Cancer Research Application Note No. 5 化合物誘発性肝細胞毒性の 早期検出: 動物実験削減を目的とした 先進的細胞解析 キーワード：3Rコンセプト、毒性学、肝毒性、統合ワークフローアプ リケーション、ハイスループット細胞分析、生化学的アッセイ、トキシ コゲノミクス、qRT-PCR、マイクロアレイ 1 イントロダクション 動物実験に供される個体数を削減し（Reduce）、苦痛を軽減 し（Refine）、代替法を行う（Replace）という3Rコンセプトを 満たすために、新しい細胞ベースのin vitro 技術が必要とさ れています（1）。毒性学的なin vitro アッセイで化合物を早期 に同定できれば、適切でない化合物のin vivo 試験に用いられ Mary-Anne Watt3, Markus Schmitz1, Alexander Seiler1, Roxana Alexandridis3, Heiko Walch1, Franziska Boess2, Adrian B. Roth2 1 Roche Diagnostics GmbH, Nonnenwald 2, 82377 Penzberg, Germany 2 F. Hoffmann-La Roche AG, Grenzacherstrasse 124, 4070 Basel, Switzerland 3 Roche NimbleGen, Inc., 500 S. Rosa Road, Madison, WI 53719, USA る実験動物数を削減し、薬剤試験の後期段階で最終的に不合 格となるケースを回避できます。 細胞 の 生存 と 毒性 の 評価 に お い て 最 も 汎用的 なin vitro アッセイは、細胞の溶解を伴うエンドポイントアッセイ です。しかし、RocheとACEA Biosciencesが共同開発した xCELLigenceリアルタイム セルアナライザー（RTCA）シス テムを用いれば、非侵襲性かつラベルフリーで、細胞の挙動 を連続的にモニタリングできます（2）。xCELLigence RTCA SP・MP・DPインスツルメントは、専用の細胞培養プレー トであるE-Plate 16（16ウェル）およびE-Plate 96（96ウェル） の各ウェルの底面で、接着細胞が微小電極センサのネット Markus Schmitz Alexander Seiler Mary-Anne Watt Roxana lexandridis A ワークに接触したときに発生する電気的インピーダンスを 測定します。この技術により、増殖・細胞死・接着・伸展や、 その他の形態変化といった細胞イベントの長期動的モニタ リングを、リアルタイムで行うことができます。 Heiko Walch Franziska Boess 生命科学研究用です。 診断用途には使用しないで下さい。 Adrian Roth 特定の処理に対する細胞応答の連続的モニタリングを、エン ドポイントアッセイや他の下流アプリケーション（プロテオ ミクスやトキシコゲノミクスなど）とひとつの実験系として 組み合わせること（3）は、予測に基づくハイスループットの毒 性評価を行う上で有力な方法であり、in vitro 試験の将来的な 重要性をより高めることになります。 今回の研究でわれわれは、ラット初代培養肝細胞を肝毒性の in vitro モデルとして用い、確立された毒性学ワークフローで xCELLigenceシステムを使用できるかどうか検討しました。 xCELLigence RTCA MPインスツルメント（6枚のE-Plate 96、 総計576ウェル）を用いて、セルインデックス値で示される、 連続的な化合物依存的および濃度依存的細胞インピーダンス プロファイルを作成し、化合物誘発性肝毒性を連続的にモニ タリングしました。 実験結果から、xCELLigenceシステムを用いた連続的モニタ リングにより、実験のタイムコース全体にわたる経時的な細 胞培養条件、適切な化合物投与時期の特定、および下流アッ セイの結果を左右する諸条件に関する詳細な情報が同時に得 られることが明らかになりました。使用した全体のワークフ ローは以下の通りです。 ▪ xCELLigenceシステムを用いた連続的な細胞モニタリング ▪ 細胞毒性、細胞生存率、細胞レドックス状態を定量化する 機能的生化学エンドポイントアッセイ ▪ NimbleGenマイクロアレイおよびLightCycler®システムの qRT-PCRを用いた遺伝子発現プロファイリング この多面的なワークフローにより、相互に関連づけられた データが取得でき、毒性学研究においてxCELLigenceシステ ムが提供する付加価値を強く提示できました。以下の文書に 示すように、xCELLigenceシステムと、既存のエンドポイン ト アッセイおよび遺伝子発現プロファイリングを組み合わ せることによって、薬剤や製品の初期段階における安全性評 価の有用性がより向上することが判明しました。 2 材料と方法 肝細胞の分離・培養、化合物の投与 いて、細胞増殖の挙動を72時間にわたって連続的にモニタリ 10～14週齢の雄HanBrl：WISTラットから、Collagenase B（ロ ングしました。モニタリングに先立って各ウェルあたり100µL シュ社）を用いた肝臓灌流法によりラット初代培養肝細胞を の培地を添加し、バックグラウンドインピーダンスを測定し 分離し、肝臓1個あたり約2×108個の細胞を回収しました。ト ました。最終的なウェルの容量は200µL（各ウェルあたり肝 リパンブルー色素排除法で評価したところ、生存率は85％～ 細胞1.5×104個を含む） に調整しました。E-Plateをステーショ 9 5％で し た。分離 し た 細胞 を、コ ラーゲ ン コート さ れた ンに設置後（処置前の24時間）は、15分間隔でインピーダンス E-Plate 96（ロシュ社）およびコラーゲンコートされた一般的 を記録しました。