JP 2008-501356 A 2008.1.24
(57)【要約】
接着性神経幹細胞の均質な対称分裂集団が、ＥＧＦレ
セプターファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達
経路のアクチベーターを、必要に応じてＦＧＦレセプタ
ーの下流のシグナル伝達経路のアクチベーターと組み合
わせて用いて、ＥＳ細胞または胎児もしくは成体脳単離
物から得られる。神経幹細胞集団は、純度が高く、そし
て１００継代を超えた継代後でもニューロンに分化する
能力を保持している。
(2)
JP 2008-501356 A 2008.1.24
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹（ＮＳ）細胞の対称分裂を促進する方法であって、
（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；
および
（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、基材に付着した該細胞を培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターが、
10
ＥＧＦレセプターのアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アゴニストが、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、エ
ピレグリン、ベータセルリン、ニューレグリン１、２、３もしくは４、およびＣｒｉｐｔ
ｏ−１からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターが、ＦＧＦレセプ
ターのアゴニストである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記アゴニストが、ＦＧＦ−２である、請求項４に記載の方法。
20
【請求項６】
組成物であって、
神経幹細胞；
ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および
ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む、組成物。
【請求項７】
前記神経幹細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求
項６に記載の組成物。
【請求項８】
30
前記神経幹細胞が、それらがＲＣ２、３ＣＢ２、ＢＬＢＰ、およびＳｏｘ−２の発現に
対して陽性であることで特徴付けられている、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
前記神経幹細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイス
Ｘ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項８に記載
の組成物。
【請求項１０】
前記神経幹細胞がさらに、それらが
40
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項８または
９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記神経幹細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に
対して陰性である、請求項６から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記神経幹細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または該神経
幹細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項６から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
50
(3)
JP 2008-501356 A 2008.1.24
前記組成物中の細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細
胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、請求項６から１２のいずれかに記載の組
成物。
【請求項１４】
請求項１から５のいずれかに記載の方法により得られ得る神経細胞の集団であって、該
細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、集団。
【請求項１５】
請求項１から５のいずれかに記載の方法により得られ得る神経細胞の集団であって、該
集団中の神経幹細胞が、それらがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、およびＢＬＢＰの発現に対
して陽性であることで特徴付けられている、集団。
10
【請求項１６】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイス
Ｘ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項１５に記
載の神経細胞の集団。
【請求項１７】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項１５また
20
は１６に記載の神経細胞の集団。
【請求項１８】
前記集団中の神経幹細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１
の発現に対して陰性である、請求項１４から１７のいずれかに記載の神経細胞の集団。
【請求項１９】
前記集団中の神経幹細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、また
は該神経幹細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項１４から１８のいずれかに記載の神経
細胞の集団。
【請求項２０】
前記細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対する
30
マーカーの発現に対して陽性である、請求項１４から１９のいずれかに記載の神経細胞の
集団。
【請求項２１】
神経幹細胞を調製する方法であって、
請求項１から５のいずれかに記載の方法に従って神経幹細胞を培養し、それによって神
経幹細胞の培養物を得る工程、および
該培養物から神経幹細胞を単離する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法により得られ得る神経幹細胞。
40
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法により得られ得る神経幹細胞であって、該細胞が、それがマー
カーＲＣ２、３ＣＢ２、およびＢＬＢＰの発現に対して陽性であることで特徴付けられて
いる、神経幹細胞。
【請求項２４】
前記細胞がさらに、それが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイス
Ｘ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項２３に記
載の神経幹細胞。
50
(4)
JP 2008-501356 A 2008.1.24
【請求項２５】
前記細胞がさらに、それが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項２３また
は２４に記載の神経幹細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して
陰性である、請求項２２から２５のいずれかに記載の神経幹細胞。
【請求項２７】
前記細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または該細胞が、不
10
死化幹細胞ではない、請求項２２から２６のいずれかに記載の神経幹細胞。
【請求項２８】
神経幹細胞株を樹立する方法であって、
（ａ）単一の神経幹細胞を得る工程、
（ｂ）請求項１から５のいずれかに記載の方法に従って該神経幹細胞を培養する工程
を含み、
それによって神経幹細胞の集団を得る、方法。
【請求項２９】
前記神経幹細胞の集団が、クローン集団であり、そして該細胞の全てが、単一の神経幹
細胞の子孫である、請求項２８に記載の方法。
20
【請求項３０】
前記単一の神経幹細胞が、請求項２１に記載の方法に従って得られる、請求項２８また
は２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞が、ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチ
ベーター、およびＦＧＦレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチベーターの存在下
で維持されている、細胞株。
【請求項３２】
前記細胞株がクローン原性である、請求項３１に記載の細胞株。
【請求項３３】
30
請求項２８から３０のいずれかに記載の方法によって得られ得る細胞株であって、該細
胞が、それらがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、Ｓｏｘ−２、およびＢＬＢＰの発現に対して
陽性であることで特徴付けられている、細胞株。
【請求項３４】
前記細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイス
Ｘ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項３３に記
載の細胞株。
【請求項３５】
40
前記細胞がさらに、それらが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項３３また
は３４に記載の細胞株。
【請求項３６】
細胞が、それらがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、Ｓｏｘ−２、およびＢＬＢＰの発現に対
して陽性であることで特徴付けられている、細胞株。
【請求項３７】
前記細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイス
50
(5)
JP 2008-501356 A 2008.1.24
Ｘ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項３６に記
載の細胞株。
【請求項３８】
前記細胞がさらに、それらが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項３６また
は３７に記載の細胞株。
【請求項３９】
前記細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して
10
陰性である、請求項３６から３８のいずれかに記載の細胞株。
【請求項４０】
前記細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対する
マーカーの発現に対して陽性である、請求項３６から３９のいずれかに記載の細胞株。
【請求項４１】
前記細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または該細胞が、不
死化細胞ではない、請求項３６から４０のいずれかに記載の細胞株。
【請求項４２】
前記細胞株が神経幹細胞株である、請求項３１から４１のいずれかに記載の細胞株。
【請求項４３】
20
培養中の神経幹細胞の対称分裂を促進するための、ＥＧＦファミリーのレセプターから
下流のシグナル伝達経路のアクチベーターの使用。
【請求項４４】
接着性の無血清培養中の神経幹細胞の対称分裂を促進するための、
（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；
および
（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
の組合せの使用。
【請求項４５】
対称的に分裂している神経幹細胞のトランスフェクトされた集団を得てこれを維持する
30
方法であって、
（ａ）選択マーカーＡをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程であ
って、該選択マーカーＡが、神経前駆細胞特異的プロモーターの制御下で発現され得る、
工程；
（ｂ）該ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化を促進する工程；
（ｃ）該選択マーカーＡを発現する神経幹細胞について選択する工程；および
（ｄ）該選択された細胞を、請求項１から５のいずれかに記載の方法に従って培養する
工程
を含む、方法。
【請求項４６】
40
前記選択マーカーＡが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項４
５に記載の方法。
【請求項４７】
前記神経前駆細胞特異的プロモーターが、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、およ
びＢＬＢＰからなる群から選択される、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法の工程が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の順に実施される、請求項４５か
ら４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化を促進する方法であって、
50
(6)
JP 2008-501356 A 2008.1.24
（１）単層培養または（２）胚様体分化により、ＥＳ細胞を神経前駆体に転換する工程
、および
ＮＳＡ培地で該神経前駆体を培養する工程
を含む、方法。
【請求項５０】
前記ＮＳＡ培地が、グルコースおよびＨＥＰＥＳを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
対称的に分裂している神経幹細胞の集団を調製し維持する方法であって、
請求項４９または５０に記載の方法に従って神経前駆細胞の集団を得る工程；および
該集団を、請求項１から５のいずれかに記載の方法に従って培養する工程
10
を含む、方法。
【請求項５２】
神経前駆細胞へのＥＳ細胞の分化に関して因子の効果をアッセイするためのインビトロ
での方法であって、
該因子の存在下で、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法に従ってＥＳ細胞を培
養する工程
を含む、方法。
【請求項５３】
神経幹細胞の分化に関して因子の効果をアッセイするためのインビトロでの方法であっ
て、
20
請求項６から１３に記載の組成物、請求項１４から２０に記載の集団、請求項３１から
４２に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項２２から２７に記載の単一の神
経幹細胞と、該因子とを接触させる工程
を含む、方法。
【請求項５４】
前記因子が、誘導因子またはブロッキング因子のいずれかであり得る、請求項５２また
は５３に記載のインビトロでの方法。
【請求項５５】
神経変性疾患および脳損傷の治療用調製物の製造のための、請求項６から１３に記載の
組成物、請求項１４から２０に記載の集団、請求項３１から４２に記載の細胞株中に存在
30
する神経幹細胞または請求項２２から２７に記載の単一の神経幹細胞の使用。
【請求項５６】
神経変性疾患および脳損傷の治療方法であって、請求項６から１３に記載の組成物、請
求項１４から２０に記載の集団、請求項３１から４２に記載の細胞株中に存在する神経幹
細胞または請求項２２から２７に記載の単一の神経幹細胞の患者への移植を含む、方法。
【請求項５７】
請求項６から１３に記載の組成物、請求項１４から２０に記載の集団、請求項３１から
４２に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項２２から２７に記載の単一の神
経幹細胞をトランスフェクトする方法であって、
（ａ）選択マーカーＢをコードする構築物で該神経幹細胞をトランスフェクトする工程
40
であって、該選択マーカーＢが、組織特異的プロモーターの制御下で発現され得る、工程
；および
（ｂ）該選択マーカーＢを発現する神経幹細胞について選択する工程
を含む、方法。
【請求項５８】
前記選択マーカーＢが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項５
７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項６から１３に記載の組成物、請求項１４から２０に記載の集団、請求項３１から
４２に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項２２から２７に記載の単一の神
50
(7)
JP 2008-501356 A 2008.1.24
経幹細胞であって、選択マーカーＢをさらに含む、細胞。
【請求項６０】
神経幹細胞を含む組成物であって、該神経幹細胞が接着培養中にあり、そして該組成物
中の細胞の少なくとも８０％が神経幹細胞である、組成物。
【請求項６１】
前記組成物中の細胞の少なくとも９０％が神経幹細胞である、請求項６０に記載の組成
物。
【請求項６２】
前記神経幹細胞が、少なくとも３０回継代されている、請求項６０または６１に記載の
組成物。
10
【請求項６３】
前記神経幹細胞が、少なくとも６０回継代されている、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
神経幹細胞を得る方法であって、
（ｉ）神経幹細胞に分化し得る多分化能性もしくは分化多能性幹細胞を得る工程、
（ ii） （ ｉ ） の 細 胞 を 、 分 化 多 能 性 細 胞 に 非 許 容 性 で あ る 培 地 で そ し て （ ａ ） Ｅ Ｇ Ｆ フ
ァミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストおよび（ｂ）ＦＧＦファミ
リーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストの存在下で培養する工程
を含む、方法。
【請求項６５】
20
前記幹細胞が分化多能性幹細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記分化多能性幹細胞がＥＳ細胞またはＥＧ細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞をＥＧＦレセプターのアゴニストおよびＦＧＦレセプターのアゴニストの存在
下で培養する工程を含む、請求項６４から６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
前記神経幹細胞からニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞を得る工程をさらに含
む、請求項６４から６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
30
核再プログラミング方法であって、ドナー核が、請求項２２から２７、３１から４２、
５９、および６０から６３のいずれかに記載の神経幹細胞または請求項１から５、２１、
２８から３０、４５から５１、および６４から６８のいずれかに記載の方法に従って得ら
れた細胞に由来する、方法。
【請求項７０】
核再プログラミング方法であって、
ドナー細胞を得る工程；
レシピエント細胞を得る工程；
該ドナー細胞の核を該レシピエント細胞に移入する工程であって、該ドナー細胞が、（
ｉ）請求項２２から２７、３１から４２、５９、および６０から６３のいずれかに記載の
40
神 経 幹 細 胞 、 ま た は 、 （ ii） 請 求 項 １ か ら ５ 、 ２ １ 、 ２ ８ か ら ３ ０ 、 ４ ５ か ら ５ １ 、 お よ
び６４から６８のいずれかに記載の方法に従って得られた細胞である、工程；および
該細胞を培養して該ドナー細胞の核を再プログラミングし、それによって再プログラミ
ングされた細胞を得る工程
を含む、方法。
【請求項７１】
必要に応じて前記ドナー細胞の核の移入前におよび必要に応じて該ドナー細胞の核の移
入後に、前記レシピエント細胞の核を除去する工程を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ドナー細胞の核を遺伝子操作する工程を含む、請求項７０または７１に記載の方法
50
(8)
JP 2008-501356 A 2008.1.24
。
【請求項７３】
疾患原因遺伝子配列または推定疾患原因遺伝子配列を前記ドナー細胞の核に導入する工
