LC/MSおよびUV検出器を用いたフルーツジュース中に含まれる

LC /MS および UV 検出器を用いたフルーツジュース中に含まれる
ポリフェノール類の分析
Evelyn Goh1, Antonietta Gledhill 2
Waters Pacific, Singapore, 2Waters Corporation, Manchester, UK
1
アプリケーションの利点
■■
高速高分離分析によるフルーツジュース中に
目的
フルーツジュース中のポリフェノール類の検出、同定および定量
含まれるポリフェノール類の検出、同定および
定量
■■
ACQUITY UPLC® の導入により、従来の HPLC
法では 1 時間を越えていた分析時間を 10 分
ポリフェノール類は緑茶やワイン、果実など、食品や清涼飲料水に含まれる
以下に短縮することが可能。これにより、品
機能性成分として広く知られています。これらは心疾患や成人病を予防する上
質管理における 1 システムあたりのサンプル
で潜在的な役割を果たすことが報告されています 1,2,3 。
処理能力を向上
■■
はじめに
天然ポリフェノール化合物の分析では、従来の HPLC の分離能力では分離でき
定量、ピーク分離の検証や化合物同定を行う
ない多くの夾雑化合物による妨害を受けます 4。そのため長年にわたり、天然ポ
ための UV や MS スペクトル情報を有効活用
リフェノール化合物分析は、非常に困難な課題となっていました。逆相クロマ
トグラフィによるポリフェノール類の分離、同定を行う HPLC 条件では、 1 分析
あたり1 時間以上かかるものもあります 5。
近年、高分離能を有する ACQUITY UPLC システムが開発され、より高品質なポリ
フェノールの分析が可能になりました。これにより、ポリフェノール類の分析に
おける分離能の向上と、分析時間の短縮が同時に達成されました 3,6,7。製品を
より早く出荷するためには、品質管理部門におけるサンプル処理能力の向上が
極めて重要です。分析時間の短縮は、このサンプル処理能力の向上を可能に
しました。
ACQUITY UPLC H-Class システムは、HPLC としても使用することができ、且つ
UPLC® としての早さと性能を兼ね備えています。そのため、ACQUITY UPLC
ウォーターズのソリューション
ACQUITY UPLC H-Class システム
H-Class システムを導入することで、HPLC と UPLC を 1 システムで柔軟に切り替え
て業務を効率化することができます。ACQUITY UPLC H-Class UV MS システムは、
QC におけるジュースサンプル分析のための、頑健性の高いソリューションを提供
ACQUITY UPLC PDA 検出器
します。
ACQUITY SQD
このアプリケーションノートでは、ACQUITY UPLC H-Class システムによる、フルーツ
Empower ® ソフトウェア
ジュース中に含まれるポリフェノール化合物の検出と同定の高速分析条件を
紹介します。ACQUITY® SQD による質量分析計での選択性を付加することで、
対象化合物の定量にかかる分析時間を大幅に短縮できます。
キーワード
ポリフェノール類、フルーツジュース、品質管理、QC
1
実験方法
データ取り込みと処理条件
試料
ACQUITY UPLC H-Class システムによるポリフェノール分析の事例として、2 つの
サンプルとして市販の7 種のフルーツジュース
製品と、11 種のポリフェノール標準品を分析
しました。
条件を紹介します。条件 1 は分離を優先した条件で、サンプルのキャラクタリゼー
ションを目的としたフィンガープリンティングに適しています。条件 2 は、QC ラボ
で行われる日常的な対象ポリフェノール類の定量用に推奨の条件であり、分析室
の生産性向上を目的として分析時間をより短縮しています。
前処理
ジュースサンプルはそれぞれ孔径 0.45 μ m の
フィルターでろ過し、等量の水で希釈しました。
条件1
カラム：ACQUITY UPLC HSS T3 2.1×100 mm 1.8 μ m
カラム温度：45℃
LC 条件
流量：0.65 mL/min
LC システム：
移動相 A：
移動相 B：
サイクルタイム：15.0 min
ACQUITY UPLC H-Class
0.1% 酢酸水溶液
0.1% 酢酸 /
アセトニトリル溶液
MS 条件
MS システム： ACQUITY SQD
イオン化法： ESI
キャピラリー電圧： 3.0 kV
サンプルコーン電圧：30 V
エクストラクションコーン電圧： 3.0 V