化合物投与直後は、インピーダンスを2分間 な96ウェル細胞培養プレートに、それぞれ細胞1.5×10 4個/ 隔で6時間記録し、その後は15分間隔で記録しました（処置後 ウェルおよび2.0×104個/ウェルの密度で播種しました。 の48時間） 。総ての実験は3重測定にて実施し、セルインデッ クス（CI）値は化合物投与時の値に対してノーマライズしま 細胞を10％ウシ胎仔血清（FCS） 、ペニシリン（100U/mL） 、ス した（正規化CI） 。 トレプトマイシン（0.1mg/mL） 、インスリン（100nM） 、デキ サメタゾン（100nM） を添加したWilliam’ s Medium E（WME） 細胞毒性、生存率、レドックス状態の分析のための に播種し、5％CO2および37℃の加湿環境にて培養しました。 エンドポイントアッセイ 4時間後、培地をFCSフリーの添加WMEと交換し、化合物投 化合物投与24時間後に、96ウェルフォーマットでのマルチプ 与を行う前に細胞を20時間培養しました。その後、肝細胞に レックスアプローチによって、生化学的エンドポイントアッ さまざまな濃度のタクリン、ドキソルビシン、新種のキナー セイを通常通り行いました（実験はxCELLigenceシステム同 ゼ阻害剤（ロシュ社製薬部門） 、そして非毒性化合物である3- 様、3重測定にて行いました） 。 アセトアミドフェノール（AMAP）を投与しました。これら 急性細胞毒性は、細胞培地への乳酸脱水素酵素（LDH）の放 の薬物投与は、 培地を試験化合物を添加したFCSフリーの 出により評価しました。LDH活性は、ADVIA 1650 Auto- WMEワーキング溶液（インスリン、デキサメタゾン非含有） analyzer（Bayer Health Care社） を用いた分光測定により解 と置換することによって実施しました。 析されました。培地中の酵素活性は、培養開始時の細胞の総 LDH活性に対する割合として示しました。 RTCA MPインスツルメントを用いた 細胞レドックス状態を評価するため、蛍光色素monochlo- 細胞増殖のモニタリング robimane（mClB） を用いて細胞内還元型グルタチオン（GSH） xCELLigence RTCA MPインスツルメント（ロシュ社） を用 濃度を定量しました。肝細胞をKrebs-Henseleith Buffer Improved Cellular Analysis for the Early Detection of Compound-Induced Hepatic Cytotoxicity to Reduce Animal Testing （KHB）で洗浄し、Wallac Victor2マルチラベル カウンター マイクロアレイサンプルの調製および分析 （Perkin Elmer社、ex＝355nm、em＝460nm） を用いて、KHB NimbleGenラット遺伝子発現12×135Kアレイを用いて、 の自家蛍光を測定しました。その後、各ウェルに最終濃度 cDNAサンプルのマイクロアレイ解析を行いました。各スラ 100µMとなるようにmClBを添加し、37℃で15分間インキュ イドには独立した12個のアレイが載っており、各アレイには ベートしました。mClB溶液をKHBと交換し、蛍光強度を前 遺伝子26,419種をカバーするプローブが135,000種固定されて 述の条件設定通り測定しました。 います（標的遺伝子あたりプローブ5種）。cDNA（1µg）を 細胞のエネルギー状態は、細胞内ATP濃度を測定できるATP NimbleGenアレイ遺伝子発現解析用ユーザーガイドに従って バイオルミネッセンス アッセイキットHS II（ロシュ社） を用 Cy3標識して精製した後、NanoDrop分光光度計（Thermo社） いて定量しました。予熱した0.9％NaClで細胞を洗浄・溶解 でCy3標識cDNAを定量しました。Cy3-cDNAを、推奨プロト させ、キットに記されたプロトコールに従って処理した後、 コールに従ってNimbleGenラット遺伝子発現12×135Kスラ Wallac Victor2マルチラベル カウンター（Perkin Elmer社） を イ ド 上 の ア レ イ に ハ イ ブ リ ダ イ ズ さ せ ま し た。 洗浄後、 用いて蛍光強度を測定しました。ATP濃度は、絶対量が判明 NimbleGen MS200マイクロアレイスキャナを用いて、解像度 しているATPに基づいて作成された標準曲線を用いて算出 2µmおよび励起波長532nmにてスライドをスキャンしまし しました。 た。NimbleScan v2.5ソフトウエア（Roche NimbleGen社） に よりスキャン画像からシグナルを数値化しました。 トータルRNAの分離とcDNA合成 High Pure FFPE RNA Micro Kit（ロシュ社） にMagNA Pure アレイ内でのシグナルの均一性、アレイ間のサンプルクロス LC DNA Isolation Kit I Lysis/Binding Buffer（ロシュ社） を コンタミネーションチェック、再現性という項目の測定基準 組み合わせて、化合物を投与して1・6・24時間後に、トータ に基づいてデータの質をまず評価しました。品質基準を満た ルRNAを分離しました。E-plate 96の各ウェルあたり100µLの していたデータのみを以降の解析に用いました。各種の化合 溶解バッファー（MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I 物を投与して1・6・24時間後のデータはRobust Multichip Lysis/Binding Buffer 75µL＋エタノール25µL） を用いて、細 Average（RMA）アルゴリズム（4）を用いて正規化し、それぞ 胞を溶解しました。細胞溶解液をHigh Pure FFPE RNA れ の 時点 で の 遺伝子発現量 を 求 め ま し た。 