程を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
請求項７３に記載の方法であって、
前記再プログラミングされた細胞を培養して該再プログラミングされた細胞に由来する
複数の細胞を得る工程；および
アッセイに該複数の細胞を用いる工程
を含む、方法。
10
【請求項７５】
請求項７０から７４のいずれかに記載の方法であって、
前記再プログラミングされた細胞に由来する組織を含む動物を得る工程；および
該組織を用いてアッセイを実施する工程
を含む、方法。
【請求項７６】
前記レシピエント細胞が卵母細胞である、請求項７０から７５のいずれかに記載の方法
。
【請求項７７】
細胞を再プログラミングする方法であって、
20
細胞の混合集団を提供する工程；
該混合集団から、請求項２２から２７、３１から４２、５９、および６０から６３のい
ずれかに記載の細胞を単離する工程；および
該単離された細胞の核をレシピエント細胞に移入する工程
を含む、方法。
【請求項７８】
前記単離された細胞を、その核を前記レシピエント細胞に移入する前に遺伝子操作する
工程を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
請求項７７または７８に記載の方法であって、
30
前記単離された細胞を培養して細胞のクローン集団を得る工程；および
前記集団中の１つの細胞の核を前記レシピエント細胞に移入する工程
を含む、方法。
【請求項８０】
非ヒト動物をクローン化する方法であって
（ｉ）該非ヒト動物から神経幹細胞を得る工程；
（ ii） 該 非 ヒ ト 動 物 と 同 じ 種 の 卵 母 細 胞 を 得 る 工 程 ；
（ iii） 該 神 経 幹 細 胞 の 核 を 該 卵 母 細 胞 に 移 入 す る 工 程 ；
（ iv） （ iii） で 得 ら れ た 細 胞 を 該 同 じ 種 の 雌 に 移 植 す る 工 程
を含む、方法。
40
【請求項８１】
前記神経幹細胞が、（ｉ）請求項２２から２７、３１から４２、５９、および６０から
６ ３ の い ず れ か に 記 載 の 神 経 幹 細 胞 、 ま た は 、 （ ii） 請 求 項 １ か ら ５ 、 ２ １ 、 ２ ８ か ら ３
０、４５から５１、および６４から６８のいずれかに記載の方法に従って得られた細胞で
ある、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
実施例のいずれかを参照して本明細書中に実質的に記載される、神経幹（ＮＳ）細胞の
対称分裂を促進する方法。
【請求項８３】
実施例のいずれかを参照して本明細書中に実質的に記載される、細胞株。
50
(9)
JP 2008-501356 A 2008.1.24
【請求項８４】
ニューロンを得る方法であって、（ａ）ＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下でかつ
ＥＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、神経幹細胞を培養する工程；および（ｂ）そ
の後、ＦＧＦレセプターのアゴニストの不在下でかつＥＧＦレセプターのアゴニストの不
在下で、該細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項８５】
単層培養に細胞を播種する工程を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ＥＧＦを含まないがＦＧＦ−２を含む培地にＮＳ細胞を移す工程、および少なくとも２
日間それらを培養する工程、および次いで該培地からＦＧＦ−２を除去する工程を含む、
10
請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記神経幹細胞が、請求項１から５、２１、２８から３０、４５から５１、および６４
から６８のいずれかに記載の方法に従って得られる、請求項８４から８６のいずれかに記
載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞、ならびに幹細胞の対称分裂および自己再生を促進するための神
経幹細胞（ＮＳ細胞またはＮＳＣ）の培養条件および培養方法に関する。組成物、細胞集
20
団、細胞株、および単一の神経幹細胞もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
神経幹細胞は種々の供給源からインビトロで単離されるといわれているが、これまで、
これらの細胞を対称分裂している未分化状態で大規模培養で増殖することはできなかった
。この状態での細胞の長期の増殖が、実験的観点および治療的観点の両方から、非常に望
ましい。純粋な神経幹細胞集団を有することにより、ニューロン、星状細胞、および乏突
起膠細胞の３つの細胞型への方向付けられた分化が可能になる。
【０００３】
神経幹細胞を培養する１つの公知の方法は、不均質な細胞集団中の微量成分であるにも
30
関わらず、神経球系である。この系は、不均質な細胞の凝集体の連続継代を包含するが、
真の神経幹細胞はほんのわずかな割合でしかない。神経球中の細胞の大部分は、分化が方
向付けられた前駆体である。
【０００４】
神経球の異質性および不安定性、ならびにそれがニューロンを生成する能力に制限があ
る こ と の 多 く の 報 告 が あ る （ 例 え ば 、 Morsheadら , 2002） 。 Rappaら Neuroscience 2003
は、フィブロネクチン上にそれらを１∼７日間播種し、次いで神経球を再形成することに
より神経球細胞をトランスフェクトするための方法を報告しているが、（ある場合には）
神経球内の幹細胞のいかなる顕著な特徴づけも提供していない。
【０００５】
40
Suslovら 2002は 、 神 経 球 系 が 、 そ の 中 の 任 意 の 幹 細 胞 の 有 意 義 な 特 徴 づ け を 可 能 に す
るには不均質すぎることの明確なデータを提供している。主な結論は、神経球内の異質性
がある−「クローン内神経細胞系統多様性を示す、すなわち、それらは、ＮＳＣに加えて
、異なる分化状態のニューロンおよび膠細胞前駆体を含む」−だけでなく、異なるクロー
ン 神 経 球 株 間 の 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ィ ー ル に 大 き な 差 異 が 存 在 す る こ と で あ る 。 Suslovの 遺
伝子発現プロファイリングは、「得られた分子表現型は、我々の系の中のクローン原性Ｎ
ＳＣが不均質であり、別個の神経発達方向の決定を反映しているサブセットを有すること
を示している」と論文中に明白に確認されているように、神経球内の幹細胞の定義を構成
していない。
【０００６】
50
(10)
JP 2008-501356 A 2008.1.24
こ の 分 野 に お け る 多 く の 文 献 は 、 膠 細 胞 の 特 性 を 記 載 し て い る 。 Skoghら MCN 2001は 、
ＧＦＡＰを発現しそしてＲＣ２およびネスチンに対して可変的に染色する膠細胞の培養物
を記載している−マウスＧＦＡＰは、インビボにて放射神経膠で発現されていないことに
留 意 さ れ た い （ Rakic, 2003） 。 彼 ら は 、 彼 ら の 細 胞 が 、 神 経 原 性 放 射 神 経 膠 の ホ ー ル マ
ー ク で あ る Ｐ ａ ｘ ６ を 発 現 し て い な い こ と を 報 告 し て お り （ Malatestaら , 2001, 2003）
、そして彼らは、他の放射神経膠マーカーはどれも調べていない。彼らは、不均質な培養
物を有していたが、クローン分析を実施しなかった。
【０００７】
インビトロでの放射神経膠の他の報告は、それらを分化の中間体または終末産物として
み な し て い る 。 し た が っ て 、 Bibelら （ Nat Neurosci, 2004） は 、 一 過 性 放 射 神 経 膠 様 細
10
胞 を 介 す る Ｅ Ｓ 細 胞 か ら の ニ ュ ー ロ ン の 生 成 を 報 告 し て お り 、 そ し て Greggお よ び Weiss（
J Neurosci, 23: 11587-601,2003; 米 国 特 許 公 開 ２ ０ ０ ３ ／ ０ ０ ３ ２ １ ８ １ ） は 、 放 射 神
経 膠 へ の 神 経 球 細 胞 の 「 分 化 」 を 記 載 し て い る 。 Hartfussら （ Dev Biol, 2001） は 、 放 射
神経膠が神経球に存在していることを示している。
【０００８】
Greggお よ び Weissは 、 放 射 神 経 膠 が 神 経 球 の 分 化 産 物 で あ る こ と を 見 出 し 、 「 こ れ ら の
結果は、神経幹細胞がＲＧＣ［放射神経膠細胞］を生じ得ること、およびＲＧＣが導く移
動は成体ＣＮＳにおいて繰り返され得ることを示唆している」と結論した。優勢な意見は
、放射神経膠が、神経球から生じる分化した細胞型の１つであるというものである。
【０００９】
20
Liourお よ び Yu（ Glia, 2003） は 、 放 射 神 経 膠 細 胞 分 化 が Ｅ Ｓ 細 胞 か ら 得 ら れ 得 る こ と
を示しているが、この分野の他の報告と同様に、神経原性放射神経膠の発現を報告してい
ない。
【００１０】
Gobbelら Brain Res 2003は 、 「 基 材 に 緩 く 付 着 し た 増 殖 し た 細 胞 の 球 状 塊 と し て の 」
、すなわち、均一な単層としてではない、多分化能性ラット細胞の増殖を報告している。
さらに、この論文の要約は、「これらの細胞は、３つの分裂のうち約２つにおいて分裂終
了細胞を生じ、このため増殖を困難にしている」と結論している。それらの培養物中には
広範囲の膠原性分化があるが、著者らは「比較的少ない」（＜３％）のニューロンを見出
している。彼らは、彼らの細胞の分子表現型を提供していない。
30
【００１１】
ＷＯ０１／３０９８１は、ニューロンに分化し得る細胞の培養物を記載している。しか
し、これらの細胞は、ＧＦＡＰおよびネスチンに対して陽性であり、星状膠細胞として記
載され、そして比較的純粋でない混合集団である。
【００１２】
幹細胞が特定の細胞微環境、すなわちニッチを必要とするという概念は、幹細胞生物学
において通説である。常に認められているわけではないが、神経球において、幹細胞は、
前駆体、芽球細胞、および未熟分化子孫の中で総細胞のほんのわずかな割合しか占めてい
ないことが知られている。この混合細胞型の凝集は、その中で小部分である、幹細胞であ
り得る細胞のためのニッチを構成し得る。
40
【００１３】
文献の中で、ＥＳ細胞から神経幹細胞の均質な集団を誘導するとの報告はなく、唯一、
神経膠に制限されるようになる前に一過的に増殖され得る神経上皮前駆細胞を誘導すると
の 報 告 が あ る （ 例 え ば 、 Brustleら , Science 1999） 。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、当該分野には多数の課題が存在している。
【００１５】
全ての報告は、それらの培養物が不均質であることを認めている。対称的に分裂しかつ
50
(11)
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未分化の状態で神経幹細胞の大規模培養を維持するために、神経球系を使用することはで
きなかった。多数の神経幹細胞を培養する他の試みは、５∼２０継代を越えてはうまくい
かず、また細胞が分化する傾向が高いことによって妨害されてきた。例外は、成体ラット
海馬幹細胞における研究であるが、これらは、核型が異常であり、そして低い効率でニュ
ーロンを形成する。
【００１６】
一過性の神経発生前駆体が知られているが、永久または半永久の自己再生幹細胞は単離
精製されていない。
【００１７】
ＥＳ細胞から神経幹細胞を誘導し、次いでこれらの神経幹細胞を純粋培養で維持するこ
10
とが望まれているが、これは、これまでできていない。また、移植のためにＥＳ細胞から
神経幹細胞を誘導することも望まれているが、公知のＥＳ誘導細胞集団中のＥＳおよび他
の非神経細胞の残存は、レシピエント動物に腫瘍を生じる。さらに、胎児および出生後Ｃ
ＮＳから純粋な神経幹集団を得ることが望まれている。
【００１８】
神経幹細胞の挙動を制御する分子および細胞事象の完全な理解は、胚発生の理解のため
の経路としてだけではなく、将来の治療適用のために神経幹細胞が単離され増殖されそし
て制御され得る枠組みとしてもまた、必須である。当該分野で公知の神経幹細胞の培養方
法は、上記の理由のために、このような研究および治療適用に使用するには不適切である
。したがって、細胞を対称的に分裂している自己再生状態に維持できる、大量の神経幹細
20
胞を培養するための方法および条件を開発することが所望され得る。限定培地の使用は、
臨床設定で非常に所望され得るので、上記要件を満たしている、限定した培養培地を有す
ることが特に所望され得る。
【００１９】
本発明は、上記課題の１つ以上を解決する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
より詳細には、本発明は、神経幹（ＮＳ）細胞の対称分裂を促進する方法を提供し、こ
の方法は、
（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；
30
および
（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、該細胞を培養する工程
を含む。
【００２１】
好ましい実施態様では、細胞は、血清の不在下で、例えば、血清を含まずかつ血清抽出
物を含まない培地で培養される。さらに、細胞は基材に付着されて、別の言い方をすれば
、接着培養で、培養されることが好ましい。また、培養培地が、インスリンまたは細胞上
のインスリンレセプターの別のアゴニストを含むことが好ましい。
【００２２】
40
本発明においては、用語「促進する」は、神経幹細胞を対称的に分裂している状態に維
持することを包含すると理解される。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、多くの継代にわたって未分化状態での神経幹細胞の自己再
生および対称分裂を支持する、および好ましくは促進する培養培地が提供される。この培
地は、神経幹細胞の非対称分裂および分化を実質的に防ぐ。
【００２４】
本発明はさらに、本明細書中のプロトコルに詳細に記載されるように、神経幹細胞を得
る方法を提供し、そしてさらに、このような方法により得られる細胞を提供する。
【００２５】
50
(12)
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本発明はまた、神経細胞集団、組成物、細胞株、クローン原性細胞株、および単一の神
経幹細胞を提供し、これらは、自己再生性の対称的に分裂している神経幹細胞を含む。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、ＥＳ細胞から神経幹細胞への分化を促進するための方法、お
よび自己再生性の対称的に分裂している実質的に未分化の状態で得られる神経幹細胞を維
持するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（定義の節）
「神経幹細胞」
10
本明細書中で使用される用語「神経幹細胞」とは、ニューロンおよび神経膠の両方を生
成する潜在能を維持しながら２０∼３０よりも多くの細胞分裂を受け得る細胞を記載して
いる。好ましくは、該細胞は、４０より多くの、より好ましくは５０より多くの、最も好
ましくは無制限のこのような細胞分裂を受け得る。
【００２８】
神経幹細胞は、対称的または非対称的のいずれかで分裂し得る。対称的に分裂している
場合、神経幹細胞は、分裂して２つの娘神経幹細胞または２つの方向付けられた前駆体を
形成する。しかし、他に記載されない限り、対称分裂とは、本明細書中では対称的な自己
再生をいう。非対称的に分裂している場合、神経幹細胞は、分裂して１つの娘神経幹細胞
と１つの方向付けられた前駆体（例えば、ニューロン前駆体または神経膠前駆体のいずれ
20
か）とを形成する。
【００２９】
本発明の神経幹細胞は、放射神経膠として記載され得、そして放射神経膠マーカーＲＣ
２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、およびＰａｘ６の少なくとも１つ（および好まし
くは全部）を発現することが示されている。好ましくは、本発明の神経幹細胞は、ＲＣ２
、３ＣＢ２、およびＧＬＡＳＴを発現している。より好ましくは、細胞は、ＲＣ２、３Ｃ
Ｂ２、ＧＬＡＳＴ、および、ＢＬＢＰもしくはＰａｘ−６の少なくとも１つを発現してい
る。本発明の神経幹細胞はまた、それらが神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメン
チン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニンの少なくとも１つ（好ましくは全部
）発現に対して陽性であり、そしてＯｃｔ−４またはＮａｎｏｇの少なくとも１つ（好ま
30
しくは両方）の発現に対して陰性であることでもまた特徴付けられ得る（実施例１∼３も
また参照のこと）。
【００３０】
本発明の神経幹細胞は、定義により多分化能性である、すなわち、それらは、多数の神
経細胞型（例えば、ニューロン／神経膠）に分化し得る。以下の実施例は、本発明の方法
に従って培養された神経幹細胞が、それらの潜在能を保持しており、そして全ての期待さ
れる細胞型に分化し得ることを確証している。
【００３１】
「神経幹細胞の供給源」
広範な種々の供給源から本発明の神経幹細胞を誘導することができる。例えば、神経幹
40
細胞は、胚から直接、成体組織から、胎児組織から、または胚性幹（ＥＳ）細胞（野生型
または遺伝子改変ＥＳ細胞のいずれか）から誘導され得る。好ましくは、本発明の神経幹
細胞は、マウスもしくはヒトのＥＳ細胞から誘導されるか、またはマウスもしくはヒトの
胎児細胞から誘導される。
【００３２】
本発明の神経幹細胞は、とりわけ、ヒト、霊長類、げっ歯類、および鳥類に由来し得る
。好ましくは、神経幹細胞は、哺乳動物、特にマウス、ラット、およびヒトに由来する。
【００３３】
「ＥＧＦレセプターファミリー」
本明細書中で使用される用語「ＥＧＦレセプターファミリー」は、ＥＧＦシグナル伝達
50
(13)
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因子のファミリーによって活性化され得るレセプター（通常、ホモダイマーもしくはヘテ
ロダイマーレセプター）のファミリーを記載している。レセプターは、４つの非常に相同
性の高い膜貫通糖タンパク質ＥｒｂＢ−１（ＥＧＦ−Ｒとしても知られる）、ＥｒｂＢ−
２、ＥｒｂＢ−３、およびＥｒｂＢ−４のファミリーで構成される。
【００３４】
「ＥＧＦレセプター」というときは、ＥＧＦレセプターファミリーの任意のモノマーも
しくはダイマーレセプター複合体を包含する。
【００３５】
各レセプターは、細胞外リガンド結合ドメイン、単一疎水性膜貫通ドメイン、および１
型レセプターチロシンキナーゼ活性によってシグナル伝達の原因となる細胞質チロシンキ
10
ナーゼドメインを有する。これらのレセプターのいずれかへのリガンドの結合は、レセプ
ターの二量体化および自己リン酸化、続いて多数の細胞基質のリン酸化を生じ、種々の生
物学的効果に至る。レセプターの二量体化は、レセプターリガンドおよび毒性環境刺激（
例えば、ＵＶ照射）を含む種々の刺激によって引き起こされ得る。各ダイマーレセプター
は、異なるＳＨ２含有エフェクタータンパク質を補充することによって別個のシグナル伝
達経路を開始させる。例えば、ＥＧＦ−Ｒダイマーは、グアニンヌクレオチド放出因子Ｓ
ＯＳにカップリングされたアダプタータンパク質Ｇｒｂと複合体化し得る。Ｇｒｂ−ＳＯ
Ｓ複合体は、レセプター中のホスホチロシン部位に直接結合し得るか、またはＳｈｃを介
して間接的に結合し得る。これらのタンパク質相互作用は、ＳＯＳをＲａｓに近接した位
置にもたらし、Ｒａｓを活性化させる。このことは引き続き、ＥＲＫおよびＪＮＫのシグ
20
ナル伝達経路を活性化させ、引き続き、遺伝子発現を調節する転写因子（例えば、ｃ−ｆ
ｏｓ、ＡＰ−１、およびＥｌｋ−１）を活性化させる。ＥＧＦレセプターはまた、ＰＬＣ
γシグナル伝達経路も活性化させ得る。
【００３６】
「ＦＧＦレセプター」
本明細書中で使用される用語「ＦＧＦレセプター」は、膜貫通ＦＧＦレセプターチロシ
ンキナーゼのファミリーの任意のメンバーを記載している。これらのレセプターの４つの
主要なイソ型ＦＧＦＲ１、２、３、および４が存在し、そしてそれらは、ヘパリンおよび
ヘパラン硫酸（ＨＳ）系と密に関連して作用することが知られている。ＦＧＦレセプター
というときは、ＦＧＦレセプターファミリーの任意のモノマーまたはダイマー（ホモもし
30
くはヘテロダイマー）複合体を含む。
【００３７】
