リン酸基含有化合物分析に対する新規高耐圧ステンレスフリーカラムの

学会発表資料＿抜粋
リン酸基含有化合物分析に対する
新規高耐圧ステンレスフリーカラムの有用性について
○佐藤友紀1,3，山口忠行2，尾坂裕輔2，山本祝久1
(株式会社島津ジーエルシー1,株式会社島津製作所2,
独立行政法人国立循環器病研究センター薬剤部3)
はじめに
リン酸基含有化合物や⾦属キレート性のある化合物は，分析を⾏う際
にテーリング現象や吸着現象が起こる事が一般的に知られている。この
種の化合物は代謝物・薬物等に多く存在し，HPLCによる分析時には溶離
液に塩やキレート剤を添加する事で吸着現象を軽減できる。しかしなが
ら，これらの溶離液は質量分析計には使⽤できないものが多く，また，
HPLCシステム流路に残存しゴーストピークの原因となる事も懸念される。
これらの吸着現象は，カラムを含めたHPLCシステム流路全体の⾦属部
分が影響しており，根本的な改善が広く求められているところである。
そこで我々は，カラムボデーに着目し開発・検討を⾏った。PEEK製
のボデーはこれらの物質に対し不活性度が非常に⾼いが，耐圧性が低い。
そのため，ステンレススチールのカラムボデー内面を特殊コーティング
し，フリットは⾼耐圧性の樹脂素材を採⽤することで不活性と⾼耐圧の
両⽴を目指した。本報告ではリン酸基含有化合物を⽤い，新開発したボ
デーのカラムの評価を⾏ったのでここに報告する。
2
講演概要
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
分析例
3
講演概要
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
分析例
4
リン酸基含有化合物について
ヌクレオチド
ATP,ADP,AMP,GMP,UDP,CTPなど・・・
代謝物
医薬品（有効成分）
農薬
など・・・
5
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
Men+
Men+
Men+
Men+
Men+
Men+
Men+
Metal
6
例えば、下記のHPLC条件でヌクレオチド（ATP、AMP）
を分析してみると・・・
Instruments : Nexera
Column
: Typical C18 100mmL*2.1mmI.D., 3µm
Mobile Phase : 10 mM Ammonium Formate in Water
:ACN = 99:1_Isocratic flow
Flow Rate : 0.2 mL / min
Oven Temperature : 40 ℃
Detection : SPD-M20A at 256nm , Slit Width 1.2nm
Injection Vol.
: 1µL
ヌクレオチドの分析例
AMP
Adenosine triphosphate (ATP)
ATP
Adenosine monoiphosphate (AMP)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
min
ヌクレオチドの分析例
ATP
島津アプリケーションニュース No.L423より抜粋
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
配管素材の影響
－：Stainless steel配管(600mm)
－：PEEK配管(600mm)
Column
Instrument
Mobile Phase
Flow Rate
Column Temp.
Detection
Injection Vol.
:Typical C18 （100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm）
: Nexera
: Mobile Phase : 10 mM Ammonium Formate in
Water : MeCN=99:1
: 0.2 mL/min
: 40 ℃
: SPD-M20A at (254 nm)
: 1 µL
10
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
配管素材の影響
：600mmL
11
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
配管素材の影響
－：Stainless steel配管(600mm)
－：PEEK配管(600mm)
2
Peak
1
Peak
2
Stainless
steel
5.10
1.49
PEEK
4.67
1.48
2
■Peak
1. Adenosine Triphosphate
2. Adenosine Monophosphate
11
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
2.75 min
12
講演概要
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
分析例
13
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
Stainless steel Body
Polymer frit
Polymer lining
Stationary phase
MastroTM
Multi Stroma:多層
14
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
Mastro（マストロ）カラム耐圧
Mastro C18 100mmL×2.1mmI.D., 3µm
耐圧
：50MPa (7250psi)
Stainless steel Body
Polymer frit
Polymer lining
Stationary phase
15
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
MastroTM
16
講演概要
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
分析例
17
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
Column
: Mastro C18 100mmL*2.1mmI.D.,3µm
Instruments : Nexera
Mobile Phase : 10 mM Ammonium Formate in Water
:ACN = 99:1_Isocratic flow
Flow Rate
: 0.2 mL / min
Oven Temperature : 40 ℃
Detection
: SPD-M20A at 256nm , Slit Width 1.2nm
Injection Vol.