データ 解析 は Microフィルターチューブに添加し、プロトコールに従って Partek Genomics Suite（v6.5beta） およびRソフトウエアを用 処理しました。回収した25ngのトータルRNAをテンプレート い、Principal Components Analysis（PCA）解析、および にして、WT-Ovation Pico RNA増幅システム（NuGEN社） で Euclidean distanceとaverage linkageを用いた階層的クラス RNA増幅とcDNA合成を行いました。キャリアはビール酵母 タリング、ANOVAモデルによる統計解析を行いました。 由来のtRNA（ロシュ社） を用い、余剰の核酸を除去するため、 A N O V Aモデルによる統計解析では、 アレイに存在する cDNAをHigh Pure PCR Cleanup Micro Kit（ロシュ社） の「低 26,419個の遺伝子のlog 2変換した発現量を用いて、時間・化 分子量DNA除去」プロトコールに従って精製しました。RNA 合物・濃度の因子を組み合わせて投与サンプルと対照サンプ とcDNAの質と量は2100 Bioanalyzer（Agilent社） で評価しま ルで発現が異なる遺伝子を同定しました。要因効果の有意性 した。 はt検定によって検証し、step-up False Discovery rate（FDR） 法を用いて多重検定補正を行いました。この実験ではFDRの p値が0.01未満かつ、遺伝子発現変動倍率が3を超える遺伝子 を発現が異なる遺伝子として同定しました。さらに、同定さ れた遺伝子を分子機能カテゴリーに対する遺伝子オントロ ジー（Gene Ontology：GO） で分類し、Fisherの正確確率検定 によるスコアを算出しました。 Cancer Research Application Note No. 5 リアルタイムqPCRおよびデータ解析 cDNA合成キット（ロシュ社）を用いて合成したラットcDNA ユニバーサル・プローブライブラリー アッセイ デザインセ でバリデートしました。qRT-PCRは、LightCycler®480プロー ンター（ロシュ社）を用いて、以下の遺伝子（3個のリファレ ブマスター（ロシュ社）を使用し、2重測定を実施しました。 ンス遺伝子：Gapdh、Ppia、Tfrcおよび9個の標的遺伝子： ΔΔCp法に基づき、各測定サンプルのCp値（Cpsample）の平均 Bcl2、Cyp1a1、Cyp3a18、Ddit1、Ddit3、Hmox1、Pcna、 値を、リファレンス遺伝子3個の平均Cp値（Cpref）の平均値に Serpinb9、Slc2a1）のPCRアッセイをデザインしました。アッ て補正を行い（ΔCp=2^（－ （Cpsample－Cpref） ） ） 、それぞれの セイは、ラット ユニバーサル リファレンス トータルRNA DMSOコントロール サンプルの遺伝子発現レベルで標準化 （ClonTech） からトランスクリプター ファースト ストランド しました（ΔΔCp＝ΔCpsample/ΔCpDMSO） 。 表1：バリデートしたラットPCRアッセイのリスト 個々のEnsembl Gene ID、 プライマー配列、 プローブ番号を示します。 遺伝子 Ensembl Gene ID プライマー配列�������� ������� （������ 5’-3’� ） プローブ� ��� No. Gapdh ENSRNOT00000050443 left: aaagctgtggcgtgatgg right: ttcagctctgggatgacctt 26 Ppia ENSRNOT00000009407 left: tgctggaccaaacacaaatg right: cttcccaaagaccacatgct 42 Tfrc ENSRNOT00000002407 left: gagttcactgacatcatcaagca right: tccagcctcacgaggagtat 129 Bcl2 ENSRNOT00000003768 left: tagtcagaagcggcactgg right: aagactggatcattcggaagaa 68 Cyp1a1 ENSRNOT00000026473 left: gtccttcctcacagccaaag right: aaggcagaatgtggtgacg Cyp3a18 ENSRNOT00000001285 left: ttggtttcaaccatttaaagagaag right: tcagttaatgttgtgggtctacct Ddit1/Gadd45a ENSRNOT00000007698 left: agccaagctgctcaacgta right: cccggtcgtcatcttcat 40 Ddit3/Gadd153 ENSRNOT00000008941 left: caccacacctgaaagcagaa right: agctggacactgtctcaaagg 13 Hmox1 ENSRNOG00000014117 left: gtcaggtgtccagggaagg right: ctcttccagggccgtataga Pcna ENSRNOT00000028887 left: tgaactttttcacaaaagccact right: tgtcccatgtcagcaatttta 94 Serpinb9 ENSRNOT00000059949 left: gataatgacggggacctcag right: gtgttcttcataaagtctgggttg 64 Slc2a1 ENSRNOT00000047556 left: cccacagctcttcgtgga right: tggagtctaagccgaacacc 5 109 9 105 Improved Cellular Analysis for the Early Detection of Compound-Induced Hepatic Cytotoxicity to Reduce Animal Testing 3 結果 細胞培養条件の最適化 ラット初代培養肝細胞を、xCELLigenceシステムで肝臓特異 A 的な細胞毒性効果を評価するin vitro モデルとして用いまし 2.3 セルインデックス 1.8 た。