ＦＧＦレセプターと関連した細胞性シグナル伝達経路は、ＭＡＰキナーゼ経路、および
ＰＬＣγ経路を含む。
【００３８】
「培養培地」
本発明で使用される培養培地は、好ましくは、必要に応じて付加成分が添加された基本
培地を含む。
【００３９】
基本培地は、神経幹細胞のための炭素および／またはビタミンおよび／またはミネラル
40
の必須供給源を供給する培地である。基本培地は、一般に、タンパク質を含まず、そして
それ自身単独では神経幹細胞の自己再生／対称分裂を支持し得ない。
【００４０】
好ましくは、本発明で使用される培養培地は、例えば、血清および／またはフィーダー
細胞のような非限定である成分、すなわち、その含有量が不明である成分、または未特定
の非限定または変動のある因子を含み得る成分、を含まない。血清を含まずかつ血清抽出
物を含まない、完全限定培地を用いる利点は、神経幹細胞の培養およびそれに続く操作の
ために、効率的かつ一貫したプロトコルが導かれ得ることである。
【００４１】
「培養表面」
50
(14)
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本発明の全ての局面における神経幹細胞の培養のための代表的な表面は、細胞培養に有
用であると当該分野で認識されている培養表面であり、そしてこれらには、プラスチック
製表面、金属製表面、複合材製表面が含まれるが、通常は、広く市販されているプラスチ
ック製組織培養プレートのような表面が用いられる。このようなプレートは、しばしば、
直径数センチメートルである。スケールアップのために、このタイプのプレートは、ずっ
とより大きい直径で用いられ得、そして多くの繰り返しプレートユニットが用いられ得る
。
【００４２】
培養表面は、通常には表面上にコーティングされた、細胞接着タンパク質をさらに含み
得る。幹細胞上に存在するレセプターもしくは他の分子が、該タンパク質または他の細胞
10
培養基材に結合し、そしてこれは、表面への接着を促進し、そして増殖を促進する。ゼラ
チンでコーティングしたプレートが特に好ましい。
【００４３】
本発明は、ＥＧＦレセプターのアゴニストまたはＥＧＦおよびＦＧＦ−２レセプターの
両方のアゴニストを含む培地中の基材に付着した神経幹細胞の培養が、幹細胞の制限のな
い対称分裂を促進しそしてニューロン／神経膠へのそれらの分化を実質的に防ぐとの知見
に基づく。
【００４４】
本発明の種々の局面を、ここに詳述する。
【００４５】
20
本発明の第一の局面は、神経幹（ＮＳ）細胞の対称分裂を促進する方法を提供し、この
方法は、
（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；
および
（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、該細胞を培養する工程
を含む。
【００４６】
本発明の別の方法は、神経幹細胞を得るために、以下の工程を含む：
（１）神経幹細胞を含む細胞の混合集団を得る工程；
30
（２）（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベー
ター；および（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含
む培地に該細胞を再播種する工程；
（３）該細胞を培養する工程；
（４）細胞の凝集体を回収する工程；
（５）（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベー
ター；および（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含
む培地に該細胞を再播種する工程；
（６）該細胞を培養する工程；
（７）（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベー
40
ター；および（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含
む培地に、単一細胞として細胞を再播種する工程。
【００４７】
この方法は、例えば、このようなマーカーの発現を、それらの分化した子孫でのその発
現に比較して神経幹細胞で優先的に活性なプロモーターに連結させることにより、神経幹
細胞特異的マーカーを発現している細胞について選択することが付加され得る。好ましく
は、この方法は、６５％以下のコンフルエンスで、より好ましくは５５％以下のコンフル
エンスで、特に５０％を下回るコンフルエンスで、細胞を継代させる工程を含む。
【００４８】
本発明の方法の他の好ましい特徴は、実施例９で本発明のプロトコルに記載される通り
50
(15)
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である。
【００４９】
本発明の培養物は、好ましくは、接着培養であり、すなわち細胞が基材に付着されてい
る。
【００５０】
基材は、代表的には、培養容器または別の物理的支持体での表面、例えば、培養ディッ
シュ、フラスコ、ビーズ、もしくは他のキャリアでの表面である。好ましくは、基材は、
細胞の接着性を向上させるためにコーティングされていおり、そして適切なコーティング
には、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチン、およびゼラチンが含まれる。細胞が、単
層培養で増殖し、懸濁中で増殖せず、細胞のボールもしくは塊として増殖しないこともま
10
た好ましい。より高い密度では、細胞は、互いに積み重なり始め得るが、培養物は、基材
に付着されて、本質的に単層であるかまたは単層として開始する。
【００５１】
ＥＧＦファミリーのレセプターから下流の１つ以上のシグナル伝達経路は、好ましくは
、ＥＧＦファミリーのレセプターのアゴニストを用いて活性化され得る。ＥＧＦファミリ
ーのレセプターのアゴニストは、適切には、シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーのメン
バーであり、そして好ましくは、ＥＧＦレセプターの細胞外ドメインに結合する。用語「
アゴニスト」はまた、シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーに対する模倣物、融合タンパ
ク質、抗体、シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーのキメラ、ならびにそれらのフラグメ
ント、改変体および誘導体も包含し、これらは、ＥＧＦファミリーのレセプターを活性化
20
し得る。
【００５２】
シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーを構成する分子は、それらが少なくとも１つのＥ
ＧＦ様ドメインを含む点で特徴付けられ得る。このドメインは、ジスルフィド結合の形成
を通して３つのペプチドループを生じる６つのシステイン残基によって定義され得る。
【００５３】
ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターを通して作用し得そしてこれらのレセプター
の下流の経路を活性化し得る特定のアゴニストとしては、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィ
レグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、エピレグリン、ベータセルリン、ニューレグリン１∼４
、およびＣｒｉｐｔｏ−１が挙げられる。好ましくは、アゴニストは、ＥＧＦそれ自体で
30
ある。
【００５４】
ＦＧＦのレセプターから下流の１つ以上のシグナル伝達経路は、好ましくは、ＦＧＦの
レセプターのアゴニストを用いて活性化され得る。ＦＧＦのレセプターのアゴニストは、
適切には、シグナル伝達因子のＦＧＦファミリーのメンバーである。用語「アゴニスト」
はまた、シグナル伝達因子のＦＧＦファミリーに対する模倣物、融合タンパク質、抗体、
シグナル伝達因子のＦＧＦファミリーのキメラ、ならびにそれらのフラグメント、改変体
および誘導体も包含すると意図され、これらは、ＦＧＦのレセプターを活性化し得る。
【００５５】
好ましくは、ＦＧＦレセプターのアゴニストは、ＦＧＦ−２またはラミニン−ＦＧＦで
40
ある。
【００５６】
ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターまたはＦＧＦレセプターのいずれかの下流の
シグナル伝達経路の活性化はまた、構成的に活性なレセプターによって、またはそれぞれ
のシグナル伝達経路の下流のエフェクター（例えば、ＭＥＫもしくはＢｃｌ２）によって
も引き起こされ得ることが理解される。本発明の特に好ましい実施態様では、シグナル伝
達経路は、細胞透過性小分子によって活性化される。これは、それぞれのレセプターを迂
回し、シグナル伝達経路を直接活性化し得る。したがって、本発明では、用語「アクチベ
ーター」は、ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターまたはＦＧＦレセプターの下流の
シグナル伝達経路を活性化し得る全ての分子を包含する。
50
(16)
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【００５７】
本発明の神経幹細胞培養物の維持におけるアクチベーターの有効性は、以下の実施例１
−１および１−２において実証されている。ここでは、神経幹細胞のバルクおよびクロー
ン集団が、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を含む培地で維持され、そして多数回継代され得る。
さらに、試験した細胞集団中では神経幹細胞マーカーが至るところに存在することによっ
て示されるように、神経幹細胞の分化は無視し得る程度であるか全く存在しない（実施例
１−３を参照のこと）。そしてそれらはそれらの潜在能を保持し、全ての期待される細胞
型に分化し得る（実施例１−４を参照のこと）。
【００５８】
したがって、本発明は、自己再生性の対称的に分裂している未分化状態で神経幹細胞の
10
大きな集団を維持する効率的な方法を提供する。本発明の組成物は、神経幹細胞を含む組
成物であって、神経幹細胞が接着培養中にあり、そして組成物中の細胞の少なくとも５０
％、７０％、または８０％が神経幹細胞である組成物を包含する。神経幹細胞の割合は、
さらに好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、非常に好ましく
は少なくとも９７％である。さらに、本発明の神経幹細胞は、大いに継代され得る。神経
幹細胞は、少なくとも３０回、より好ましくは少なくとも６０回、非常に好ましくは少な
くとも９０回継代されていることが好ましい。なおさらに、本発明の神経細胞の集団では
、該細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも
９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である。この組成物中の細胞は、単独または
組み合わせて、本発明の任意の特徴および全部の特徴によってさらに特徴付けられ得る。
20
【００５９】
組成物もまた提供され、この組成物は、
神経幹細胞；
ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および
ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む。
【００６０】
組成物は、好ましくは、基本培地を含む。また、組成物中の神経幹細胞の少なくとも８
０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、対称的に分裂
している神経幹細胞であることが好ましい。
30
【００６１】
上記神経細胞集団および組成物の両方において、神経幹細胞は、好ましくは、オンコジ
ーンをコードする外因性遺伝物質を含まない。すなわち、それらは、不死化ストラテジー
を受けていない。特定の実施態様では、集団／組成物の神経幹細胞は、それらが、
神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン；
Ｓｏｘ−２；
放射神経膠細胞特異的マーカーのＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、もしくは
Ｐａｘ−６；
ルイスＸ抗原；
ムサシ−１；および
40
プロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であり、そして
Ｏｃｔ４、および
Ｎａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている。
【００６２】
好ましくは、細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、およびＧＬＡＳＴの発現に対して陽性である
。他の実施態様では（必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）、細胞は、ＢＬ
ＢＰ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、
ムサシ−１、またはプロミニンの少なくとも１つの発現に対して陽性である。特に好まし
50
(17)
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い実施態様では（そして必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）、細胞は、Ｏ
ｃｔ４またはＮａｎｏｇの少なくとも１つの発現に対して陰性である。
【００６３】
さらなる実施態様では（必要に応じて上のマーカープロフィールに加え）、細胞は、Ｓ
ｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である。マウ
ス 由 来 Ｎ Ｓ 細 胞 を 含 む 特 定 の 組 成 物 ／ 集 団 で は 、 細 胞 の １ ％ 以 下 が 、 Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ま た は β II
Iチ ュ ー ブ リ ン の 発 現 に 対 し て 陽 性 で あ り 、 そ れ に よ り 星 状 細 胞 ま た は ニ ュ ー ロ ン へ の 細
胞の分化が無視し得る程度であることが確認される。他の組成物／集団では、細胞の１％
以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に
対して陽性である。
10
【００６４】
本発明はまた、ラット細胞を用いて実施された。したがって、本発明者らは、ラットＣ
ＮＳから細胞を採取し、そして本発明の方法を用いて、ラット神経幹細胞の培養物を得た
。ラット神経幹細胞は、（ｉ）高純度、代表的には８０％または９０％を超えるラット神
経 幹 細 胞 、 お よ び （ ii） 多 数 回 の 倍 加 、 ５ ０ を 超 え る 、 １ ０ ０ を 超 え る 、 さ ら に ２ ０ ０ を
超える倍加後に、その高割合（最少で５０％）がニューロンおよび神経膠を形成する能力
を保持している細胞であるとの特性を有する。当該分野では、ラット由来の細胞は、明ら
かに非常に不均質であり、成体海馬からのみであった。本発明者らは、この供給源から細
胞を得ずに、代わりにラットＣＮＳから得た。この点において、本発明の方法は、３種（
ラット、マウス、ヒト）の全てにわたって有効であったことが注目に値する。本発明の方
20
法に従って、単一の細胞が、神経幹細胞コロニーを形成すれば、ニューロンがそのコロニ
ー中の細胞から得られ得ることが一般に理解される。これは、例えば、（ｉ）核に対して
（ す な わ ち 、 全 て の 細 胞 を 染 色 ） お よ び （ ii） ニ ュ ー ロ ン に 対 し て （ す な わ ち 、 ニ ュ ー ロ
ンのみ）個別に染色することによって測定される。染色された細胞の相対数を比較するこ
とにより、ニューロンを形成する細胞の割合が算定され得る。
【００６５】
本発明の第二の局面は、神経幹細胞の調製のための方法を提供し、この方法は、（ｉ）
上記の方法に従って神経幹細胞を培養し、それによって神経幹細胞の培養物を得る工程、
お よ び （ ii） 該 培 養 物 か ら 神 経 幹 細 胞 を 単 離 す る 工 程 を 含 む 。 好 ま し く は 、 単 離 さ れ た 神
経幹細胞は、対称的な様式で分裂するように条件付けられた細胞である。
30
【００６６】
多数の細胞供給源が用いられ得、そこから神経幹細胞が誘導される。１つの方法では、
細胞は、動物の神経組織から得られ、そして本発明に従って培養され、対称的に分裂して
いる神経幹細胞の培養物が得られる。神経組織は、成体または胎児の組織に由来し得る。
神経組織は、ＣＮＳに由来し得、そして神経幹細胞の対称分裂集団は、ヒトおよびマウス
の両方からの成体および胎児の両方のＣＮＳから採取された抽出物から得られ得る。神経
組織は、好ましくは、放射神経膠表現型を有すると同定された細胞を含む。例えば、この
表現型を有する細胞は、小脳および網膜からの抽出物で同定されており、その両方ともが
、適切なさらなる細胞供給源を表す。神経幹細胞は、疾患のモデリングに有用な罹患神経
組織から得られ得、例えば、細胞は、この目的で脳腫瘍から得られ得る。
40
【００６７】
本発明を使用する選択肢には、罹患個体から神経幹細胞を誘導し、次いで（ｉ）アッセ
イ の た め に こ れ ら の 細 胞 を 使 用 す る か 、 ま た は （ ii） そ の 個 体 に 細 胞 を 戻 す 移 植 の 前 に 遺
伝子改変を実施することがある。したがって、神経変性障害（例はアルツハイマー病およ
びパーキンソン病を含む）；または脳腫瘍を有する個体から、細胞が得られ得る。
【００６８】
神経幹細胞を得る別の方法は、
（ｉ）神経幹細胞に分化し得る多分化能性もしくは分化多能性幹細胞を得る工程、
（ ii） （ ｉ ） の 細 胞 を 、 分 化 多 能 性 細 胞 に 対 し て 非 許 容 性 で あ る 培 地 で そ し て （ ａ ） Ｅ
ＧＦファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストおよび（ｂ）ＦＧＦ
50
(18)
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ファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストの存在下で培養する工程
を含む。
【００６９】
使用に際して、混入している可能性のあるＥＳ細胞が、この方法によって除去されるか
、または少なくとも実質的に数が減少され、より純粋でかつ移植の際に奇形腫を生じる可
能性がより少ない培養物が得られる。
【００７０】
幹細胞は、適切には分化多能性幹細胞であり、特にＥＳまたはＥＧ細胞である。方法は
、好ましくは、ＥＧＦレセプターのアゴニストおよびＦＧＦレセプターのアゴニストの存
在下で細胞を培養する工程を含む。
10
【００７１】
本発明のＮＳ細胞を用いて、本発明者らは、ＥＧＦおよびＦＧＦを除去しそして血清ま
たはＢＭＰ４を添加することによって星状細胞を得、本発明者らは、ＥＧＦを除去し、次
いで約１週間おいた後にＦＧＦを除去し、そしてラミニン上に細胞を播種することによっ
てニューロンを得、そして本発明者らは、ＥＧＦおよびＦＧＦを両方とも除去することに
よって乏突起膠細胞を得た。一般に、神経幹細胞を生成するために使用される本発明の方
法は全て、必要に応じて、神経幹細胞をニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞に分
化する工程、および次いでさらに必要に応じて（例えば、アッセイで、移植のために、ま
たはそれ以外に）、ニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞を用いる工程をさらに含
む。
20
【００７２】
神経幹細胞培養物が単離されると、次いで、それは、神経幹細胞株を樹立するために使
用され得る。このような細胞株の樹立は、好ましくは、
（ａ）単一の神経幹細胞を得る工程、
（ｂ）前記の方法のいずれかに従って神経幹細胞を培養する工程
を含み、それによって、神経幹細胞のクローン集団を得る。
【００７３】
特定の実施態様では、細胞株を樹立するために使用される単一の神経幹細胞は、対称的
に分裂している神経幹細胞、または対称的な様式で分裂するように条件付けられた神経幹
細胞である。好ましくは、単一の神経幹細胞は、神経幹細胞を調製するために、上記の方
30
法に従って得られる。
【００７４】
好ましい実施態様では、上記の方法によって得られる神経幹細胞株は、神経幹細胞のク
ローン集団（すなわち、その中の細胞の全てが単一の神経幹細胞の子孫である）である。
【００７５】
単一の神経幹細胞および細胞株（必要に応じて上記の方法によって得られ得る）もまた
