JP 2007-517492 A 2007.7.5
(57)【要約】
本発明は、高い親和性で対応するプロテアーゼと結合
できるプロテアーゼプロドメインの同定を対象とする。
本発明のプロテアーゼプロドメインは、第２のタンパク
質と融合して、プロテアーゼプロドメイン融合タンパク
質を形成する。融合タンパク質中のプロテアーゼプロド
メインタンパク質の存在によって、対応するプロテアー
ゼと共にインキュベーションすることにより、第２のタ
ンパク質の簡単かつ選択的な精製が可能になる。
(2)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質をコードする核酸構築物であって、
プロドメインタンパク質のコード配列に作動可能に連結された目的タンパク質のコード
配列を含み、該プロドメインタンパク質は、対応するプロテアーゼまたはその変異体に対
する親和性が増大されている目的タンパク質、核酸構築物。
【請求項２】
前記対応するプロテアーゼが、ズブチリシンまたはその変異体である、請求項１に記載
の核酸構築物。
【請求項３】
10
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンまたはその変異体に対する結合親和性を
増大させるアミノ酸配列をさらに含む、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記プロドメインタンパク質が、Ｐ４についてはアミノ酸残基ＦまたはＹ、Ｐ３につい
ては任意のアミノ酸残基、Ｐ２についてはＡまたはＳ、Ｐ１についてはＭ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、
またはＬの置き換えを含む、Ｐ１∼Ｐ４アミノ酸配列に対する置換配列を含む、請求項１
に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンのプロドメインである、請求項２に記載
の核酸構築物。
20
【請求項６】
前記プロドメインタンパク質が、Ｃ末端の末端で、Ｐ４についてはアミノ酸残基Ｆまた
はＹ、Ｐ３については任意のアミノ酸残基、Ｐ２についてはＡまたはＳ、Ｐ１については
Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、またはＬの置き換えを含む、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
プロドメインタンパク質に作動可能に連結された標的タンパク質を含む融合タンパク質
であって、該プロドメインタンパク質はズブチリシンまたはその変異体に対して増大され
た親和性を示すように修飾されている、融合タンパク質。
【請求項８】
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンプロドメインタンパク質である、請求項
30
７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ズブチリシンプロドメインタンパク質が、Ｐ１からＰ４アミノ酸を置き換えるＦＫ
ＡＭのアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記プロドメインタンパク質が、同種の配列として使用されるアミノ酸残基Ｅ Ｅ Ｄ
Ｋ Ｌ （Ｆ／Ｙ） Ｑ Ｓ （Ｍ／Ｌ／Ｙ）のバリエーションを含む、請求項７に記
載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記標的タンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡBドメイン；プロテインＡB変異体Ａ２
40
１９；連鎖球菌プロテインＧBドメイン；連鎖球菌プロテインＧaドメイン；プロテインＧ
B
変異体Ｇ３１１；大腸菌仮想Ｙａｂ；ウシトランスデューシンのａ−サブユニット；好
熱性メタン生成古細菌（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＣＤＣ６；ストレ
プトアビジン；アビジン；Ｔａｑポリメラーゼ；アルカリホスファターゼ；ＲＮアーゼ；
ＤＮアーゼ；制限酵素；ペルオキシダーゼ；エンド−１，４−βグルカナーゼ；エンド−
１，３−β−グルカナーゼ；キチナーゼ；βおよびαグルコシダーゼ；βおよびαグルコ
ロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）；アミラーゼ；グルコシル−トランスフェラ
ーゼ；ホスホ−トランスフェラーゼ；クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラ
ーゼ；β−ラクタマーゼ；ルシフェラーゼ；エステラーゼ；リパーゼ；プロテアーゼ；バ
クテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｅ）；抗生物質；酵素阻害剤；成長因子；ホルモ
50
(3)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
ン；受容体；膜タンパク質；核タンパク質；転写因子；翻訳因子；または核酸修飾酵素で
ある、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ズブチリシン結合融合タンパク質の生産方法であって、
ズブチリシンまたはその変異体と高い親和性で結合するように修飾されたプロドメイン
タンパク質と、目的とする第２のタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする核酸構
築物を供給する工程；
前記核酸構築物を用いて宿主細胞を形質転換する工程；および
融合タンパク質の発現のための適切な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工
程を含む方法。
10
【請求項１４】
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンのプロドメインである、請求項１３に記
載の方法。
【請求項１５】
前記プロドメインタンパク質が、Ｐ４からＰ１アミノ酸を、アミノ酸配列ＦＫＡＭ、Ｆ
ＫＡＹ、またはＦＫＡＦで置き換えることによって修飾されている、請求項１４に記載の
方法。
【請求項１６】
前記目的とする第２のタンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡBドメイン；プロテイン
ＡB変異体Ａ２１９；連鎖球菌プロテインＧBドメイン；連鎖球菌プロテインＧaドメイン
20
；プロテインＧB変異体Ｇ３１１；大腸菌仮想Ｙａｂ；ウシトランスデューシンのａ−サ
ブユニット；好熱性メタン生成古細菌（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）Ｃ
ＤＣ６；ストレプトアビジン；アビジン；Ｔａｑポリメラーゼ；アルカリホスファターゼ
；ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼ；制限酵素；ペルオキシダーゼ；エンド−１，４−βグルカナ
ーゼ；エンド−１，３−β−グルカナーゼ；キチナーゼ；βおよびαグルコシダーゼ；β
およびαグルコロニダーゼ；アミラーゼ；グルコシル−トランスフェラーゼ；ホスホ−ト
ランスフェラーゼ；クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ；β−ラクタ
マーゼ；ルシフェラーゼ；エステラーゼ；リパーゼ；プロテアーゼ；バクテリオシン；抗
生物質；酵素阻害剤；成長因子；ホルモン；受容体；膜タンパク質；核タンパク質；転写
因子；翻訳因子；または核酸修飾酵素である、請求項１５に記載の方法。
30
【請求項１７】
前記宿主細胞に、大腸菌、桿菌、サルモネラ、シュードモナス；サッカロミセスセレビ
シエ、ピキアパストリス、クルベロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ、シ
ゾサッカロミセス由来の細胞；またはＣＨＯ細胞が含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
融合タンパク質からの目的タンパク質の精製および分離のための方法であって、
目的タンパク質に連結されたプロドメインタンパク質を含む融合タンパク質を、ズブチ
リシンまたはその変異体と融合タンパク質のプロドメインタンパク質との間の結合複合体
の形成に適した条件下で、有効量のズブチリシンまたはその変異体と接触させる工程；
ズブチリシンまたはその変異体が、目的タンパク質を結合複合体から切断するのに十分
40
な時間、結合複合体をインキュベートする工程；および
目的タンパク質を回収する工程を含む方法。
【請求項１９】
前記ズブチリシンが、プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質に特異的に結合するよ
うに修飾されている請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ズブチリシンが、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｋ４３Ｎ、Ａ７３Ｌ、７５∼
８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｋ
２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅ、Ｙ１０４Ａ、Ｇ１２８Ｓ、およびアミ
ノ酸位置３２、１５５、または２２１における少なくとも１つのさらなる突然変異を含む
50
(4)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンプロドメインであり、かつＰ４からＰ１
アミノ酸を、アミノ酸配列ＦＫＡＭ、ＦＫＡＹまたはＦＫＡＦで置き換えることによって
修飾される請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記目的タンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡBドメイン；プロテインＡB変異体Ａ２
１９；連鎖球菌プロテインＧBドメイン；連鎖球菌プロテインＧaドメイン；プロテインＧ
B
変異体Ｇ３１１；大腸菌仮想Ｙａｂ；ウシトランスデューシンのａ−サブユニット；好
熱性メタン生成古細菌（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＣＤＣ６；ストレ
10
プトアビジン；アビジン；Ｔａｑポリメラーゼ；アルカリホスファターゼ；ＲＮアーゼ；
ＤＮアーゼ；制限酵素；ペルオキシダーゼ；エンド−１，４−βグルカナーゼ；エンド−
１，３−β−グルカナーゼ；キチナーゼ；βおよびαグルコシダーゼ；βおよびαグルコ
ロニダーゼ；アミラーゼ；グルコシル−トランスフェラーゼ；ホスホ−トランスフェラー
ゼ；クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ；β−ラクタマーゼ；ルシフ
ェラーゼ；エステラーゼ；リパーゼ；プロテアーゼ；バクテリオシン；抗生物質；酵素阻
害剤；成長因子；ホルモン；受容体；膜タンパク質；核タンパク質；転写因子；翻訳因子
；または核酸修飾酵素である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ズブチリシンが、固相マトリックス上に固定されている、請求項２０に記載の方法
20
。
【請求項２４】
9
前記ズブチリシンのプロドメインが、ズブチリシンへの結合親和性が１０ Ｍ
- 1
超に増
大するように変異されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ズブチリシンが、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｋ４３Ｎ、Ａ７３Ｌ、７５∼
８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｋ２１７Ｌ、Ｎ
２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅ、Ｙ１０４Ａ、Ｇ１２８Ｓ、およびアミノ酸位置３２
または２２１における少なくとも１つのさらなる突然変異を含む請求項１９に記載の方法
。
30
【請求項２６】
前記ズブチリシンが、Ｓ１８９、Ｓ１９０、Ｓ１９４、Ｓ１９６、Ｓ１９７、またはＳ
１９８である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ズブチリシンが、Ｓ１９９、Ｓ２０１、またはＳ２０２である、請求項２５に記載
の方法。
【請求項２８】
試験サンプル中における目的物質の存在を検出するための分析方法であって、
（ａ）十分な量のプロテアーゼプロドメイン融合タンパク質と共に、目的物質を含有す
る可能性のある試験サンプルをインキュベートする工程
40
（ただし、該プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質は、
（ｉ）高い親和性でズブチリシンまたはその変異体と結合できるプロテアーゼプロドメイ
ン、および
（ｉｉ）目的物質の第２のタンパク質への結合を可能にするインキュベーションの条件下
で、目的物質を結合できる第２のタンパク質を含む）；
（ｂ）ズブチリシンまたはその変異体（ただし、ズブチリシンまたはその変異体は、前
記融合タンパク質と結合するのに有効な量で溶解しているか、固相上に固定されている）
に、工程（ａ）で使用されたプロテアーゼプロドメイン融合タンパク質を接触させて、ズ
ブチリシン／プロドメイン融合タンパク質結合複合体を形成する工程；
（ｃ）ズブチリシンまたはその変異体が、前記結合複合体から第２のタンパク質を切断
50
(5)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
するのに十分な時間、前記ズブチリシン／プロドメイン融合タンパク質結合複合体をイン
キュベートする工程；
（ｄ）前記目的物質と結合した第２のタンパク質を回収する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記目的物質に結合できる検出可能な標識を導入する工程；および
標識の有無を決定して、試験サンプル中における目的物質の有無の指標を提供する工程
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合複合体から第２のタンパク質を分離するより前、または前記第２のタンパク質
を回収した後に、前記検出可能な標識が導入される、請求項２９に記載の方法。
10
【請求項３１】
前記試験サンプルが、血液、尿、精液、唾液、粘液、涙、または膣分泌物である、請求
項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記目的物質が、抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のタンパク質が、前記抗体に対して親和性を有する抗原性受容体である、請求
項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記目的物質が、抗原である請求項３１に記載の方法。
20
【請求項３５】
前記第２のタンパク質が、前記抗体に対して親和性を有する抗体である、請求項３４に
記載の方法。
【請求項３６】
前記ズブチリシンが、プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質と特異的に結合するよ
うに修飾されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記ズブチリシンが、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｋ４３Ｎ、Ａ７３Ｌ、７５∼
８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｋ
２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅ、Ｙ１０４Ａ、Ｇ１２８Ｓ、およびアミ
30
ノ酸位置３２、１５５または２２１における少なくとも１つのさらなる突然変異を含む、
請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記プロテアーゼプロドメインタンパク質が、ズブチリシンプロドメインであり、かつ
Ｐ４からＰ１アミノ酸を、アミノ酸配列ＦＫＡＭ、ＦＫＡＹ、またはＦＫＡＦで置き換え
ることによって修飾されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
目的薬物が結合されて融合生成物を形成したズブチリシンプロドメインタンパク質を含
む薬物送達システムであって、
前記融合生成物は、ズブチリシンまたはその変異体とさらに複合体形成して薬物送達複
40
合体を形成している、薬物送達システム。
【請求項４０】
前記目的薬物が、直接またはリンカー部分を介して、ズブチリシンプロドメインタンパ
ク質にコンジュゲートされている、請求項３９に記載の薬物送達システム。
【請求項４１】
前記目的薬物が、薬物送達複合体からゆっくりと放出される、請求項３９に記載の薬物
送達システム。
【請求項４２】
前記薬物送達生成物が、組成物中に含まれており、非経口的に、経口的に、局所的に、
または吸入により投与される、請求項４１に記載の薬物送達システム。
50
(6)
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【請求項４３】
前記組成物が、固体、ゲル、液体、またはエアロゾルを含む、請求項４１に記載の薬物
送達システム。
【請求項４４】
前記ズブチリシンが、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｋ４３Ｎ、Ａ７３Ｌ、７５∼
８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｋ
２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅ、Ｙ１０４Ａ、Ｇ１２８Ｓ、およびアミ
ノ酸位置３２、１５５、または２２１における少なくとも１つのさらなる突然変異を含む
、請求項４１に記載の薬物送達システム。
【請求項４５】
10
前記ズブチリシンプロドメインタンパク質が、Ｐ４からＰ１アミノ酸残基を、アミノ酸
配列ＦＫＡＭ、ＦＫＡＹ、またはＦＫＡＦで置き換えることにより修飾されている、請求
項４１に記載の薬物送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、精製法に関し、より詳細には、標的タンパク質とプロテアーゼプロドメイン
タンパク質とを含む融合タンパク質に関する。ただし、プロドメインタンパク質は、対応
するプロテアーゼまたはその変異体との結合に対する高親和性を有し、標的タンパク質の
20
その後の回収のためのプロテアーゼ結合複合体が提供される。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
組換えＤＮＡ技術によって、医学およびバイオテクノロジーにおける様々な適用のため
のタンパク質の発現が容易になりつつある。しかし、組換え型タンパク質の精製は、しば
しば複雑であり、問題をはらんでいる。タンパク質の大規模な、経済的な精製は通常、そ
のタンパク質のための遺伝子を含有する組換えプラスミドの挿入によって、目的タンパク
質を生成するように設計された細菌細胞系などの細胞培養によるタンパク質の生成を含む
。細胞に供給される化合物の混合物から、また、細胞それ自体の副産物から、所望のタン
30
パク質を、ヒト治療薬として使用するのに十分な純度まで分離することは、厄介な難題を
提起する。
【０００３】
細胞残屑からタンパク質を精製するための手法は、第一に、タンパク質の発現の部位に
依存する。ある種のタンパク質は、細胞から周囲の増殖培地に直接分泌させるようにでき
、またある種のものは、細胞内に生じる。後者のタンパク質については、精製プロセスの
第一段階は、細胞の溶解を含む。これは、機械的な剪断、浸透圧ショック、または酵素処
理を含めた様々な方法により行うことができる。こうした破壊により、ホモジェネートに
は、細胞の完全な内容物が放出され、さらに、細胞より小さいフラグメントを生成し、こ
れは、そのサイズが小さいために取り除くのが困難である。これらは通常、分画遠心分離
40
によって、あるいは濾過によって除去される。同じ問題は、より小さい規模ではあるが、
細胞の自然死およびタンパク質生成実施の間の細胞内宿主細胞タンパク質の放出に起因し
て、直接分泌されるタンパク質でも生じる。
【０００４】
一旦、目的タンパク質を含有する清澄化された溶液が得られると、通常異なる技術の組
み合わせを使用して、細胞によって産生される他のタンパク質からのその分離が試みられ
る。タンパク質に対する全回収プロセスの一部として、タンパク質を、タンパク質に結合
する固定された試薬にさらすことができる。
【０００５】
ポストゲノム時代のプロテオミクスイニシアティブにより、タンパク質の精製および分
50
(7)
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析のための、迅速、効果的、かつ標準化された手順の需要が増している。例えば、組換え
型タンパク質は、精製を容易にするために、他のタンパク質またはペプチドと頻繁に融合
される。融合されるドメインは、アフィニティ精製のための一時的なフックとして働き、
最終的には、部位特異的なタンパク質加水分解によって切断する必要がある。特に大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のための、異なるキャリアタンパク質を使用するいくつかの融合タ
ンパク質システムが、現在、市販品として入手できる。その例には、マルトース結合タン
パク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク
質、チオレドキシン、およびセルロース結合ドメインが含まれる。
【０００６】
融合タンパク質発現は、固定された、キャリアタンパク質に特異的な中程度の−アフィ
10
ニティーリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィによる細胞抽出物からの組
換え型タンパク質の分離を簡単にする。しかし、一般的に、固定は多くの場合、リガンド
のマトリックスへの共有結合を必要とし、これは、活性の喪失をもたらす。広く使われて
いる生成物の典型的な例は、プロテインＡ−セファロースである。この非常に高価な生成
物は、アフィニティークロマトグラフィによるＩｇＧの精製のために、また、多くの診断