E-Plate 96ウェルでの最適な細胞培養条件を明らかにす 1.4 るため、さまざまなコーティング剤と播種細胞密度を試験し ました。コラーゲン コートしたウェルに細胞を1.5×10 4個播 コラーゲンコート コートなし 0.9 種したところ、最高の結果が得られました（図1A参照） 。図 1Bに示したように、セルインデックス（CI）プロファイルは、 0.5 実験中を通して培養細胞の生物学的状態を反映します。細胞 は培養後最初の4時間以内に接着し、CI値は1.4に達しました。 播種の4時間後に培地を取り替えたところ、CI値が一時的に 上昇しました。細胞を20時間、血清フリーの細胞培養条件に 適応させたところ、CI値が安定化しました。播種の24時間後 0 B に化合物を投与すると、CI値は急激に低下しましたが、対照 1 2 3 時間 2.0 4 5 セルインデックス 細胞の形態におよぼす影響は、光学顕微鏡による形態観察で DMSO control 毒物 1.2 も明らかになりました（図1C参照） 。 7 投与 1.6 試験細胞のCI値は約1.0で安定化していました。化合物投与が 6 0.8 FCS フリー培地 0.4 播種 0 図1：E-Plate 96における最適な肝細胞培養条件 （A）1.5×104個/ウェルで初代培養肝細胞をプレーティングすることが、 最適な細胞密度であることが判明しました。細胞はコラーゲン コートされ たプレートに最もよく接着しました。 （B）xCELLigenceシステムを用いて得られるセルインデックス （CI） プロ ファイルにより、 （i）細胞接着、 （ii）細胞培養適応、 （iii）化合物投与の影響、 それぞれのモニタリングを行いました。 毒性化合物を添加するとCI値が迅速に低下しましたが、対照物質を投与 した細胞のCI値は変化しませんでした。 （C）毒性化合物投与による形態変化を示す顕微鏡写真。 Cancer Research Application Note No. 5 8 16 24 32 時間 40 48 C DMSO 毒物 薬剤誘発性肝細胞障害の動的モニタリング ドキソルビシン、タクリン、キナーゼ阻害剤は、大規模な細 細胞培養の最適化後、RTCA MPインスツルメントを用いて、 胞死を誘発し、濃度依存的なCI値の低下が観察されました。 ドキソルビシン、タクリン、キナーゼ阻害剤の肝毒性効果を xCELLigenceシステムが明らかにした早期の顕著なCI値の 分析しました。ラット初代培養肝細胞にさまざまな濃度の化 低下により、これら3種の薬剤が有する肝細胞障害に対する 合物を投与し、投与後48時間以上にわたってCI値を記録しま 即効性（投与後最初の6時間）が観察されました。AMAPは、 した（図2参照） 。ドキソルビシンは、アントラサイクリン系 きわめて高濃度の場合（1mM以上）のみ毒性効果を示しまし 抗腫瘍薬であり、心臓と肝臓の細胞毒性を促進します（5）。ア た。特筆すべきイベントとして、投与直後の非常に一時的な セチルコリンエステラーゼ阻害薬であるタクリンも、ヒトの CI値上昇が、タクリンにのみ認められました。これはおそら 肝臓障害を誘発することが報告されています（6）。広く利用され くタクリン特異的な細胞効果であると推測されます。細胞毒 ている鎮痛・解熱薬であるアセトアミドフェノール（AMAP： 性をxCELLigenceソフトウエアを用いてさらに定量し、投与 アセトアミノフェンの毒性がない位置異性体）を、対照物質 24時間後の時点でのIC50値を算出し、試験した化合物の毒性 としました。セルインデックスプロファイリングにより、試 順位を決定しました（ドキソルビシン＞キナーゼ阻害剤＞タ 験した総ての化合物に対する特徴的な細胞応答が明らかにな クリン＞AMAP） 。 りました。 ドキソルビシン 正 規 化セルインデックス 1.2 control 100nM 1μM 3μM 10μM 30μM 50μM 100μM 1.0 IC50 = 0,77μM 0.7 0.5 0.3 0.0 25 投与 33 49 57 65 正 規 化セルインデックス control 100nM 1μM 3μM 10μM 30μM 50μM 100μM 0.6 0.3 24 33 42 51 時間 60 69 78 図2：化合物特異的なインピーダンスに基づく毒性プロファイル 4種類の化合物の肝毒性効果を、xCELLigenceシステムにより投与48 時間後まで連続的にモニタリングしました。セルインデックス （CI）は、化 合物投与時点の値に対して正規化しており、IC 50値で定量できる濃度依 存的および時間依存的肝毒性効果を示しています。高い化合物濃度では 0.6 0.3 投与 IC50 = 155μM 33 41 49 57 65 73 AMAP 1.2 0.9 0.0 0.8 25 IC50 = 9,1μM 投与 control 10μM 50μM 100μM 150μM 200μM 300μM 500μM 1.0 0.1 73 キナーゼ阻害剤 1.5 1.2 41 タクリン 1.3 1.0 control 10μM 50μM 100μM 300μM 1mM 3mM 5mM 0.8 0.5 0.3 0.1 25 投与 33 IC50 = 620μM 41 49 時間 57 65 73 細胞死の開始が検出され、同時にCI値が迅速に低下しました。細胞死は、 モニタリング後期では低濃度でも検出されました。 ドキソルビシン、 タクリ ン、キナーゼ阻害剤では肝毒性が認められましたが、対照物質である AMAPは、極めて高濃度の場合に限り細胞死を誘発しました。 