: 1µL
新規高耐圧ステンレスフリーカラムによる
ヌクレオチドの分析例
uV
30000
AMP
20000
ATP
10000
0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
min
ヌクレオチドの分析例（カラム⽐較）
Peak Asymmetry
uV
ATP
AMP
MastroTM C18
1.39
1.14
Typical C18
5.10
1.49
60000
50000
40000
AMP(Typical C18)
ATP (Mastro)
30000
AMP (Mastro)
20000
ATP(Typical C18)
10000
0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
min
副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
水溶性ヒドロコルチゾン製剤（有効成分）
Hydrocortisone Sodium Succinate
副腎皮質ホルモン製剤（有効成分）
Hydrocortisone Sodium Phosphate
副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
: MastroTM C18（100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm）
Typical C18 （100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm）
Instrument
: Nexera
Mobile Phase
: 0.1 % Formic Acid in Water : 0.1 % Formic Acid in
MeCN=50:50
Flow Rate
: 0.2 mL/min
Column Temp.
: 40 ℃
Detection
: SPD-M20A at (254 nm)
Injection Vol.
: 1µL
Column
副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
■Peak
1. Hydrocortisone Sodium Phosphate
2. Hydrocortisone Sodium Succinate
Typical C18カラム
2
1
0
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
min
副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
■Peak
1. Hydrocortisone Sodium Phosphate
2. Hydrocortisone Sodium Succinate
MastroTM C18カラム
C18カラム
1
2
0
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
min
副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
MastroTM C18カラム
■Peak
1. Hydrocortisone Sodium Phosphate
2. Hydrocortisone Sodium Succinate
1
2
0
1.0
1.5
2.0
2.5
Typical C18カラム
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
min
2
1
0
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
副腎皮質ホルモン製剤の分析
Column
Instrument
Mobile Phase
Flow Rate
Column Temp.
Detection
Injection Vol.
: MastroTM C18（100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm）
Typical C18 （100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm）
: Prominece UFLCXR + LCMS - 2020
: A：0.1 % Formic Acid in Water
B： 0.1 % Formic Acid in MeCN
0.01min ポンプ
B.Conc 10％
5.00
ポンプ
B.Conc 80
5.01
ポンプ
B.Conc 10
6.50
ポンプ
B.Conc 10
: 0.2 mL/min
: 40 ℃
: MS (SIM mode)
: 2µL
5.5
min
副腎皮質ホルモン製剤の分析 10ppm
(x100,000)
MastroTM C18カラム
C18カラム
1.4
S/N : 685
1.3
1.2
1.1
1.0
Typical C18カラム
C18カラム
0.9
S/N : 492
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
min
副腎皮質ホルモン製剤の分析 5ppm
(x10,000)
7.5
MastroTM C18カラム
C18カラム
S/N : 567
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
Typical C18カラム
C18カラム
S/N : 425
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
min
副腎皮質ホルモン製剤の分析 1ppm
(x10,000)
1.8
MastroTM C18カラム
C18カラム
1.7
S/N : 539
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
Typical C18カラム
C18カラム
0.8
S/N : 141
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
min
副腎皮質ホルモン製剤の分析 0.1ppm
(x1,000)
MastroTM C18カラム
C18カラム
S/N : 34
3.9
3.8
3.7
3.6
3.5
3.4
3.3
3.2
3.1
3.0
2.9
2.8
Typical C18カラム
C18カラム
S/N : 9.5
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
min
副腎皮質ホルモン製剤の分析 25ppb
(x1,000)
3.5
3.4
3.3
MastroTM C18カラム
C18カラム
S/N : 24
3.2
3.1
3.0
2.9
Typical C18カラム
C18カラム
S/N :2.8
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
min
まとめ
リン酸基含有化合物の分析において新規高耐圧ステンレスフリーLCカラム
“MastroTM”が有効である事が示唆された。
ギ酸、ギ酸アンモニウム等の揮発性の塩を用いリン酸基含有化合物を分析したと
ころ、⼀般的なステンレスボデーカラムに⽐べ良好なピーク形状となった事より
、LC/MS(/MS)分析において有効である事が示唆された。
終わりに
本資料は静岡県⽴⼤学薬学部生体機能分子分析学分野
共同研究により得られたデータを使用しております。
轟⽊堅⼀郎准教授との

Download Report