用プロトコルのために使用される。
【０００７】
したがって、可溶タンパク質の精製のための、より経済的かつ技術的に簡単な方法（ク
ロマトグラフィ手法のスケールアップを含まない）が所望される。
【０００８】
20
プロテアーゼの機能は、胚発生から細胞死までの生理学的プロセスを調節する、広い特
異性の分解酵素から、非常に配列特異的な酵素までの範囲に及ぶ。ある種の高い特異性の
プロテアーゼは、天然から補充されており、ＤＮＡを操作するための制限エンドヌクレア
ーゼの使用にいくらか似た方式で、タンパク質の精製および分析のためのツールとして働
く。現在利用できる特異的なプロセッシング酵素は、トロンビン、Ｘａ因子、およびエン
テロペプチダーゼなど、哺乳類供与源からのものである。しかし、タンパク質研究では広
く使われているものの、これらの天然の酵素は、非常に高価でありかつ安定性が低く、多
くの適用に対するその有用性は限られている。
【０００９】
与えられた配列を切断するための、ズブチリシンなどの強力な細菌プロテアーゼを設計
30
するために、かなりの労力が捧げられてきた。ズブチリシンは、グラム陽性菌によって、
あるいは真菌によって産生されるセリンプロテアーゼである。ズブチリシンは、重要な工
業用の酵素であり、かつ酵素によって与えられる莫大な速度の増進を理解するためのモデ
ルでもある。多数のズブチリシンのアミノ酸配列が、知られており、例えば、ズブチリシ
ンＢＰＮ’、ズブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、ズブチリシンＤＹ、
ズブチリシンアミロサッカリティカス（ａｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓ）、およ
びメセンチコペプチダーゼ（ｍｅｓｅｎｔｉｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）などの、桿菌属（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株由来のズブチリシンが含まれる。遺伝子のタイムリーなクローニン
グ、発現および精製の容易さ、および原子分解能構造の有用性と共に、これらの理由のた
めに、ズブチリシンは、１９８０年代に、タンパク工学研究のためのモデルシステムとな
40
った。１５年後、ズブチリシンの２７５アミノ酸５０％をはるかに上回る突然変異が、科
学文献に報告された。大抵のズブチリシン工学は、触媒アミノ酸、基質結合領域、および
安定化（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）変異を使用している。最も突然変異が起こるズブチリ
シン［１、２］は、桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、アミロリケファシエンス（ａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＢＰＮ’）、スブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ズブチ
リシンＥ）およびレンタス（ｌｅｎｔｕｓ）（サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ））から分
泌されるものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
50
(8)
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ズブチリシンのタンパク工学における強い活性にもかかわらず、これを、幅広い基質選
好性をもつプロテアーゼから、特異的な基質のプロセッシングに適した酵素に形質転換し
、それによって、これを、タンパク質回収システムのために有用にすることは、これまで
可能ではなかった。したがって、精製プロセスのためにズブチリシンなどの特異性の低い
プロテアーゼを使用できることは、研究およびタンパク質精製にとって極めて有用であろ
う。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、ズブチリシンおよびその変異体が、プロテアーゼに対して高親和性の基質配
10
列（ただし、基質配列は、好ましくはズブチリシンのプロドメインである）と共に使用さ
れる場合、タンパク質の精製に有用であるという発見に関する。また、ズブチリシンのプ
ロドメインと目的とする第２のタンパク質とを含む融合タンパク質の生成のための発現シ
ステムの構築を開示する。
【００１２】
分泌されるプロテアーゼ（ズブチリシンなど）は、プロテアーゼ活性化のタイミングを
しっかりと調節するために、不活性のチモーゲン前駆体として合成される［１５９］。多
くの場合、チモーゲン前駆体は、成熟したプロテアーゼ配列に付着したＮ末端アミノ酸か
らなる。多数のこれらのＮ末端伸長物（プロドメイン）は、独立に折り畳まれるのに十分
に大きく、成熟したプロテアーゼの活性サイトにしっかりと結合することが示されている
20
［１４９、１６０∼１６６］。
【００１３】
ズブチリシンＢＰＮは、プレ−プロ−タンパク質（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ）
である一次翻訳産物を有する、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の細胞外セリンプロテイナーゼである［９、１
０］。３０のアミノ酸前配列（配列番号２）は、膜を横切るタンパク質分泌のためのシグ
ナルペプチドとして働き、シグナルペプチターゼによって加水分解される［１６７］。成
熟過程の細胞外部分は、プロズブチリシンの折り畳み、７７アミノ酸配列（配列番号１）
の自己プロセシング（その結果プロセッシングされた複合体が産生される）、最後に、プ
ロドメインの分解（その結果２７５アミノ酸（配列番号３）の成熟したＳＢＴ配列がもた
30
らされる）を含む。７７アミノ酸のプロドメインは、自己触媒的に除去され、また、プロ
ドメインは、桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からの分泌の後まで、ズブチリシンの活性化を
遅らせることが示唆されている［１６８］。これは、プロドメインが、ズブチリシンの活
性の強力な阻害を示す、活性なズブチリシン（Ｋi ５．４×１０
- 7
Ｍ）の競合阻害剤で
あるためである。
【００１４】
ズブチリシンの幅広い選好性は、それがタンパク質基質と結合する方式に由来する。大
抵のズブチリシンの接触は、基質構造中に位置する切断されやすい（ｓｃｉｓｓｉｌｅ）
結合の、アシル側の最初の４つのアミノ酸とのものである。これらの残基は、切断されや
すい結合から、基質のＮ末端の方向へ、番号を付け、Ｐ１からＰ４で表す［１５７］。基
40
質結合の側鎖成分は、主にＰ１およびＰ４アミノ酸に起因する［１９３］［４６、４７］
。ズブチリシンは、これらの位置では疎水性アミノ酸を好む。ズブチリシンとプロドメイ
ンとの間の複合体の高い分解構造により、プロドメインのＣ末端の部分が、基質としてズ
ブチリシン活性部位に結合すること、また、プロドメインの球状部分が、ズブチリシンに
対する広い相補性を有することが示される。Ｃ末端の残基は、プロドメインの中心部分か
ら、外へ伸び、切断されるＳＢＴの活性部位に沿って、基質のような方式で結合する。し
たがって、プロドメインの残基Ｙ７７、Ａ７６、Ｈ７５、およびＡ７４は、それぞれ、Ｐ
１からＰ４基質アミノ酸として作用する。これらの残基は、ズブチリシンの天然の配列選
好性に従う。折り畳まれたプロドメインは、Ｃ末端の尾部の基質相互作用と、β−シート
によって提供される疎水性インターフェースとの両方によって仲介される、天然のズブチ
50
(9)
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リシンに対して相補的かつ高親和性の形状を有する［１３３］。
【００１５】
同様に、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対する遺伝子の配列決定により、ＡＬＰ
が、プロエンザイム（ｐｒｏ−ｅｎｚｙｍｅ）として合成されることも示された。ＡＬＰ
では、プロドメイン（１６６アミノ酸）は、成熟したプロテアーゼ（１９８アミノ酸）と
ほぼ同じくらいの大きさである。さらに、ＡＬＰプロドメインは、生体内で活性なＡＬＰ
を産生するために必要とされること、また、１６６アミノ酸のプロドメインは、ＡＬＰの
強力な競合阻害剤であることが実証された［１７０］。興味深いことには、そのプロドメ
インを伴うＡＬＰの構造解析によって、ＡＬＰの活性部位に対するプロドメインの親和性
結合が示された［１８７］。
10
【００１６】
プロドメインによって仲介される折り畳みの他の例は、プロテアーゼの機構的ファミリ
ーの４つすべてに発見されている：セリンプロテアーゼ［１７２∼１７７］、アスパラギ
ン酸プロテアーゼ［１７８∼１８０］、メタロプロテアーゼ［１８１∼１８５］、および
システインプロテアーゼ［１８６］。
【００１７】
したがって、一態様では本発明は、標的タンパク質に結合されるプロドメインタンパク
質を使用する、タンパク質精製プロセスに関する。ただし、このプロドメインタンパク質
は、通常関連するプロテアーゼに対して高親和性を有し、それによって、プロドメインか
らの標的タンパク質の簡単な分離が提供される。好ましくは、本発明は、ズブチリシンま
20
たはその変異体などの分泌されるプロテアーゼのプロドメインに関する。ただし、このプ
ロドメインは、ズブチリシンまたはその変異体に対する高親和性を有する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、標的タンパク質に融合されるプロテアーゼプロドメインを含
む融合タンパク質に関する。ただし、切断は、プロドメインと標的タンパク質を連結して
いるペプチド結合を、特異的に対象とし、かつ、プロドメインは、対応するプロテアーゼ
に対する高親和性の結合を有する。好ましくは、プロテアーゼは、ズブチリシンまたはそ
の変異体である。ただし、変異体は、プロテアーゼプロドメインと標的タンパク質との間
のペプチド結合を特異的に加水分解するように修飾される、かつ／またはその加水分解活
性を、特定のイオンによって誘発することができる。さらに、プロドメインタンパク質は
30
、プロテアーゼに対する同種の配列を含めることによって、最適化させることができる。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、目的タンパク質に融合されたアミノ酸配列の配列番号
１のプロドメインタンパク質を含む。さらに、プロドメイン配列は、以下を含めた少なく
ともＰ１∼Ｐ４アミノ酸残基の代替物を含むことができる：
【００２０】
【表１】
40
【００２１】
ＦＫＡＭ、ＦＫＡＹ、またはＦＫＡＦを含めて、いくつかの同種の配列は、非常に有効
であることが判明している。驚くべきことに、配列ＦＫＡＭ、ＦＫＡＹ、またはＦＫＡＦ
9
の付加はまた、ズブチリシンに対するプロドメインの親和性を＞１０ Ｍ
- 1
に増大する。
【００２２】
さらに、ズブチリシンプロドメインは、ズブチリシンに対するその親和性をさらに増大
させるために、安定化変異をさらに含むことができる。さらに、非特異的アミノ酸配列の
50
(10)
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そのタンパク質加水分解を大幅に減少させるために、ズブチリシンの４つの触媒アミノ酸
の１つまたは複数に、突然変異を組み込んでもよい。好ましい突然変異は、配列番号３と
同定され、図２に示されるズブチリシン配列の、アミノ酸位置３２、６４、１５５、およ
び２２１に含まれる。
【００２３】
したがって、別の態様では、本発明は、プロドメインにおける同種の配列に対するＫm
が１ｎｍ未満であるプロセッシングプロテアーゼを提供する。プロセッシングプロテアー
ゼのｋcatは、１０
- 1
ｓｅｃ
- 1
から１０
- 5
ｓｅｃ
- 1
の範囲である。したがって、プロセッ
シングプロテアーゼおよびその同種のプロドメイン基質に対するターンオーバー数（ｋca
4
t
／Ｋm）が、１０ Ｍ
- 1
ｓ
- 1
8
- 1
ｓ
- 1
- 1
である。
から１０ Ｍ
対するターンオーバー数は、＜１Ｍ
ｓ
- 1
の範囲であるのに対して、非特異的配列に
10
【００２４】
6
好ましいプロセッシング酵素は、非特異的配列に対して＞１０ 倍その同種のプロドメ
インを好むこととなる。本発明の最も好ましい実施形態は、０．００１∼０．０００１ｓ
- 1
の範囲のｋcat値を有するプロセッシングズブチリシンである。この時間範囲で切断す
るズブチリシンは、Ｎ末端融合ドメインとしての同種のプロドメインを含有する任意のタ
ンパク質のアフィニティ精製を可能にするのに十分にゆっくりと、基質を処理する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ドメインに連結された標的タンパク質を含む融合タンパク質
を提供する。ただし、ドメインタンパク質は、（Ｅ Ｅ Ｄ Ｋ Ｌ（Ｆ／Ｙ）Ｑ Ｓ（
20
Ｍ／Ｌ／Ｙ）という変異体を含むＣ末端上のアミノ酸残基を含み、ドメインのＣ末端の部
分は、ズブチリシンまたはその変異体に対する親和性を生じさせる。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、ズブチリシンプロドメイン融合生成物を生じる方法を
提供する。典型的な手順は、次のステップを含む：
ズブチリシンプロドメイン融合タンパク質をコードする核酸を提供するステップ（ただし
、融合タンパク質は、ズブチリシンまたはその変異体のプロドメインと、目的とする第２
のタンパク質とを含み、プロドメインは、ズブチリシンまたはその変異体と高親和性で結
合できる）；
核酸を用いて、あるいは、核酸を宿主細胞に導入するための等価手段を使用して、宿主細
30
胞を形質移入するステップ；および
融合タンパク質の発現に適した条件下で、形質転換された宿主細胞を培養するステップ。
【００２７】
主題の融合タンパク質は、組換え方法によって、特に、好ましくはズブチリシンプロド
メイン／第２タンパク質ＤＮＡの発現によって、通常産生される。ただし、ＤＮＡは、微
生物宿主細胞（特に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））中で発現される。
この菌が、天然にズブチリシンを産生し、タンパク質の効率的な分泌者であり、かつ、活
性なコンフォメーションのプロドメインタンパク質を産生することが可能であるからであ
る。しかし、本発明は、桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中での融合タンパク質の発現に限定
されず、むしろ、融合タンパク質の発現を提供するいずれの宿主細胞における発現も包含
40
する。発現に適した宿主細胞は、当分野でよく知られており、例えば、細菌宿主細胞（大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ
属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）など）、酵
母細胞（サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルベロミセス属（Ｋｌ
ｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃ
ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）など）、および哺乳類宿主細胞（ＣＨＯ細胞など
）が含まれる。しかし、細菌宿主細胞が、発現のために好ましい宿主細胞である。
【００２８】
ズブチリシンプロドメイン／第２のタンパク質融合タンパク質をコードしているＤＮＡ
50
(11)
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の発現は、入手可能なベクターおよび調節配列を使用できる。実際の選択は、発現のため
に利用される特定の宿主細胞に、大部分依存する。例えば、融合タンパク質が桿菌属（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）中で発現される場合、桿菌属から得られるベクターはもとより、桿菌属
プロモーターも通常利用されることとなる。微生物宿主細胞中での融合タンパク質の発現
は、これによって、微生物宿主細胞が、適切なコンフォメーションでズブチリシンプロド
メインを産生できるようになるので、通常好ましいこととなる。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、融合タンパク質から、目的タンパク質を精製し、そこから分
離するための方法に関する、方法は、
ズブチリシンまたはその変異体と、融合タンパク質のプロドメインタンパク質との間の結
10
合複合体の形成に適した条件下で、有効量のズブチリシンまたはその変異体と、目的タン
パク質に連結されたプロドメインタンパク質を含む融合タンパク質を接触させること；
ズブチリシンまたはその変異体が、結合複合体から、目的タンパク質を切断するのに十分
な時間、結合複合体をインキュベートすること；および
目的タンパク質を回収すること
を含む。
【００３０】
好ましくは、プロテアーゼは、プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質と特異的に結
合するために修飾され、かつ、プロテアーゼプロドメインタンパク質は、結合複合体から
の第２のタンパク質の自触媒的除去のためのプロテアーゼの同種の配列が含まれるように
20
修飾されている。好ましくは、プロテアーゼは、ズブチリシンまたはその変異体であり、
プロドメインは、こうしたプロテアーゼに対する高い結合親和性を有する。
【００３１】
本発明のさらに別の態様は、プロテアーゼプロドメインタンパク質と、第２の標的タン
パク質とを含む（その間に位置する切断部位を含む）融合タンパク質をコードする核酸を
提供する。好ましくは、切断部位は、融合生成物の第２のタンパク質のＮ末端アミノ酸の
上流にある。好ましくは、切断部位は、Ｐ４∼Ｐ１アミノ酸残基の下流にある。
【化１】
30
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明のプロテアーゼプロドメイン融合タンパク質をコードする
核酸からなる宿主細胞を提供する。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、目的物質の検出のための診断キットに関し、キットは、
（ａ）以下を含むプロテアーゼプロドメイン融合タンパク質：
（ｉ）ズブチリシンまたはその変異体に高親和性で結合できるプロテアーゼプロドメイ
40
ン；および
（ｉｉ）目的物質を結合できる第２のタンパク質；
（ｂ）検出可能な標識；および
（ｃ）プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質に結合させるためのズブチリシンまたは
その変異体
を含む。
【００３４】
好ましくは、プロドメインは、ズブチリシンプロドメインであり、また第２のタンパク
質としては、それだけには限らないが、酵素、ホルモン、抗原、または抗体が含まれ得る
。
50
(12)
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【００３５】
別の態様では、本発明は、試験サンプル中の目的物質の存在を検出するための上記の診
断キットを使用するための分析方法に関し、方法は、
（ａ）試験サンプル（十分な量のプロテアーゼプロドメイン融合タンパク質と共に、目的
物質を含有できる）をインキュベートすること
（ただし、プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質は、
（ｉ）ズブチリシンまたはその変異体と高親和性で結合できるプロテアーゼプロドメイン
、および
（ｉｉ）目的物質と結合できる第２のタンパク質
を含み、
10
インキュベーションの条件は、目的物質の第２のタンパク質への結合を可能にするもので
ある）；
（ｂ）ズブチリシンまたはその変異体（ただし、ズブチリシンまたはその変異体は、融合
タンパク質と結合して結合複合体を形成するのに有効な量で溶解している、あるいは固相
上に固定されている）に、工程（ａ）で使用されたプロテアーゼプロドメイン融合タンパ
ク質を接触させて、ズブチリシン／プロドメイン融合タンパク質結合複合体を形成するこ
と；
（ｃ）結合複合体からの第２のタンパク質の自触媒的切断にとって十分な時間、ズブチリ
シン／プロドメイン融合タンパク質結合複合体をインキュベートすること；
（ｄ）目的物質と結合した第２のタンパク質を回収すること
20
を含む。
【００３６】
この実施形態は、さらに、試験サンプル中の目的物質の有無の指標を提供するために、
検出可能な標識（ただし、標識は、目的物質に結合できる）を導入すること、および標識
の有無を決定することを提供する。検出可能な標識は、結合複合体からの第２のタンパク
質の分離より前、あるいは、第２のタンパク質が回収された後に導入できる。
【００３７】
試験サンプルは、それだけには限らないが、血液、尿、精液、唾液、粘液（ｍｕｃｕｓ
）、涙、膣分泌物などを含めて、体液であり得る。
【００３８】
30
本発明の特定の実施形態では、この方法は、試験サンプル中の特定のタンパク質または
ペプチドの検出のために設計されており、したがって、プロドメインズブチリシン融合タ
ンパク質の第２のタンパク質は、試験サンプル中の特定のタンパク質またはペプチドに対
する抗体であり得る。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっ
てもよい。本発明のズブチリシンプロドメインは、直接、あるいはリンカー部分を介して
、抗体に複合することができる。
【００３９】
目的物質はまた、タンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、または他のプローブ−標的
可能な分子に結合された、ビオチン化されたプローブを含むこともできる。標識は、酵素
に対する十分な量の基質を加えると、その基質が、酵素によって、検出可能な化合物に転
40
換されるような酵素を含んでいてもよい。
【００４０】
最後に、融合生成物（ただし、融合生成物は、ズブチリシンまたはその変異体とさらに
複合体形成されて、複合薬物送達を形成する）を形成するための、目的とする治療的化合
物または薬物に関連するズブチリシンプロドメインタンパク質を含む薬物送達システムを
提供することは、本発明のさらなる態様である。こうした薬物送達システムでは、目的薬
物は、直接、あるいはリンカー部分を介して、ズブチリシンプロドメインに複合されても