、本発明の一部を形成する。第一の実施態様では、細胞株が提供され、そこでは細胞が、
ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチベーター、
およびＦＧＦレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチベーターの存在下で維持され
ている。他の実施態様では、単一の神経幹細胞および細胞株の細胞は、それらが、
40
神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン；
Ｓｏｘ−２；
放射神経膠細胞特異的マーカーであるＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、もし
くはＰａｘ−６；
ルイスＸ抗原；
ムサシ−１；および
プロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であり、そしてそれらが、
Ｏｃｔ４、および
Ｎａｎｏｇ
50
(19)
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の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている。
【００７６】
好ましくは、細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、およびＧＬＡＳＴの発現に対して陽性である
。他の実施態様では、（必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）細胞は、ＢＬ
ＢＰ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、
ムサシ−１、またはプロミニンの少なくとも１つの発現に対して陽性である。特に好まし
い実施態様（そして必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）細胞は、Ｏｃｔ４
またはＮａｎｏｇの少なくとも１つの発現に対して陰性である。
【００７７】
他の特定の実施態様では、（必要に応じて上のマーカープロフィールに加え）細胞は、
10
Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である。特
定 の マ ウ ス 由 来 細 胞 株 で は 、 細 胞 の １ ％ 以 下 が 、 Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ま た は β IIIチ ュ ー ブ リ ン の 発
現に対して陽性である。他の（例えば、ヒト）細胞株では、細胞の１％以下が、成熟した
星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である
。
【００７８】
単一の神経幹細胞および細胞株の細胞の両方とも、オンコジーンをコードする外因性遺
伝物質を含まないこと、すなわち、それらは、不死化ストラテジーを受けていないことが
好ましい。記載の細胞株が、神経幹細胞株であることも好ましい。
【００７９】
20
第三の局面では、本発明は、対称的に分裂している神経幹細胞のトランスフェクトされ
た集団を得てこれを維持する方法を提供し、この方法は、
（ａ）選択マーカーＡをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程であ
って、使用に際して、該選択マーカーが、神経前駆細胞特異的プロモーターの制御下で発
現される、工程；
（ｂ）該ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化を促進する工程；
（ｃ）該選択マーカーＡを発現している神経前駆細胞について選択する工程；および
（ｄ）該選択された細胞を、前に記載の方法のいずれかに従って培養する工程
を含む。
【００８０】
30
選択マーカーＡは、抗生物質耐性、細胞表面マーカー、または例えばＥＰ−Ａ−０６９
５３５１に記載されるような別の選択マーカーをコードし得る。神経前駆細胞特異的プロ
モーターは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、ＢＬＢＰ、およびネスチン神経エン
ハンサーからなる群から選択され得る。この選択ストラテジーのさらなる詳細を、実施例
１−１に示す。
【００８１】
本発明の神経幹細胞（すなわち、本発明の単一の神経幹細胞ならびに組成物、細胞株、
および集団中に存在する神経幹細胞）は、遺伝子改変され得る。したがって、本発明の神
経幹細胞をトランスフェクトする方法が提供され、この方法は、
（ａ）選択マーカーＢおよびポリペプチドをコードする構築物で神経幹細胞をトランス
40
フェクトする工程；および
（ｂ）該選択マーカーＢを発現する神経幹細胞について選択する工程
を含む。
【００８２】
選択マーカーＢは、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードし得、そして選択マ
ーカーＡと同じかまたは異なり得る。適切なトランスフェクション方法は、公知の方法で
あ り 、 エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 、 リ ポ フ ェ ク シ ョ ン 、 ヌ ク レ オ フ ェ ク シ ョ ン （ necleofect
ion） 、 お よ び レ ト ロ ウ イ ル ス ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン お よ び レ ン チ ウ イ ル ス ト ラ ン ス フ ェ
クションが含まれる。
【００８３】
50
(20)
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遺伝子改変神経幹細胞もまた本発明の一部を形成し、したがって、本発明は、この構築
物をさらに含む、本発明の単一の神経幹細胞または組成物、集団、もしくは細胞株中に存
在するような神経幹細胞を提供する。このような神経幹細胞は、選択マーカーＢに加え、
選択マーカーＡをすでに含み得ることが理解される。
【００８４】
前記のように、本発明の方法は、任意の供給源から誘導された神経幹細胞との使用に適
している。１つの特定の実施態様では、本発明は、ＥＳ細胞の供給源から神経幹細胞を得
るための方法を提供する。この方法によれば、例えば単層での培養または胚様体分化によ
り、ＥＳ細胞を神経前駆体に転換し、次いでＮＳＡ培地中で該神経前駆体を培養すること
により、ＥＳ細胞の神経幹細胞への分化が促進される。さらに、ＮＳＡ培地は、付加成分
10
（例えば、付加グルコースおよびＨＥＰＥＳ）を含み得ることが意図される。代替として
、グルコースおよびＨＥＰＥＳが付加された培地（好ましくは基本培地）もまた、この分
化を促進するために使用され得る。
【００８５】
ＮＳＡおよび／またはグルコースおよびＨＥＰＥＳの存在下で、条件は、神経幹細胞の
増殖が好まれるような条件であり、培養物中に存在するいかなる非神経細胞もが優先的に
死滅するという利点が付加される。このことは、実質的に純粋な神経幹細胞培養物（例え
ば、存在する全細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは
少なくとも９５％）を生じる。実施例１−５は、この方法の更なる詳細を提供する。
【００８６】
20
好ましい実施態様では、実施例１−５の方法は、対称的に分裂している神経幹細胞の集
団を調製するために使用され得る。引き続き、集団は、上記の本発明の培養方法のいずれ
かを用いて維持される。
【００８７】
実施例１−５の方法はまた、神経幹細胞へのＥＳ細胞の分化に関する因子の効果につい
てアッセイするために使用され得る。好ましいアッセイ実施態様では、ＥＳ細胞が、試験
される因子の存在下で、実施例１−５に記載の方法を用いて培養される。因子の効果は、
例えば、得られた細胞のマーカープロフィールを決定する、すなわち、細胞が、本発明の
細胞と同様のマーカープロフィールを有するか、またはＥＳマーカープロフィールが維持
されているかを示すことにより、評価され得る。試験される因子は、誘導因子またはブロ
30
ッキング因子のいずれでもあり得る。
【００８８】
神経性疾患および神経変性疾患、および脳損傷の治療において、特に、パーキンソン病
およびアルツハイマー病、多発性硬化症、および筋萎縮性側索硬化症のような疾患の治療
において、神経幹細胞の使用に大きな関心がある。本発明の方法、組成物、細胞集団、細
胞株、および単一の細胞は全て、このような治療において、ならびにこのような治療のた
めの調製物の製造において、用いられ得る。本発明を用いて治療され得る特定の神経性／
神経変性疾患としては、以下が挙げられる：パーキンソン病、運動ニューロン疾患、卒中
、多発性硬化症、およびハンチントン病。
【００８９】
40
したがって、第５の局面では、本発明は、細胞療法のため、および神経変性疾患および
脳損傷の治療用組成物の製造のための、上に記載の細胞株、神経細胞集団、単一の神経細
胞、および組成物の使用を提供する。このような調製物は、リン酸緩衝化生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）中に処方され得る。
【００９０】
上に列挙した疾患の治療の方法は、本発明の単一の細胞、細胞株、組成物、または細胞
集団の患者への移植を含み得る。好ましくは、患者は哺乳動物であり、より好ましくは、
患者はヒトである。このような移植は、胚および成体の両ＣＮＳでの成功が示されており
、そして実施例１−６に詳細に記載している。
【００９１】
50
(21)
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本発明の細胞、および特に細胞株は、神経幹細胞の分化に関する誘導因子またはブロッ
キング因子の効果をアッセイするために使用され得る。このようなアッセイは、本発明の
神経幹細胞（すなわち、組成物、細胞株、および集団中に存在する細胞、または単一の神
経幹細胞）と、試験される因子とを接触させる工程を含み得る。神経幹細胞の分化に関す
る因子の効果は、適切には、得られた細胞のマーカープロフィールを決定する、すなわち
、細胞が、本発明の細胞と同様のマーカープロフィールを有するか、またはこれらのマー
カーが失われたかを示すことにより、評価され得る。本発明の細胞はまた、薬剤をアッセ
イするのにも適している。
【００９２】
ニューロンまたは神経膠を形成する細胞の割合を評価するために、細胞をクローン増殖
10
する。細胞が個々に播種されると全ての細胞がクローンコロニーを形成するわけではない
が、クローンコロニーを形成するもののうち一般には５０％以上が、ニューロン（適切な
プロトコル下で）または神経膠（再度、適切なプロトコル下で）をつくる。これらの細胞
は、従来技術から区別される。従来技術は、神経幹細胞特性を有する細胞の同定およびそ
の増殖さえも議論しているが、それらの集団は非常に不均質であったからである。これは
、重要な相違である。純粋でない集団は、残りの神経幹細胞にシグナル伝達を提供する細
胞を含むからであり、このことは、分化を刺激しそしてさらには神経幹細胞の割合を減少
させる。先行技術の方法は、個々の細胞から神経球を生成し得るが、本発明は、個々の細
胞から実質的に純粋な集団の生成を可能にしている。
【００９３】
20
本発明の特定の実施態様（以下の実施例により詳細に記載する）では、全てのＮＳ細胞
コロニーが、１５％以上、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは約２０∼３０％
のＴｕＪ陽性ニューロンを生成している。より高い密度の培養で、本発明者らは、ＴｕＪ
陽性細胞を計数した。ＬＣ１ ＮＳ細胞の３５％がニューロン形態を獲得し、そして１年
よ り も 長 い 連 続 培 養 で あ る １ １ ５ 継 代 後 に も β IIIチ ュ ー ブ リ ン を 発 現 し て い た 。 こ れ ら
の細胞は、この期で二倍体核型を保持していた。ＬＣ１は、クローン化されていない集団
である。したがって、データは、神経膠に制限された前駆体または遺伝的形質転換に対す
る選択圧が最小限であったことを示している。
【００９４】
本発明の細胞は、異種細胞と共培養することなくかつ非限定の条件培地、細胞外マトリ
30
ックス画分または血清を用いることなく増殖され得、これは、ＥＳ細胞以外の幹細胞のタ
イプについて以前に示されていない特徴である。したがって、本発明によれば、神経幹細
胞が、好ましくは、規定された条件で均質な培養で増殖される。マイクロウェル中に単離
された単一のＮＳＣでさえも増殖し得、このことは、ＥＧＦおよびＦＧＦ以外の細胞外シ
グナルへの依存が最小限であること、およびインビトロでは、ＮＳＣにとって必須の外的
自己再生シグナルが、ＥＧＦおよびＦＧＦに対して減少され得ることを示している。
【００９５】
実施例により詳細に示したさらなる実施態様では、実質的に全てのコロニー（播種して
いる単一の細胞から発達したコロニーの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％
、より好ましくは少なくとも９７％）が、（ｉ）ＦＧＦ＋ＥＧＦにおいて神経前駆体マー
40
カ ー の 同 一 の 均 質 な 発 現 と 分 化 マ ー カ ー の 不 在 と を 示 し 、 そ し て （ ii） 増 殖 因 子 の 除 去 に
際してニューロンを生成している。特定の実施例では、全てのコロニーがこれらの特性を
有していた。これは、対称的な自己再生の証拠である。さらに、非クローンＮＳ細胞培養
物におけるコロニーアッセイからのデータは、クローンＮＳ５株由来のデータと比較可能
であった。ＮＳ５からの増殖可能な未分化のコロニーの連続的な形成は、クローン原性細
胞が幹細胞であること、およびそれらの数がＮＳ集団と比例して増大していることを示し
ている。形式的に、幹細胞数の増加は、２つの機構を介して生じ得る：デノボ生成または
対称的な自己再生分裂。前者は、前幹細胞供給源、すなわち、分化多能性細胞または胎児
原基を必要とし、それらのいずれも、本明細書中のＮＳ細胞培養物中には存在しない。そ
こで、対称的な自己再生がＮＳ細胞培養で生じていなければならない。
50
(22)
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【００９６】
以下の実施例で得られた特定のＮＳ細胞は、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｅｍｘ２、Ｏｌｉｇ
１、Ｏｌｉｇ２、ネスチン、ＢＬＢＰ、ＧＬＡＳＴ、ビメンチンを発現し、そしてＲＣ２
、３ＣＢ２、ＳＳＥＡ−１、およびプロミニンに対して免疫反応性である。好ましくは、
それらは、Ｓｏｘ１を発現せず、そしてＧＦＡＰおよびニューロン抗原に対して陰性であ
る。これらのＮＳ細胞は、分化多能性マーカーおよび他の胚葉のマーカーを欠く。本発明
者らは、ＥＳ細胞での場合と同様に、神経幹細胞の特徴がＣＮＳ発生の間でマスクされて
おり、エクスビボでのみ真に実証可能であることを主張する。Ｓｏｘ１発現がＮＳ細胞で
維持されなかったという知見は、新規で予期されないものであり、そしてＳｏｘ１を用い
る連続的な系統選択は実りあるものではないことを示している。
10
【００９７】
本発明のさらなる実施態様では、ＥＳ細胞由来非クローン化（ＣＧＲ８−ＮＳ）および
クローン化（ＮＳ５）ＮＳ株および胎児皮質由来非クローン化（Ｃｏｒ１）およびクロー
ン化（Ｃｏｒ１−３）ＮＳ株により例証されるＮＳ細胞は、培養物中に放射神経膠マーカ
ー３ＣＢ２、ＢＬＢＰ、ＧＬＡＳＴ、ネスチン、ＲＣ２、およびビメンチンの発現を示し
ている。ＧＦＡＰの発現は、これらの培養物のいずれにおいても、好ましくは細胞の１０
％未満、より好ましくは５％未満、特に２％未満である。特定の実施例では、ＧＦＡＰ発
現は、細胞の１％未満で見られた。本発明者らはまた、１１５継代後のＥＳ細胞由来ＮＳ
細 胞 に お い て 、 Ｇ Ｆ Ａ Ｐ お よ び β IIIチ ュ ー ブ リ ン は な く 、 ネ ス チ ン お よ び Ｒ Ｃ ２ の 均 一
な発現を示した。このことは、ＮＳ細胞表現型が安定であることを示している。本発明の
20
好ましい細胞は、ＥＳ細胞から分化され、そして３０継代後、好ましくは６０継代後、よ
り好ましくは１００継代後に、（１）ネスチンおよびＲＣ２の発現が続きそして（２）Ｇ
Ｆ Ａ Ｐ お よ び β IIIチ ュ ー ブ リ ン の 発 現 が な い こ と が 続 く 。 Ｇ Ｆ Ａ Ｐ お よ び β IIIチ ュ ー ブ
リンの発現がないとは、細胞の５％未満、好ましくは細胞の２％未満に発現が見られるこ
とを意味する。
【００９８】
本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲによって分析を実施し、特定のＮＳ細胞に分化多能性、中
胚葉、または内胚葉の特異的転写因子がないことを確認した。本発明者らはまた、アフィ
メトリックス（ＲＴＭ）発現プロファイリングを実施し、系統の不適切な転写物がないこ
とを確認し、そして３つの異なるＮＳ細胞培養（ＥＳ由来、胎児皮質由来、およびクロー
30
ン胎児皮質由来）において神経マーカーおよび放射神経膠マーカーの一貫した発現を実証
している。
【００９９】
ＥＳ細胞からの分化によりＮＳ細胞を得ることは、好ましくは、連続接着培養で細胞を
維持する工程を含み、そしてより好ましくは、神経球を形成する工程を省く。しかし、胎
児または成体脳由来の一次細胞単離物からの細胞の分化によりＮＳ細胞を得ることは、必
要 に 応 じ て 、 （ ｉ ） ま ず 懸 濁 凝 集 体 ま た は 神 経 球 を 形 成 す る 工 程 、 お よ び （ ii） 引 き 続 き
接着培養に細胞を維持する工程を含む。本発明者らは、実施例において、数日後に、これ
らの凝集体がゼラチンコートされたプラスチックに付着され得、次いでＮＳ細胞が増殖す
ることを見出した。
40
【０１００】
本発明者らは、本発明の細胞の初期および後期継代で生成したニューロンおよび星状細
胞の割合を、（詳細には、ＬＣ１ ＮＳ細胞に対して、８継代目および１１５継代目で）
決定した。後者の培養は、１２ヶ月の増殖を表し、倍加時間は２４時間であった。後期継
代で得られたニューロンの数にはささやかに減少があるが、これはなお３５％よりも多く
を占める。独立して４６Ｃ ＥＳ細胞から誘導されたＮＳ５クローン株は、３０継代目に
同様のレベルのニューロン分化効率を示している。ＧＦＡＰ免疫反応性星状細胞の生成は
、ＬＣ１ ＮＳ細胞についておよびＮＳ５細胞についても、両時点で１００％に近づいた
。さらに、多数回継代で増殖し、次いでＧＦＰレンチウイルスを形質導入しそして移植前
にさらに増殖させたＬＣ１ ＮＳ細胞を用いて、インビボでのデータを得た。このデータ
50
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は、ニューロンおよび星状細胞の両方の広範な分化を示している。放射神経膠マーカー発
現の均一性と組み合わせて、非クローン化ＬＣ１ ＮＳ細胞についての安定な分化能に関
するデータは、ＦＧＦおよびＥＧＦにおける接着培養が、幹細胞自己再生を好み、そして
神経膠またはニューロンのいずれかの運命への方向付けを抑制することを示している。
【０１０１】
本発明者らは、ＥＳ細胞からの分化により得られたＮＳ細胞が、５週間にわたって腫瘍
の形成なく移植され得ること、したがって、マウス脳において４週以内に巨視的な奇形腫
を生じたＥＳ細胞とは異なることを見出した。
【０１０２】
本発明はまた、核再プログラミング方法、ならびにこれらの方法によって得られる細胞
10
および動物にも関する。
【０１０３】
核再プログラミングは、体細胞、必要に応じて幹細胞もしくは終末分化細胞の核が、比
較的より高い潜在能の細胞の核として挙動するように再プログラミングされる技術である
。最終的には、完全に再プログラミングされた核が、分化多能性細胞の核として作用し、
そして再プログラミングは、しばしば分化多能性に対して様々に再プログラミングするこ
とを意味する。核移入による再プログラミングの方法は、当該技術分野で十分に確立され
ており、ＷＯ９６／０７７３２に記載の発明（時に、「ドリー羊」発明といわれる）後に
十分に公開されるようになった。したがって、核移入は、非ヒト動物をクローン化するた
めに使用され得る。
20
【０１０４】
核移入方法は、多くの課題を有する。まず、それらは低効率のままであり、得られた細
胞が、真に分化多能性であるように再プログラミングされるのはまれである。再プログラ
ミングの一部として核で遺伝子操作を実施し得ることも所望され得る。しかし、現時点で
は、この操作は、ドナー核のクローン集団を得るのが困難であるため、可能ではないかま
たは信頼性がない。クローン核を用いてさえも、再プログラミング方法は、多くの独立し
た工程を必要とする複雑な手順である。最後に、いくつかの種に由来するＥＳ細胞は、単
離するのがなお困難である。再プログラミング技術の使用は、そのようなことが利用でき