Improved Cellular Analysis for the Early Detection of Compound-Induced Hepatic Cytotoxicity to Reduce Animal Testing 生化学的エンドポイントアッセイとの比較 アッセイよりも高い感度を示しました。同様に、細胞内ATP 化合物 が 誘発 す る 肝毒性 の 分子機構 を 精査 す る た め、 およびGSH濃度の測定により、化合物に起因するホメオスタ xCELLigenceシステムプロファイリングと通常の生化学的 シスの混乱が明らかになりました。しかし、エネルギーとレ アッセイを並行して行いました。LDH放出・GSH欠乏・細胞 ドックス状態の低下は、試験化合物が高濃度の場合しか検出 内ATP濃度を投与24時間後にアッセイし、対応するCI値と比 されませんでした。機能的生化学アッセイは、タクリン投与 較しました（図3参照） 。 細胞のATP定量といった、 “全か無か”の反応のみを明らかに AMAP以外の総ての試験化合物でLDH放出の明白な増加が する傾向があり、IC50を算出できませんでした。これらエン 認められました。このことは、ラット初代培養肝細胞に有意 ドポイントアッセイにおける制約事項は、 “より詳細なデー な化合物誘発性細胞損傷が引き起こされたことを示していま タ解析を行うべき時間を特定できる”という、xCELLigence す。興味深いことに、この薬物投与24時間後のアッセイでは、 システムの連続的な細胞モニタリングにより解消できます。 xCELLigenceシステムを用いて記録されたCI値が、LDH放出 250 ドキソルビシン Cell Index LDH ATP GSH 200 150 100 50 control 100nM 1μM 3μM 10μM 30μM 50μM 100μM 0 250 250 タクリン Cell Index LDH Cell Index LDH ATP GSH control 10μM 50μM 100μM 150μM 200μM 300μM 500μM ATP GSH control 10μM 50μM 100μM 300μM 1mM 3mM 5mM 200 150 100 50 0 キナーゼ阻害剤 Cell Index LDH ATP 200 150 100 50 GSH control 100nM 1μM 3μM 10μM 30μM 50μM 100μM 0 図3：生化学的エンドポイント解析 ラット初代培養肝細胞を一般的な96ウェルプレートで培養し、濃度依存 的に各化合物を投与し、24時間後に生化学的アッセイを行いました。 ATP・GSH・LDH放出アッセイから得られた結果は、投与24時間後のCI Cancer Research Application Note No. 5 250 200 150 100 50 AMAP 0 値と同様でした。xCELLigenceシステムで測定したCI反応は完全に濃度 依存的でしたが、生化学的アッセイでは投与24時間後のIC 50を算出でき ませんでした。 このことは、 リアルタイム モニタリングの利点を示すものです。 遺伝子発現解析 与で4.5倍、500µMタクリン投与で5.2倍） 、この時点において特 ドキソルビシン（1µM、100µM） またはタクリン（100µM、 異的な遺伝子制御が起こっていることを示唆しています。 500µM）を投与した培養細胞、および対照物質を投与した肝 細胞の全遺伝子発現解析を、化合物投与1・6・24時間後に行 9個の標的遺伝子すなわちBcl2・Cyp1a1・Cyp2c13・Ddit1・ いました。投与1時間後の遺伝子発現挙動は、投与した化合物 Ddit3・Hmox1・Pcna・Serpinb9・Slc2a1の発現レベルを、タ の種類によって有意に分類されませんでした。対照的に、投 クリン（100µM、500µM）またはドキソルビシン（1µM、100 与6時間経過時点での主成分分析（PCA）および階層的クラス µM） を投与した初代培養肝細胞のPre-amplificationしたcDNA タリングの結果、投与した化合物ごとに遺伝子発現挙動が分 サンプルを用いたqRT-PCRにより、詳細に解析しました。投 離していることが明らかになりました（図4AおよびB参照） 。 与1・6・24時間後の標的遺伝子の相対的な遺伝子発現レベル これは、化合物投与後の初期の時点でサンプルを明確に区別 （ΔΔCp）および3種類のリファレンス遺伝子の平均値を図5に できることを示しています。一方、ANOVAモデルを用いて、 まとめました。予め想定されていたことですが、リファレン 投与サンプルと対照サンプルで投与1・6・24時間後に発現が ス遺伝子の発現レベルは化合物投与および時間の影響を受け 異なる（DE） 遺伝子を同定し、図4Cに遺伝子数を示しました。 ませんでした。細胞周期調節因子Ddit1およびDdit3の発現レ ベルは、化合物投与1時間後に有意にアップレギュレートさ 同定されたDE遺伝子の数は、化合物への曝露時間が長くな れ、6時間後に低下し、24時間後に対照実験と同等のレベルと るほど増加する傾向が見られ、投与後6時間後には数百のDE なりました。これは、細胞周期停止を引き起こす迅速な細胞 遺伝子が同定されました。このことは、短時間の化合物曝露 応答を示しています。 後に細胞をアッセイすれば、貴重な生物学的情報が得られる B 可能性を示しています。