よい。結合の多くの方法が存在しており、当技術分野で知られている。例えば、シクロヘ
キシルカルボジイミドなどのアシル活性化薬剤が存在し、これを、アミドまたはエステル
結合を形成するために使用することができる。
50
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【００４１】
一実施形態では、こうした薬物送達システムは、目的薬物が、ズブチリシンと結合され
たズブチリシンプロドメインから、ゆっくり放出される、徐放性または持続性薬物送達シ
ステムであってもよい。こうした薬物送達システムは、非経口的に、経口的に、局所的に
、あるいは吸入によって投与できる組成物に組み込むことができると考えられる。さらに
、組成物は、固体、ゲル、液体、またはエアロゾルの形であり得る。
【００４２】
本発明の他の特徴および効果は、以下の詳細な説明、図面、および先の特許請求の範囲
から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
10
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、非常に特異的なプロセッシングズブチリシンプロテアーゼと結合するための
最適化された同種の配列を含むプロドメインに関する。ただし、このペアは、タンパク質
精製のための特定の有用性をもつ。
【００４４】
単離されたズブチリシンプロドメインは、折り畳まれていないが、４本鎖の逆平行β−
シートおよびズブチリシンと複合体を形成する２つの３−ターンα−らせんを伴うコンパ
クトな構造であると考えられる［１３０、１３３］（図１）。Ｃ末端の残基は、プロドメ
インの中心部分から、外へ伸び、切断されるＳＢＴの活性部位に沿って、基質のような方
20
式で結合する。プロドメインの残基Ｙ７７、Ａ７６、Ｈ７５、およびＡ７４はそれぞれ、
Ｐ４からＰ１基質アミノ酸になる。これらの残基は、ズブチリシンの天然の配列選択に従
う。折り畳まれたプロドメインは、Ｃ末端の尾部の基質相互作用と、β−シートによって
提供される疎水性インターフェースとの両方によって仲介される、天然のズブチリシンに
対して相補的かつ高親和性の形状を有する［１３３］。プロドメインの天然の三次構造は
、ズブチリシンへの最大の結合にとって必要である。突然変異が、ズブチリシンと直接接
触しないプロドメインの領域に導入される場合、ズブチリシンへの結合に対するその影響
は、それが固有立体配座（ｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を安定させるか否
かに結びつけられる。したがって、プロドメインの独立した折り畳みを安定させる突然変
異は、その結合親和性を増大させる［１３７］。
30
【００４５】
本明細書では、用語「突然変異」は、遺伝子配列および／またはその遺伝子配列によっ
てもたらされるアミノ酸配列の改変を指す。突然変異には、野生型タンパク質配列に対す
るアミノ酸残基の欠損、置換、および付加が含まれる。
【００４６】
本明細書では、用語「野生型」は、変異されていない生物によって産生されたタンパク
質、ここでは特にプロテアーゼまたはプロドメインを指す。野生型ズブチリシンのような
プロテアーゼは、例えば、バチルスアルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉ
ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスアミロサッカリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏ
40
ｓａｃｃｈａｒｉｃｕｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）および枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物によって産生される。
【００４７】
用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、本明細書では、アミノ酸配列または天然に存在
する分子の他の特徴が修飾されているタンパク質と定義され、変異体を含むことが意図さ
れている。本発明に含まれるいくつかの変異体は、最終の構築物が、プロテアーゼプロド
メインと対応するプロテアーゼとの間の所望の結合親和性を有しているという条件で、ア
ミノ酸の置換 欠損および／または挿入を有する。プロテアーゼプロドメインタンパク質
または対応するプロテアーゼにおけるアミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解
50
(14)
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性、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいて行われる。例えば、
負に帯電するアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に帯電する
アミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれ、親水値が同じである荷電していない極
性頭基または無極性の頭基をもつアミノ酸には、以下が含まれる：ロイシン、イソロイシ
ン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フ
ェニルアラニン、チロシン。変異体の定義には、その変異体が結合親和性を保持する限り
、Ｃ末端、Ｎ末端の１つまたは複数の部位に追加のアミノ酸を有するタンパク質も含まれ
る。
【００４８】
本発明の変異体としては、ズブチリシン様プロテアーゼも含むことができる。本明細書
10
では、用語「ズブチリシン様プロテアーゼ」は、ズブチリシンの配列と、少なくとも２５
％、好ましくは８０％、および好ましくは９０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ少な
くとも野生型プロテアーゼと同じ機能活性を保持しているプロテアーゼを意味する。
【００４９】
本発明は、対応するプロテアーゼと高親和性で結合できるプロテアーゼプロドメインの
同定を対象とする。本発明のプロテアーゼプロドメインは、第２のタンパク質と融合して
、プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質を形成する。融合タンパク質中のプロテアー
ゼプロドメインタンパク質の存在は、対応するプロテアーゼと共にインキュベーションす
ることによる第２のタンパク質の容易かつ選択的な精製を可能にする。
【００５０】
20
第２のタンパク質の例には、以下が含まれるが、これに限定されるものではない：ブド
ウ球菌（ｓｔａｐｈｙｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡBドメインおよびプロテインＡB変異
体Ａ２１９を含めてプロテインＡ；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）プロテイン
ＧBドメイン、連鎖球菌プロテインＧaドメイン、およびプロテインＧB変異体Ｇ３１１を
含めてプロテインＧ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）仮想（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）Ｙａｂ
；ウシトランスデューシンのａ−サブユニット；好熱性メタン生成古細菌（Ｍ．ｔｈｅｒ
ｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＣＤＣ６；ストレプトアビジン；アビジン；Ｔａｑポリ
メラーゼおよび他のポリメラーゼ；アルカリホスファターゼ；ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼ；
様々な制限酵素；ペルオキシダーゼ；エンド−１，４−βグルカナーゼ、エンド−１，３
−β−グルカナーゼなどのグルカナーゼ；キチナーゼ、およびその他；βおよびαグルコ
30
シダーゼ；βおよびαグルコロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）；アミラーゼ；
トランスフェラーゼ（グルコシル−トランスフェラーゼ、ホスホ−トランスフェラーゼ、
クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼなど）；β−ラクタマーゼおよび
他の抗生物質修飾および減勢酵素；ルシフェラーゼ；エステラーゼ；リパーゼ；プロテア
ーゼ；バクテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｅ）；抗生物質；酵素阻害剤；異なる成
長因子；ホルモン；受容体；膜タンパク質；核タンパク質；転写および翻訳因子；および
核酸修飾酵素。
【００５１】
用語「プロテアーゼプロドメインタンパク質」は、プロドメインアミノ酸配列またはそ
の機能的等価物を指す。ただし、プロテアーゼプロドメインタンパク質は、対応するプロ
40
テアーゼに高親和性で結合する能力を有する。好ましくは、プロドメインは、実質的に、
それが本来関連する他のタンパク質（例えば、プロテアーゼタンパク質の残り）を含まな
い。さらに、プロドメイン中の１つまたは複数の予め定められたアミノ酸残基を、例えば
、置換、挿入、あるいは、欠損させて、生物学的性質が向上されたプロドメインタンパク
質を産生する、あるいは、結合および発現レベルを変化させることができる。組換えＤＮ
Ａ技術の使用を介して、基本的な核酸を改変することによって、残基が欠損、置換および
／または挿入された本発明のプロドメインタンパク質を調製できる。
【００５２】
一実施形態では、プロテアーゼプロドメインタンパク質を、第２のタンパク質としての
抗体または抗原決定基に融合させて、診断キットにおいて、あるいはイムノアッセイにお
50
(15)
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いて有用であるプロテアーゼプロドメイン融合タンパク質を形成できる。したがって、例
えば、プロテアーゼプロドメインタンパク質に融合した第２のタンパク質としてのプロテ
アーゼプロドメインおよび抗原エピトープを利用することによって、体液を、特定の抗体
の存在について試験することができる。反対に、抗原またはその抗原性部分は、プロテア
ーゼプロドメインおよび抗体融合タンパク質を使用して検出できる。
【００５３】
用語「融合タンパク質」は、本明細書では、少なくとも２つのタンパク質、すなわちプ
ロドメインタンパク質（好ましくはプロテアーゼプロドメイン）と第２のタンパク質が共
に連結することを指す。さらに、本発明の融合生成物は、プロテアーゼプロドメインと第
２のタンパク質との間に位置する酵素的切断部位を含む。切断部位は、好ましくは第２の
10
タンパク質のＮ末端に隣接し、それによって、融合生成物から第２のタンパク質を回収す
るための手段が与えられる。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質は、組換え型融合生成物である。「組換え
型融合生成物」は、融合生成物をコードする核酸を用いて形質転換または形質移入された
宿主細胞、あるいは相同組み換えの結果として融合タンパク質を産生する宿主細胞におい
て産生されたものである。「形質転換」および「形質移入」は、核酸を細胞に導入するプ
ロセスを指すために、同義的に使用される。形質転換または形質移入後、核酸は、宿主細
胞ゲノムに統合されていてもよいし、染色体外因子として存在してもよい。「宿主細胞」
は、宿主生物内の細胞だけでなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養中の細胞を含む。
20
【００５５】
「核酸」は、５’から３’ホスホジエステル結合の一連の核酸を含むヌクレオチド配列
を指し、これは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列であり得る。核酸がＤＮＡである場合、ヌクレ
オチド配列は、一本鎖または二本鎖である。プロドメインプロテアーゼタンパク質をコー
ドする核酸は、対応するプロテアーゼと高親和性で結合できるタンパク質をコードする、
あるいはこうしたタンパク質をコードする核酸配列に相補的である、あるいはストリンジ
ェントな条件下でこうしたタンパク質をコードする核酸配列とハイブリッド形成して、こ
れと安定に結合されたままであるようなＲＮＡまたはＤＮＡである。
【００５６】
融合タンパク質発現ベクターの構築においては、プロドメインをコードする核酸を、プ
30
ロテアーゼプロドメインタンパク質と第２のタンパク質のオープンリーディングフレーム
が、完全であり、融合タンパク質生成物の翻訳が起こるのが可能であるように、第２のタ
ンパク質をコードする核酸に連結または結合させることとなる。
【００５７】
本発明のプロドメインタンパク質をコードする核酸は、細胞供与源から単離および精製
されたＤＮＡから、あるいはゲノムクローニングによって、得ることができる。クローン
のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリは、当分野でよく知られた技術を使用して調製するこ
とができ、遺伝子のいずれかの部分に実質的に相補的であるヌクレオチドプローブを用い
て、核酸をコードする特定のプロテアーゼまたはプロテアーゼプロドメインについてスク
リーニングすることができる。あるいは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、適切なオリゴ
40
ヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲクローニングのための鋳型として使用できる。完
全長のクローン、すなわち、所望のプロテアーゼプロドメインタンパク質の完全なコード
領域を含有するものは、発現ベクターを構築するために選択できる。あるいは、重複する
ｃＤＮＡ同士を連結させて、完全なコード配列を形成することもできる。あるいは、好ま
しいプロテアーゼプロドメインをコードするＤＮＡは、当分野で標準であると考えられる
技術を使用して、化学合成によって、全体的または部分的に合成できる。
【００５８】
ポリペプチドの組換え型生成のための方法は、当業者によく知られている。簡単に言う
と、例えば、宿主細胞は、選択される第２のタンパク質に連結されるプロテアーゼプロド
メインタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質移入される。ＤＮＡ分子などの外
50
(16)
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因性ポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換または形質移入する手段は、当分野でよく
知られており、これには、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランが仲介する形
質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソームが仲介する形質移入、直接マイク
ロインジェクション（ｄｉｒｅｃｔ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、およびアデノウ
イルス感染などの技術が含まれる。
【００５９】
最も広く使用されている方法は、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランによ
って仲介される形質移入である。形質移入されたＤＮＡは、その機構はよく知られていな
いままであるが、エンドサイトーシスによって細胞の細胞質に入り、核に輸送されると考
えられる。細胞のタイプに応じて、培養細胞の集団のうちの最高９０％までは、どの時点
10
においても形質移入できる。その高い効率が理由で、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−
デキストランによって仲介される形質移入は、多数の細胞における外来性ＤＮＡの一時的
発現を必要とする実験のために最適な方法である。リン酸カルシウムが仲介する形質移入
はまた、外来性ＤＮＡのコピー（これは通常、頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）タン
デムアレイに配列される）を宿主細胞ゲノムに組み込んだ細胞系を確立するためにも使用
される。
【００６０】
様々な哺乳類および植物細胞への短時間の高圧電気パルスの適用により、原形質膜にナ
ノメートルサイズの孔が形成される。ＤＮＡは、これらの孔を介して、あるいは孔の閉鎖
を伴う膜成分の再分布の結果として、細胞の細胞質に直接取り出される。電気穿孔法は、
20
極めて効率的であり得、クローン化された遺伝子の一時的発現のために、また、目的とす
る遺伝子の組み込まれたコピーを運ぶ細胞系の設立のために使用できる。電気穿孔法は、
リン酸カルシウムが仲介する形質移入およびプロトプラスト融合とは対照的に、１つ、多
くても２、３の、外来性ＤＮＡの組み込まれたコピーを運ぶ細胞系をしばしば生じる。
【００６１】
形質移入の後、細胞は、本発明の融合タンパク質の発現に十分な期間、培養条件下で維
持される。培養条件は、当分野でよく知られており、イオン組成および濃度、温度、ｐＨ
などが含まれる。一般的に、形質移入された細胞は、培養条件下で培地に維持される。様
々な細胞のタイプのための適切な培地が、当分野でよく知られている。好ましい実施形態
では、温度は、約２０℃から約５０℃である。ｐＨは、好ましくは、約６．０の値から約
30
８．０の値である。コードされたタンパク質の形質移入および発現のために必要とされる
他の生物学的条件は、当分野でよく知られている。
【００６２】
形質移入された細胞は、融合タンパク質の発現のために十分な時間、維持され、一般的
に、維持時間は、約２から約１４日である。組換え技術を使用する場合、融合タンパク質
は、細胞内、ペリプラズム間隙中に産生させる、あるいは直接、培地に分泌させることが
できる。ポリペプチドが、細胞内に産生される場合、第一段階として、微粒子片、すなわ
ち宿主細胞または溶解された細胞のいずれか（例えばホモジナイゼーションに起因する）
は、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。
【００６３】
40
本発明のプロテアーゼプロドメイン融合タンパク質を、宿主細胞の分泌経路に導くため
に、分泌シグナル配列（別名リーダー配列またはプレ配列）が、通常必要とされる。本発
明では、プロテアーゼのプロドメイン配列は、融合タンパク質の一部であり、したがって
、融合タンパク質の分泌は、配列番号２中で定義されるものなどのシグナル配列を含める
ことによって、容易に実施される。
【００６４】
したがって、組換え型融合タンパク質は、形質移入された細胞またはそれらの細胞が培
養された培地から回収または収集される。融合タンパク質は、その後、１つまたは複数の
精製ステップにかけられる。本発明の一実施形態では、回収ステップは、融合タンパク質
を含む組成物を、プロドメインタンパク質と高親和性で結合してプロテアーゼ／プロテア
50
(17)
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ーゼプロドメイン結合複合体を形成するズブチリシンまたはその変異体を固定した固相に
さらすことを含む。固相は、カラムに詰め込むことができ、固定された対応するプロテア
ーゼは、融合タンパク質を捕獲し、化学的かつ／または物理的に融合タンパク質を修飾し
て、第２のタンパク質を放出する。
【００６５】
「固相」は、融合生成物が付着できるプロテアーゼを含むマトリックスを意味する。固
相は、精製カラム、離散粒子の分散相、膜、またはフィルタであり得る。固相を形成する
ための材料の例には、多糖（アガロースおよびセルロースなど）；およびシリカ（例えば
微細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ））、ポリ（スチレンジビ
ニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子、上述のいずれかの誘導体などの
10
他の機械的に安定なマトリックスが含まれる。好ましい実施形態では、固相は、融合タン
パク質生成物のプロドメインタンパク質に対して高親和性で結合するためのプロテアーゼ
でコートされた、カラム内に保持される微細孔ガラスビーズを含む。
【００６６】
本明細書では、語句「高い親和性で結合する」は、プロテアーゼプロドメインの、ｎＭ
からｐＭのＫdで、約１０ｎＭから約１０ｐＭの範囲、好ましくは＜１００ｐＭで同種の
プロテアーゼと結合する能力を指す。
【００６７】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質の使用を介する、試験サンプル、特に、組織エ
キスまたは体液（血清または尿など）などの生体試料中の目的タンパク質の診断用検出に
20
関する。生体試料は、好ましくは哺乳類の起源、最も好ましくはヒト起源である。本発明
の一実施形態では、融合タンパク質は、当分野でよく知られた様々なイムノアッセイ形式
を使用して生体試料中の抗原の存在を検出するために使用される抗体を含むことができる
。あるいは、融合タンパク質の第２のタンパク質は、抗原決定基を認識する抗体の検出に
有用な抗原エピトープを含んでなる。
【００６８】
「抗体」は本明細書では、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、ヒト
化またはキメラ抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）の
（抗Ｉｄ）抗体および上述のいずれかのエピトープ−結合フラグメントを含むと意図され
る。
30
【００６９】
用語「検出可能な標識」は、本明細書では、検出可能なシグナルを直接的または間接的
に提供する任意の標識を指し、これには、例えば、酵素、放射標識された分子、蛍光体（
ｆｌｕｏｒｅｓｏｒ）、粒子、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｏｒ）、酵素基質
または補助因子、酵素阻害剤、磁性粒子が含まれる。本発明において検出可能な標識とし
て有用な酵素の例には、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダ
ーゼが含まれる。目的タンパク質に検出可能な標識を連結するために、様々な方法が利用
でき、それには、例えば、酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼなどを、目