かつ信頼性があれば、これらの種において分化多能性細胞への代替の経路を提供する。
【０１０５】
30
本発明のさらなる局面は、上記課題に対する代替のアプローチを提供すること、および
それらへの解決を提供することを目的として有する。
【０１０６】
したがって、本発明は、核再プログラミングの方法を提供し、この方法では、ドナー核
が本発明の神経幹細胞から得られる。
【０１０７】
本発明の神経核細胞は、高い効率で再プログラミング可能であることが見出されており
、したがって、本発明は、効率的な再プログラミング方法を提供し、そしてまた、多くの
種の遺伝子改変された再プログラミングされた細胞（特に分化多能性幹細胞）の作製を容
易にする。本発明によって個々の神経幹細胞をクローン増殖できることとは、全てが同じ
40
遺伝子改変を用いて、遺伝子操作後に細胞のクローン集団が得られ得、そして再プログラ
ミング方法で使用され得ることを意味する。
【０１０８】
特定の細胞表面マーカーの存在および／または他のものの不在に従って神経幹細胞を同
定することもまた可能である。このことは、神経幹細胞は、混合集団（例えば、脳ホモジ
ネート）から直接採集され得るので、本明細書中に記載の本発明の局面に従って培養する
工程が省かれ得るという利点を有する。
【０１０９】
したがって、核再プログラミングの方法が本明細書中に提供され、この方法では、ドナ
ー核が、本発明の任意の実施態様または局面に従って得られた神経幹細胞に由来する。
50
(24)
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【０１１０】
核再プログラミングの特定の方法は
ドナー細胞を得る工程；
レシピエント細胞を得る工程；
該ドナー細胞の核を該レシピエント細胞に移入する工程であって、該ドナー細胞が、（
ｉ ） 神 経 幹 細 胞 、 ま た は （ ii） 本 発 明 の 方 法 に 従 っ て 得 ら れ た 細 胞 で あ る 、 工 程 ； お よ び
該細胞を培養して該ドナー細胞の核を再プログラミングし、それによって再プログラミ
ングされた細胞を得る工程
を含む。
【０１１１】
10
レシピエント細胞の核は、一般に、プロセス中の一段階で除去され、そのため得られる
細胞は二倍体であり、これは、必要に応じて該ドナー細胞の核の移入前におよび必要に応
じて該ドナー細胞の核の移入後になされる。
【０１１２】
本発明のＮＳ細胞によって提供される関心のある可能性の１つは、遺伝的病変（例えば
、悪性を誘導し得る）を導入することである。したがって、さらなる選択肢は、ドナー細
胞核を遺伝子操作することである。これは、目的の変異または遺伝子を導入するために使
用され得、例えば、アッセイまたは他の試験目的のために細胞または動物を生成し得、複
数の細胞が全て同じ操作で得られる。操作の範囲は広範である。一例は、疾患原因遺伝子
配列または推定疾患原因遺伝子配列をドナー細胞核に導入することであり、薬物スクリー
20
ニングに有用である。さらなる選択肢は、再プログラミングされた細胞から誘導された組
織を含む動物を得、そして該組織を用いてアッセイを実施することである。細胞は、例え
ば卵母細胞への核転移によって、分化多能性に戻るように再プログラミングされることが
好ましい。
【０１１３】
本発明の特定の実施態様では、所望の神経幹細胞における細胞表面マーカーの本発明か
らの知識を利用することにより、そうでなければ混合集団からの神経幹細胞の単離に必要
とされる培養工程の省略が可能になる。１つのこのような再プログラミング方法は、細胞
の混合集団を提供する工程、その細胞表面マーカープロフィールに基づいて該混合集団か
ら神経幹細胞を単離する工程、および該単離された細胞の核をレシピエント細胞に移入す
30
る工程を含む。
【０１１４】
他の方法と同様に、単離された細胞は、レシピエント細胞へのその核の移入の前に遺伝
子操作され得る。また、単離された細胞は、集団中の１つの細胞の核をレシピエント細胞
に移入する前に細胞のクローン集団を得るために培養され得る。
【０１１５】
より詳細には、本発明の細胞の応用には、高スループット薬物スクリーニングがある。
本発明の神経幹細胞とそれから得られるニューロン、神経膠などとの両方ともが、スクリ
ーニングのために、例えば、細胞のいずれかの型で活性である因子を同定するために使用
され得る。細胞または子孫は、脳内癌のモデルで使用され得る。細胞および子孫は、神経
40
系（特に、ＣＮＳ）の腫瘍から得られ得、そしてそれに由来する神経細胞およびそれらの
子孫が、スクリーンにおいて使用され得る。スクリーンの性質は全てに対して明らかであ
ると考えられるが、概要では、本発明の細胞またはそれらの分化した子孫を得る工程、試
験因子の存在下で該細胞または子孫を培養する工程、および該細胞または子孫に関する該
因子の効果を決定する工程を含む。特定のスクリーニング使用で、細胞が提供され、この
細胞は、本発明の細胞または本発明によって得られる細胞であり、そしてＥＧＦレセプタ
ーまたはさらなるＥＧＦレセプターを発現するように改変されている。
【０１１６】
細胞は、スクリーンで使用される前に改変され得る。例えば、細胞は、遺伝子において
変異を導入するように、または疾患（特に、神経細胞の疾患であり、パーキンソン病およ
50
(25)
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びアルツハイマー病を含む）に関与していることが知られているもしくは関与の疑いのあ
る遺伝子産物をコードする核酸を導入するように、遺伝子改変され得る。パーキン変異が
導入され得る。アルツハイマー病に関与するタンパク質（例えば、ＡＰＰ）をコードする
遺伝子が発現または変異され得、またはその発現を変更され得る。
【０１１７】
本発明の細胞は、細胞療法の細胞の供給源として有用である。それらは、患者からの幹
細胞の供給源を提供し、これは、潜在的に核移入のための核の供給源であり得る。それら
は、遺伝子療法（神経防御遺伝子療法を含む）の送達のために用いられ得る。一例の療法
では、本発明の細胞は、神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を発現している。これ
らの細胞は、本発明に従いそして細胞を遺伝子操作することにより得られ得る。細胞は、
10
損傷した神経回路の回復および／または脳機能の回復のために移植され得る。
【０１１８】
本発明の利点は、得られる細胞の純度にある。純粋な集団は、移植または培養において
制御することがより容易であり、不均質な培養においては、より多くの細胞が神経膠運命
に既に方向付けられているのでニューロンが得られる割合が低くなる。いくつかの療法は
、ニューロンおよび星状細胞の両方を必要とする。他の療法は、神経膠細胞を必要とする
（例えば、ＭＳについては乏突起膠細胞、他の適用については星状細胞、遊走細胞）。
【０１１９】
非ヒト動物をクローン化する方法が本発明によって提供される。非ヒト動物をクローン
化 す る １ つ の 方 法 は 、 （ ｉ ） 該 非 ヒ ト 動 物 か ら 神 経 幹 細 胞 を 得 る 工 程 、 （ ii） 該 非 ヒ ト 動
20
物 と 同 じ 種 の 卵 母 細 胞 を 得 る 工 程 、 （ iii） 該 神 経 幹 細 胞 の 核 を 該 卵 母 細 胞 に 移 入 す る 工
程 、 お よ び （ iv） （ iii） で 得 ら れ た 細 胞 を 該 同 じ 種 の 雌 に 移 植 す る 工 程 を 含 む 。 し た が
って、本発明は、神経幹細胞の単離に基づく非ヒト動物クローニングの効率的な方法を提
供する。このクローニング方法は、実質的に全ての非ヒト動物に対して適用できると考え
られる。特に家畜動物（ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ニワトリ、および他を含む）
およびまた実験動物（マウスおよびラットを含む）に対してである。
【０１２０】
本発明により、初めて、ＥＳ細胞と同様に、二倍体のクローン原性のトランスフェクト
可能な組織幹細胞の純粋な集団の増殖が可能になる。これは、種々の新規な実験機会を切
り開く、幹細胞生物学において顕著な前進である。例えば、「神経幹細胞」のプロファイ
30
リ ン グ に 関 す る 以 前 の 研 究 は 、 不 均 質 な 神 経 球 培 養 （ 例 え ば 、 Suslovら ） へ の 信 頼 に 大 い
に妥協している。さらに、ＮＳ細胞の放射神経膠特徴が、それらのインビボの対応物を定
義している。放射神経膠の純粋な集団を培養および遺伝子操作できることはまた、幹細胞
および特殊化された足場細胞の両方として機能し得る、これらの目立った細胞の細胞生物
学を分析するための新規な機会を切り開く。最後に、異種細胞または細胞抽出物を含まな
い単純な培地でＮＳ細胞を増殖できることは、自己再生が、増殖因子単独によって駆動さ
れ得、そしてこれまで幹細胞生物学者によって不可欠であると考えられていた複雑な微細
環境ニッチを必要としないことを確立する。本発明は、細胞を用いる核再プログラミング
および必要に応じた遺伝子操作への新規なアプローチを切り開く。
【０１２１】
40
本発明は、ＮＳ細胞からのニューロンの効率的な生成を提供する。本明細書中のプロト
コルにより詳細に記載した方法において、ニューロンを得る方法は、（ａ）ＦＧＦレセプ
ターのアゴニストの存在下でかつＥＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、神経幹細胞
を培養する工程；および（ｂ）その後、ＦＧＦレセプターのアゴニストの不在下でかつＥ
ＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、該細胞を培養する工程を含む。例えばＥＧＦが
存在しない期間は、例えばＦＧＦが実質的に除去された場合にニューロンになるように細
胞を刺激することが見出されている。神経幹細胞は、好ましくは、単層培養で播種される
。代表的には、ＮＳ細胞は、ＥＧＦを含まないがＦＧＦ−２を含む培地に移され、そして
ある期間（言わば少なくとも２日間または少なくとも４日間）培養され、その後、ＦＧＦ
−２もまた培地から除去される（それを含まない培地に細胞が移されることを含む）。特
50
(26)
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定の方法では、細胞をＥＧＦのないＦＧＦ−２中で１週間増殖させ、次いでＦＧＦ−２を
除去する。ＦＧＦの除去により、培養中に幾らかの細胞死が生じるが、良好な割合が生存
しニューロンを形成する。この方法は、ＮＳ細胞の誘導のために、本明細書中に記載の方
法のいずれかへの必要に応じた追加として使用され得る。
【０１２２】
本発明の全ての局面の方法／使用は、インビボまたはインビトロのいずれかにて実施さ
れ得ることが理解される。
【０１２３】
本発明の方法および組成物は、添付の図面において図示される。
【０１２４】
10
図１は、ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す；
図２は、ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す；
図３は、ＮＳ細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す；
図４は、ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す；および
図５は、分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動
を示す。
【０１２５】
より詳細に図面を参照して、図１は、ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す
：Ａ．ＥＧＦおよびＦＧＦ−２中で増殖された接着ＮＳ細胞培養物（ＬＣ１）（ａ）は、
ニューロン抗原（ｂ）または星状細胞抗原（ｃ）の発現を示さず、そして前駆体マーカー
20
であるＲＣ２（ｄ）およびネスチン（示さず）の均一な発現を示している。ＬＣ１細胞は
、血清の添加に際して免疫陽性星状細胞に分化し（ｅ）、そして増殖因子の除去に際して
ニューロンを生成する（ｆ∼ｈ）。得られるニューロンの割合は、１１５継代後もなお総
細胞の３５％より多い（ｉ）。Ｂ，クローンＮＳ−５細胞は、Ｓｏｘ１神経系統選択によ
って生成された。ａおよびｃは、それぞれ１継代目および５継代目の神経前駆体の位相画
像 で あ り 、 ｂ お よ び ｄ は 、 対 応 す る Ｓ ｏ ｘ １ − Ｇ Ｆ Ｐ 蛍 光 で あ る 。 ｅ は 、 Terasakiウ ェ ル
への播種１時間後の単一の細胞。ｆは、２０継代目のクローン細胞株の位相差画像である
。Ｃ，ＥＳ細胞および神経幹細胞／放射神経膠細胞マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ（４
６Ｃ、親ＥＳ株；Ｐ５、神経分化後５継代目；ＮＳ−５クローンＮＳ株；ＬＣ１、ＮＳ集
団（１７継代目）；脳、Ｅ１２．５／Ｅ１６．５マウス脳）。Ｄ，神経幹細胞／放射神経
30
膠マーカーに対するＮＳ−５免疫反応性。Ｅ，ＮＳ−５の星状細胞（ａ，ｂ）およびニュ
ーロン（ｄ，ｅ）への分化とネスチン免疫反応性の喪失（ｃ，ｆ）。Ｆ，ＮＳ−５細胞の
コロニー（ａ）は、増殖因子除去に際してニューロンを生成し（ｂ）、そしてＥＧＦ／Ｆ
ＧＦの存在下で、ＲＣ２およびＢＬＢＰの均質な発現を保持し、ＧＦＡＰに対する免疫反
応性を喪失している（ｃ，ｄ）。Ｇ，ＮＳ−５の中期広がり（３１継代目）。
【０１２６】
図２は、ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す：Ｎ
Ｓ細胞は、独立したＥＳ細胞株（ＣＧＲ８、Ｅ１４Ｔｇ２ａ）または一次皮質（Ｃｏｒ−
１）および線条体（Ｓｔｒ−１）組織から誘導した。Ａ，幹細胞／放射神経膠マーカーの
ＲＴ−ＰＣＲ。Ｂ，転写調節因子についてのＲＴ−ＰＣＲ。Ｃ，ＥＳ由来株（ＣＧＲ８−
40
ＮＳ）および胎児由来株（Ｃｏｒ−１）は、形態学（ａ，ｆ）および神経幹細胞／放射神
経膠マーカー免疫反応性（ｂ，ｃ，ｇ，ｈ）ではＬＣ１とは区別不能であり、各々はニュ
ーロン（ｄ，ｉ）および星状細胞（ｅ，ｊ）に分化し得る。
【０１２７】
図３は、ＮＳ細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す：ａ∼ｈ ｅＧＦＰをレ
ンチウイルス形質導入し、海馬（ａ，ｂ）または線条体（ｃ∼ｈ）に移植４週間後のＬＣ
１ ＮＳ細胞の共焦点像。ｂ，ｄ，それぞれパネルａおよびｃのより高い倍率の差込図。
ｅ，ｆ，ニューロンマーカーＴｕＪ（ｅ，赤）またはＭＡＰ−２（ｆ，赤）の共発現（黄
）を示しているｅＧＦＰ移植ＮＳ細胞（緑）の例。ｇ，星状膠マーカーＧＦＡＰ（赤）。
ｈ，神経前駆体マーカーネスチン（赤）。ｉ，成体マウス線条体への移植の４週間後の移
50
(27)
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植片に由来するニューロン（ＭＡＰ２）、星状膠（ＧＦＡＰ）、前駆体（ネスチン）、お
よび増殖（Ｋｉ６７）細胞の定量分析。データは、５匹の独立した動物由来の少なくとも
５００のｅＧＦＰ＋細胞の平均（±標準偏差）である。スケールバー：ａ，ｃ，１００μ
ｍ；ｂ，ｄ，ｅ，４０μｍ；ｆ∼ｈ，２０μｍ。
【０１２８】
図４は、ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。Ａ，ヒトＥＳ細胞からの誘導。
ａ，ヒトＥＳ一次培養物。ｂ，神経ロゼット構造へのヒトＥＳ細胞の分化。ｃ，ＮＳ増殖
培地における９継代目。ｄ，個々の細胞は放射神経膠形態を示す。ｅ∼ｈ，神経幹細胞／
放射神経膠マーカーに対する免疫染色。Ｂ，ヒト胎児前脳からの誘導。ｉ，皮質から生成
した神経球。ｊ，付着および成長。ｋ，ＮＳ増殖培地における５継代目。ｌ，放射神経膠
10
形態。ｍ∼ｐ，神経幹細胞／放射神経膠マーカー。Ｃ，分化。ｑ，ＴｕＪ陽性未熟ニュー
ロン。ｒ，ＧＦＡＰ陽性星状膠。
【０１２９】
図５は、以下を示す：Ａ．分化培地における６日（ａ）、１２日（ｂ）、および３０日
（ｃ）間のインキュベーション後の３つの異なるＮＳ細胞からの異なる膜電位（−９０ｍ
Ｖの保持電位から−７０ｍＶと＋４０ｍＶとの間）で得られる内向きおよび外向きの重畳
電流追跡。Ｂ．（Ａ）において示される電流記録が得られた直後に電圧クランプから電流
クランプに切り替えることによる、（Ａ）と同じ３つの細胞（ａ，ｂおよびｃ）における
脱分極矩形電流パルスの注入後に得られた重畳電圧応答。破線は、−６０ｍＶの電圧レベ
ルを表している。Ｃ．ラベルにより示されるように時間が増加している間に分化培地で培
養した細胞からの−２０ｍＶで誘発された平均Ｎａ
Ｄ．１０ｍＭ Ｂａ
２ ＋
＋
20
電流。バーは、ＳＥを示している。
中およびＴＴＸの存在下の−４０ｍＶおよび０ｍＶで誘発された
内向きの重畳電流；保持電位は−９０ｍＶであった。Ｅ．（Ｄ）と同じ細胞からの電流／
電圧関係。
【０１３０】
本発明は、以下の実施例を用いて実証される。
【実施例】
【０１３１】
（実施例１−１）
（ＮＳ細胞のバルク集団の単離および培養）
30
接着単層培養での５０∼７０％の間のＳｏｘ１陽性神経前駆体の効率的かつ一貫した生
成を可能にするＥＳ細胞分化プロトコルが、近年確立された。これらの培養物内の神経前
駆体（マウス由来）を単離し増殖しそして特徴付けるために、Ｓｏｘ１遺伝子座にターゲ
ティングしたＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシンレポーターカセットを含む以前に生成
さ れ た 細 胞 株 （ ４ ６ Ｃ 細 胞 ） を 使 用 し た （ Yingら , 2003b） 。 ピ ュ ー ロ マ イ シ ン を ７ 日 後
に分化培養物に添加し、そして３日以内に、残りの細胞の９５％より多くがＧＦＰ＋神経
前駆体となった。この時点で、細胞を、（ピューロマイシンなしで）ＥＧＦ／ＦＧＦ−２
を添加したＮ２Ｂ２７培地に再播種した。これらの細胞は迅速に増殖し、数継代内で均質
な形態をとった。
【０１３２】
40
これらの４６Ｃ神経前駆細胞（４６Ｃ−ＮＰ）は、２０継代より多くの間培養物中で継
続して維持され、特徴的な二極性の形態を保持していた。これらの培養物は、ほとんど細
胞死を示さず、そして高い播種効率を有し、倍加時間は約２５時間であった。
【０１３３】
（実施例１−２）
（細胞株の培養）
クローン細胞株を単離するために、４６Ｃ−ＮＰ細胞の５継代目バルク培養物からの単
一の細胞を、マイクロウェルプレートの別々のウェル中に播種した。スコア付けした９５
の単一の細胞のうち１５がコロニーに増殖し、そしてこれらのうち４株が１０継代より多
くにわたって継続して増殖し続けた。１つの株（ＮＰ５）は、バルク集団で観察されたの
50
(28)
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と同一である均質な形態を有する特徴的な二極性の細胞を示した。このＮＰ５株は、無期
限に培養物中で維持された（ＮＰ５ ４１継代目；５ヶ月以上）。
【０１３４】
（実施例１−３）
（ＮＳ細胞の特徴づけ）
バルク細胞集団およびクローン株の両方ともを特徴付けるために、種々のマーカーにつ
いて免疫細胞化学を用いた。予期されるように、細胞株の各々は、神経前駆体マーカーで
あるネスチンもしくはビメンチンに対して陽性であることが判明した。重要なことに、こ
れらの細胞はまた、放射神経膠特異的マーカーであるＲＣ２、３ＣＢ２および星状細胞特
異的グルタミン酸輸送因子（ＧＬＡＳＴ）に対しても陽性であった。細胞の１％未満がＧ
10
Ｆ Ａ Ｐ ま た は β IIIチ ュ ー ブ リ ン の い ず れ か に 対 し て 陽 性 で あ っ た 。 こ の こ と は 、 こ れ ら
の細胞の継代の間に、星状細胞またはニューロンへの自発的分化がほとんど生じていない
ことを示唆している。霊長類／ヒト細胞とは異なり、げっ歯類放射神経膠は、ＧＦＡＰに
対して陰性である。さらに、これらの細胞は、成体神経幹細胞に対して富化するために以
前に使用されたＳＳＥＡ−１、ルイスＸ抗原を認識する抗体に対して免疫反応性である。
【０１３５】
種々のマーカーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施し、放射神経膠としてのそれらの同一性を
確認した。４つのクローン株の全てならびにバルク集団は、免疫細胞化学と一致して、Ｏ
ｃｔ４またはＮａｎｏｇに対して陰性であり（このことは、それらがＥＳ細胞ではないこ
とを確証している）、一方、それらは、ネスチン、ビメンチン、およびＧＬＡＳＴを発現
20
していた。さらに、各細胞株は、ＢＬＢＰ、放射神経膠マーカーの発現を示した。これら
の細胞はまた、ムサシ−１およびプロミニンも発現している。
【０１３６】
興味深いことに、４６Ｃ−ＮＰのバルク培養物は、ＧＦＰレポーターにより評価される
ように、Ｓｏｘ１の発現を徐々に喪失し、５継代目まで（約２週間）に、ほとんどの細胞
が緑色ではなくなった。また、Ｓｏｘ１駆動ＧＦＰ発現を示したクローン株はなく、ＲＴ