化合物投与6時間後のDE遺伝子群の、 能に関してのGene Ontologyスコアは対照物質投与と比較し 高さ トランスポーター活性などの生体異物解毒に関与する分子機 て統計学的に有意であり（スコアは100µMドキソルビシン投 A 130 PCA����� マッピング（���� ����� 39%� ） 105 1 hrs PC #2 12.8% 80 ドキソルビシン タクリン ドキソルビシン タクリン （������ 100μM� ） （������ 500μM� ） （���� 1μM� ） （������ 100μM� ） 55 30 ● Control ● ドキソルビシン （���� 1μM� ） ● ドキソルビシン （������ 100μM� ） ● タクリン （������� 100μM�� ）� ● タクリン （������ 500μM� ） 5 -19 -44 -69 -94 C 時間 1 時間 -120 -120 -93 -67 -41 -15 10 36 62 88 114 140 PC #1 16.9 % 80 PCA����� マッピング（���� ����� 41%� ） 61 6 hrs PC #2 12.9 % 42 24 時間 23 4 ● Control ● ドキソルビシン （���� 1µM� ） ● ドキソルビシン （������ 100μM� ） ● タクリン （������� 100μM�� ）� ● タクリン （������ 500μM� ） -15 -33 -52 -71 -90 -110 -100 -76 -53 -30 -7 15 38 PC #1 17 % 61 6 時間 84 107 130 サンプル ドキソルビシン（���� 1μM� ） ドキソルビシン（������ 100μM� ） タクリン（������ 100μM� ） タクリン（������ 500μM� ） ドキソルビシン（���� 1μM� ） ドキソルビシン（������ 100μM� ） タクリン（������ 100μM� ） タクリン（������ 500μM� ） ドキソルビシン（���� 1μM� ） タクリン（������ 100μM� ） DE DE DE 2195 1879 1160 2307 4924 5371 6982 5672 6949 7189 122 141 91 260 966 742 1028 1004 1308 1583 （FC>3） （FDR 1%） （FC>3 + FDR<1%） 142 187 116 312 984 746 1041 3797 1337 1597 図4：全ゲノム発現マイクロアレイ解析 （A）細胞培養のPCAマッピングで、投与6時間後の同一条件でのレプリケートデー タは良好な相関を示しますが、投与1時間後の結果は相関が見られませんでした。 （B）投与6時間後のサンプルのアレイデータの階層的クラスタリングで、同一条件 でのレプリケートデータは相互に高い相関を示していました。技術的および生物学 的レプリケートの区分はそれぞれ、点線四角内の数値で表示しています。 （C）化合物を投与された細胞とDMSOのみを投与されたコントロール細胞を比較 して、発現が異なる（DE）遺伝子を同定しました。DE遺伝子数は、FDR補正p値が 0.01未満、3倍以上の倍率変化（FC）を示すもの、あるいはその両方の条件を満た すものに分けて示しています。 Improved Cellular Analysis for the Early Detection of Compound-Induced Hepatic Cytotoxicity to Reduce Animal Testing Hmox1とPcna（両方ともDNA損傷応答と修復に関与する） の転写物濃度は、タクリンとドキソルビシンにより有意に上 昇し、投与6時間後にピークに達しました。興味深いことに、 ドキソルビシン投与24時間後にはHmox1とPcnaに有意な変 化は認められませんでした。このことは、肝細胞が大規模の 細胞死を起こした時に克服される一時的なストレス応答で あることを示しています。細胞死の開始と一致して、抗アポ トーシス分子Bcl2およびSerpinb9は、6時間後と24時間後は 強くダウンレギュレートされました。これはタクリン投与サ ンプルで最も著明に認められました。しかし、ドキソルビシ ン投与では、6時間後にBcl2とSerpinb9のダウンレギュレー ションが生じ、24時間後は影響が認められませんでした。 100μM ���� タクリン 500μM ���� タクリン 1h 6h 24h Hmox1 100 0,1 1h 0,1 6h 24h Ddit1/Gadd45a 10 1h 6h 24h Hmox1 100 0,1 1h 6h 24h 0,1 24h Serpinb9 10 Log10 ΔΔCp 6h 0,1 0,01 6h 24h Serpinb9 10 0,1 1h 6h 24h Cyp1a1 Log10 ΔΔCp 10 0,01 1h 6h 24h 1h 6h 24h 0,01 1h 6h 24h Cancer Research Application Note No. 5 1h 6h 24h Ddit3 1h 6h 24h Bcl2 0,1 1h 6h 24h Bcl2 10 1 0,01 0,1 1h 0,1 1h 24h 6h 1h 6h 0,01 1h 24h 0,1 1h 0,1 24h 6h 24h Cyp3a18 10 24h 6h Slc2a1 10 Cyp3a18 10 0,1 6h Slc2a1 10 Cyp1a1 10 0,1 0,1 0,01 0,1 1h 0,1 10 0,1 1h Pcna 100 10 0,1 1μM ������� ドキソルビシン 100μM ������� ドキソルビシン 10 Ddit3 100 10 10 10 Pcna 10 Log10 ΔΔCp Log10 ΔΔCp 24h Log10 ΔΔCp Log10 ΔΔCp 0,1 6h Ddit1/Gadd45a Log10 ΔΔCp 1h 10 リファレンス 10 Log10 ΔΔCp Log10 ΔΔCp 0,1 100μM ���� タクリン 500μM ���� タクリン 1μM ������� ドキソルビシン 100μM ������� ドキソルビシン Log10 ΔΔCp リファレンス 10 生体異物トランスポーターSlc2a1は、1～24時間後まで一貫 してドキソルビシンによりアップレギュレートされました。 一方タクリンは、投与後1～6時間のみSlc2a1アップレギュ レーションを惹起しました。