的タンパク質に付着させるための、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロ−フェニ
ルスルホンなどの二官能性薬剤の使用が含まれる。その後、付着された検出可能な標識を
40
、基質と反応させて、検出可能である反応生成物を産生させる。本発明の範囲内であるも
のは、さらに、第２のタンパク質が、抗原エピトープに対する親和性をもつモノクローナ
ル抗体であるような、プロテアーゼプロドメイン融合生成物の治療または診断用の使用で
ある。例えば、（ｉ）同種のプロテアーゼと高親和性で結合できるプロテアーゼプロドメ
イン、および（ｉｉ）抗原を結合できるモノクローナル抗体、を含むプロテアーゼプロド
メイン融合生成物は、薬物／プロテアーゼ複合体またはイメージング剤／プロテアーゼ複
合体を、抗原を産生している癌細胞を標的にさせるための方法に使用できる。この実施形
態では、第２のタンパク質（モノクローナル抗体）に連結されるプロテアーゼプロドメイ
ンは、哺乳類に投与される。融合生成物の投与と並行して、あるいはその後に、薬物／プ
ロテアーゼまたはイメージング剤／プロテアーゼ複合体が投与される。抗原の部位に局所
50
(18)
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化されるプロテアーゼプロドメイン融合生成物への薬物／プロテアーゼまたはイメージン
グ剤／プロテアーゼ複合体の結合により、所望の治療的または診断用活性のための関連す
る部位に、薬物またはイメージング剤が誘導され、向けられる。
【００７０】
本発明は、以下の実施例でさらに説明するが、これは、いかなる形であれ、主張するも
のとしての本発明の範囲に限定するものではない。
【００７１】
方法および材料
突然変異、クローニング、および発現の選択
本出願に記述される特定の点突然変異は、本発明に従って突然変異させる、配列番号：
10
３（図２）に示す通りの、ズブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列中の特定のアミノ酸を同定
する。例えば、Ｓ１４９変異体は、アミノ酸７５∼８３の欠損を含み、以下の置換突然変
異をさらに含む：Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ
７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、
Ｋ２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ、およびＱ２７１Ｅ。さらなる突然変異された変異
体は、図３に示す通りの表１に記述する。
【００７２】
バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）（ズブチリシンＢＰＮ’）由来のズブチリシン遺伝子を、クローン化して、配列
決定し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中のその天然のプロモーター配
20
列から高レベルで発現させる［９、１０］。すべての突然変異遺伝子を、ｐＵＢ１１０に
基づく発現プラスミドに再クローン化させ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを形質転換するために
使用した。宿主として使用されるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は、そのズブチリシン遺伝子の
染色体欠損を含有し、したがって、バックグラウンド野生型（ｗｔ）活性を生じない（フ
ァーネストック（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ）ら、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ．」５３：３７９∼３８４（１９８７年））。オリゴヌクレオチド突然変異誘発
は、前述の通りに実施された［１７］。
【００７３】
野生型ズブチリシンおよび変異体の酵素は、本質的に、ブライアン（Ｂｒｙａｎ）ら［
１７、９４、および９５］に記載されている通りに精製され、均質性について検査された
30
。場合によっては、Ｃ２２１変異体ズブチリシンは、スルフヒドリル特異的な水銀アフィ
ニティーカラム（Ａｆｆｉ−ゲル５０１、バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））上で再精製さ
れた。
【００７４】
ズブチリシンのプロドメインのクローニングおよび発現
ズブチリシンＢＰＮ’遺伝子のプロドメイン領域を、シュトラウスベルク（Ｓｔｒａｕ
ｓｂｅｒｇ）ら［１３８］に記載されている通りのポリメラーゼ連鎖反応を使用してサブ
クローニングした。クローン化されたプロドメイン遺伝子の突然変異誘発を、オリゴヌク
レオチド−誘導性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発システム、バージ
ョン２（アマシャムインターナショナル社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
40
ａｌ ｐｌｃ））に従って実施した。
【実施例】
【００７５】
実施例１
プロドメイン−誘導性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）プロセッシングの実現可能性を実証するた
めに、連鎖球菌プロテインＧの５６アミノ酸Ｂドメイン（ＧB）のＮ末端上にｐＲ８プロ
ドメインの融合体の合成を導くように、遺伝子を構築した。ｐＲ８中に２つのアミノ酸欠
損を生じているＳＧＩＫで置き換えられたアミノ酸残基１６∼２１（ＱＴＭＳＴＭ）の突
然変異を有するプロドメインｐＲ８（ただし、ＳはＱ１６を置き換え、ＧはＴ１７を置き
換え、Ｍ１８ＩはＳ１９およびＴ２０を置き換え、「Ｋ」はＭ２１を置き換える；さらに
50
(19)
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置換Ａ２３Ｃ、Ｋ２７Ｑ、Ｖ３７Ｌ、Ｑ４０Ｃ、Ｈ７２Ｋ、およびＨ７５Ｋを伴う）は、
独立して安定であり、野生型プロドメインよりも約１００倍高い親和性でズブチリシンに
結合する。さらに、ｐＲ８は、したがって、ズブチリシン切断部位を特定する同種配列に
なる。
【００７６】
融合タンパク質（１μＭ）を、１μＭの野生型ズブチリシンと混合した。融合タンパク
質は、急速かつ特異的に切断され、ｐＲ８からＧBを放出した。これらの結果から、以下
を含めたいくつかの関連する見解が得られた：１）プロセッシングは、サイクルの最後の
ｐＲ８による強力な生産物阻害を伴う単一のターンオーバー反応である；２）切断の単一
6
のサイクルの速度は、基質結合速度（１ｅ Ｍ
- 1
ｓ
- 1
）によって制限される；また３）ＧB
10
は、ズブチリシン活性をかなり妨げるので、プロセッシングは非常に特異的である。
【００７７】
実施例２
非同種配列に対してズブチリシン活性を低下させる突然変異
ｐＲ８を使用して、その内部およびそれ自体の切断を導くことは、非同種配列に対する
ズブチリシンの高い活性のため、最適なプロセッシングシステムをもたらさない。次のス
テップは、非同種配列に対してより活性でないズブチリシンを設計することであった。プ
ロセッシングズブチリシンを設計するための出発点は、Ｓ１４９と表される変異体であっ
た：（Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｋ４３Ｎ、Ａ７３Ｌ、７５∼８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６
６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｋ２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ
20
２５４Ａ、およびＱ２７１Ｅ）。Ｓ１４９は、プロドメインの高い安定性および独立に折
り畳める能力に対して設計された。これらの特性は、絶対的ではないが、プロセッシング
酵素では非常に所望される。
【００７８】
第１に、Ｓ４ポケットを拡張するために、突然変異Ｇ１２８ＳおよびＹ１０４Ａを、Ｓ
１４９に導入した（Ｓ１６０と表される）［４８、５１］。Ｓ１４９およびＳ１６０の触
媒特性を、過渡状態の動力学的方法（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｋｉｎｅｔｉｃ
ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、２つの蛍光発生基質、すなわちｓＤＶＲＡＦ−ＡＭＣおよび
ｓＤＦＲＡＭ−ＡＭＣに対して分析した。Ｐ１位置でのＭに対するＦ以上の既存の選好性
を伴うＳ１６０における拡大されたＳ４ポケットは、ｓＤＶＲＡＦ−ＡＭＣ（Ｋｓ＝８３
30
μＭ）に対するｓＤＦＲＡＭ−ＡＭＣ（Ｋｓ＝０．８μＭ）の１００倍の選好性をもたら
した。それに比べて、Ｓ１４９は、ｓＤＶＲＡＦ−ＡＭＣ（Ｋｓ＝５μＭ）の５倍、ｓＤ
ＦＲＡＭ−ＡＭＣ（Ｋｓ＝１μＭ）が好ましい。このように、修飾されたズブチリシンは
、同種配列に対する選好性を増大するために設計されてもよい。
【００７９】
実施例３
ｐＲ８の修飾形は、その最後の４つのアミノ酸（ＡＨＡＹ）をＦＲＡＭで置き換えて構
築した（ｐＲ５８と表される）。ｐＲ５８は、約３０ｐＭのＫｉでＳ１６０を阻害する。
ＧBドメインへのｐＲ５８のＮ末端融合物は、非常に好ましいペンタペプチド基質ｓＤＦ
ＲＡＭ−ＡＭＣよりも少なくとも１ｅ５−倍のｐＭ範囲の基質親和性（Ｋｓ）でＳ１６０
40
と結合することが判明した。本質的に、プロドメイン構造は、Ｐ１およびＰ４配列シグナ
ルの増幅因子として作用する。加水分解は、強力な生産物阻害による単一のターンオーバ
ーに限定される。生産物阻害は、基質と生成物との間の構造的な類似点のため、特異的切
断を導くための高い基質親和性を使用する際には回避するのが困難である。したがって、
本発明者らは、この特性を取り除こうとはしない。後述する通り、単一のターンオーバー
反応は、このシステムをタンパク質精製に適用する際に利用できる。
【００８０】
Ｓ１６６Ｇを用いるＳ１６０の修飾されたバージョンもまた、構築された（Ｓ１９３と
表される）。この変異体は、それぞれ、Ｐ４およびＰ１アミノ酸としてＦおよびＹを好む
。
50
(20)
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【００８１】
非同種配列に関連するｐＲ５８−融合物へのＳ１６０の優先的な結合は、非常に特異的
な切断をもたらすことはない。この理由は、単一の触媒回路に対する以下の機構を考える
ことによって認識することができる：
【化２】
10
生成物ｄＰ／ｄｔの放出の速度＝ｋ2ｋ1［Ｓ］／（ｋ1［Ｓ］＋ｋ-1＋ｋ2）。
【００８２】
Ｓ１６０とｓＤＦＲＡＭ−ＡＭＣの反応では、基質解離（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆｆ
）速度（ｋ-1）は、１００ｓ
- 1
のアシル化速度（ｋ2）と比較して約１０ｓ
- 1
である。ｐ
Ｒ５８−ＧBの反応では、アシル化速度は、同様であるが、ｋ-1は、５桁小さい（１ｘ１
０
- 4
ｓ
- 1
）。速度式の分母におけるｋ2項は、いずれの場合においても、ｋ-1項より１０
倍以上大きいが、したがって、ｋ-1は、生成物形成の観察される速度に対してほとんど影
響を与えない。しかし、アシル化速度が十分に遅く、酵素と基質の間の平衡が近似される
場合、基質親和性は、ますます重要になるであろう。ｋ2を遅らせることは、触媒アミノ
20
酸（Ｓ１９０中のＤ３２）、（Ｓ１９４中のＳ２２１）およびオキシアニオンホールアミ
ノ酸（Ｓ１８８中のＮ１５５）中の突然変異を用いて達成された（図３中の表１を参照の
こと）。
【００８３】
活性部位求核部位（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）Ｓ２２１Ａにおける突然変異。
Ｓ１６０における活性部位セリン求核部位（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）の突然変異は、
１０ｐＭの親和性でｐＲ５８融合タンパク質と結合する変異体（Ｓ１９４）をもたらす。
6
Ｓ１９４は、結合の速度は速い（約１ｘ１０ Ｍ
０ｈｒ
- 1
- 1
ｓ
- 1
）が、非常にゆっくりと（＜１０
）融合タンパク質を切断する。しかし、この変異体は、切断されていない融合タ
ンパク質のアフィニティ精製のために有用である。
30
【００８４】
オキシアニオンホールにおける突然変異：Ｎ１５５Ｌ、Ｎ１５５Ｑ
遷移状態のオキシアニオンを安定させる水素結合の除去は、アシル化反応（ｋ2）の速
度を約１０００分の１に低下させる。Ｎ１５５（Ｓ１８８およびＳ１９１）変異体による
ｐＲ５８−ＧＢ融合タンパク質のプロセッシングは、遅い、単一のターンオーバー反応で
ある。切断の単一のラウンドの後、ｐＲ５８は、酵素にしっかりと結合されたままである
。前述したように、ｋ2のこの低下は、差別的な基質結合に基づく大きな程度の配列識別
をもたらす。
【００８５】
Ａｓｐ−Ｈｉｓ対における突然変異：アニオンスイッチの作成
40
特に有用なものは、Ｄ３２の突然変異であった。Ｄ３２の水素のカルボキシレートは、
触媒的なＨ６４と結合し、アシル化の間、最初に一般的な塩基、その後一般的な酸として
作用できるようになる。トリプシンにおける触媒Ａｓｐの突然変異は、中性のｐＨ周辺で
の活性の急激な減少、ただし、明らかにｐＨ １０を超えると、強く水酸化物に依存する
他の機構をもたらした［１９６、１９７］。結合ステップと、それに続く化学的に誘発さ
れる切断ステップからなる２つの段階の反応をもたらす潜在能力によって、Ｄ３２での突
然変異への集中がもたらされた。結果的に、Ｄ３２は、Ｓ１６０およびＳ１９３において
、Ａ、Ｓ、Ｖ、ＧおよびＴに突然変異した。Ｄ３２変異体の配列特異性は、ｓＦＲＡＭ−
1
ＡＭＣに対してｋｃａｔ／Ｋｍ １０Ｍ− ｓ
- 1
で極めて高い。プロ配列（ｐｒｏ−ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ）のＰ４残基がＡからＦに変異していない限り、高い特異性はまた、それが
50
(21)
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ｐＲ８−ＧBを処理するできないこと、またそれが生体内で自己処理できないことによっ
て明らかにされた。
【００８６】
融合タンパク質ｐＲ５８−ＧB切断の速度を、表２に示す。
【００８７】
【表２】
10
【００８８】
実施例４
特に好都合なものは、活性が必要に応じて誘発されるプロセッシングプロテアーゼであ
る。トリガーとして有用であるイオンは、ＯＨ−（ｐＨ）、Ｃｌ−、およびＦ−である。
これらの表は、特異的なアニオンの機能としての様々なＤ３２変異体の切断速度をまとめ
て示す。
【００８９】
【表３】
20
【００９０】
【表４】
30
【００９１】
【表５】
40
【００９２】
図４に示す通り、活性化の速度は、イオンの濃度と比例する。したがって、Ｓ１８９は
、必要に応じて切断速度を増大させるトリガーであり得、精製プロセスに必要とされる場
合、これは非常に好都合であり得る。一旦、融合タンパク質が、ズブチリシン変異体に結
50
(22)
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合されて、結合複合体が形成されると、標的タンパク質は、活性化イオン溶液の導入を用
いるズブチリシン変異体の活性化によって、プロドメインタンパク質から切断することが
できる。
【００９３】
実施例５
プロドメインの切り詰め
ズブチリシンのプロドメインは、プロセッシングプロテアーゼとの最適化された結合の
ために選択されたかなり短い同種配列で置き換えることができる。プロドメインのＣ末端
部分のみのバリエーションを含むアミノ酸（Ｅ Ｅ Ｄ Ｋ Ｌ（Ｆ／Ｙ）Ｑ Ｓ（Ｍ／
Ｌ／Ｙ）を、同種配列として使用できる。例えば、一旦、９アミノ酸のＣ末端尾部が加え
10
られると、ズブチリシンに対する天然の親和性を持たない、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｃｏｃｃａｌ）プロテインＧのＩｇＧ結合ドメインが、マイクロモル以下の解離定数でＳ
１９４に結合することが示されている。
【００９４】
実施例６
アフィニティ精製およびプロセッシングのためのプロセッシングズブチリシンの固定
プロセッシングズブチリシンの結合および触媒特性によって、それらが、ｐＲ５８配列
を用いて標識されるタンパク質の精製のためのアフィニティーマトリックスおよびプロセ
ッシングプロテアーゼとして使用できるようになる。この点を実証するために、Ｓ１８９
は、クロマトグラフィ樹脂上に固定された。
20
【００９５】
ｐＲ５８−ＧBを含有する大腸菌細胞溶解物を、固定されたＳ１８９を含有するマトリ
ックスに通過させた。融合タンパク質は、Ｓ１８９マトリックスと速やかに結合したのに
対して、不純物は、図５に示す通りのマトリックスを通して洗浄された。結合した融合タ
ンパク質の切断は、誘発アニオン（例えば１０ｍＭ ＫＦ）の付加によって、あるいは図
６に示す通りの長時間インキュベーション（例えばｐＨ ７．２で１８時間）によって、
その後実施された。切断後、純粋な、プロセッシングされたタンパク質が、マトリックス
から洗浄されるのに対して、同種のプロドメインは、マトリックス上のズブチリシンにし
っかりと結合されたままである。複数のラウンドの精製は、ｐＨ ２．１でＳ１８９カラ
ムからｐＲ５８を取り除き、中性のｐＨでカラムを再平衡化させることによって、行うこ
とができる。プロセッシングズブチリシン（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉ
ｎ）の表１（図３）中に列挙したものなどの安定性が高く容易に折り畳まれる変異体が、
カラム再循環のために必要とされる。
【００９６】
ズブチリシンＳ１８９またはＳ１９０と、融合タンパク質を複合体形成させることによ
って、以下を含めた、ｐＲ５８および標的タンパク質を含む８つの異なる融合タンパク質
が、精製され、好収率で回収された。
【００９７】
30
(23)
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【表６】
10
【００９８】
図７に示す通り、連鎖球菌プロテインＧBドメインに連結されたｐＲ５８（ｐＲ８ＦＲ
ＡＭ）を含む融合タンパク質を、Ｓ１８９とＳ１９０の両方が固定された床上で、複合体
形成させ、分離させた。レーン３および４は、異なる分子量の複数の成分が、このシステ
ムを介して洗浄されることを示す。十分なインキュベーション期間の後は、放出（ｏｕｔ
ｐｕｔ）の画分はプロテインＧに限定され、レーン１０で同定されるプロテインＧの分子
量に対する、レーン５、６、７、および８に示される分子量画分によって表される。
20
【００９９】
βサブユニットウシトランスデューシン（３５０ａａ）の精製の結果は、図８に示され
る。標的タンパク質は、レーン４∼９に示される溶離による徴候として、ズブチリシンＳ
１８９の活性によって、プロドメインタンパク質と標的タンパク質との間の結合を切断す
るのに十分な時間の後、カラムから溶出される。
【０１００】
ＣＤＣ６（３７９ａａ）の精製の結果は、図９に示される。好熱性メタン生成古細菌（
Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＣＤＣ６に連結されたｐＲ５８（ｐＲ８Ｆ
ＲＡＭ）を含む融合タンパク質を、Ｓ１８９が固定された床上で複合体形成させ、分離さ
せた。レーン２は、異なる分子量の複数の成分が、分離の期間の初期にこのシステムを介
30
して洗浄されることを示す。十分なインキュベーション期間の後は、レーン４∼８に示さ
れる分子量画分によって証明される通り、放出の画分は、ＣＤＣ６に限定される。
【０１０１】
図１０ＡおよびＢは、Ｓ１８９ＡＬ＿１０カラム上で精製され、そこから回収される、
（ａ）プロテインＧ３１１および（ｂ）プロテインＡ２１９の
1 5
Ｎ ＨＳＱＣスペクトル
を示す。２つのタンパク質は、配列において、５９％同一であるが、異なるタンパク質折
り畳みを示す。
【０１０２】
実施例７
さらなる精製実験は、ｐＲ５８（ｐＲ８ＦＲＡＭ）に連結された５６アミノ酸の連鎖球
40
菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＧBドメイン上で行われた。そこでは、６
７１融合タンパク質（ｐＲ５８ＦＫＡＭ−ＧB）が精製され、０．１Ｍ ＫＦの連続注入
によって、Ｓ１８９ ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳカラム上で分離され、変異体ズブチリシンが
フッ化物イオンにより誘発された場合の、標的タンパク質の放出の有効性が実証された。
図１１は、融合タンパク質が、通常の手順の通りに結合され、洗浄された場合の結果を示
す。図１２は、フッ化物イオンが、結合された融合タンパク質と接触して、標的タンパク
質を放出し、その結果、それがカラムから洗い落とされ、それが濃縮されるので、０．１
ｍｌ／ｍｉｎで注入された１００ｍＭフッ化カリウムの付加が、迅速な切断を引き起こす
ことを示す。図１３は、通常の手順の通りの０．１Ｍ Ｈ3ＰＯ4中のカラムからのプロド
メイン（ｐＲ５８）の除去を示す。これらの結果は、標的タンパク質の放出を、変異体ズ
50
(24)
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ブチリシンのプロテアーゼ活性を誘発するためのトリガー（ＯＨ−（ｐＨ）、Ｃｌ−、お
よびＦ）としてのある種のイオンの使用によって調整できることを示す。
【０１０３】
図１４は、Ｓ１８９が固定された床上での連鎖球菌プロテインＧBドメインに連結され
るｐＲ５８（ｐＲ８ＦＲＡＭ）を含む融合タンパク質の分離を示す。レーン１は、分子量
標準である。レーン２および４は、このシステムを介して洗浄される通りの、異なる分子
量の多数の成分を示す。０．１Ｍ ＫＦの付加の後は、放出の画分は、レーン５および６
に示される分子量画分によって表される、プロテインＧBに限定される。
【０１０４】
参考文献
10
ここで引用されたすべての参考文献は、あらゆる目的のために参照として本明細書に組
み入れられる。
1. Neet KE, Koshland DE, Jr.: The conversion of serine at the active site of sub
tilisin to cysteine: a "chemical mutation". Proc Natl Acad Sci U S A 1966, 56:16
06-1611.