−ＰＣＲは、これらの細胞がＳｏｘ１を発現せず、代わりに関連のＳｏｘＢ１クラスのタ
ンパク質であるＳｏｘ２を発現していることを確証した。まとめると、これらの結果は、
種々のＳｏｘ１発現神経前駆体が、ピューロマイシン選択ストラテジーを用いて単離され
得ること、および前脳放射神経膠の特性を有するＳｏｘ１−，Ｓｏｘ２＋細胞が、単離お
30
よびクローン増殖され得ることを示唆している。
【０１３７】
（実施例１−４）
（ニューロンおよび神経膠へのＮＳ細胞株分化）
ＮＳ細胞株により発現された分子マーカーは、それらが神経前駆細胞の型であることを
確証している。これらの細胞が真の多分化能性幹細胞である（すなわち、ニューロンまた
は神経膠のいずれかとして分化し得る）ことを確認するために、細胞の潜在能を試験する
ために設計した種々の条件を試験した。
【０１３８】
神経前駆体の以前の研究は、マイトジェンの除去および／または血清もしくは他のサイ
40
トカインの添加を包含するプロトコルによって、分化を誘導した。本発明の場合では、Ｅ
ＧＦ、ＦＧＦ、または両方を、プラスチック上で培養した増殖中のＮＰ５および４６Ｃ−
ＮＰ細胞から除去した。ＥＧＦおよびＦＧＦの両方を同時に除去することにより、２４時
間以内に急速かつ広範囲の細胞死が生じた。比べて、ＦＧＦ単独での培養は、３日間かか
って細胞死に至った。ＥＧＦ単独での培養では、細胞死も分化も生じなかったが、細胞増
殖は減少した。したがって、明らかに、ＥＧＦは、プラスチック上で培養したＮＳ細胞に
対して必須の細胞生存シグナル（部分的にＦＧＦシグナル伝達により補償される）として
作用している。
【０１３９】
サイトカインの除去後の細胞の増殖に関する血清の効果もまた試験した。このようにし
50
(29)
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て処理した細胞は、ＥＧＦの不在下でさえも生存し、そして同期様式で迅速に分化し、こ
れにより細胞の１００％が、ＧＦＡＰに対して陽性およびネスチンに対して陰性に染色し
た大きな扁平の星状細胞を獲得した。したがって、増殖集団内の全てのＮＳ細胞が、星状
細胞として分化し得る。この効果は、プラスチック上のＥＧＦ／ＦＧＦ除去後の血清の不
在下でのＢＭＰ４の添加によって模倣され得る。ＣＮＴＦおよびＴＧＦ−βは、星状細胞
形態が異なりそしてより多くの細胞死が初期にあったが、ＢＭＰ４と同様に挙動した。Ｂ
ＭＰ、ＣＮＴＦおよびＬＩＦは各々、一次皮質前駆体から星状細胞運命を誘導することが
示 さ れ て い る （ Grossら , 1996; Lillienお よ び Raff, 1990; Nakashimaら , 1999） 。 こ れ
らの研究と一致して、ＢＭＰ−４または血清処理でのＩｄ遺伝子（＞３０倍）の迅速な誘
導が見られた（データは示さず）。
10
【０１４０】
ニューロン分化を誘導しようとして、ラミニン処理ディッシュでのＥＧＦの除去を試験
した。プラスチック上での細胞の培養で見られた細胞死を回避するために、細胞を、ＦＧ
Ｆを含むがＥＧＦを含まないラミニン基材上に播種した。プラスチックまたはゼラチン上
でのこれらの条件で見られたＰＣＤは生じておらず、細胞は生存していた。細胞の形態が
、より拡張された二極性の突起に変化しており、これは、放射神経膠の特徴的なエンドフ
ィートを有する。これらの細胞は、（ＢｒｄＵ取り込みによって）増殖において激烈な減
少を示したが、放射神経膠マーカー（ＲＣ２、ビメンチン、ネスチン）を維持しており、
分化しておらず、ほんの少ない割合のニューロンまたは星状細胞のみが高密度の領域で見
られた。ニューロン分化を誘導するために、６日後、培地をＮＳＡ／Ｎ２ ＋ＦＧＦ２か
20
ら Ｎ Ｓ Ａ ／ Ｂ ２ ７ （ Ｆ Ｇ Ｆ ２ な し ） に 変 更 し た 。 こ の こ と に よ り 、 Ｍ Ａ Ｐ ２ お よ び β III
チューブリン抗体染色により判断されるように約４０∼６０％の細胞のニューロン分化が
促進された。これらのニューロンは、ＧＡＢＡ免疫反応性によって評価されるようにＧＡ
Ｂ Ａ 原 性 （ GABAergic） で あ っ た が 、 星 状 細 胞 （ Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ） は ほ と ん ど 存 在 し な か っ た 。
これらの結果は、ニューロン分化の妨害におけるＦＧＦの以前に記載された役割と一致し
ている。
【０１４１】
各細胞株が、ＥＳ細胞と同様に首尾よく凍結されそして融解され得ることもまた見出さ
れた。
【０１４２】
30
さらなる試験において、単一の細胞から始まる分化を試みた。このクローン発現および
分化は、細胞の全てがニューロンを形成する能力を有することを示した。
【０１４３】
（実施例１−５）
（遺伝子選抜ストラテジーを用いない任意のＥＳ細胞株からのＮＳ細胞の単離）
ＮＰ５を単離するために用いられるＮ２Ｂ２７培地は、ＥＳ細胞の神経前駆体への変換
に対してもともと最適化されており、このため、ＥＳ細胞および神経前駆体の両方の良好
な生存が可能になった。したがって、ピューロマイシン選択がなければ、ＥＳ細胞および
非神経細胞型のキャリーオーバーのために、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を用いて４６Ｃ−Ｎ
Ｐ細胞を効率的に増殖することができなかった（データは示さず）。これを克服しそして
40
他のターゲティングされないＥＳ株からの放射神経膠細胞の生成を可能にするために、神
経前駆体を生存および増殖させるが他の細胞型はそうではない他の基本培地の組合せを試
験した。
【０１４４】
市 販 の 培 地 で あ る Ｎ Ｓ − Ａ 培 地 （ Euroclone） を 用 い て 、 ７ 日 目 で の ４ ６ Ｃ Ｅ Ｓ 細 胞
単層分化の再播種が、細胞の塊／球の形成ならびに非神経細胞の細胞死を生じることが分
かった。引き続いて、これらの細胞塊の付着が生じ、そして細胞の均質な集団が大きくな
った。この継代可能な細胞集団（＞７５継代）のさらなる特徴づけにより、ピューロマイ
シン選択ストラテジーを用いて以前に見られた発現されたマーカーの同一のプロフィール
が明らかになった。したがって、細胞は神経前駆体マーカー（ネスチン、ビメンチン）に
50
(30)
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対して陽性であり、また放射神経膠マーカー（ＲＣ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰおよびＰａ
ｘ６）に対しても陽性であった。４６Ｃ−ＮＰ細胞は、形態においてほんのわずかな差異
を有しそしてマーカー遺伝子の差異がないことがかつて確立されているＮ２Ｂ２７または
ＮＳＡ培地のいずれにおいても、同様に挙動した。
【０１４５】
このプロトコルを用いて、６つの他のＥＳ株からの細胞株を単離した：ＣＧＲ８、Ｅ１
４Ｔ、Ｏｃｔ４−ＧＩＰ、Ｓ１１、Ｒ１およびＶ６．５。これらの細胞株の各々は、同様
の形態および発現プロフィールを有し、そして広範に継代され得る。
【０１４６】
（実施例１−６）
10
（ＮＳ細胞の移植）
インビボでＮＳ細胞の能力を試験するために、それらを、胚性および成体ＣＮＳの両方
へ、ならびに腎臓嚢移植片に移植した。
【０１４７】
エレクトロポレーションをＮＰ５において試験した。それらは、矩形波エレクトロポレ
ーターを用いて効率的にエレクトロポレートされることが見出された。細胞はまた、リポ
フェクタミン添加試薬を用いてトランスフェクト可能である。これは、マウスに用いられ
る全ての遺伝子操作が利用可能になるので、大きな利点である。
【０１４８】
移植した細胞の迅速な評価を可能にするために、ｅＧＦＰマーカー遺伝子を保有するレ
20
ンチウイルス粒子で４６Ｃ−ＮＰを形質導入した。感染は非常に効率的であり、細胞のほ
ぼ９５％が首尾よくマーキングされ、ｅＧＦＰシグナルは継代と共に強くかつ安定であっ
た。レンチウイルス感染の使用により、トランスジーンは安定に組み込まれ、そしてシグ
ナルは、移植した細胞の長期分析に安定なままとなった。
【０１４９】
胚性脳（未熟神経細胞を持続しそして分化を方向付けることが可能な分子および因子の
全てを含む環境）での移植後の細胞の挙動を評価した。Ｅ１４．５マウス胚をレシピエン
ト と し て 用 い 、 Magrassiお よ び 共 同 研 究 者 （ Magrassiら , Development 1999） に よ っ て 以
前 に 記 載 さ れ た 手 順 に 従 っ て 、 100,000個 の 細 胞 を ２ μ Ｌ の 最 終 容 量 中 に 再 懸 濁 し た 。 細
胞 は 、 移 植 後 良 好 に 生 存 し （ 概 算 に よ り 、 移 植 片 中 で 約 20000個 の 細 胞 で あ っ た ） 、 ｅ Ｇ
30
ＦＰシグナルは、容易に検出可能であり、そしてそれらは、移植後に初期の時点で既に遊
走活動を提示した。移植後の種々の時点（４日、７日、２週間、および１ヶ月）で移植し
た細胞が獲得した運命を分析した。４日目および１週間の時点で、細胞の大部分は、ネス
チン免疫反応性によって示されるようになお未熟であったが、２３％は、ニューロンマー
カーＴｕｊ−１を発現し、そして１６．３％は、神経膠マーカーＧＦＡＰを獲得していた
。これらのデータは、移植したＮＳが、多分化能性ＮＳ細胞から予期されるように、イン
ビボでニューロンおよび神経膠の両方を生成し得ることを示している。
【０１５０】
ＮＳ細胞を、成体線条体にも移植した。これらの移植体では、細胞は良好に生存し（い
ずれにせよ生存は、胚性移植片におけるよりも低い）、そしてニューロンおよび神経膠の
40
両運命の方向に分化した。移植後２週間目に実施した定量分析は、細胞の４３．３％がニ
ューロン特異的マーカーＴｕｊ−１を発現し、一方、２６．６％が神経膠マーカーＧＦＡ
Ｐに対して免疫反応性を提示したことを示した。少ない割合の細胞（１１．１％）が、ネ
スチンの発現により示されるように未熟な表現型を保持していた。
【０１５１】
腎臓嚢へのＮＰ５−ＧＦＰ細胞は、奇形腫を生じなかった（ｎ＝４、データは示さず）
。
【０１５２】
（実施例２）
（実施例２−１）
50
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（方法）
（マウス細胞の培養および分化）
Ｅ Ｓ 細 胞 お よ び 神 経 分 化 は 、 Yingお よ び Smith, 2003に よ っ て 詳 述 さ れ て い る 。 Ｌ Ｃ １
と命名したＮＳ細胞および他のＥＳ細胞由来ＮＳ細胞を、Ｎ２および１０ｎｇ／ｍｌのＥ
Ｇ Ｆ お よ び Ｆ Ｇ Ｆ − ２ の 両 方 を 添 加 し た Ｎ Ｓ − Ａ 培 地 （ Euroclone） （ Ｎ Ｓ 増 殖 培 地 ） に
おいてコーティングされていないプラスチック上で７日目の神経分化単層培養物を再播種
することにより、通常通りに生成した。細胞は凝集体を形成し、引き続いて付着しそして
ＮＳ細胞を大きくした。７日目に０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを分化接着培養物
に添加した後に生成された細胞を、４６Ｃ−ＮＳ細胞と命名した。３日後に、細胞を、ピ
ュ ー ロ マ イ シ ン の な い １ ０ ｎ ｇ ／ ｍ Ｌ の Ｅ Ｇ Ｆ お よ び Ｆ Ｇ Ｆ − ２ （ Peprotech） の 両 方 を
10
含むＮ２Ｂ２７培地において、コーティングされていないＴ７５フラスコ中に再播種した
。 ク ロ ー ン 株 Ｎ Ｓ − ５ を 、 限 定 希 釈 に よ っ て ９ ６ ウ ェ ル マ イ ク ロ ウ ェ ル プ レ ー ト （ Nunc）
中に単一の細胞を播種することにより生成した（播種１時間後に単一の細胞をスコア付け
した）。一次培養物を、Ｅ１６．５マウス胚の皮質／線条体から標準プロトコルを用いて
生成し、そして０．１％ゼラチンで処理したフラスコ上に付着させた。次いで、Ｃｏｒ−
１およびＳｔｒ−１細胞を、ＮＳ増殖培地を用いてゼラチン上で増殖させた。星状細胞分
化 の た め に 、 Ｎ Ｓ 細 胞 を 、 １ ％ ウ シ 胎 児 血 清 ま た は １ ０ ｎ ｇ ／ ｍ ｌ Ｂ Ｍ Ｐ ４ （ R&D Syst
em） を 添 加 し た Ｎ Ｓ − Ａ 培 地 中 に １ × １ ０
５
種した。ニューロン分化のために、５×１０
細胞／ウェルで、４ウェルプレート上に再播
４
ＮＳ細胞を、ＦＧＦ−２単独を添加したＮ
Ｓ−Ａにおいてポリオルニチン／ラミニン処理ウェル中に播種した。７日後、培地を、増
20
殖 因 子 を 含 ま な い Ｂ ２ ７ （ Gibco） を 添 加 し た Ｎ Ｓ − Ａ に 切 り 替 え た 。 ク ロ ー ン 分 化 の た
めに、ＮＳ−５またはＣｏｒ−１培養物からの１０００細胞を、ラミニンで前処理した１
０ｃｍプレートに播種し、ＥＧＦ／ＦＧＦ−２中で１２日間増殖させ、そして上記のよう
にインサイチュで分化させた。
【０１５３】
（ＮＳ細胞の特徴づけ）
免疫細胞化学を、適切なＴＲＩＴＣまたはＦＩＴＣ二次結合体とＤＡＰＩでの核対比染
色とを用いて実施した。以下の希釈で一次抗体を用いた：ネスチン（１：１０）、ビメン
チン（１：５０）、Ｐａｘ６（１：５）、３ＣＢ２（１：２０）、ＲＣ２（１：５０）（
DSHB） ； Ｔ ｕ Ｊ （ １ ： ２ ０ ０ ） （ Covance） ； Ｇ Ｆ Ａ Ｐ （ １ ： ３ ０ ０ ） （ ポ リ お よ び モ ノ
30
、 Sigma） 、 Ｍ Ａ Ｐ ２ （ １ ： ２ ０ ０ ） （ Chemiconお よ び Becton Dickinson） ； Ｎ ｅ ｕ Ｎ （
１ ： ２ ０ ０ ） 、 Ｇ Ａ Ｂ Ａ （ １ ： ２ ０ ０ ） 、 Ｇ ａ ｄ ６ ５ ／ ６ ７ （ １ ： ２ ０ ０ ） （ Chemicon）
； シ ナ プ ト フ ィ シ ン （ １ ： ２ ０ ０ ） （ Sigma） ； Ｏ ｌ ｉ ｇ ２ （ １ ： ５ ０ ０ ０ ） （ H. Takeba
yashi） ； Ｅ ｍ ｘ ２ （ １ ： ２ ０ ０ ０ ） （ A. Corte） ； Ｂ Ｌ Ｂ Ｐ （ １ ： ５ ０ ０ ） （ N. Heintz
） ； プ ロ ミ ニ ン ／ ｍ Ａ ｂ １ ３ Ａ ４ （ １ ： ２ ０ ０ ） （ W. Huttner） 。 陰 性 コ ン ト ロ ー ル は Ｅ
Ｓ細胞、分化したＮＳ細胞または二次単独であった。ＲＴ−ＰＣＲのために、全ＲＮＡを
RNeasyキ ッ ト （ Qiagen） を 用 い て 抽 出 し 、 そ し て ｃ Ｄ Ｎ Ａ を Superscript II（ Invitrogen
）を用いて生成した。β−アクチン（２５サイクル）を除いて、全てのマーカーについて
ＰＣＲを３０サイクル実施した。中期広がりのために、細胞を５ｍｌの０．５６％ ＫＣ
ｌで２０分間処理し、氷上でメタノール：酢酸（３：１）中に１５分間固定し、スライド
40
ガ ラ ス 上 に 広 げ 、 そ し て Ｔ Ｏ Ｐ Ｒ Ｏ − ３ （ Molecular probes） で 染 色 し た 。
【０１５４】
（ヒト胚および胎児培養物）
イ ン フ ォ ー ム ド コ ン セ ン ト の も と で の ヒ ト 組 織 に 関 す る 研 究 は 、 Research Ethics Comm
ittee of Lothian Health Boardに よ っ て 認 可 さ れ た 。 凍 結 し た 余 剰 の ヒ ト 胚 が 、 Human F
ertilisation and Embryology Authorityに よ り 発 行 さ れ た ラ イ セ ン ス Ｒ ０ １ ３ ２ 下 で の
研 究 の た め に 贈 与 さ れ た 。 Polkinghorneガ イ ド ラ イ ン 下 の 研 究 の た め に 同 意 の も と に 選 択
中絶したカーネギー１９／２０期の胎児からヒト皮質を切り出した。
【０１５５】
（移植）
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Magrassiら , 1998に 記 載 に よ り 胎 児 手 術 を 実 施 し た 。 ガ ラ ス キ ャ ピ ラ リ ー を 用 い て 、 １
μＬのＨＢＳＳの容量中に５×１０
４
個 の 細 胞 を 、 透 照 下 で 曝 露 し た E14.5 Sprague Dawl
eyラ ッ ト 胎 児 の 終 脳 小 胞 に 注 入 し た 。 注 入 さ れ た 胎 児 を 、 満 期 ま で 発 生 の た め に 腹 腔 内 に
戻した。分娩後、移植後７日目（出生後日数（Ｐ）１、ｎ＝１６）および５週目（Ｐ３０
、ｎ＝８）で動物を屠殺した。成体移植のために、１２９またはＣＤ１マウスをＫｏｐｆ
定位枠内に置き、そして５μＬのＨＢＳＳ中に懸濁した２×１０
５
個のＮＳ細胞を線条体
（ｎ＝２２）または海馬（ｎ＝２１）に注入した。移植されたマウスを２週後（ｎ＝１６
）および４週後（ｎ＝１０）に屠殺し、そして４％パラホルムアルデヒドを経心臓にて灌
流した。低温切片（１６μｍ）を以下の抗体で染色した：（マウス）：ＮｅｕＮ（１：１
０ ０ ） お よ び Ｋ ｉ ６ ７ （ １ ： １ ０ ） （ Chemicon） 、 Ｍ Ａ Ｐ ２ （ １ ： ２ ０ ０ ； Becton Dicki
10
nson） 、 ネ ス チ ン （ １ ： ５ ;Ron McKay） ； （ ウ サ ギ ） ： β IIIチ ュ ー ブ リ ン （ １ ： ５ ０ ０
； Covance） ； Ｇ Ｆ Ａ Ｐ （ １ ： ２ ０ ０ ； Dako） ； 二 次 抗 体 、 Texas Red（ Vector） （ Jackso
n ImmunoResearch） お よ び AlexaFluor 488（ Molecular Probes） 。 切 片 を 変 退 色 防 止 溶 液
中 で 保 存 し 、 そ し て Nikon TE2000-S ECLIPSEお よ び Biorad Radiance 2100共 焦 点 顕 微 鏡 で
分析した。
【０１５６】
（実施例２−２）
本発明者らは、ＥＳ細胞の単層分化を７日間誘導し、次いでＥＧＦおよびＦＧＦ−２を
添加した基本培地（ＮＳ−Ａ＋Ｎ２）に再播種した。これらの最少条件（ＥＳ細胞生存に
対して非許容）下で生存している細胞が主として結合して浮遊塊となる。３∼５日後、こ
20
れらの凝集体を採取し、そして新鮮な培地に再播種した。それらは、２∼３日以内に付着
し、そして二極細胞の形態的に均質な集団に大きくなった（ＬＣ１と命名）。継代に際し
て、ＬＣ１細胞は、接着培養物として増殖し続け、しばしば、格子状網を形成した。それ
らは、連続的かつ迅速に増殖され得、倍加時間は約２４時間である。ＬＣ１細胞は、神経
前駆マーカーのネスチンおよびＲＣ２を提示するが、星状細胞分化マーカーのＧＦＡＰま
たはニューロン抗原の発現は無視し得る程度である（図１Ａ）。血清またはＢＭＰへの曝
露に際して、ＬＣ１細胞は、４８時間以内に代表的な星状細胞形態をとり、そして引き続
き、ＧＦＡＰを均一に発現する（図１Ａ，ｅ）。対照的に、ニューロン突起を有する細胞
は、ＥＧＦなしで５∼７日間ラミニン上に再播種しそしてＦＧＦ−２を除去した後に出現
す る 。 こ れ ら の 細 胞 は 、 ニ ュ ー ロ ン マ ー カ ー の III型 β − チ ュ ー ブ リ ン 、 Ｍ Ａ Ｐ ２ （ 図 １
30
Ａ，ｆ，ｇ）およびｎｅｕＮ（示さず）を発現している。ほとんどのニューロンは、ＧＡ
Ｄ６７（図１Ａ，ｇ）およびＧＡＢＡ（示さず）に対して染色し、そして７日目まで、亜
集団が、成熟マーカーのシナプトフィシンの発現を示す（図１Ａ，ｈ）。１１５継代後で
さえも、多数のニューロン（＞３５％）が生成される（図１Ａ，ｉ）。ＬＣ１細胞が後期
継代で二倍体染色体内容物を保持しているという所見（示さず）とともに、このことは、
自己再生神経幹（ＮＳ）細胞の存在を確証している。
【０１５７】
（実施例２−３）
細胞凝集がＮＳ細胞の生成に必須であるか否かを決定するために、本発明者らは、誘導
プ ロ セ ス を 通 し て 細 胞 付 着 を 維 持 し た 。 こ の た め に 、 本 発 明 者 ら は 、 GFPirespacレ ポ ー タ
40
ー ／ 選 択 カ セ ッ ト が Ｓ ｏ ｘ １ 遺 伝 子 （ 神 経 分 化 の 特 異 的 マ ー カ ー （ Aubertら , 2003） で あ
る ） に 組 み 込 ま れ て い る ４ ６ Ｃ Ｅ Ｓ 細 胞 を 用 い る 系 統 選 択 （ Liら , 1998） を 利 用 し た 。
分化誘導後の一過性のピューロマイシン選択により、残余ＥＳ細胞のない神経前駆体の精
製 さ れ た 集 団 を 得 た （ Stavridisら , 2003） （ 図 １ Ｂ ａ ， ｂ ） 。 次 い で 、 Ｆ Ｇ Ｆ − ２ お
よびＥＧＦを、富化培地中でＳｏｘ１発現神経前駆体に与えた。この条件で細胞は接着し
たままであった。細胞異質性は３∼４継代にわたって減少した。二極細胞の数が累進的に
増大し、広範囲に格子を形成し始めたからである。興味深いことに、Ｓｏｘ１の発現はこ