これは、トランスポーター活性 を上げて生体異物解毒をサポートする細胞応答を反映して います。重要なことに、チトクロムP450ファミリーに属する Cyp1a1とCyp3a18（薬物代謝に関与していることが知られ ている）は、逆の制御を受けました。Cyp1a1は投与1～24時 間後、急激にダウンレギュレートされましたが、Cyp3a18は ドキソルビシンおよびタクリンにより有意にアップレギュ レートされました。 1h 6h 図5：qRT-PCRによる遺伝子発現解析 選択した9遺伝子の相対的遺伝子発現 （ ΔΔ C p ）を 示しています。タクリン （100μMおよび500μM） とドキソルビ シン（1μMおよび100μM）投与の1・ 6・2 4 時 間 後 にサンプル を 採 取し 、 LightCycler®480システムでユニバー サル・プローブライブラリー アッセイに より解析しました。 ΔΔCpは、DMSO投 与コントロール細胞と比較した化合物 投与細胞の相対的遺伝子発現レベルを 示しています。 リファレンス遺伝子の遺伝 子発現レベルは化合物投与による経時 的な影響を受けませんでしたが、選択し た9標的遺伝子の発現レベルは、化合 物・濃度・時間に応じて有意に変化しま した。特筆すべきことは、大半の遺伝子 の発現は投与6時間後に大きく変化して いる点です。 これは、xCELLigenceシス テムによる連続的モニタリングが明らか にした細胞死の開始時点とも一致して います。 アスタリスク （*） は、対照と比較し た時の有意差、P＜0.05を示していま す。 24h 4 結論 3R：Reduce, Refine, Replaceという概念は、50年以上前に という早い段階において、試験化合物に対する濃度依存的な W.M.S. RussellとR.L. Burchが『人道的実験技術の原理（The 肝細胞応答が明らかになりました。この結果は、このような Principles of Humane Experimental Technique） 』 という著 早期の時点で、遺伝子発現に基づいた肝毒性作用を検討する 書の中で提唱したものです。3Rは、ヒト以外の脊椎動物を用 ことの有意性を示しています。全ゲノム マイクロアレイ解析 いた実験を削減し、最終的には無くしていくための方法を詳 では、投与6時間後に、再現性のある有意な遺伝子発現の変化 しく述べています（1）。毒性学では、細胞ベースのin vitro アッ が明らかになりました。これはxCELLigenceシステムのデー セイが、ヒトに対するリスク評価のために不可欠なツールで タで認められた細胞死の開始と一致していました。選択した す。in vitro アッセイを用いて毒性化合物を早期に同定できれ 一部の遺伝子に関するその後の定量的RT-PCRにより、化合 ば結果的に、薬剤試験の後期段階である化合物のin vivo 試験 物投与6時間後の遺伝子発現の有意な変化が明らかになった 数を削減できます。今回の研究でわれわれは、肝毒性評価を ことから、投与後最初の数時間以内の早期に遺伝子制御が開 目的とした、リアルタイム細胞分析・生化学的アッセイ・遺 始されていることが示されました。 伝子発現解析を含むin vitro 技術の包括的ワークフローにつ い て 述 べ ま し た。化合物投与 ラット 初代培養肝細胞 を、 結論としてこれらの結果は、この包括的ワークフロー（リア xCELLigenceシステムを用いて連続的にモニタリングした ルタイム細胞解析、生化学的エンドポイントアッセイ、遺伝子 ところ、実験全体を通じて細胞の状態に関する情報をリアル 発現解析） による付加価値を強く示すものです。xCELLigence タイムで示すことができました。このシステムを用いれば、下 システムを用いた連続的モニタリングは、わずかな細胞の作 流のプロテオミックおよびゲノミック解析を実行するのに最 用を容易に確認でき、下流のプロテオミクス・ゲノミクス解 適なタイミングを明確にできます。 析のために最適な時間を明らかにできる万能の方法です。 NimbleGenマイクロアレイを用いて適切なタイミングで解析 試験化合物の肝毒性作用は、xCELLigenceシステムにより簡 を行えば、新しい標的遺伝子やバイオマーカー候補の同定の 単にモニタリングでき、化合物誘発性細胞死の開始と進行を ために、有意義で再現性の高い全ゲノム発現データが得られ 定量化するセルインデックス（CI）プロファイルが得られま ます。ユニバーサル・プローブライブラリー アッセイを用い した。汎用の生化学的エンドポイントアッセイと薬剤投与後 た遺伝子発現解析は、事前に検証済みのRealTime ready アッ 24時間経過時点での比較において、xCELLigenceシステムは セイも利用できます。xCELLigenceシステムと、確立された 高い感度を示しました。さらに、リアルタイム解析がもたら Rocheエンドポイントアッセイ、ならびにこの新世代のRoche す動態的なプロファイルでは、毒性試験の最初から最後まで 遺伝子発現アッセイを組み合わせることで、初期安全性評価 を詳細にモニタリングできました。連続的なCIの記録は、細 の予測の質を大きく改善でき、将来的には現在の動物実験数 胞毒性を定量化し、IC50算出を行うのに最適な時点を明示し を減らすことができるでしょう。 ます。