2. Polgar L, Bender ML: The reactivity of thiol-subtilisin, an enzyme containing
a synthetic functional group. Biochemistry 1967, 6:610-620.
3. Philipp M, Tsai IH, Bender ML: Comparison of the kinetic specificity of subti
lisin and thiolsubtilisin toward n-alkyl p-nitrophenyl esters. Biochemistry 1979
20
, 18:3769-3773
4. Philipp M, Bender ML: Kinetics of subtilisin and thiolsubtilisin. Mol Cell Bi
ochem 1983, 51:5-32.
5. Nakatsuka T, Sasaki T, Kaiser ET: Peptide segment coupling catalyzed by the s
emisynthetic enzyme thiolsubtilisin. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109:3808-3810.
6. Kullman W: Enzymatic Peptide Synthesis. Boca Raton, FL: CRC Press; 1987.
7. Wong CH: Enzymatic catalysts in organic synthesis. Science 1989, 244:1145-115
2.
8. Wong CH, Shen GJ, Pederson RL, Wang YF, Hennen WJ: Enzymatic catalysis in org
anic synthesis. Methods Enzymol 1991, 202:591-620.
30
9. Wells JA, Ferrari E, Henner DJ, Estell DA, Chen EY: Cloning, sequencing and s
ecretion of Bacillus amyloliquifaciens Subtilisin in Bacillus Subtilis. Nucleic
Acids Res. 1983, 11:7911-7925.
10. Vasantha N, Thompson LD, Rhodes C, Banner C, Nagle J, Filpula D: Genes for a
lkaline and neutral protease from Bacillus amyloliquifaciens contain a large ope
n-reading frame between the regions coding for signal sequence and mature protei
n. J. Bacteriol. 1984, 159:811-819.
11. Jacobs M, Eliason M, Uhlen M, Flock J: Cloning, sequencing and expression of
subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis. Nucleic Acids Res. 1985, 13:8
913-8926.
40
12. Estell DA, Graycar TP, Wells JA: Engineering an enzyme by site-directed muta
genesis to be resistant to chemical oxidation. J. Biol. Chem. 1985, 260:6518-652
1.
13. Bryan PN, Rollence ML, Pantoliano MW, Wood J, Finzel BC, Gilliland GL, Howar
d AJ, Poulos TL: Proteases of enhanced stability: characterization of a thermost
able variant of subtilisin. Proteins: Str. Funct. Gen. 1986, 1:326-334.
14. Wells JA, Powers DB: In vivo formation and stability of engineered disulfide
bonds in subtilisin. J. of Biol. Chem. 1986, 261:6564-6570.
15. Thomas PG, Russell AJ, Fersht AR: Tailoring the pH dependence of enzyme cata
lysis using protein engineering. Nature 1985, 318:375-376.
50
(25)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
16. Wells JA, Cunningham BC, Graycar TP, Estell DA: Importance of hydrogen-bond
formation in stabilizing the transition state of Subtilisin. Phil. Trans. R. Soc
. Lond. 1986, 317:415-423.
17. Bryan P, Pantoliano MW, Quill SG, Hsiao HY, Poulos T: Site-directed mutagene
sis and the role of the oxyanion hole in subtilisin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1986, 83:3743-3745.
18. Estell DA, Graycar TP, Miller JV, Powers DB, Burnier JP, Ng PG, Wells JA: Pr
obing steric and hydrophobic effects on enzyme-substrate interactions by protein
engineering. Science 1986, 233:659-663.
19. Carter P, Wells JA: Dissecting the catalytic triad of a serine protease. Nat
10
ure 1988, 332:564-568.
20. Sternberg MJ, Hayes FR, Russell AJ, Thomas PG, Fersht AR: Prediction of elec
trostatic effects of engineering of protein charges. Nature 1987, 330:86-88.
21. Mizushima N, Spellmeyer D, Hirono S, Pearlman D, Kollman P: Free energy pert
urbation calculations on binding and catalysis after mutating threonine 220 in s
ubtilisin. J Biol Chem 1991, 266:11801-11809.
22. Braxton S, Wells JA: The importance of a distal hydrogen bonding group in st
abilizing the transition state in subtilisin BPN'. J Biol Chem 1991, 266:11797-1
1800.
23. Neet KE, Nanci A, Koshland DE, Jr.: Properties of thiol-subtilisin. The cons
20
equences of converting the active serine residue to cysteine in a serine proteas
e. J Biol Chem 1968, 243:6392-6401.
24. Polgar L, Bender ML: Chromatography and activity of thiol-subtilisin. Bioche
mistry 1969, 8:136-141.
25. Rao SN, Singh UC, Bash PA, Kollman PA: Free energy perturbation calculations
on binding and catalysis after mutating Asn 155 in subtilisin. Nature 1987, 328
:551-554.
26. Carter P, Wells JA: Functional interaction among catalytic residues in Subti
lisin BPN'. Proteins:
Str., Funct., and Gen. 1990, 7:335-342.
27. Davis BG, Shang X, DeSantis G, Bott RR, Jones JB: The controlled introductio
30
n of multiple negative charge at single amino acid sites in subtilisin Bacillus
lentus [In Process Citation]. Bioorg Med Chem 1999, 7:2293-2301.
28. Russell AJ, Fersht AR: Rational modification of enzyme catalysis by engineer
ing surface charge. Nature 1987, 328:496-500.
29. Russell AJ, Thomas PG, Fersht AR: Electrostatic effects on modification of c
harged groups in the active site cleft of subtilisin by protein engineering. J M
ol Biol 1987, 193:803-813.
30. O'Connell T P, Day RM, Torchilin EV, Bachovchin WW, Malthouse JG: A 13C-NMR
study of the role of Asn-155 in stabilizing the oxyanion of a subtilisin tetrahe
dral adduct. Biochem J 1997, 326:861-866.
40
31. Wangikar PP, Rich JO, Clark DS, Dordick JS: Probing enzymic transition state
hydrophobicities. Biochemistry 1995, 34:12302-12310.
32. Dinakarpandian D, Shenoy BC, Hilvert D, McRee DE, McTigue M, Carey PR: Elect
ric fields in active sites: substrate switching from null to strong fields in th
iol- and selenol-subtilisins. Biochemistry 1999, 38:6659-6667.
33. Whiting AK, Peticolas WL: Details of the acyl-enzyme intermediate and the ox
yanion hole in serine protease catalysis. Biochemistry 1994, 33:552-561.
34. Tonge PJ, Carey PR: Length of the acyl carbonyl bond in acyl-serine protease
s correlates with reactivity. Biochemistry 1990, 29:10723-10727.
35. Wells JA: Additivity of mutational effects in proteins. Biochemistry 1990, 2
50
(26)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
9:8509-8517.
36. Leis JP, Cameron CE: Engineering proteases with altered specificity. Curr Op
in Biotechnol 1994, 5:403-408.
37. Ballinger MD, Tom J, Wells JA: Designing subtilisin BPN' to cleave substrate
s containing dibasic residues. Biochemistry 1995, 34:13312-13319.
38. Ballinger MD, Tom J, Wells JA: Furilisin: a variant of subtilisin BPN' engin
eered for cleaving tribasic substrates. Biochemistry 1996, 35:13579-13585.
39. Carter P, Wells JA: Engineering enzyme specificity by "substrate-assisted ca
talysis". Science 1987, 237:394-399.
40. Carter P, Nilsson B, Burnier JP, Burdick D, Wells JA: Engineering Subtilisin
BPN' for site-specific proteolysis. Proteins:
10
Str., Funct., and Gen. 1989, 6:2
40-248.
41. Carter P, Abrahmsen L, Wells JA: Probing the mechanism and improving the rat
e of substrate-assisted catalysis in Subtilisin BPN'. Biochemistry 1991, 30:6141
-6148.
42. Wells JA, Powers DB, Bott RR, Graycar TP, Estell DA: Designing substrate spe
cificity by protein engineering of electrostatic interactions. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1987, 84:1219-1223.
43. Wells JA, Cunningham BC, Graycar TP, Estell DA: Recruitment of substrate-spe
cificity properties from one enzyme into a related one by protein engineering. P
20
roc Natl Acad Sci U S A 1987, 84:5167-5171.
44. Bech LM, Sorensen SB, Breddam K: Mutational replacements in subtilisin 309.
Val104 has a modulating effect on the P4 substrate preference. Eur J Biochem 199
2, 209:869-874.
45. Bech LM, Sorensen SB, Breddam K: Significance of hydrophobic S4-P4 interacti
ons in subtilisin 309 from Bacillus lentus. Biochemistry 1993, 32:2845-2852.
46. Gron H, Breddam K: Interdependency of the binding subsites in subtilisin. Bi
ochemistry 1992, 31:8967-8971.
47. Gron H, Meldal M, Breddam K: Extensive comparison of the substrate preferenc
es of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on t
30
he principle of intramolecular quenching. Biochemistry 1992, 31:6011-6018.
48. Gron H, Bech LM, Sorensen SB, Meldal M, Breddam K: Studies of binding sites
in the subtilisin from Bacillus lentus by means of site directed mutagenesis and
kinetic investigations. Adv Exp Med Biol 1996, 379:105-112.
49. Sorensen SB, Bech LM, Meldal M, Breddam K: Mutational replacements of the am
ino acid residues forming the hydrophobic S4 binding pocket of subtilisin 309 fr
om Bacillus lentus. Biochemistry 1993, 32:8994-8999.
50. Rheinnecker M, Baker G, Eder J, Fersht AR: Engineering a novel specificity i
n subtilisin BPN'. Biochemistry 1993, 32:1199-1203.
51. Rheinnecker M, Eder J, Pandey PS, Fersht AR: Variants of subtilisin BPN' wit
40
h altered specificity profiles. Biochemistry 1994, 33:221-225.
52. Mei HC, Liaw YC, Li YC, Wang DC, Takagi H, Tsai YC: Engineering subtilisin Y
aB: restriction of substrate specificity by the substitution of Gly124 and Gly15
1 with Ala. Protein Eng 1998, 11:109-117.
53. Takagi H: [Protein engineering of subtilisin]. Tanpakushitsu Kakusan Koso 19
92, 37:303-313.
54. Takagi H, Maeda T, Ohtsu I, Tsai YC, Nakamori S: Restriction of substrate sp
ecificity of subtilisin E by introduction of a side chain into a conserved glyci
ne residue. FEBS Lett 1996, 395:127-132.
55. Takagi H, Yamamoto M, Ohtsu I, Nakamori S: Random mutagenesis into the conse
50
(27)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
rved Gly154 of subtilisin E: isolation and characterization of the revertant enz
ymes. Protein Eng 1998, 11:1205-1210.
56. Tanaka T, Matsuzawa H, Kojima S, Kumagai I, Miura K, Ohta T: P1 specificity
of aqualysin I (a subtilisin-type serine protease) from Thermus aquaticus YT-1,
using P1-substituted derivatives of Streptomyces subtilisin inhibitor. Biosci Bi
otechnol Biochem 1998, 62:2035-2038.
57. Tanaka T, Matsuzawa H, Ohta T: Engineering of S2 site of aqualysin I; altera
tion of P2 specificity by excluding P2 side chain. Biochemistry 1998, 37:17402-1
7407.
58. Tanaka T, Matsuzawa H, Ohta T: Identification and designing of the S3 site o
10
f aqualysin I, a thermophilic subtilisin-related serine protease. J Biochem (Tok
yo) 1999, 125:1016-1021.
59. DeSantis G, Berglund P, Stabile MR, Gold M, Jones JB: Site-directed mutagene
sis combined with chemical modification as a strategy for altering the specifici
ty of the S1 and S1' pockets of subtilisin Bacillus lentus. Biochemistry 1998, 3
7:5968-5973.
60. DeSantis G, Shang X, Jones JB: Toward tailoring the specificity of the S1 po
cket of subtilisin B. lentus: chemical modification of mutant enzymes as a strat
egy for removing specificity limitations. Biochemistry 1999, 38:13391-13397.
61. DeSantis G, Jones JB: Probing the altered specificity and catalytic properti
20
es of mutant subtilisin chemically modified at position S156C and S166C in the S
1 pocket. Bioorg Med Chem 1999, 7:1381-1387.
62. Lu W, Apostol I, Qasim MA, Warne N, Wynn R, Zhang WL, Anderson S, Chiang YW,
Ogin E, Rothberg I, et al.: Binding of amino acid side-chains to S1 cavities of
serine proteinases. J Mol Biol 1997, 266:441-461.
63. Masuda-Momma K, Shimakawa T, Inouye K, Hiromi K, Kojima S, Kumagai I, Miura
K, Tonomura B: Identification of amino acid residues responsible for the changes
of absorption and fluorescence spectra on the binding of subtilisin BPN' and St
reptomyces subtilisin inhibitor. J Biochem (Tokyo) 1993, 114:906-911.
64. Masuda-Momma K, Hatanaka T, Inouye K, Kanaori K, Tamura A, Akasaka K, Kojima
30
S, Kumagai I, Miura K, Tonomura B: Interaction of subtilisin BPN' and recombina
nt Streptomyces subtilisin inhibitors with substituted P1 site residues. J Bioch
em (Tokyo) 1993, 114:553-559.
65. Teplyakov AV, van der Laan JM, Lammers AA, Kelders H, Kalk KH, Misset O, Mul
leners LJ, Dijkstra BW: Protein engineering of the high-alkaline serine protease
PB92 from Bacillus alcalophilus: functional and structural consequences of muta
tion at the S4 substrate binding pocket. Protein Eng 1992, 5:413-420.
66. Abrahmsen L, Tom J, Burnier J, Butcher KA, Kosiakoff A, Wells JA: Engineerin
g Subtilisin and its substrates for efficient ligation of peptide bonds in aqueo
us solution. Biochemistry 1991, 30:4151-4159.