の段階で喪失したが（図１Ｂ ｃ，ｄ）、細胞は、Ｓｏｘ２およびネスチンに対してなお
陽 性 で あ っ た 。 神 経 幹 （ Ｎ Ｓ ） 細 胞 の 存 在 を 確 立 す る た め に 、 単 一 の 細 胞 を Terasakiウ ェ
ルに単離し、そして接着培養として増殖させた（図１Ｂ，ｅ，ｆ）。まず、同様の形態お
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よび増殖特性の５つのクローン株を、バルクＬＣ１集団に誘導した。これらの細胞は、分
化多能性因子のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ、ならびにまた初期神経マーカーのＳｏｘ１の
検出可能な発現を欠いていたが、汎神経上皮マーカーのＳｏｘ２およびネスチンを保持し
ていた（図１Ｃ）。したがって、ＮＳ細胞は、連続接着培養によってＳｏｘ１陽性初期神
経外胚葉前駆体から生成された。
【０１５８】
（実施例２−４）
クローンＮＳ−５をさらに詳細に試験し、そしてＰａｘ６、Ｇｌａｓｔ、およびＢＬＢ
ＰのｍＲＮＡを発現していること、および、ＲＣ２、ビメンチン、３ＣＢ２、ＳＳＥＡ１
／Ｌｅｘ１、およびプロミニンに対して免疫陽性であることを見出した（図１Ｄ）。この
10
マーカーセットは、神経原性放射神経膠に対する診断に有用であるとみなされており、神
経 系 の 発 生 の 間 の ニ ュ ー ロ ン お よ び 星 状 細 胞 の 両 方 の 前 駆 体 で あ る （ Campbellら , 2002;
Hartfussら , 2001） 。 ク ロ ー ン 化 さ れ て い な い Ｌ Ｃ １ 細 胞 と 同 様 に 、 Ｎ Ｓ − ５ 細 胞 は 、 星
状細胞およびニューロン分化に対してコンピテントであった（図１Ｅ）。ＥＧＦ＋ＦＧＦ
−２にクローン密度で播種したＮＳ−５細胞は、二極細胞のコロニーを生じた。全てのコ
ロニーが、事実上全ての細胞でのＲＣ２およびＢＬＢＰの発現、ならびにＧＦＡＰの不在
を示した（図１Ｆ，ｃ，ｄ）。これらのサブクローンを選抜し、そして連続して増殖させ
た。ＮＳ培養内でのニューロン分化可能な細胞の頻度を決定するために、本発明者らは、
再度、ＮＳ−５細胞をクローン密度で播種し、ＥＧＦ／ＦＧＦ−２中で１２日間、次いで
ＦＧＦ−２単独で５日間、次いでさらに７日間増殖因子なしで増殖させた。全てのコロニ
20
ー（１２６／１２６）が、ＴｕＪ陽性細胞を生成した（図１Ｆ，ｂ）。これらのデータは
、ＮＳ培養物中の全てのコロニー形成細胞が、ニューロン分化に対してコンピテントであ
ったことを示した。最終的に、ＬＣ１と同様に、ＮＳ−５細胞は、二倍体染色体相補体を
維持しており（図１Ｇ）、そして複雑な細胞微細環境の必要なく自己再生する非形質転換
クローン神経幹（ＮＳ）細胞株であることを表していた。
【０１５９】
（実施例２−５）
無血清単層誘導プロトコルがＮＳ細胞生成に予め必要であるか否かを評価するために、
ＥＳ細胞を、胚様体形成および血清含有培地中のレチン酸への曝露によって分化を誘導し
た （ Bainら , 1995） 。 凝 集 体 を 、 Ｇ ４ １ ８ を 用 い る Ｓ ｏ ｘ ２ 系 統 選 択 （ Liら , 1998; Bill
30
onら , 2002） に ４ ８ 時 間 供 し 、 次 い で 血 清 な し で Ｆ Ｇ Ｆ − ２ お よ び Ｅ Ｇ Ｆ の 存 在 下 で 再 播
種した。付着した後、Ｓｏｘ２陽性、ネスチン陽性の細胞が増殖した。これらの細胞は、
ＮＳ細胞に代表的な二極性の形態および格子状の増殖を提示し、さらに多重継代後に星状
細胞およびニューロン分化能を有した（データは示さず）。このように、ＮＳ細胞が、胚
様体から誘導された。
【０１６０】
（実施例２−６）
３つの独立したＥＳ細胞単離株Ｅ１４ＴＧ２ａ、ＣＧＲ８、およびＲ１から、ＬＣ１に
ついて記載したような系統選択を行わずに単層誘導を用いてＮＳ細胞を誘導した。試験し
たＮＳ株は全てが、細胞の少なくとも９５％においてネスチンおよびＲＣ２を発現した。
40
ＣＧＲ８およびＥ１４ＴＧ２ａ由来ＮＳ細胞のより詳細な研究により、フルパネルの放射
神経膠マーカー（図２Ａ）、神経前駆体マーカーＳｏｘ２およびＳｏｘ３、ならびにｂＨ
ＬＨ転写因子Ｏｌｉｇ２およびＭａｓｈ１（図２Ｂ）を示した。Ｓｏｘ１がダウンレギュ
レ ー ト さ れ た が Ｓ ｏ ｘ ２ は 維 持 さ れ た こ と は 、 こ れ ら の 転 写 因 子 の 推 定 の 決 定 的 機 能 （ Pe
vnyら , 1998） を 考 慮 し て 、 こ れ ら の Ｎ Ｓ 細 胞 の 顕 著 な 特 徴 で あ っ た 。 こ の よ う に 、 Ｓ ｏ
ｘ１は、全ての神経外胚葉前駆体をマークしているが、Ｓｏｘ２が重要な役割を果たして
いると考えられる幹細胞においては、これは保持されなかった。ＮＳ細胞はまた、Ｅｍｘ
２ を 発 現 し て い た 。 Ｅ ｍ ｘ ２ は 、 神 経 前 駆 細 胞 の 増 殖 に 関 与 し て い る （ Heinら , 2001; Ga
lliら , 2002） 。 試 験 し た 全 て の Ｎ Ｓ 培 養 物 は 、 形 態 学 お よ び 免 疫 染 色 の 両 方 に よ っ て 評
価される星状細胞およびニューロンの分化を受けた（図２Ｃ）。
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【０１６１】
（実施例２−７）
それらの放射神経膠への明らかな関係を考慮して、本発明者らは、ＮＳ細胞が、エクス
ビボ増殖へのＥＳ細胞の前適応から生じるか、または胎児神経組織から誘導され得るかを
調べた。Ｅ１６．５胎児脳からの一次胎児ＣＮＳ細胞は、増殖因子を添加した基本培地で
はプラスチックへの接着はわずかであり、自発的に凝集体を形成した。６∼７日後、これ
らの凝集体は、ゼラチンコーティングしたプラスチック上に定着した。１４日後、成長体
をトリプシン処理し、そしてゼラチンコーティングしたプラスチック上に播種した。３つ
の別個の実験において、ＮＳ細胞と形態学的に同定可能な細胞が増殖し、そして引き続き
増殖させて、連続細胞株になった。これらの胎児脳誘導物は、ＥＳ細胞由来ＮＳ細胞と同
10
じ放射神経膠および神経原性マーカーを発現し（図２Ａ、Ｂ）、そして一致したｍＲＮＡ
プロフィールを示した。それらは、同様に、星状細胞およびニューロン分化に対してコン
ピテントであった（図２Ｃ）。ＮＳ−５について記載したように、皮質誘導Ｃｏｒ−１細
胞を単一の細胞として播種し、次いでコロニーを引き続く増殖因子除去に供した。全ての
コロニーが、ＴｕＪ陽性ニューロンを生成していた。このことは、Ｃｏｒ１培養物中の全
てのクローン原性細胞が神経原性であることを示していた。Ｃｏｒ−１細胞もまた、個々
の細胞から容易にサブクローン化されそして連続的に増殖された。これは、自己再生を示
す。このように、ＮＳ細胞が胎児脳から誘導され、そしてこれは、ＥＳ細胞由来ＮＳ細胞
の重要な特性を共有していた。
【０１６２】
20
ほとんどのＮＳ細胞は、放射神経膠であると認められる、伸長した二極性の形態、平板
状 の 伸 長 部 、 エ ン ド フ ィ ー ト お よ び 卵 形 の 核 （ Rakic, 2003） を 有 し て い た 。 短 い 伸 長 部
を有する扁平状の緻密な細胞もまた存在していた。中期マーカーであるリン酸化ヒストン
Ｈ３に対する免疫染色により、緻密な細胞は、有系分裂しているものであることが示され
た。時間差ビデオ顕微鏡により、細胞分裂前に形態が活発に変化していることが確認され
た。さらに、この時間差により、ＮＳ細胞が、運動間の核移動を受けていることが明らか
になった。これは、インビボでの神経上皮および放射神経膠細胞の十分に特徴付けられた
特徴である。
【０１６３】
したがって、ＮＳ細胞は、神経原性放射神経膠の連続的に増殖可能なインビトロアナロ
30
グであった。
【０１６４】
（実施例２−８）
凍結／融解した４０継代目のマウス神経球を、ＮＳ増殖培地中でゼラチンコーティング
したプラスチックに付着させた。ＮＳ細胞と区別不能な二極細胞が生じた。これらの細胞
は、均一なＲＣ２陽性ＧＦＡＰ陰性の集団として連続的に増殖され得、次いで星状細胞ま
たはニューロンへの分化が誘導され得る。
【０１６５】
（実施例２−９）
本発明者らは、マウス脳への移植の際のＮＳ細胞の挙動を調べた。レンチウイルスｅＧ
40
ＦＰ発現ベクターを用いて形質導入したＥＳ細胞由来ＬＣ１細胞を、Ｅ１４．５での子宮
内 注 入 に よ り 発 生 中 の 脳 に 導 入 し た （ Magrassiら , 1998） 。 出 生 後 、 動 物 を 屠 殺 し 、 そ し
て脳切片のｅＧＦＰ陽性細胞の存在を調べた。ＮＳ細胞子孫は、種々の脳領域に遊走して
いた。免疫組織化学分析により、ｅＧＦＰと、前駆体マーカーネスチン、ニューロンマー
カーＴｕＪ、ＮｅｕＮ、およびＭＡＰ２と、ならびに数は少なくなるがＧＦＡＰとが共発
現していることが明らかになった。ＮＳ細胞を成体マウス線条体にも注入した。この場合
、ＧＦＰ陽性細胞は、注入部位の近辺に局在したままであった。移植４週間後、ＧＦＰ発
現細胞の４４．４±５．７％がニューロン形態を有しそしてＭＡＰ２に対して免疫陽性で
あり、３７．４±６．１％がＧＦＡＰを発現し、そして４．２±１．９％がネスチンの発
現を保持していた（図３）。増殖マーカーＫｉ６７は、ＧＦＰ陽性細胞の１．０±０．６
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％でのみ検出された。このことは、ＮＳ細胞がインビボで細胞周期から回収されたことを
示している。このことと一致して、本発明者らは、移植の１ヵ月後に調べた全部で３５の
脳において、制御されない増殖または腫瘍形成の組織学的証拠がないことを認めた。さら
に、マウス腎臓嚢に移植されたＮＳ細胞は、増殖せず、奇形腫も生じなかった。これらの
データは、ＮＳ細胞が胎児脳および成体脳の両環境において生存しそして分化し得ること
、 お よ び Ｅ Ｓ 細 胞 （ Brustleら , 1997） と は 異 な り 、 そ れ ら は 奇 形 腫 を 生 じ な い こ と を 示
していた。さらに、この比較的高い頻度でのニューロン分化は、継代した神経球の移植片
（ Rossiら , 2002） と は 非 常 に 対 照 的 で あ る 。
【０１６６】
（実施例２−１０）
10
最後に、本発明者らは、同様のＮＳ細胞が、ヒト供給源から単離され得るか否かを調べ
た。贈与された余剰胚からヒトＥＳ細胞を誘導する過程において、本発明者らは、培養５
∼６週後に、神経上皮細胞に代表的であるロゼット状構造への広範な分化を認めた。これ
らの細胞をＮＳ増殖培地に移した。さらに３∼４週後、ＮＳ細胞に類似の二極細胞がこれ
らの培養物から出現し（図４Ａ）、そして５ヶ月間連続的に培養した。本発明者らはまた
、選択中絶からカーネギー１９∼２０期のヒト胎児皮質組織を確保した。解離した細胞は
まず浮遊凝集体を形成した。マウス胎児脳からのＮＳ細胞の誘導と同様に、その７日後に
再播種し、そしてゼラチンコーティングしたプラスチックに付着させた。増殖している培
養物が樹立された（図４Ｂ）。ＥＳ細胞および胎児組織の両方からのヒトＮＳ培養物は、
二極細胞が付随した扁平状の細胞の存在によって特徴付けられた。しかし、全ての細胞が
20
、未熟前駆体マーカーであるネスチン、ビメンチン、および３ＣＢ２を発現していた（図
４Ｂ）。時間差モニタリングによって、２つの細胞形態が形成されかつこれらは互換性で
あることが確証された。これらのヒト細胞はまた、低レベルのＧＦＡＰを提示し、これは
、 放 射 神 経 膠 中 の ヒ ト Ｇ Ｆ Ａ Ｐ プ ロ モ ー タ ー の 活 性 （ Rakic, 2003; Malatestaら , 2000）
と一致した。それらは、マウス細胞よりもゆっくりと増殖した。倍加時間は数日間であっ
た。ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を引き続き除去した後、それらは、未熟なニューロン細胞を
生成しているようであった（図４Ｃ）。強いＧＦＡＰ免疫反応性を有する代表的な星状細
胞形態の細胞が、血清中の継代後に生成された（図４Ｃ）。
【０１６７】
（実施例３）
30
特定の処理後、これらの細胞が、成熟した機能的なニューロンに効率的に転換し得るか
否かを電気生理学的観点から知るために、インビトロでの分化の間、培養物におけるＮＳ
細胞の電気生理学特性を、パッチクランプ技術のホールセル改変型を用いることにより調
べた。
【０１６８】
（電気生理学記録用溶液）
電極と細胞との間のシールを、以下からなるバス溶液中で確立した（ミリモル／ｌで表
す）：１５５ ＮａＣｌ、１．０ ＣａＣｌ２ 、１ ＭｇＣｌ２ 、３．０ ＫＣｌ、１０
グルコース、１０ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）。ホールセルコンフィギュレ
ーションを確立した後、電流クランプ記録および電圧クランプ中の総電流記録のために、
40
ピペット充填溶液は以下を含んだ（ミリモル／ｌで表す）：１２８ ＫＣｌ、１０ Ｎａ
Ｃｌ、１１ ＥＧＴＡ、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）。
電圧クランプ条件下での電圧ゲートＮａ
＋
チャネルの研究のために、パッチピペットを以
下で満たした（ミリモル／ｌで表す）：１３０ ＣｓＣｌ、１０ ＮａＣｌ、２０ ＴＥ
Ａ−Ｃｌ、１０ ＥＧＴＡ、２ ＭｇＣｌ２ 、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳ／Ｃ
ｓＯＨ（ｐＨ７．４）。そして細胞外溶液は以下を含んだ（ミリモル／ｌで表す）：１３
０ ＮａＣｌ、２ ＣａＣ１２ 、２ ＭｇＣｌ２ 、１０ グルコース、５ テトラエチル
アンモニウム−Ｃｌ、ＣｄＣｌ２ ０．２、１０ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）
。電圧ゲートＣａ
２ ＋
チャネルの研究のために、パッチピペットを以下で満たした（ミリ
モル／ｌで表す）：１２０ ＣｓＣｌ、２０ ＴＥＡ−Ｃｌ、１０ ＥＧＴＡ、２ Ｍｇ
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Ｃｌ２ 、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳ／ＣｓＯＨ（ｐＨ７．４）。そして細胞外
溶液は以下を含んだ（ミリモル／ｌで表す）：１３０ ＮａＣｌ、１０ ＢａＣｌ２ 、１
０ グルコース、５ テトラエチルアンモニウム−Ｃｌ、１０ ４−ＡＰ １、ＴＴＸ １０
− ３
、ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）。
【０１６９】
（パッチクランプ記録）
イ オ ン 電 流 を 、 Axopatch 200Bパ ッ チ ク ラ ン プ 増 幅 器 （ Axon Instruments Inc., Burlin
game, CA） に よ っ て 室 温 （ ２ ０ ∼ ２ ４ ℃ ） で パ ッ チ ク ラ ン プ ホ ー ル セ ル 配 置 （ １ ９ ） を 用
い て 電 圧 ク ラ ン プ 条 件 下 で 記 録 し 、 そ し て Ｉ Ｂ Ｍ 互 換 Ｐ Ｃ と イ ン タ ー フ ェ ー ス し た Digida
ta 1322A Ａ ／ Ｄ 変 換 器 （ Axon Instruments Inc., Burlingame, CA） を 用 い て 、 ２ ６ ∼ １
10
００μｓｅｃのサンプリング間隔でデジタル化した。刺激、データの取得、およびデータ
分 析 は 、 以 下 の ソ フ ト ウ ェ ア パ ッ ケ ー ジ を 用 い て 実 施 し た ： pClamp 9（ Axon Instruments
Inc., Burlingame, CA） お よ び ORIGIN 6（ Microcal Software Inc., Northampton, MA）
。電圧クランプ実験のために、まず、漏洩および容量の電流の線形成分をアナログサーキ
ットリによって減少させ、次いでＰ／Ｎ法でほぼ完全にキャンセルした。パッチピペット
をホウケイ酸ガラス管から作製し、火入れした。ピペットは、内部溶液で満たしたときに
３∼４ＭΩの最終抵抗を有していた。電流は５ＫＨｚでフィルタリングした。
【０１７０】
図５Ａは、内向き（Ｎａ
＋
）および外向き（Ｋ
＋
）の両電圧ゲートイオン電流の分離に
適したバスおよびピペット充填溶液を用いた、インビトロ分化の異なる段階での３つのＮ
20
Ｓ細胞（それぞれ分化培地中で６日、２０日、および３０日間培養）における脱分極試験
電位に対するホールセル電圧クランプ工程の間に得られた電流記録を示す。電流追跡の簡
単な観察から、相当に大きな外向きの電圧ゲート電流がインビトロ分化の初期段階で既に
存在していることが明らかである（６日、トレースａ）。この電流は、５ｍＭテトラエチ
ルアンモニウム−Ｃｌを含む細胞外生理食塩水の適用によってブロックされ、遅延整流Ｋ
＋
電流の特徴を有する。その振幅は、分化の後期段階でわずかにのみ増大した（２０∼３
０日、それぞれトレースｂおよびｃ）。対照的に、内向き電流の振幅は、６日後では無視
し得る程度であるが、分化培地への曝露時間の増加によって劇的に増大している。図５Ｂ
は、図５Ａに示した同じ細胞における電圧クランプから電流クランプモードへの切り替え
後に、約−８０ｍＶの保持電位からの７０∼３００ｐＡの間の矩形脱分極電流刺激の細胞
30
内注入後に誘発された電圧応答を示す。確かに、電圧ゲート内向き電流の振幅の増大は、
分化している細胞が活動電位を誘発する能力を反映している。実際、６日間のみ分化剤に
曝露されて無視し得る程度の内向きを示している細胞は、再生電圧応答を誘発することが
できなかった（図５Ｂに（ａ）で示したトレース）。対照的に、比較的速い脱分極速度を
有するオーバーシュート作用電位が、３０日間分化培地で培養され（図５Ｂに（ｃ）で示
したトレース）そして大きな内向き電流を提示する（図Ａのトレースｃ）細胞において誘
発され得た。中間型の状況（不全活動電位を有する）が、分化剤で２０日間処理され（図
５Ｂに（ｂ）で示したトレース）そして中位の内向き電流を提示している（図Ａのトレー
スｂ）細胞で見られた。この予備分析から、これらの細胞の興奮特性が、内向き電圧ゲー
トコンダクタンスの大きさに対して厳密に相関していることが分かる。分化培地への曝露
40
時間の関数としてのこのコンダクタンスの定量分析のために、内向き電流は、分化の異な
る段階の細胞を用いそして電圧ゲートＮａ
＋
チャネルの活動の研究に特異的な細胞内およ
び細胞外生理食塩水を適用して、誘発される（方法を参照のこと）。細胞分化の任意の時
間で、速い不活性化内向き電流は、選択的Ｎａチャネルブロッカーであるテトロドトキシ
ン（１μＭ）によって完全にブロックされ、そして−２０∼−１０ｍＶの間の試験電位で
ピークとなった。これは、ニューロンにおける電圧ゲートＮａ
＋
電流の代表的な特徴を示
している（データは示さず）。図５Ｃには、分化培地への曝露時間の関数として−２０ｍ
ＶでのＮａ
＋
電流振幅の発生が示される。興味深いことに、Ｎａ
＋
コンダクタンスの増大
は、分化培地への細胞曝露の増大と十分に相関している。確かに、平均して、Ｎａ
＋
電流
振幅は処理３０日以内で約１０倍増大している（最初の５日間の５５±１４ｐＡ（ｎ＝１
50
(37)
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７）から２５日より長い間の−４３４±１３５ｐＡ（ｎ＝１３）へ）。同じように、電流
クランプ条件下のＮａ
＋
電流により誘発された再生電位（閾値とピーク値との間で測定さ
れたΔＶ）は、インビトロ分化の最初の１５日間（ｎ＝６）は０から＋２０ｍＶの間であ
ったが、処理が２５日より長ければ、＋３０から＋７０ｍＶの間の値に達した（ｎ＝６）
。全体では、分化培地で２５日より長く処理されたＮＳ細胞で見られた興奮特性および原
電圧ゲートＮａ
＋
コンダクタンスの特性は、それらの成体表現型に発達しているニューロ
ンに代表的である。以前の結論を立証する別の特徴は、少なくとも７日間またはそれより
長く分化培地に曝露した後に試験した細胞のほとんどにおける電圧ゲートＣａ
ルコンダクタンスの存在である。図５Ｄは、１０ｍＭ Ｂａ
２ ＋
２ ＋
チャネ
のバス中に入れた同じ細
胞からの示した試験電位に対する膜脱分極により得られるサンプル追跡を示す。−４０ｍ
10
Ｖで誘発された速い活性化およびやや速い不活性化（Δｈ ＝２１ｍｓ）電流成分は、ニュ
ーロンＬＶＡ Ｃａ
２ ＋
チ ャ ネ ル 電 流 （ Carboneお よ び Lux, 1987） を 暗 示 し て い る 。 対 照
的に、０ｍＶで誘発されたＢａ
２ ＋
電流は、ゆっくりとした（Δｈ ＝７３ｍｓ）不完全な
不活性化を提示し、ニューロンＨＶＡ Ｃａ
２ ＋
チャネル電流の代表的な特徴を有する。
この細胞における２つの別個（ＬＶＡおよびＨＶＡ）のＣａ
２ ＋
チャネルコンダクタンス
の存在は、図５Ｅの電流−電圧関係によって確証される。平均して、ＬＶＡ電流は−４０