ソース温度：
150℃
脱溶媒温度：
500℃
脱溶媒ガス：
1000 L/hr
コーンガス：
20 L/hr
スキャンレンジ：
50-650 m/z
PDA検出器条件
%A
%B
Initial
99
1
1.0
99
1
10.0
70
30
12.0
5
95
12.1
99
1
15.0
99
1
条件2
カラム：ACQUITY UPLC HSS T3 2.1×50 mm 1.8 μ m
カラム温度：45℃
流量：0.80 mL/min
サイクルタイム：7.0 min
UV レンジ：
（抽出波長：
210 nm-400 nm
280 nm,305 nm）
サンプリングレート：20 ポイント / 秒
フィルタータイムコンスタント：高速
データの取得および処理は全て Empower2 ソフト
ウェアで行いました。
Time (min)
Time (min)
%A
%B
Initial
99
1
0.5
99
1
4.0
70
30
5.5
5
95
5.6
99
1
7.0
99
1
今回、分析対象となる11 種類のポリフェノール化合物の選択イオンレコー
ディング（SIR）取得条件の開発は IntelliStartTM 機能により自動で行いました。
IntelliStart では化合物の基本情報を入力するだけで、Table1 に示すようなプレ
カーサーイオンの決定やコーン電圧の最適化を自動的に行うことができます。
LC/MSおよびUV検出器を用いたフルーツジュース中に含まれるポリフェノール類の分析
2
高い再現性で定量するために、デュエルタイムは各クロマトグラムピークにおいて、少なくとも 15 ポイント
以上を確保するように最適化されています。ジュースサンプル中のポリフェノール成分の定量は、各ポリフェ
ノール成分の検量線を用いて算出します。
Fig.1 に Empower ソフトウェアでセットアップした、いくつかの MS メソッドを示しました。
Fig.1. EmpowerソフトウェアによるMS 条件の設定
Compound
m/z
Polarity
Cone voltage (V)
Arbutin
271.2
–
30
Gallic acid
169.1
–
30
5-hydroxymethyl-2furaldehyde (HMF)
127.1
+
20
Chlorogenic acid
353.3
–
25
Catechin
289.3
–
40
Caffeic acid
179.1
–
30
Epicatechin
289.2
–
35
p-Coumaric acid
163.1
–
25
Ferulic acid
193.1
–
30
Phloridzin
435.5
–
40
t-Cinnamic acid
147.1
–
25
Table 1. MS分析パラメーター
LC/MSおよびUV検出器を用いたフルーツジュース中に含まれるポリフェノール類の分析
3
結果および考察
PDA および SQD を接続した ACQUITY UPLC H-Class システムによる分析で、11 種類のポリフェノール成分が
10 分間で分離しました。波長 280nm で抽出したクロマトグラムと、11 成分の SIR クロマトグラムの重ね書き
を Fig.2 に示しました。
5.702
4
9.444
10
4.737
1
4.0x106
11
7
2
6.0x106
9
8.532
8.0x106
1.281
1.394
Intensity
1.0x107
8
6
5
6.731
3
6.023
MS (SIR)
4.807
5.005
1.2x107
2.638
1.4x107
2.0x106
0.0
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
6
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
Phloridzin - 8.496
HMF - 2.676
7
5
11
10
9
7.00
8.00
t-Cinnamic Acid - 9.414
0.05
8
Ferulic Acid - 6.690
1
0.10
4
p-Coumaric Acid - 5.980
AU
0.15
3
Epicatechin - 5.654
PDA 2
(280nm)
Arbutin - 1.298
Gallic Acid - 1.402
0.20
Chlorogenic Acid - 4.687
Catechin - 4.758
Caffeic Acid - 4.960
Minutes
9.00
10.00
Minutes