40
67. Atwell S, Wells JA: Selection for improved subtiligases by phage display. Pr
oc Natl Acad Sci U S A 1999, 96:9497-9502.
68. Kidd RD, Sears P, Huang DH, Witte K, Wong CH, Farber GK: Breaking the low ba
rrier hydrogen bond in a serine protease. Protein Sci 1999, 8:410-417.
69. Sears P, Schuster M, Wang P, Witte K, Wong C-H: Engineering subtilisin for p
eptide coupling:
Studies on the effects of counterions and site-specific modifi
cations on the stability and specificity of the enzyme. J. Am. Chem. Soc. 1994,
116:6521-6530.
70. Zhao H, Li Y, Arnold FH: Strategy for the directed evolution of a peptide li
gase. Ann N Y Acad Sci 1996, 799:1-5.
50
(28)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
71. Plettner E, DeSantis G, Stabile MR, Jones JB: Modulation of esterase and ami
dase activity of subtilisin Bacillus lentus by chemical modification of cysteine
mutants. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121:4977-4981.
72. Bell IM, Hilvert D: Peroxide dependence of the semisynthetic enzyme selenosu
btilisin. Biochemistry 1993, 32:13969-13973.
73. Bell IM, Fisher ML, Wu ZP, Hilvert D: Kinetic studies on the peroxidase acti
vity of selenosubtilisin [published erratum appears in Biochemistry 1993 Aug 31;
32(34):8980]. Biochemistry 1993, 32:3754-3762.
74. Peterson EB, Hilvert D: Nonessential active site residues modulate selenosub
tilisin's kinetic mechanism. Biochemistry 1995, 34:6616-6620.
10
75. Syed R, Wu ZP, Hogle JM, Hilvert D: Crystal structure of selenosubtilisin at
2.0-A resolution. Biochemistry 1993, 32:6157-6164.
76. Haring D, Schreier P: Chemical engineering of enzymes: altered catalytic act
ivity, predictable selectivity and exceptional stability of the semisynthetic pe
roxidase seleno-subtilisin. Naturwissenschaften 1999, 86:307-312.
77. Haring D, Schreier P: From detergent additive to semisynthetic peroxidase-si
mplified and up- scaled synthesis of seleno-subtilisin. Biotechnol Bioeng 1998,
59:786-791.
78. Haring D, Hubert B, Schuler E, Schreier P: Reasoning enantioselectivity and
kinetics of seleno-subtilisin from the subtilisin template. Arch Biochem Biophys
20
1998, 354:263-269.
79. Haring D, Schuler E, Waldemar A, Saha-Moller CR, Schreier P: Semisynthetic e
nzymes in asymetric synthesis:
Enantioselective reduction of racemic hydroperox
ides catalyzed by seleno-subtilisin. J. Org. Chem. 1999, 64:832-835.
80. Graycar T, Knapp M, Ganshaw G, Dauberman J, Bott R: Engineered Bacillus lent
us subtilisins having altered flexibility. J Mol Biol 1999, 292:97-109.
81. Kano H, Taguchi S, Momose H: Cold adaptation of a mesophilic serine protease
, subtilisin, by in vitro random mutagenesis. Appl Microbiol Biotechnol 1997, 47
:46-51.
82. Taguchi S, Ozaki A, Momose H: Engineering of a cold-adapted protease by sequ
30
ential random mutagenesis and a screening system. Appl Environ Microbiol 1998, 6
4:492-495.
83. Taguchi S, Ozaki A, Nonaka T, Mitsui Y, Momose H: A cold-adapted protease en
gineered by experimental evolution system. J Biochem (Tokyo) 1999, 126:689-693.
84. Takagi H, Ohtsu I, Nakamori S: Construction of novel subtilisin E with high
specificity, activity and productivity through multiple amino acid substitutions
. Protein Eng 1997, 10:985-989.
85. Takagi H, Morinaga Y, Ikemura H, Inouye M: Mutant subtilisin E with enhanced
protease activity obtained by site- directed mutagenesis. J Biol Chem 1988, 263
:19592-19596.
40
86. Fagain CO: Understanding and increasing protein stability. Biochim Biophys A
cta 1995, 1252:1-14.
87. Braxton SB, Wells JA: Incorporation of a stabilizing Ca-binding loop into su
btilisin BPN'. Biochemistry 1992, 31:7796-7801.
88. Cunningham BC, Wells JA: Improvement in the alkaline stability of subtilisin
using an efficient random mutagenesis and screening procedure. Protein Engineer
ing 1987, 1:319-325.
89. Mitchinson C, Wells JA: Protein engineering of disulfide bonds in subtilisin
BPN'. Biochemistry 1989, 28:4807-4815.
90. Bryan PN, Rollence ML, Wood J, Quill S, Dodd S, Whitlow M, Hardman K, Pantol
50
(29)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
iano MW: Engineering a stable protease. In Biotechnology Research and Applicatio
ns. Edited by Gavora J, Gerson DF, Luong J, Storer A, Woodley JH: Elsevier Appli
ed Science Publishers, Ltd.; 1988:57-67.
91. Bryan PN, Pantoliano MP: Combining mutations for the stabilization of subtil
isin. US Patent 1988, 4,990,452.
92. Bryan PN: Engineering dramatic increases in the stability of subtilisin. In
Pharmaceutical Biotechnology. Edited by Ahern TJ, Manning MC: Plenum Press; 1992
:147-181. [Botchard RT (Series Editor): Stability of protein pharmaceuticals, vo
l Part B.]
93. Bryan PN: Site-directed mutagenesis to study protein folding and stability.
10
In Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Edited by Shirley BA: Hum
ana Press, Inc.; 1995:271-289. Method in Molecular Biology, vol 40.]
94. Pantoliano MW, Ladner RC, Bryan PN, Rollence ML, Wood JF, Poulos TL: Protein
engineering of Subtilisin BPN': stabilization through the introduction of two c
ysteines to from a disulfide bond. Biochemistry 1987, 26:2077-2082.
95. Pantoliano MW, Whitlow M, Wood JF, Rollence ML, Finzel BC, Gilliland G, Poul
os TL, Bryan PN: The engineering of binding affinity at metal ion binding sites
for the stabilization of proteins: Subtilisin as a test case. Biochemistry 1988,
27:8311-8317.
96. Pantoliano MW, Whitlow M, Wood JF, Dodd SW, Hardman KD, Rollence ML, Bryan P
20
N: Large increases in general stability for Subtilisin BPN' through incremental
changes in the free energy of unfolding. Biochemistry 1989, 28:7205-7213.
97. Rollence ML, Filpula D, Pantoliano MW, Bryan PN: Engineering thermostability
in Subtilisin BPN' by in vitro mutagenesis. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1988, 8:
217-224.
98. Zhao H, Arnold FH: Functional and nonfunctional mutations distinguished by r
andom recombination of homologous genes. Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94:79978000.
99. Miyazaki K, Arnold FH: Exploring nonnatural evolutionary pathways by saturat
ion mutagenesis: rapid improvement of protein function. J Mol Evol 1999, 49:716-
30
720.
100. Zhao H, Arnold FH: Directed evolution converts subtilisin E into a function
al equivalent
of thermitase. Protein Eng 1999, 12:47-53.
101. Chu NM, Chao Y, Bi RC: The 2 A crystal structure of subtilisin E with PMSF
inhibitor. Protein Eng 1995, 8:211-215.
102. Erwin CR, Barnett BL, Oliver JD, Sullivan JF: Effects of engineered salt br
idges on the stability of subtilisin BPN'. Protein Eng 1990, 4:87-97.
103. Keough TW, Sun Y, Barnett BL, Lacey MP, Bauer MD, Wang ES, Erwin CR: Rapid
analysis of single-cysteine variants of recombinant proteins. Methods Mol Biol 1
40
996, 61:171-183.
104. Goddette DW, Christianson T, Ladin BF, Lau M, Mielenz JR, Paech C, Reynolds
RB, Yang SS, Wilson CR: Strategy and implementation of a system for protein eng
ineering. J Biotechnol 1993, 28:41-54.
105. Paech C, Goddette DW, Christianson T, Wilson CR: Unusual ligand binding at
the active site domain of an engineered mutant of subtilisin BL. Adv Exp Med Bio
l 1996, 379:257-268.
106. Heringa J, Argos P, Egmond MR, de Vlieg J: Increasing thermal stability of
subtilisin from mutations suggested by strongly interacting side-chain clusters.
Protein Eng 1995, 8:21-30.
50
(30)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
107. Bae KH, Jang JS, Park KS, Lee SH, Byun SM: Improvement of thermal stability
of subtilisin J by changing the primary autolysis site. Biochem Biophys Res Com
mun 1995, 207:20-24.
108. Jang JS, Bae KH, Byun SM: Effect of the weak Ca(2+)-binding site of subtili
sin J by site-directed mutagenesis on heat stability. Biochem Biophys Res Commun
1992, 188:184-189.
109. Jang JS, Park DK, Chun M, Byun SM: Identification of autoproteolytic cleava
ge site in the Asp-49 mutant subtilisin J by site-directed mutagenesis. Biochim
Biophys Acta 1993, 1162:233-235.
110. Narhi LO, Stabinsky Y, Levitt M, Miller L, Sachdev R, Finley S, Park S, Kol
10
venbach C, Arakawa T, Zukowski M: Enhanced stability of subtilisin by three poin
t mutations. Biotechnol Appl Biochem 1991, 13:12-24.
111. Sattler A, Kanka S, Maurer KH, Riesner D: Thermostable variants of subtilis
in selected by temperature-gradient gel electrophoresis. Electrophoresis 1996, 1
7:784-792.
112. Kidd RD, Yennawar HP, Sears P, Wong C-H, Farber GK: A weak calcium binding
site in subtilisin BPN' has a dramatic effect on protein stability. J. Am. Chem.
Soc. 1996, 118:1645-1650.
113. Takagi H, Takahashi T, Momose H, Inouye M, Maeda Y, Matsuzawa H, Ohta T: En
hancement of the thermostability of subtilisin E by introduction of a disulfide
20
bond engineered on the basis of structural comparison with a thermophilic serine
protease. J
Biol Chem 1990, 265:6874-6878.
114. Tange T, Taguchi S, Kojima S, Miura K, Momose H: Improvement of a useful en
zyme (subtilisin BPN') by an experimental evolution system. Appl Microbiol Biote
chnol 1994, 41:239-244.
115. Takagi H, Morinaga Y, Ikemura H, Inouye M: The role of Pro-239 in the catal
ysis and heat stability of subtilisin E. J Biochem (Tokyo) 1989, 105:953-956.
116. Zhu L, Ji Y: Protein engineering on subtilisin E. Chin J Biotechnol 1997, 1
3:9-15.
30
117. Sowdhamini R, Srinivasan N, Shoichet B, Santi DV, Ramakrishnan C, Balaram P
: Stereochemical modeling of disulfide bridges. Criteria for introduction into p
roteins by site-directed mutagenesis. Protein Eng 1989, 3:95-103.
118. Narinx E, Baise E, Gerday C: Subtilisin from psychrophilic antarctic bacter
ia:
characterization and site-directed mutagenesis of residues possibly involved in
the adaptation to cold. Protein Eng 1997, 10:1271-1279.
119. Pantoliano MW: Proteins designed for challenging environments and catalysis
in organic solvents. Curr Opin Struct Biol 1992, 2:559-568.
120. Gron H, Bech LM, Branner S, Breddam K: A highly active and oxidation-resist
40
ant subtilisin-like enzyme produced by a combination of site-directed mutagenesi
s and chemical modification. Eur J Biochem 1990, 194:897-901.
121. Strausberg S, Alexander P, Gallagher DT, Gilliland G, Barnett BL, Bryan P:
Directed evolution of a subtilisin with calcium-independent stability. Bio/techn
ology 1995, 13:669-673.
122. Wong C-H, Chen S-T, Hennen WJ, Bibbs JA, Wang Y-F, Liu JL-C, Pantoliano MW,
Whitlow M, Bryan PN: Enzymes in organic synthesis: Use of Subtilisin and a high
ly stable mutant derived from multiple site-specific mutations. J. Am. Chem. Soc
. 1990, 112:945-953.
123. Chen K, Arnold FH: Tuning the activity of an enzyme for unusual environment
50
(31)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
s: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformam
ide. Proc Natl Acad Sci U S A 1993, 90:5618-5622.
124. von der Osten C, Branner S, Hastrup S, Hedegaard L, Rasmussen MD, Bisgard-F
rantzen H, Carlsen S, Mikkelsen JM: Protein engineering of subtilisins to improv
e stability in detergent formulations. J Biotechnol 1993, 28:55-68.
125. Brode PF, 3rd, Erwin CR, Rauch DS, Lucas DS, Rubingh DN: Enzyme behavior at
surfaces. Site-specific variants of subtilisin BPN' with enhanced surface stabi
lity. J Biol Chem 1994, 269:23538-23543.
126. Brode PF, 3rd, Erwin CR, Rauch DS, Barnett BL, Armpriester JM, Wang ES, Rub
ingh DN: Subtilisin BPN' variants: increased hydrolytic activity on surface- bou
10
nd substrates via decreased surface activity. Biochemistry 1996, 35:3162-3169.
127. Egmond MR, Antheunisse WP, van Bemmel CJ, Ravestein P, de Vlieg J, Peters H
, Branner S: Engineering surface charges in a subtilisin: the effects on electro
phoretic and ion-exchange behaviour. Protein Eng 1994, 7:793-800.
128. Huang W, Wang J, Bhattacharyya D, Bachas LG: Improving the activity of immo
bilized subtilisin by site-specific attachment to surfaces. Anal Chem 1997, 69:4
601-4607.
129. Bryan P, Alexander P, Strausberg S, Schwarz F, Wang L, Gilliland G, Gallagh
er DT: Energetics of folding subtilisin BPN'. Biochemistry 1992, 31:4937-4945.
130. Bryan P, Wang L, Hoskins J, Ruvinov S, Strausberg S, Alexander P, Almog O,
20
Gilliland G, Gallagher TD: Catalysis of a protein folding reaction: Mechanistic
implications of the 2.0A structure of the subtilisin-prodomain complex. Biochemi
stry 1995, 34:10310-10318.
131. Bryan PN: Subtilisin Engineered for facile folding: Analysis of uncatalyzed
and prodomain-catalyzed folding. In Intramolecular chaperones and protein foldi
ng. Edited by Shinde U, Inouye M: R. G. Landes; 1995:85-112.
132. Gallagher TD, Bryan P, Gilliland G: Calcium-free subtilisin by design. Prot
eins: Str. Funct. Gen. 1993, 16:205-213.
133. Gallagher TD, Gilliland G, Wang L, Bryan P: The prosegment-subtilisin BPN'
complex: crystal structure of a specific foldase. Structure 1995, 3:907-914.
30
134. Gallagher TD, Gilliland G, Bryan P: Crystal structure analysis of subtilisi
n BPN' mutants engineered for studying thermal stability. Edited by Bott R, Betz
el C. New York: Plenum Press; 1996.
135. Ruan B, Hoskins J, Wang L, Bryan PN: Stabilizing the subtilisin BPN' prodom
ain by phage display selection: how restrictive is the amino acid code for maxim
um protein stability? [In Process Citation]. Protein Sci 1998, 7:2345-2353.
136. Ruan B, Hoskins J, Bryan PN: Rapid Folding of Calcium-Free Subtilisin by a
Stabilized Prodomain Mutant. Biochemistry 1999, 38:8562-8571.
137. Ruvinov S, Wang L, Ruan B, Almog O, Gilliland G, Eisenstein E, Bryan P: Eng
ineering the independent folding of the subtilisin BPN' prodomain:
Analysis of
40
two-state folding vs. protein stability. Biochemistry 1997, 36:10414-10421.
138. Strausberg S, Alexander P, Wang L, Schwarz F, Bryan P: Catalysis of a prote
in folding reaction:
Thermodynamic and kinetic analysis of subtilisin BPN' inte
ractions with its propeptide fragment. Biochemistry 1993, 32:8112-8119.
139. Strausberg S, Alexander P, Wang L, Gallagher DT, Gilliland G, Bryan P: An e
ngineered disulfide crosslink accelerates the refolding rate of calcium-free sub
tilisin by 850-fold. Biochemistry 1993, 32:10371-10377.
140. Wang L, Ruvinov S, Strausberg S, Gallagher TD, Gilliland G, Bryan P: Prodom
ain mutations at the subtilisin interface: Correlation of binding energy and the
rate of catalyzed folding. Biochemistry 1995:15,415-415,420.
50
(32)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
141. Wang L, Ruan B, Ruvinov S, Bryan PN: Engineering the independent folding of
the subtilisin BPN' prodomain: correlation of prodomain stability with the rate
of subtilisin folding. Biochemistry 1998, 37:3165-3171.
142. Eder J, Rheinnecker M, Fersht AR: Folding of subtilisin BPN': Characterizat
ion of a folding intermediate. Biochemistry 1993, 32:18-26.
143. Eder J, Rheinnecker M, Fersht AR: Folding of subtilisin BPN': Role of the p
ro-sequence. J. Mol. Biol. 1993, 233:293-304.
144. Kobayashi T, Inouye M: Functional analysis of the intramolecular chaperone.
Mutational hot spots in the subtilisin pro-peptide and a second-site suppressor
mutation within the subtilisin molecule. J Mol Biol 1992, 226:931-933.
10
145. Hu Z, Zhu X, Jordan F, Inouye M: A covalently trapped folding intermediate
of subtilisin E: spontaneous dimerization of a prosubtilisin E Ser49Cys mutant i
n vivo and its autoprocessing in vitro. Biochemistry 1994, 33:562-569.
146. Li Y, Inouye M: Autoprocessing of prothiolsubtilisin E in which active-site
serine 221 is altered to cysteine. J. Biol. Chem. 1994, 269:4169-4174.
