先端で培養皿上の細胞コロニーを引き剥がしている様子ｃ) 細胞を引き剥がされて浮遊している細胞コロニー ◎ 実験条件の詳細・細胞株：Hep2細胞（ヒト喉頭がん由来細胞）・培養器：3.5cmシャーレ・器　具：pipetty 20μ L容量(MSIC01-01-20) チップの外径0.6mm ・流　量：6.5μ L/sec (吸引量 20μ L分) 6. 試薬と実験機材 ○ 機材品名企業名型番備考 pipetty　20μ Ｌ容量 20 チップ培養倒立顕微鏡対物レンズ　(倍率：5x, 20x) アイカムス・ラボアイカムス・ラボニコン社ニコン社 MSIC01-01-20 MSIC03-01-20 ECLIPSE TS100 TU Plan Fluor ペン型電動ピペットチップの外径0.6mm 位相差型備考 ○ 試薬-消耗品品名企業名型番 DMEM High Glucose Fetal calf serum PBS Streptomycin sulfate salt penicillin G sodium salt hydrate セルカルチャーディッシュ　35mm Sigma Sigma 和光純薬工業 Sigma Sigma BD D5796 CR1211 0607P-A102X S6501-50G 13752-5G-F 353001 株式会社アイカムス・ラボ・東京営業所・盛岡本社〒130-0026　東京都墨田区両国1-8-4　両国坂本ビル　708号室〒020-0857　岩手県盛岡市北飯岡一丁目8番25号 TEL：019-601-8228 FAX：019-601-8227 ・ e-mailアドレス・ URL [email protected] http://www.icomes.co.jp/