Fig.2. シングル分析により同時取り込みした、10ppm 標準混合試料の PDA およびMS(SIR) のデータ
各ポリフェノール標準品のリテンションタイム（条件 1 及び条件 2）と、条件 1 で分析を行った際に MS 検出器で
検出された各ピークのリテンションタイムおよび面積値の 6 回繰り返し注入における相対標準偏差を Table2
に示しました。
Retention times (min)
Peak
Compound
1
2
% RSD for Method 1 (MS)
Method 1
Method 2
Retention time
Peak area
Arbutin
1.30
0.57
0.10
0.26
Gallic acid
1.40
0.64
0.06
0.20
3
5-hydroxymethyl-2-furaldehyde (HMF)
2.68
1.23
0.19
0.26
4
Chlorogenic acid
4.69
2.12
0.29
0.37
5
Catechin
4.76
2.13
0.29
0.37
6
Caffeic acid
4.96
2.22
0.27
0.34
7
Epicatechin
5.65
2.45
0.22
0.31
8
p-Coumaric acid
5.98
2.59
0.20
0.27
9
Ferulic acid
6.69
2.84
0.17
0.24
10
Phloridzin
8.50
3.39
0.13
0.18
11
t-Cinnamic acid
9.41
3.78
0.11
0.75
Table 2. リテンションタイムと再現性結果
LC/MSおよびUV検出器を用いたフルーツジュース中に含まれるポリフェノール類の分析
4
リンゴ、ミカン（ 2 種）、ベリー、グァバ、マンゴーおよびライムの 7 種の市販のジュースについて、ポリフェ
ノール含量を測定しました。
一例として、条件 1 を使用して分析したリンゴジュースの結果を Fig.3 に示しました。
3x10 6
Intensity
2x10 6
MS (SIR)
4
SIR (HMF)
SIR (Chlorogenic acid)
3
6
SIR (Catechin)
SIR (Caffeic acid)
1x10 6
7
0
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
Minutes
0.12
4
3
5 6
4.898
4.967
0.04
0.02
7
5.543
0.06
2.682
AU
0.08
4.694
PDA (280 nm)
0.10
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
Minutes
Fig.3. リンゴジュースにおけるポリフェノール分析のUVクロマトグラムとMS 重ね書きクロマトグラム
リンゴジュース中のポリフェノール類は、Fig3 の PDA クロマトグラムを Empower ソフトウェアにより解析する
ことで、簡単に同定、定量することができます。
LC/MSおよびUV検出器を用いたフルーツジュース中に含まれるポリフェノール類の分析
5
Empower ソフトウェアでは単に保持時間の一致を見るだけでなく、 PDA の UV スペクトルライブラリー機能
を使用することで、化合物同定においてより信頼性の高い解析が可能です。HMF（ピーク 3）の解析事例を
示します。 Fig.4 は HMF 標準品と、リンゴジュースから検出された HMF 標準品と同じリテンションタイムの
ピークのインデックスプロットを示しています。HMF とリンゴジュース中のピーク 3 の UV スペクトルの合致に
よりリンゴジュース中から検出された HMF の同定結果を検証することができます。
HMF Standard
Apple Juice
2.682 Extracted
0.030
2.643 Extracted
284.0
284.0
0.20
0.020
AU
AU
0.15
0.010
0.10
0.05
357.5 385.1
0.000
0.00
350.00Wavelength
300.00
nm
250.00
2.682
0.20
0.15
AU
AU
0.020
350.00 Wavelength
300.00
nm
0.030
2.642
250.00
0.10
0.010
0.05
0.000
0.00
2.60
2.65
2.70
2.75
2.80
Minutes
0.10
PDA (280 nm)
0.06
AU
2.50
0.04
6
3
4
0.02
0.00
1.00
2.00
2.55
3.00
2.60
2.65
2.70