147. Li Y, Hu Z, Jordan F, Inouye M: Functional analysis of the propeptide of su
btilisin E as an intramolecular chaperone for protein folding. Refolding and inh
ibitory abilities of propeptide mutants. J Biol Chem 1995, 270:25127-25132.
148. Shinde U, Inouye M: Folding mediated by an intramolecular chaperone: autopr
ocessing pathway of the precursor resolved via a substrate assisted catalysis me
20
chanism. J Mol Biol 1995, 247:390-395.
149. Shinde U, Inouye M: Propeptide-mediated folding in subtilisin: the intramol
ecular chaperone concept. Adv Exp Med Biol 1996, 379:147-154.
150. Li Y, Inouye M: The mechanism of autoprocessing of the propeptide of prosub
tilisin E: intramolecular or intermolecular event? J Mol Biol 1996, 262:591-594.
151. Shinde UP, Liu JJ, Inouye M: Protein memory through altered folding mediate
d by intramolecular chaperones [published erratum appears in Nature 1998 Mar 12;
392(6672):210]. Nature 1997, 389:520-522.
152. Jain SC, Shinde U, Li Y, Inouye M, Berman HM: The crystal structure of an a
utoprocessed Ser221Cys-subtilisin E- propeptide complex at 2.0 A resolution. J M
30
ol Biol 1998, 284:137-144.
153. Shinde U, Fu X, Inouye M: A pathway for conformational diversity in protein
s mediated by intramolecular chaperones. J Biol Chem 1999, 274:15615-15621.
154. Volkov A, Jordan F: Evidence for intramolecular processing of prosubtilisin
sequestered on a solid support. J Mol Biol 1996, 262:595-599.
155. Hu Z, Haghjoo K, Jordan F: Further evidence for the structure of the subtil
isin propeptide and for its interactions with mature subtilisin. J Biol Chem 199
6, 271:3375-3384.
156. Schulein R, Kreft J, Gonski S, Goebel W: Preprosubtilisin Carlsberg process
ing and secretion is blocked after deletion of amino acids 97-101 in the mature
40
part of the enzyme. Mol Gen Genet 1991, 227:137-143.
157. Berger A, Schechter I: Mapping the active site of papain with the aid of pe
ptide substrates and inhibitors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1970, 257:24
9-264.
158. Perona JJ, Craik CS: Structural basis of substrate specificity in the serin
e proteases. Protein Sci 1995, 4:337-360.
159. Khan AR, James MN: Molecular mechanisms for the conversion of zymogens to a
ctive proteolytic enzymes. Protein Sci 1998, 7:815-836.
160. Agard DA: To fold or not to fold. Science 1993, 260:1903-1904.
161. Baker D, Shiau AK, Agard DA: The role of pro regions in protein folding. Cu
50
(33)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
rr Opin Cell Biol 1993, 5:966-970.
162. Baker D, Agard D: Kinetics versus thermodynamics in protein folding. Bioche
mistry 1994, 33:7505-7509.
163. Baker D: Metastable states and folding free energy barriers. Nat Struct Bio
l 1998, 5:1021-1024.
164. Inouye M: Intramolecular chaperone: the role of the pro-peptide in protein
folding. Enzyme 1991, 45:314-321.
165. Shinde U, LI Y, Chatterjee S, Inouye M: Folding pathway mediated by an intr
amolecular chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90:6924-6928.
166. Shinde U, Inouye M: Intramolecular chaperones and protein folding. TIBS 199
10
3, 18:442-446.
167. Bryan PN: Prodomains and protein folding catalysis. Chem Rev 2002, 102:4805
-4816.
168. Wong S, Doi R: Determination of the signal peptide cleavage site in the pre
prosubtilisin of Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 1986, 261:10176-10181.
169. Power SD, Adams RM, Wells JA: Secretion and autoproteolytic maturation of s
ubtilisin. Proc Natl Acad Sci U S A 1986, 83:3096-3100.
170. Silen JL, McGrath CN, Smith KR, Agard DA: Molecular analysis of the gene en
coding alpha-lytic protease: evidence for a preproenzyme. Gene 1988, 69:237-244.
171. Silen JL, Agard DA: The alpha-lytic protease pro-region does not require a
20
physical linkage to activate the protease domain in vivo. Nature 1989, 341:462-4
64.
172. Winther JR, Sorensen P: Propeptide of carboxypeptidase Y provides a chapero
ne-like function as well as inhibition of the enzymatic activity. Proc Natl Acad
Sci U S A 1991, 88:9330-9334.
173. Zhou Y, Lindberg I: Purification and characterization of the prohormone con
vertase PC1(PC3). J Biol Chem 1993, 268:5615-5623.
174. Baier K, Nicklisch S, Maldener I, Lockau W: Evidence for propeptide-assiste
d folding of the calcium-dependent protease of the cyanobacterium Anabaena. Eur
J Biochem 1996, 241:750-755.
30
175. Fabre E, Nicaud JM, Lopez MC, Gaillardin C: Role of the proregion in the pr
oduction and secretion of the Yarrowia lipolytica alkaline extracellular proteas
e. J Biol Chem 1991, 266:3782-3790.
176. Fabre E, Tharaud C, Gaillardin C: Intracellular transit of a yeast protease
is rescued by trans-complementation with its prodomain. J Biol Chem 1992, 267:1
5049-15055.
177. Chang YC, Kadokura H, Yoda K, Yamasaki M: Secretion of active subtilisin Ya
B by a simultaneous expression of separate pre-pro and pre-mature polypeptides i
n Bacillus subtilis. Biochem Biophys Res Commun 1996, 219:463-468.
178. Baardsnes J, Sidhu S, MacLeod A, Elliott J, Morden D, Watson J, Borgford T:
40
Streptomyces griseus protease B: secretion correlates with the length of the pr
opeptide. J Bacteriol 1998, 180:3241-3244.
179. van den Hazel HB, Kielland-Brandt MC, Winther JR: The propeptide is require
d for in vivo formation of stable active yeast proteinase A and can function eve
n when not covalently linked to the mature region. J Biol Chem 1993, 268:18002-1
8007.
180. Cawley NX, Olsen V, Zhang CF, Chen HC, Tan M, Loh YP: Activation and proces
sing of non-anchored yapsin 1 (Yap3p). J Biol Chem 1998, 273:584-591.
181. Fukuda R, Horiuchi H, Ohta A, Takagi M: The prosequence of Rhizopus niveus
aspartic proteinase-I supports correct folding and secretion of its mature part
50
(34)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 1994, 269:9556-9561.
182. Nirasawa S, Nakajima Y, Zhang ZZ, Yoshida M, Hayashi K: Intramolecular chap
erone and inhibitor activities of a propeptide from a bacterial zinc aminopeptid
ase. Biochem J 1999, 341 ( Pt 1):25-31.
183. Marie-Claire C, Ruffet E, Beaumont A, Roques BP: The prosequence of thermol
ysin acts as an intramolecular chaperone when expressed in trans with the mature
sequence in Escherichia coli. J Mol Biol 1999, 285:1911-1915.
184. Cao J, Hymowitz M, Conner C, Bahou WF, Zucker S: The propeptide domain of m
embrane type 1-matrix metalloproteinase acts as an intramolecular chaperone when
expressed in trans with the mature sequence in COS-1 cells. J Biol Chem 2000, 2
10
75:29648-29653.
185. Ventura S, Villegas V, Sterner J, Larson J, Vendrell J, Hershberger CL, Avi
les FX: Mapping the pro-region of carboxypeptidase B by protein engineering. Clo
ning, overexpression, and mutagenesis of the porcine proenzyme. J Biol Chem 1999
, 274:19925-19933.
186. Wetmore DR, Hardman KD: Roles of the propeptide and metal ions in the foldi
ng and stability of the catalytic domain of stromelysin (matrix metalloproteinas
e 3). Biochemistry 1996, 35:6549-6558.
187. Yamamoto Y, Watabe S, Kageyama T, Takahashi SY: Proregion of Bombyx mori cy
steine proteinase functions as an intramolecular chaperone to promote proper fol
20
ding of the mature enzyme. Arch Insect Biochem Physiol 1999, 42:167-178.
188. Sauter NK, Mau T, Rader SD, Agard DA: Structure of alpha-lytic protease com
plexed with its pro region. Nat Struct Biol 1998, 5:945-950.
189. McPhalen CA, James MNG: Structural comparison of two serine proteinase-prot
ein inhibitor complexes:
Eglin-C-Subtilisin Carlsberg and CI-2-Subtilisin novo.
Biochemistry 1988, 27:6582-6598.
190. McPhalen CA, Schnebli HP, James MN: Crystal and molecular structure of the
inhibitor eglin from leeches in complex with subtilisin Carlsberg. FEBS Lett 198
5, 188:55-58.
191. Henrich S, Cameron A, Bourenkov GP, Kiefersauer R, Huber R, Lindberg I, Bod
30
e W, Than ME: The crystal structure of the proprotein processing proteinase furi
n explains its stringent specificity. Nat Struct Biol 2003, 10:520-526.
192. Holyoak T, Wilson MA, Fenn TD, Kettner CA, Petsko GA, Fuller RS, Ringe D: 2
.4 A resolution crystal structure of the prototypical hormone-processing proteas
e Kex2 in complex with an Ala-Lys-Arg boronic acid inhibitor. Biochemistry 2003,
42:6709-6718.
193. Estell DA, Graycar TP, Miller JV, Powers DB, Burnier JP, Ng PG, Wells JA: P
robing steric and hydrophobic effects on enzyme-substrate interactions by protei
n engineering. Science 1986, 233:659-663.
194. Bryan PN: Protein engineering of subtilisin. Biochim Biophys Acta 2000, 154
40
3:203-222.
195. Hedstrom L: Serine protease mechanism and specificity. Chem Rev 2002, 102:4
501-4524.
196. Craik CS, Roczniak S, Largman C, Rutter WJ: The catalytic role of the activ
e site aspartic acid in serine proteases. Science 1987, 237:909-913.
197. Sprang S, Standing T, Fletterick RJ, Stroud RM, Finer-Moore J, Xuong NH, Ha
mlin R, Rutter WJ, Craik CS: The three-dimensional structure of Asn102 mutant of
trypsin: role of Asp102 in serine protease catalysis. Science 1987, 237:905-909
.
【図面の簡単な説明】
50
(35)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
【０１０５】
【図１】ズブチリシンのα−炭素主鎖と、そのプロドメインとの複合体を表すリボン図で
ある。
【図２】ズブチリシンＢＰＮの野生型のアミノ酸配列を示す。
【図３】表１に示されたズブチリシンＢＰＮに導入される突然変異を示す。
【図４】イオンの濃度と比例するプロテアーゼプロセッシングの速度を示す。
【図５】プロドメインへのプロセッシングズブチリシン（Ｓ１８９）の結合の速度が速い
ことを示す。
【図６】Ｓ１８９は、約４時間で二分の一を切断することを示す。遅滞期が明白である。
この遅滞は、かなりの切断が起こる前に、夾雑物が洗い流されるのを可能にするので、タ
10
ンパク質精製のために有用である。
【図７】固定された基質ズブチリシンＳ１８９または１９０を用いるｐｒ８ＦＫＡＭ−プ
ロテインＧを含む融合タンパク質の精製の結果を示す。ただし、ブロットレーンは、以下
の通りに割り当てられる：レーン１：分子量標準−２μｇバンドレーン２：細胞溶解物−
６７１ｐｒ８ＦＫＡＭ−プロテインＧの１０ｍｌから２５０ｍｌ培養株の１０μｌレーン
３：１ｍｌ／分で装填されるＳ１８９ ＡＬからの流出液（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）
（１０μｌ 画分２）レーン４：１ｍｌ／分で装填されるＳ１９０ ＡＬからの流出液（
１０μｌ 画分２）レーン５：１５時間後のＳ１８９ ＡＬからの溶離液（１０μｌ 画
分２、８μｇのプロテインＧ）レーン６：１５時間後のＳ１９０ ＡＬからの溶離液（１
０μｌ 画分、４．８μｇのプロテインＧ）レーン７：Ｓ１８９ ＡＬからの除去（１０
20
μｌ 画分７、３μｇ ｐＲ８ＦＫＡＭ）レーン８：Ｓ１９０ ＡＬからの除去（１０μ
ｌ 画分７、９μｇ ｐＲ８ ＦＫＡＭ）レーン９：約１０分後のＳ１８９ ＡＬからの
除去（１０μｌ 画分６、６．４μｇ ６７１ ＦＫＡＭ）レーン１０：ＧＢ標準
【図８】α−サブユニットウシトランスデューシンの精製結果を示す。ただし、ブロット
レーンは、以下の通りに割り当てられる：レーン１：細胞溶解物−６７１ｐｒ８ＦＫＡＭ
−ＣｈｉＴの１０ｍｌから２５０ｍｌの培養株の１０μｌレーン２∼３：カラム洗浄液レ
ーン４∼９：１５時間後のＳ１８９ ＡＬからの溶出液レーン１０：プールされた画分
【図９】好熱性メタン生成古細菌（Ｍ．Ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＣＤＣ
６の精製結果を示す。ただし、ブロットレーンは、以下の通りに割り当てられる：レーン
１：分子量標準−２μｇバンドレーン２：細胞溶解物−ｐｒ８ＦＫＡＭ−ＣＤＣ６の５０
30
ｍｌから７５０ｍｌの培養株の１０μｌレーン３：１０ｍｌ／分で装填されるＳ１８９ ＡＬ＿１０カラムからの流出液レーン４∼８：１５時間後のＳ１８９ ＡＬからの溶出液
（１０μｌ 画分２∼６
【図１０Ａ−Ｂ】残基特異的な主鎖への帰属を用いて注釈をつけられた（ａ）プロテイン
Ｇ３１１および（ｂ）プロテインＡ２１９の
1 5
Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを示す。２つのタ
ンパク質は、配列が５９％同一であるが、ＮＭＲによると、異なるタンパク質折り畳みを
示す。
【図１１】融合タンパク質が、通常の手順の通りに結合され、洗い流された場合の、Ｓ１
８９ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳカラム上での６７１融合タンパク質（ｐＲ５８ＦＫＡＭ−ＧB
）からの５６アミノ酸ＧBの分離プロセスの結果を示す。
40
【図１２】標的タンパク質の放出が、標的タンパク質の精製のために必要とされる時間を
減少させるフッ化物イオンの付加により誘発される場合の結果を示す。
【図１３】プロドメイン（ｐＲ５８）が、通常の手順の通りに、０．１Ｍ Ｈ3ＰＯ4中で
カラムから取り除かれる場合の結果を示す。
【図１４】ＫＦの付加により誘発される場合の、連鎖球菌プロテインＧBの精製の結果を
示す。ただし、ブロットレーンは、以下の通りに割り当てられる：レーン１：分子量標準
−２μｇバンドレーン２：ＢＬ２１ ＤＥ３細胞溶解物−６７１（ｐＲ５８ＦＫＡＭ−Ｇ
B
）の５０ｍｌから１Ｌの培養株の１０μｌＳ１８９ＨＴ１カラムに１ｍｌの溶解物を注
入した：レーン３：１ｍｌ／分で装填される流出液（１０μｌの２ｍｌ 画分２）レーン
４：１ｍｌ／分で装填される流出液（１０μｌの２ｍｌ 画分３）レーン５：０．１Ｍ 50
(36)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
ＫＦによる切断／溶離。（１０μｌの１ｍｌ 画分１；合計約７μｇ）レーン６：０．１
Ｍ ＫＦによる切断／溶離。（１０μｌの１ｍｌ 画分２；合計約３μｇ）レーン７：０
．１Ｍ Ｈ3ＰＯ4による除去（１０μｌの１ｍｌ 画分１；合わせられたされた両方のバ
ンドにおいて合計約１０μｇ）。注：１）ＧBのクーマシー染色は、ｐＲ５８融合ドメイ
ンに対してよりもかなり弱い。タンパク質濃度は、Ａ280により決定された２）切断反応
は、この切断／溶離プロトコルを使用すると、約９０％完全であった。
【図１】
【図２】
(37)
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
JP 2007-517492 A 2007.7.5
(38)
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
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(39)
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
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(40)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
【配列表】