興味深いことに、CIプロファイルにより、投与6時間後 リファレンス 1. Russell, W. M. (1995) The development of the three Rs concept. Altern Lab Anim 23, 298-304 2. Xi, B., Yu, N., Wang, X., Xu, X., and Abassi, Y. A. (2008) The application of cell-based label-free technology in drug discovery. Biotechnol J 3, 484495 3. Suter, L., Babiss, L. E., and Wheeldon, E. B. (2004) Toxicogenomics in predictive toxicology in drug development. Chem Biol 11, 161-171 4. Irizarry, R. A., Hobbs, B., Collin, F., Beazer-Barclay, Y. D., Antonellis, K. J., Scherf, U., and Speed, T. P. (2003) Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 4, 249-264 5. Carvalho, C., Santos, R. X., Cardoso, S., Correia, S., Oliveira, P. J., Santos, M. S., and Moreira, P. I. (2009) Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Curr Med Chem 16, 3267-3285 6. Lagadic-Gossmann, D., Rissel, M., Le Bot, M. A., and Guillouzo, A. (1998) Toxic effects of tacrine on primary hepatocytes and liver epithelial cells in culture. Cell Biol Toxicol 14, 361-373 HIGH PURE, LIGHTCYCLER, MAGNA PURE, NIMBLEGEN, REALTIME READY and XCELLIGENCE are trademarks of Roche. E-PLATE and ACEA BIOSCIENCES are registered trademarks of ACEA. ProbeLibrary is a registered trademark of Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark. Other brands or product names are trademarks of their respective holders. 10 Improved Cellular Analysis for the Early Detection of Compound-Induced Hepatic Cytotoxicity to Reduce Animal Testing Ordering Information 製品名 製品番号 包装単位 Collagenase B 1 088 807 1 088 815 1 088 831 100mg 500mg 2.5g Collagen 1 179 179 30mg E-Plate 5 232 368 5 232 376 6���� プレート 6×6 ���� プレート RTCA MP Station 5 331 625 1�������� インスツルメント ATP Bioluminescence Assay Kit HS II 1 699 709 1,000アッセイ （マイクロプレート）, 500アッセイ （チューブ） High Pure FFPE RNA Micro Kit 4 823 125 50回精製 MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I Lysis/ Binding Buffer - Refill 3 246 752 100mL tRNA from brewer’s yeast 109 517 109 525 100mg 500mg High Pure PCR Cleanup Micro Kit 4 983 955 4 983 912 50回精製 200回精製 NimbleGen Rat Gene Expression 12×135K Array 5 543 827 1���� スライド NimbelGen MS 200 Microarray Scanner 5 394 341 1インスツルメント NimbleScan Software 5 933 315 ユーザーライセンス1人分 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 4 379 012 4 896 866 4 897 030 1キット（50回反応） 1キット（100回反応） 1キット（200 回反応） LightCycler® 480 Probes Master 4 707 494 4 887 301 4 902 343 5×1mL 10×5mL 1×50mL ユニバーサル��������������������������������������������������������������� ・�������������������������������������������������������������� プローブライブラリー アッセイに関する詳細情報は、www.universalprobelibrary.comをご覧����� くだ��� さい。 Cancer Research Application Note No. 5 11 05903424001JP ① 0310 お問い合わせは・ ・ ・ AS事業部（研究用試薬・機器） 本社：〒105-0014 東京都港区芝２丁目６番１号 TEL.03-5443-5287 FAX.03-5443-7098 E - M a i l：tokyo.biochemicals＠roche.com U R L：http：//www.roche-biochem.jp
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