Minutes
HMF - 2.682
0.08
2.85
Time
4.00
5
5.00
Epicatechin - 5.543
2.55
Chlorogenic Acid - 4.694
Catechin
-- 4.898
Catechin
4.898
Caffeic Acid
Acid
4.967
Caffeic
-- 4.967
2.50
2.75
2.80
2.85
Time
7
Apple
Juice
6.00
Minutes
Fig.4. スペクトラムインデックスプロットによる、リンゴジュースサンプル中から同定されたHMF の同定結果の確認
LC/MSおよびUV検出器を用いたフルーツジュース中に含まれるポリフェノール類の分析
6
さらに質量分析計による高選択性を活用することで、更なる情報を取得できます。これは品質管理者がデータ
を判断し、化合物を同定、定量するにあたり、より高い信頼性を与えます。Fig.5 から、MS で検出された HMF ピー
ク（ピーク 3）は、ジュース中のポリフェノール同定結果の信頼性も高めています。
Fig.5 中のリンゴジュースの結果にある囲いは UV と MS クロマトグラムの違いを示しました。
4
SIR (Chlorogenic acid)
SIR (Catechin)
Catechin (Peak 5)
identified in UV is
not detected in MS
MS
6
4.70
4.70
4
PDA
0.04
5
4.898
1x106
4
0.02
7
0.00
0
4.70
2.00
3.00
4.00
5.00
6
4.967
0.06
6
1.00
5.00
5.00
Minutes
3
2x106
4.80
4.80 Minutes 4.90
4.90
4.694
MS (SIR)
AU
Intensity
3x106
HMF
SIR (Caffeic acid)
6.00
4.80
4.90
5.00
Minutes
Minutes
0.06
AU
4
HMF - 2.682
0.08
6
3
0.04
0.02
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5
5.00
7
Epicatechin - 5.543
PDA (280 nm)
Chlorogenic Acid - 4.694
Catechin
-- 4.898
Catechin
4.898
Caffeic
Caffeic Acid
Acid -- 4.967
4.967
0.10
6.00
Minutes
Fig.5. ACQUITY SQD が、PDAと比較してより特異性を与えることの一例
UV において保持時間をもとに同定されたカテキン（ピーク 5）は MS では検出、定量されませんでした（赤枠部参
照）
。ＵＶ単独での同定は、ポリフェノール成分のアサインミスにより、フルーツジュース中において誤った結果
へと導く可能性があります。より高い選択性を持つ ACQUITY SQD を使用することで、PDA 単独データによる診断
よりも、より高い信頼性を得ることができます。
ACQUITY SQD はすでに Empower ソフトウェアで制御している ACQUITY UPLC H-Class を使用している QC ラボに
簡単に導入することができます。Empower ユーザーは追加トレーニングなしに MS の利点を得ることができます。
IntelliStart（Empower に構成する MS ソフトウェア）は SQD のセットアップとシステムモニタリングを容易にします。
さらに、IntelliStart は新しい化合物の SIR チャンネルのメソッド開発を自動化することができます。
LC/MSおよびUV検出器を用いたフルーツジュース中に含まれるポリフェノール類の分析
7
MS システムでは、分析対象物となる各化合物の SIR チャンネルをモニターすることができます。ACQUITY SQD
の SIR チャンネルをモニターすることで、高い選択性の検出が可能となり、各分析サンプル中から指定したポリ
フェノールの分子関連イオンをモニターすることで、その有無を容易に確認することができます。
質量分析計の高い選択性はターゲットとマトリックスの分離を可能とし、その結果、分析時間をより短縮
することができます。ターゲット化合物のみを定量するための分析時間は 10 分から 4 分（条件 2）に縮まり
Fig.6 に示すようにサンプル処理能力が大幅に向上しています。
MS により同定および定量されたジュースサンプル中のポリフェノール化合物を Table3 に示しました。
.