2007517492000001.app
【手続補正書】
【 提 出 日 】 平 成 18年 4月 5日 (2006.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質をコードする核酸構築物であって、
プロドメインタンパク質のコード配列に作動可能に連結された目的タンパク質のコード
配列を含み、該プロドメインタンパク質は、対応するプロテアーゼまたはその変異体に対
する親和性が増大されている目的タンパク質、核酸構築物。
【請求項２】
前記対応するプロテアーゼが、ズブチリシンまたはその変異体である、請求項１に記載
の核酸構築物。
【請求項３】
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンまたはその変異体に対する結合親和性を
増大させるアミノ酸配列をさらに含む、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記プロドメインタンパク質が、Ｐ４についてはアミノ酸残基ＦまたはＹ、Ｐ３につい
ては任意のアミノ酸残基、Ｐ２についてはＡまたはＳ、Ｐ１についてはＭ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、
またはＬの置き換えを含む、Ｐ１∼Ｐ４アミノ酸配列に対する置換配列を含む、請求項１
に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンのプロドメインである、請求項２に記載
の核酸構築物。
【請求項６】
前記プロドメインタンパク質が、Ｃ末端の末端で、Ｐ４についてはアミノ酸残基Ｆまた
はＹ、Ｐ３については任意のアミノ酸残基、Ｐ２についてはＡまたはＳ、Ｐ１については
Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、またはＬの置き換えを含む、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
プロドメインタンパク質に作動可能に連結された標的タンパク質を含む融合タンパク質
であって、該プロドメインタンパク質はズブチリシンまたはその変異体に対して増大され
た親和性を示すように修飾されている、融合タンパク質。
【請求項８】
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンプロドメインタンパク質である、請求項
７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ズブチリシンプロドメインタンパク質が、Ｐ１からＰ４アミノ酸を置き換えるＦＫ
ＡＭのアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記プロドメインタンパク質が、同種の配列として使用されるアミノ酸残基Ｅ Ｅ Ｄ
Ｋ Ｌ （Ｆ／Ｙ） Ｑ Ｓ （Ｍ／Ｌ／Ｙ）のバリエーションを含む、請求項７に記
載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記標的タンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡBドメイン；プロテインＡB変異体Ａ２
１９；連鎖球菌プロテインＧBドメイン；連鎖球菌プロテインＧaドメイン；プロテインＧ
(41)
B
JP 2007-517492 A 2007.7.5
変異体Ｇ３１１；大腸菌仮想Ｙａｂ；ウシトランスデューシンのａ−サブユニット；好
熱性メタン生成古細菌（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＣＤＣ６；ストレ
プトアビジン；アビジン；Ｔａｑポリメラーゼ；アルカリホスファターゼ；ＲＮアーゼ；
ＤＮアーゼ；制限酵素；ペルオキシダーゼ；エンド−１，４−βグルカナーゼ；エンド−
１，３−β−グルカナーゼ；キチナーゼ；βおよびαグルコシダーゼ；βおよびαグルコ
ロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）；アミラーゼ；グルコシル−トランスフェラ
ーゼ；ホスホ−トランスフェラーゼ；クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラ
ーゼ；β−ラクタマーゼ；ルシフェラーゼ；エステラーゼ；リパーゼ；プロテアーゼ；バ
クテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｅ）；抗生物質；酵素阻害剤；成長因子；ホルモ
ン；受容体；膜タンパク質；核タンパク質；転写因子；翻訳因子；または核酸修飾酵素で
ある、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
目的タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物であって、
ズブチリシンのプロドメインのＣ末端尾部を含むズブチリシン結合タンパク質をコード
するＤＮＡ配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質のコード配列を含む、ＤＮＡ
構築物。
【請求項１３】
ズブチリシン結合融合タンパク質の生産方法であって、
ズブチリシンまたはその変異体と高い親和性で結合するように修飾されたプロドメイン
タンパク質と、目的とする第２のタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする核酸構
築物を供給する工程；
前記核酸構築物を用いて宿主細胞を形質転換する工程；および
前記融合タンパク質の発現のための適切な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養す
る工程を含む方法。
【請求項１４】
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンのプロドメインである、請求項１３に記
載の方法。
【請求項１５】
前記プロドメインタンパク質が、Ｐ４からＰ１アミノ酸を、アミノ酸配列ＦＫＡＭ、Ｆ
ＫＡＹ、またはＦＫＡＦで置き換えることによって修飾されている、請求項１４に記載の
方法。
【請求項１６】
前記目的とする第２のタンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡBドメイン；プロテイン
ＡB変異体Ａ２１９；連鎖球菌プロテインＧBドメイン；連鎖球菌プロテインＧaドメイン
；プロテインＧB変異体Ｇ３１１；大腸菌仮想Ｙａｂ；ウシトランスデューシンのａ−サ
ブユニット；好熱性メタン生成古細菌（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）Ｃ
ＤＣ６；ストレプトアビジン；アビジン；Ｔａｑポリメラーゼ；アルカリホスファターゼ
；ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼ；制限酵素；ペルオキシダーゼ；エンド−１，４−βグルカナ
ーゼ；エンド−１，３−β−グルカナーゼ；キチナーゼ；βおよびαグルコシダーゼ；β
およびαグルコロニダーゼ；アミラーゼ；グルコシル−トランスフェラーゼ；ホスホ−ト
ランスフェラーゼ；クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ；β−ラクタ
マーゼ；ルシフェラーゼ；エステラーゼ；リパーゼ；プロテアーゼ；バクテリオシン；抗
生物質；酵素阻害剤；成長因子；ホルモン；受容体；膜タンパク質；核タンパク質；転写
因子；翻訳因子；または核酸修飾酵素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞に、大腸菌、桿菌、サルモネラ、シュードモナス；サッカロミセスセレビ
シエ、ピキアパストリス、クルベロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ、シ
ゾサッカロミセス由来の細胞；またはＣＨＯ細胞が含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
融合タンパク質からの目的タンパク質の精製および分離のための方法であって、
(42)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
目的タンパク質に連結されたプロドメインタンパク質を含む融合タンパク質を、ズブチ
リシンまたはその変異体と融合タンパク質のプロドメインタンパク質との間の結合複合体
の形成に適した条件下で、有効量のズブチリシンまたはその変異体と接触させる工程；
ズブチリシンまたはその変異体が、目的タンパク質を結合複合体から切断するのに十分
な時間、結合複合体をインキュベートする工程；および
目的タンパク質を回収する工程を含む方法。
【請求項１９】
前記ズブチリシンが、プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質に特異的に結合するよ
うに修飾されている請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ズブチリシンが、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｋ４３Ｎ、Ａ７３Ｌ、７５∼
８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｋ
２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅ、Ｙ１０４Ａ、Ｇ１２８Ｓ、およびアミ
ノ酸位置３２、１５５、または２２１における少なくとも１つのさらなる突然変異を含む
、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロドメインタンパク質が、ズブチリシンプロドメインであり、かつＰ４からＰ１
アミノ酸を、アミノ酸配列ＦＫＡＭ、ＦＫＡＹまたはＦＫＡＦで置き換えることによって
修飾される請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記目的タンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡBドメイン；プロテインＡB変異体Ａ２
１９；連鎖球菌プロテインＧBドメイン；連鎖球菌プロテインＧaドメイン；プロテインＧ
B
変異体Ｇ３１１；大腸菌仮想Ｙａｂ；ウシトランスデューシンのａ−サブユニット；好
熱性メタン生成古細菌（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＣＤＣ６；ストレ
プトアビジン；アビジン；Ｔａｑポリメラーゼ；アルカリホスファターゼ；ＲＮアーゼ；
ＤＮアーゼ；制限酵素；ペルオキシダーゼ；エンド−１，４−βグルカナーゼ；エンド−
１，３−β−グルカナーゼ；キチナーゼ；βおよびαグルコシダーゼ；βおよびαグルコ
ロニダーゼ；アミラーゼ；グルコシル−トランスフェラーゼ；ホスホ−トランスフェラー
ゼ；クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ；β−ラクタマーゼ；ルシフ
ェラーゼ；エステラーゼ；リパーゼ；プロテアーゼ；バクテリオシン；抗生物質；酵素阻
害剤；成長因子；ホルモン；受容体；膜タンパク質；核タンパク質；転写因子；翻訳因子
；または核酸修飾酵素である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ズブチリシンが、固相マトリックス上に固定されている、請求項２０に記載の方法
。
【請求項２４】
9
前記ズブチリシンのプロドメインが、ズブチリシンへの結合親和性が１０ Ｍ
- 1
超に増
大するように変異されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ズブチリシンが、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｋ４３Ｎ、Ａ７３Ｌ、７５∼
８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｋ２１７Ｌ、Ｎ
２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅ、Ｙ１０４Ａ、Ｇ１２８Ｓ、およびアミノ酸位置３２
または２２１における少なくとも１つのさらなる突然変異を含む請求項１９に記載の方法
。
【請求項２６】
前記ズブチリシンが、Ｓ１８９、Ｓ１９０、Ｓ１９４、Ｓ１９６、Ｓ１９７、またはＳ
１９８である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ズブチリシンが、Ｓ１９９、Ｓ２０１、またはＳ２０２である、請求項２５に記載
の方法。
(43)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
【請求項２８】
試験サンプル中における目的物質の存在を検出するための分析方法であって、
（ａ）十分な量のプロテアーゼプロドメイン融合タンパク質と共に、目的物質を含有す
る可能性のある試験サンプルをインキュベートする工程
（ただし、該プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質は、
（ｉ）高い親和性でズブチリシンまたはその変異体と結合できるプロテアーゼプロドメイ
ン、および
（ｉｉ）目的物質の第２のタンパク質への結合を可能にするインキュベーションの条件下
で、目的物質を結合できる第２のタンパク質を含む）；
（ｂ）ズブチリシンまたはその変異体（ただし、ズブチリシンまたはその変異体は、前
記融合タンパク質と結合するのに有効な量で溶解しているか、固相上に固定されている）
に、工程（ａ）で使用されたプロテアーゼプロドメイン融合タンパク質を接触させて、ズ
ブチリシン／プロドメイン融合タンパク質結合複合体を形成する工程；
（ｃ）ズブチリシンまたはその変異体が、前記結合複合体から第２のタンパク質を切断
するのに十分な時間、前記ズブチリシン／プロドメイン融合タンパク質結合複合体をイン
キュベートする工程；
（ｄ）前記目的物質と結合した第２のタンパク質を回収する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記目的物質に結合できる検出可能な標識を導入する工程；および
標識の有無を決定して、試験サンプル中における目的物質の有無の指標を提供する工程
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合複合体から第２のタンパク質を分離するより前、または前記第２のタンパク質
を回収した後に、前記検出可能な標識が導入される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試験サンプルが、血液、尿、精液、唾液、粘液、涙、または膣分泌物である、請求
項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記目的物質が、抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のタンパク質が、前記抗体に対して親和性を有する抗原性受容体である、請求
項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記目的物質が、抗原である請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２のタンパク質が、前記抗体に対して親和性を有する抗体である、請求項３４に
記載の方法。
【請求項３６】
前記ズブチリシンが、プロテアーゼプロドメイン融合タンパク質と特異的に結合するよ
うに修飾されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記ズブチリシンが、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｋ４３Ｎ、Ａ７３Ｌ、７５∼
８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｋ
２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅ、Ｙ１０４Ａ、Ｇ１２８Ｓ、およびアミ
ノ酸位置３２、１５５または２２１における少なくとも１つのさらなる突然変異を含む、
請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記プロテアーゼプロドメインタンパク質が、ズブチリシンプロドメインであり、かつ
Ｐ４からＰ１アミノ酸を、アミノ酸配列ＦＫＡＭ、ＦＫＡＹ、またはＦＫＡＦで置き換え
ることによって修飾されている、請求項２８に記載の方法。
(44)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
【請求項３９】
目的薬物が結合されて融合生成物を形成したズブチリシンプロドメインタンパク質を含
む薬物送達システムであって、
前記融合生成物は、ズブチリシンまたはその変異体とさらに複合体形成して薬物送達複
合体を形成している、薬物送達システム。
【請求項４０】
前記目的薬物が、直接またはリンカー部分を介して、ズブチリシンプロドメインタンパ
ク質にコンジュゲートされている、請求項３９に記載の薬物送達システム。
【請求項４１】
前記目的薬物が、薬物送達複合体からゆっくりと放出される、請求項３９に記載の薬物
送達システム。
【請求項４２】
前記薬物送達生成物が、組成物中に含まれており、非経口的に、経口的に、局所的に、
または吸入により投与される、請求項４１に記載の薬物送達システム。
【請求項４３】
前記組成物が、固体、ゲル、液体、またはエアロゾルを含む、請求項４１に記載の薬物
送達システム。
【請求項４４】
前記ズブチリシンが、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｋ４３Ｎ、Ａ７３Ｌ、７５∼
８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｋ
２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅ、Ｙ１０４Ａ、Ｇ１２８Ｓ、およびアミ
ノ酸位置３２、１５５、または２２１における少なくとも１つのさらなる突然変異を含む
、請求項４１に記載の薬物送達システム。
【請求項４５】
前記ズブチリシンプロドメインタンパク質が、Ｐ４からＰ１アミノ酸残基を、アミノ酸
配列ＦＫＡＭ、ＦＫＡＹ、またはＦＫＡＦで置き換えることにより修飾されている、請求
項４１に記載の薬物送達システム。
【請求項４６】
対応するプロテアーゼまたはその変異体に対する親和性を生み出すタンパク質のコード
配列に作動可能に連結された、目的タンパク質のコード配列を含む、融合タンパク質をコ
ードする核酸構築物。
【請求項４７】
前記対応するプロテアーゼが、前記目的タンパク質と前記タンパク質を結合しているペ
プチド結合を加水分解する、請求項４６に記載の核酸構築物。
【請求項４８】
前記タンパク質のＰ１、Ｐ２、およびＰ４アミノ酸が、対応するプロテアーゼまたはそ
の変異体のＳ１、Ｓ２、およびＳ４結合ポケットに対する親和性を生み出す、請求項４６
に記載の核酸構築物。
【請求項４９】
前記タンパク質が、Ｐ４についてはアミノ酸残基ＦまたはＹ、Ｐ３については任意のア
ミノ酸残基、Ｐ２については、Ａ、Ｓ、Ｖ、またはＴ、Ｐ１についてはＭ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、
またはＬの置き換えを含む、請求項４８に記載の核酸構築物。
【請求項５０】
目的タンパク質と融合した対応するプロテアーゼに対する結合配列を含み、化学的なト
リガーおよび融合タンパク質の付加後に特異的に該融合タンパク質を加水分解するように
改変されたプロテアーゼ変異体。
【請求項５１】
前記改変プロテアーゼが、ズブチリシン変異体である、請求項５０に記載のプロテアー
ゼ変異体。
【請求項５２】
(45)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
前記ズブチリシン変異体が、アミノ酸３２における突然変異を含む、請求項５１に記載
のプロテアーゼ変異体。
【請求項５３】
目的タンパク質を生産する方法であって、
前記目的タンパク質に融合し、対応するプロテアーゼに対する結合配列を含む融合タン
パク質を生じる工程、および、
化学的なトリガーの付加後に特異的に融合タンパク質を加水分解して前記目的タンパク
質を産生するように改変されたプロテアーゼ変異体と、前記融合タンパク質とを反応させ
る工程（ただし、この反応は、前記化学的なトリガーの存在下で行われる）、および、
前記目的タンパク質を回収する工程を含む方法。
【請求項５４】
融合タンパク質をコードする核酸構築物であって、
対応するプロテアーゼまたはその変異体に対する親和性を生み出すペプチドのコード配
列に作動可能に連結された、目的タンパク質のコード配列を含む構築物。
【請求項５５】
前記対応するプロテアーゼが、目的タンパク質とペプチドとを結合しているペプチド結
合を加水分解する、請求項５４に記載の核酸構築物。
【請求項５６】
前記ペプチドのＰ１、Ｐ２、およびＰ４アミノ酸が、対応するプロテアーゼまたはその
変異体のＳ１、Ｓ２、およびＳ４結合ポケットに対して親和性を生み出す、請求項５４に
記載の核酸構築物。
【請求項５７】
ペプチドが、Ｐ４についてはアミノ酸残基ＦまたはＹ、Ｐ３については任意のアミノ酸
残基、Ｐ２についてはＡ、Ｓ、Ｖ、またはＴ、Ｐ１についてはＭ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、またはＬ
の置き換えを含む、請求項５６に記載の核酸構築物。
【請求項５８】
ズブチリシン結合融合タンパク質の生産方法であって、
ペプチドと、目的とする第２のタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする核酸構
築物を提供する工程（ただし、該ペプチドは、ズブチリシンまたはその変異体と高い親和
性で結合するように修飾されている）；
前記核酸構築物を用いて宿主細胞を形質転換する工程；および
前記融合タンパク質の発現のための適切な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養す
る工程を含む方法。
【請求項５９】
融合タンパク質からの目的タンパク質の精製および分離のための方法であって、
目的タンパク質に連結されたペプチドを含む融合タンパク質を、ズブチリシンまたはそ
の変異体と、融合タンパク質のペプチドとの間の結合複合体の形成に適した条件下で、有
効量のズブチリシンまたはその変異体と接触させる工程；
ズブチリシンまたはその変異体が、目的タンパク質を結合複合体から切断するのに十分
な時間、結合複合体をインキュベートする工程；および
目的タンパク質を回収する工程を含む方法。
【請求項６０】
試験サンプル中における目的物質の存在を検出するための分析方法であって、
（ａ）十分な量の融合タンパク質と共に、目的物質を含有する可能性のある試験サンプ
ルをインキュベートする工程
（ただし、該融合タンパク質は、
（ｉ）高い親和性でズブチリシンまたはその変異体と結合できるペプチド、および
（ｉｉ）目的物質の第２のタンパク質への結合を可能にするインキュベーションの条件下
で、目的物質と結合できる第２のタンパク質を含む）；
（ｂ）ズブチリシンまたはその変異体（ただし、ズブチリシンまたはその変異体は、前
(46)
JP 2007-517492 A 2007.7.5
記融合タンパク質と結合するのに有効な量で溶解しているか、固相上に固定されている）
に、工程（ａ）で使用された融合タンパク質を接触させて、ズブチリシン／融合タンパク
質結合複合体を形成する工程；
（ｃ）ズブチリシンまたはその変異体が、前記結合複合体から第２のタンパク質を切断
するのに十分な時間、前記ズブチリシン／融合タンパク質結合複合体をインキュベートす
る工程；
（ｄ）前記目的物質に結合した第２のタンパク質を回収する工程を含む方法。
【請求項６１】
目的薬物結合されて融合生成物を形成したズブチリシンまたはその変異体に対する親和
性を生み出すペプチドを含む薬物送達システムであって、
前記融合生成物は、前記ズブチリシンまたはその変異体とさらに複合体形成して薬物送
達複合体を形成している、薬物送達システム。
(47)
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.
ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/06
Ａ６１Ｋ 47/48
(2006.01)
(2006.01)
テーマコード（参考）
Ｃ１２Ｐ 21/06
Ａ６１Ｋ 47/48
(81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),
EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,
CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,
DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M
A,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG
,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW
(72)発明者 ブライアン，フィリップ，エヌ．
アメリカ合衆国，メリーランド州 ２０８７８，ノース ポトマック，ダンレイス プレース １
１３０５
Ｆターム(参考) 4B024 AA01 BA14 CA07 DA07
4B050 CC04 DD02 LL01
4B064 AG01 CA19 CC24 DA01
4C076 AA09 AA11 AA93 AA94 BB01 BB11 BB27 EE41 EE59 FF31
4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA11 DA89 FA74

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