8x106
Berry juices
(4 min)
Intensity
6x106
4x106
2x106
0
1.00
2.00
1.2x107
5
AU
8.0x106
6.0x106
2.0x106
2
5.00
Minutes
6.00
7.00
8.00
9.00
9
6
10.00
Standard
(4 min)
11
7
1
4.00
8
3
1.0x107
4.0x106
3.00
Fig.6. MS 検出器の利用による
10
サンプル処理能力の向上に伴う
分析時間の短縮
4
0.0
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
Minutes
6.00
1.4x107
5
1.0x107
Intensity
8.00
9.00
9
6
11
8.0x106
7
6.0x106
10
2
4.0x106
1
2.0x106
10.00
Standard
(10 min)
8
3
1.2x107
7.00
4
0.0
1.00
Compound
2.00
Apple
3.00
4.00
Orange
(Brand 1)
Arbutin
Orange
(Brand 2)
0.31
5-hydroxymethyl-2furaldehyde (HMF)
2.12
23.75
2.29
Epicatechin
0.16
Phloridzin
t-Cinnamic acid
8.00
9.00
Guava
Mango
10.46
0.54
11.39
10.00
Lime
2.52
2.10
1.42
1.34
12.94
6.49
7.47
Caffeic acid
Ferulic acid
7.00
Berries
0.48
Catechin
p-Coumaric acid
6.00
13.71
Gallic acid
Chlorogenic acid
Minutes
5.00
1.) arbutin,
2.) gallic acid,
3.) HMF,
4.) chlorogenic acid,
5.) catechin,
6.) caffeic acid,
7.) epicatechin,
8.) p-coumaric acid,
9.) ferulic acid,
10.) phloridzin, and
11.) t-cinnamic acid.
0.47
0.50
0.35
8.35
0.19
Table 3. MS により同定、定量
されたフルーツジュースサンプル
中の化合物リスト、単位は ppm
またはmg/L
LC/MSおよびUV検出器を用いたフルーツジュース中に含まれるポリフェノール類の分析
8
結論
参考文献
今回のレポートでは、ACQUITY PDA と ACQUITY SQD を接続した
ACQUITY UPLC H-Class はフルーツジュースに含まれるポリフェ
ノール類の分離、検出、同定及び定量を可能にしました。
■■
Empower ソフトウェアと ACQUITY UPLC H-Class を使用することで、
HPLC の操作性はそのままに、高い分離性能と UPLC の処理能力
を得ることができます。
■■
Empower ソフトウェアによる ACQUITY PDA 検出器での測定では
保持時間の一致のみでなく、UV スペクトルライブラリーによる
一致を加えることで、より信頼性の高い化合物同定を行うこと
ができます。IntelliStart を装備した ACQUITY SQD を使用するこ
とで、ユーザーは容易に MS スペクトル情報を得ることができ
ます。この検出器は、分析室における定量、データ診断および
化合物確認をサポートします。
1. Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C, Jiménez L. Am J Clinical Nutrition.
79(5):727-747, 2004.
2. Seeram NP, Aviram M, Zhang Y, Henning SM et al. Comparison of Antioxidant
Potency of Commonly Consumed Polyphenol-Rich Beverages in the United
States. J Agric Food Chem. 56: 1415-1422, 2008.
3. Nagy K, Redeuil R, Bertholet R, Steiling H, Kussmann M. Anal Chem.
81: 6347-6356, 2009.
4. Wang X, Carr P W, Stoll, D R. LCGC North America. Vol 28 (11): Nov 2010.
5. Rodriguez R, Picinelli Lobo A, Suarez Valles B. J Agric Food Chem.
54: 120-124, 2006.
6. Cooper K A, Campos-Giménez E, Jiménez Alvarez D, Nagy K, Donovan J L,
Williamson G. J Agric Food Chem. 55: 2841-2847, 2006.
7. Gledhill, A. Increasing Throughput by Run Time Reduction Leads
to Greater Efficiency in Juice Laboratory. Waters application note
no. 720002960en, 2008.
総括して、PDA と MS 検出器を併用することで、ルーチン QC 分析
を行っている QC ラボに相補的な利益をもたらします。
日本ウォーターズ株式会社 www.waters.com
東京本社 ‫ޥ‬140-0001 東京都品川区北品川 1-3-12 第 5 小池ビル TEL 03-3471-7191 FAX 03-3471-7118
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