ｍＶでピークであるが、ＨＶＡ電流についてＩ／Ｖ関係は０ｍＶでピークであった。ＨＶ
Ａ Ｂａ
２ ＋
ＶＡ Ｃａ
電流は、２７細胞のうち１９で検出可能であったが、ＬＶＡ電流成分は、Ｈ
２ ＋
電流を既に発現している細胞の６０％で測定された（ｎ＝１３）。
【０１７１】
20
このデータは、本発明の神経幹細胞から生成されたニューロンが機能し得ることを示し
ている：それらは、活動電位を刺激し得、これは、活性ニューロンの顕著な特徴である。
【０１７２】
したがって、本発明にしたがって、本発明者らは、所定のＮＳ細胞をＥＳ細胞および胎
児脳抽出物の分化した子孫として誘導しそして均質に増殖した。ＮＳ細胞は、簡単な接着
単層培養でクローン増殖し、そして二倍体を維持した。増殖の延長後、それらは、インビ
トロおよび成体脳への移植の両方で、ニューロンおよび星状細胞に効率的に分化した。Ｎ
Ｓ細胞はまた、インビトロで乏突起膠細胞も形成した。ＮＳ細胞は、放射神経膠の形態お
よび分子特徴、ニューロンおよび星状細胞の胎児前駆体、を均一に発現していた。本発明
者らは、マウスおよびヒトの両方の胎児脳から接着ＮＳ細胞株を樹立できた。
30
【０１７３】
（実施例６）
以下のプロトコルを用いて、ＮＳ細胞を、マウスＥＳ細胞および胎児皮質から得た。誘
導されたＮＳ細胞は、放射神経膠マーカーを均一に発現していた。ＣＧＲ８ ＥＳ細胞ま
たはＥ１６胎児皮質（内部参照：Ｃｏｒ−１およびクローン誘導体Ｃｏｒ−１．３）から
特異的に誘導されたＮＳ細胞を、免疫化学により指示マーカーの発現について分析した。
ハイパワーでの試験は、放射神経膠マーカーが、ほとんど全ての細胞において各々発現さ
れており、一方、均一にＧＦＡＰに対して陰性であったことを示した。
【０１７４】
（実施例７）
40
以下のプロトコルを用いて、ＮＳ細胞を、増殖させたマウス胎児前脳神経球から誘導し
た。長期胎児神経球培養物（４０継代）由来のＮＳ株は、ＥＳ由来ＮＳ株と同一の形態を
示し、神経前駆細胞／放射神経膠マーカー免疫反応性を発現し、そしてニューロンおよび
星状細胞に分化し得た。これは、新鮮な胎児神経球から得られたＮＳ細胞が、凍結し次い
で長期間神経球として増殖した神経球から得られたものと同じであることを示した。
【０１７５】
（実施例８）
ＬＣ１マウスＮＳ細胞を胎児ラット脳に移植した。ｅＧＦＰを用いてレンチウイルス形
質導入したＮＳ細胞の共焦点像を、Ｅ１４．５ラットの脳室への移植１週間後に撮影した
。ドナー細胞は、塊状でおよび単一の細胞として、脳室から柔組織に移動した。移植され
50
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た細胞は、ｅＧＦＰとニューロンマーカーＭＡＰ２、星状膠マーカーＧＦＡＰまたは前駆
細胞マーカーネスチンとの共局在を示した。したがって、ＮＳ細胞は、胎児ラット脳にお
ける移植後、移動しそして分化した。
【０１７６】
（実施例９）
（ＮＳ細胞株の誘導および操作のためのプロトコル）
本発明者らは、ＮＳ細胞株の誘導および操作のために、以下のプロトコルを案出した。
【０１７７】
（ＥＳ細胞からのマウスＮＳ細胞株の誘導）
ＥＳ細胞は、接着単層培養においてＳｏｘ１発現神経前駆体に効率的に変換され得る［
10
Ｐ１］。このＥＳ細胞分化に関する詳細なプロトコルおよびトラブルシューティングは他
にも記載される［Ｐ２］。簡潔には、ＥＳ細胞を、ゼラチンコーティングした組織培養プ
ラスチック上で１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍｌ組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ
）を添加した培地中にフィーダーを与えない条件下で通常通りに培養する［Ｐ３］。未分
化 の Ｅ Ｓ 細 胞 を 、 Ｔ ７ ５ フ ラ ス コ （ Iwaki） 中 で 約 ８ ０ ％ コ ン フ ル エ ン ス ま で 増 殖 さ せ 、
トリプシン処理し、そしてＮ２Ｂ２７培地中に再懸濁する［Ｐ２］。細胞を、少なくとも
１ ０ 分 間 ０ ． １ ％ ゼ ラ チ ン 溶 液 （ Sigma） で コ ー テ ィ ン グ し 次 い で 乾 燥 さ せ て お い た ９ ｃ
ｍ プ レ ー ト （ Iwaki） 上 に 播 種 す る 。 初 期 播 種 密 度 は 、 効 率 的 な 神 経 誘 導 に と っ て 重 大 な
パラメーターであり、そしてＥＳ細胞株間で変動し得るので、本発明者らは、プレート当
たりいくつかの異なる細胞密度（０．８×１０
６
、１×１０
６
、および１．２×１０
６
）
20
で、通常通りに播種する。脱着または死亡した細胞を除去する過程で、毎日、培養培地を
入れ替える。これらの条件下では、５０∼８０％の細胞が４∼５日以内に神経系統分化を
受け、そして５日目から先では明白なニューロン分化が検出可能となる。
【０１７８】
不均質な前駆体培養物の均質ＮＳ細胞株への変換は、以下のようにして達成され得る。
７日目の分化培養物をトリプシン処理し、そして２∼３×１０
６
個の細胞を、ＮＳ増殖培
地 （ こ れ は Ｌ − グ ル タ ミ ン 、 ２ ｍ Ｍ 最 終 （ Gibco） 、 改 変 Ｎ ２ 補 充 物 （ ウ マ か ら の 調 製
直 後 の も の ） ［ Ｐ ２ ］ な ら び に １ ０ ｎ ｇ ／ ｍ ｌ の マ ウ ス Ｅ Ｇ Ｆ （ Peprotech） お よ び ヒ ト
Ｆ Ｇ Ｆ − ２ （ Peprotech） を 添 加 し た Ｎ Ｓ − Ａ 培 地 （ Euroclone） を 含 む ） 中 で 非 コ ー テ ィ
ングＴ７５フラスコ中に再播種する。増殖培地は、４週間までの間、４℃で保存され得る
30
。２∼３日以内に、フラスコは、懸濁培養物中に数千もの浮遊凝集体を含むようになる（
絶対数は、初期ＥＳ細胞分化の効率に従って変動する）。細胞凝集体は、穏やかな遠心分
離によって回収するか、または１０分間３０ｍｌユニバーサル管中で重力に従って静置さ
せる。この工程は、破片および死細胞を除去することによりＮＳ細胞創始物を濃縮し、そ
して完全な培地交換を確実にする。細胞を、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコ（
Iwaki） 上 で １ ０ ｍ ｌ の 新 鮮 な Ｎ Ｓ 増 殖 培 地 に 再 播 種 す る 。 さ ら に ３ ∼ ７ 日 後 、 細 胞 凝 集
体は、フラスコに付着し、そしてその後まもなく、特徴的な二極ＮＳ細胞形態を有する細
胞が生じる。広範な細胞成長後（さらに３∼４日後）、集団全体をトリプシン処理し、そ
して増殖培地中でゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコ上に単一の細胞として再播種
する。細胞は、非常に迅速に増殖し（倍加時間約２５時間）、そして接着したままである
40
。数継代以内に、残りの分化した細胞および芽球細胞は排除され（ＧＦＡＰおよびＴｕＪ
１免疫染色によってモニタリングする）、そして培養物は、ＮＳ細胞マーカーに対して均
一に陽性である。
【０１７９】
４６Ｃ ＥＳ細胞（Ｓｏｘｌ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｐａｃノックイン）［Ｐ４］のため
に、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を用いる一過性の選択が、非神経細胞を排除
しそして連続接着培養を介してＮＳ細胞を誘導するために使用され得る。４６Ｃ ＥＳ細
胞（１×１０
６
）を、ゼラチンコーティングした９ｃｍディッシュ上でＮ２Ｂ２７培地中
に播種して、神経方向付けを誘導する。６日後、ピューロマイシンを４８時間添加する。
次いで、富化されたＳｏｘ１発現細胞集団（約３∼５×１０
６
）を、ゼラチンコーティン
50
(39)
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グした９ｃｍプレート上でＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ
）を含むＮ２Ｂ２７培地中に再播種する。初期に形態学的に不均質なＳｏｘ１を発現する
集団は、Ｓｏｘ１陰性特徴を、そして３∼４継代後には、均一なＮＳ細胞形態およびマー
カー発現を、累進的に獲得する。
【０１８０】
（胎児ＣＮＳおよび神経球からのマウスＮＳ細胞株の誘導）
細胞クラスターは、ＮＳ細胞増殖培地中での胎児Ｅ１６．５皮質および一次培養物の解
離の際に懸濁液中で形成される。これらの一次凝集体は、増殖培地中でゼラチンコーティ
ング基材上に播種することにより、接着ＮＳ細胞株に容易に変換され得る。付着を促進す
るために、まず破片／死細胞を沈降によって有効に除去し、そして培地を完全に交換する
10
ことが重要である。細胞凝集体が付着し、そして２∼５日にわたって増殖する。引き続き
、増殖している細胞をトリプシン処理して単一の細胞にし、再播種し、そしてＮＳ細胞増
殖培地中で増殖させ得る。継代した胎児神経球［Ｐ５］から、ＮＳ細胞は、便宜的には、
解離およびＮＳ増殖培地中でのゼラチンコーティングしたプラスチック上への直接播種に
よって樹立され得る。初期の数継代の間、誘導されたＮＳ株は、特に細胞密度が高くなる
場合には、凝集する傾向を有し、フラスコから脱着し、そして神経球を再形成する。した
がって、培養物は、５０％以下のコンフルエンスで継代されるべきである。自発的に凝集
する傾向は、可変性であるが、一般には、さらなる継代の際にまたはクローン細胞株の樹
立を通して減少される。
【０１８１】
20
（ＮＳ細胞の継代および増殖）
一旦樹立されると、ＮＳ細胞をＮＳ増殖培地で増殖させる。ＮＳ細胞を、ゼラチンコー
ティングしたプラスチック／フラスコ上で増殖させ、そして１／２から１／５に通常通り
に分割する。ＮＳ細胞は、約２５時間の倍加時間を有する。トリプシン／ＥＤＴＡを用い
て 、 ま た は カ ル シ ウ ム マ グ ネ シ ウ ム 非 含 有 Ｐ Ｂ Ｓ （ Sigma） と の イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン に よ
って、細胞を継代させる。クローン株の樹立のために、単一の細胞を、増殖培地中でゼラ
チンコーティングしたマイクロウェル中に堆積させ得る。より厳格ではないが、細胞は、
非常に低い密度で播種し得る（９ｃｍディッシュ当たり１０００細胞）。コロニーが、２
週間以内に出現し、そして選抜され増殖され得る。
【０１８２】
30
（ＮＳ細胞の凍結保存および回収）
ＮＳ細胞は、凍結／融解後に容易に回収される。通常通りに、本発明者らは、６０∼９
０％のコンフルエンスであるＴ７５フラスコをトリプシン処理し、そして１．５ｍｌ Ｎ
Ｓ増殖培地＋１０％ ＤＭＳＯ中にペレットを再懸濁する。次いで、これを３つの１ｍｌ
凍 結 管 （ Nunc） に 分 け 、 そ し て − ８ ０ ℃ で 貯 蔵 す る 。 Ｎ Ｓ 細 胞 は 、 こ れ ら の 条 件 で は ６ ヶ
月より長い貯蔵後でも回収可能である。長期貯蔵のために、凍結バイアルを液体窒素に移
す。バイアルを急速に３７℃にし、続いて１０ｍｌの予温ＮＳ増殖培地に移すことにより
、ＮＳ細胞を融解する。細胞をペレット化し、次いで新鮮な増殖培地中に再懸濁してＤＭ
ＳＯを除去する。凍結保存後の細胞回収率は、ＮＳ細胞については９５％を超える。
【０１８３】
40
（ＮＳ細胞の星状細胞およびニューロン分化）
ＮＳ細胞のＧＦＡＰ陽性星状細胞への迅速な分化は、ゼラチンコーティングしたフラス
コ／プレート上でＮＳ−Ａ（Ｎ２あり、ＥＧＦ／ＦＧＦなし）中でＢＭＰ４（１０ｎｇ／
ｍｌ）または１％ ＦＣＳにＮＳ細胞を曝露してから２日以内に生じる。細胞密度は、星
状細胞分化にとって重要なパラメーターではない。
【０１８４】
ニ ュ ー ロ ン 分 化 の た め に 、 Ｎ Ｓ 細 胞 を 、 Accutase（ Sigma） ま た は カ ル シ ウ ム ／ マ グ ネ
シウム非含有ＰＢＳを用いて細胞を脱着して回収し、そして０．５∼１．０×１０
４
個の
細 胞 を 、 Ｆ Ｇ Ｆ − ２ （ ５ ｎ ｇ ／ ｍ ｌ ） 、 改 変 Ｎ ２ 、 お よ び Ｂ ２ ７ （ Gibco） を 添 加 し た Ｎ
Ｓ−Ａ培地中で、ポリオルニチン／ラミニンコーティングした４ウェルマルチディッシュ
50
(40)
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プ レ ー ト （ Nunc） の 各 ウ ェ ル 中 に 再 播 種 す る 。 本 発 明 者 ら は 、 Ｎ Ｓ − Ａ 基 本 培 地 が 、 他 の
基本培地よりもニューロン分化に対してより許容性であることを見出している。培地の容
量の半分を２∼３日ごとに取り替え、培地の条件付けを維持する。これらの条件で７日後
、 本 発 明 者 ら は 、 Ｅ Ｇ Ｆ も Ｆ Ｇ Ｆ も 含 ま な い ０ ． ２ ５ × Ｎ ２ お よ び Ｂ ２ ７ を 添 加 し た Neur
obasal培 地 （ Gibco） と １ ： １ の 比 で 混 合 し た Ｎ Ｓ − Ａ に 、 培 地 を 交 換 す る 。 こ の 処 方 物
は、さらなるニューロン分化および成熟を促進する。より長期のニューロン培養（１４日
を越える）のために、本発明者らは、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＢ２７を含
む が Ｎ ２ を 含 ま な い Neurobasalに 、 培 地 を 交 換 す る 。
【０１８５】
（ヒトＮＳ細胞の培養およびニューロン分化）
10
１００Ｕ／ｍｌ組換えヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ）をさらに添加したマウスＮＳ細胞
と 同 様 の 増 殖 培 地 中 で 、 ヒ ト Ｎ Ｓ 細 胞 を 、 ０ ． １ ％ ゼ ラ チ ン （ Sigma） で コ ー テ ィ ン グ し
たフラスコ／プレート上で増殖させる。細胞は、約１週の倍加時間を有する。それらを、
約３０％のコンフルエンスに達するとトリプシンで継代させ、そして１／２に分ける。単
層培養を維持しそして凝集および脱着を防ぐために、過剰増殖は避けるべきである。
【０１８６】
ニ ュ ー ロ ン 分 化 の た め に 、 ヒ ト Ｎ Ｓ 細 胞 を 、 Accutase（ Sigma） を 用 い て 回 収 し 、 そ し
て約１×１０
４
個 の 細 胞 を 、 増 殖 培 地 中 で 、 ポ リ オ ル ニ チ ン ／ ラ ミ ニ ン （ Sigma） コ ー テ
ィ ン グ し た １ ２ ウ ェ ル プ レ ー ト （ Iwaki） の 各 ウ ェ ル 中 に 再 播 種 す る 。 細 胞 を 、 そ れ ら が
約８０％のコンフルエンスに達するまで増殖させる。ニューロン分化は、増殖培地からＥ
20
ＧＦおよびＬＩＦを除去することにより誘導する。ＥＧＦおよびＬＩＦのない状態で７日
後、０．５×Ｎ２、Ｂ２７、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍ
ｌ ） を 添 加 し た Neurobasal培 地 （ Gibco） と １ ： １ の 比 で 混 合 し た Ｎ Ｓ − Ａ に 、 培 地 を 交
換する。これらの条件でさらに７日後、培地を、Ｎ２もＦＧＦ−２も含まないＢ２７およ
び Ｂ Ｄ Ｎ Ｆ （ １ ０ ｎ ｇ ／ ｍ ｌ ） を 添 加 し た Neurobasal培 地 に 交 換 す る 。 こ の プ ロ ト コ ル 全
体を通して、マウスＮＳ細胞と同様に、培地の容量の半分を２∼３日ごとに取り替える。
さらに１０日後、ＴｕＪ１およびＭＡＰ２と免疫反応性であるニューロン形態の細胞は、
全細胞数の４０％までになる。ＧＦＡＰ陽性細胞がほとんど出現しないニューロン分化に
関するマウスＮＳ細胞プロトコルとは対照的に、有意な数の星状細胞もまた生成される。
【０１８７】
30
したがって、本発明は、対称的に分裂している未分化状態で、多くの種の神経幹細胞を
得て維持するための方法および培地を提供する。本発明は、ＥＳ細胞、胎児および成体供
給源から得られるまたは摘出される細胞を用いて実施されている。全ての場合において、
本明細書中に記載の方法に従うことにより得られた結果の細胞は、実質的に同じように見
え、挙動する；それらは全て、多数（例えば数百）の倍加にわたって高純度培養で維持さ
れ得、高い割合の細胞が、ニューロンおよび神経膠を形成する能力を保持している。特に
、ヒト（ＥＳ、胎児ＣＮＳ）、マウス（ＥＳ、胎児ＣＮＳ、成体ＣＮＳ）およびラット（
胎児ＣＮＳ）から、ＮＳ細胞が首尾よく得られている。マウス神経幹細胞は、培養物中で
純粋な集団で増殖され、そして移植された後、腫瘍を形成することなく増殖するが、イン
ビボで分化している。
40
【０１８８】
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【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１Ａ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｂ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｃ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｄ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｅ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｆ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
50
(43)
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【図１Ｇ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図２Ａ】ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す。
【図２Ｂ】ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す。
【図２Ｃ】ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す。
【図３】ＮＳ細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す。
【図４Ａ】ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。
【図４Ｂ】ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。
【図４Ｃ】ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。
【図５Ａ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動
を示す。
10
【図５Ｂ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動
を示す。
【図５Ｃ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動
を示す。
【図５Ｄ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動
を示す。
【図５Ｅ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動
を示す。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
(44)
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図１Ｇ】
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(45)
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
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(46)
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｄ】
【図５Ｃ】
【図５Ｅ】
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(47)
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【手続補正書】
【 提 出 日 】 平 成 18年 4月 3日 (2006.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対称的に分裂している神経幹細胞のトランスフェクトされた集団を得てこれを維持する
方法であって、
（ａ）選択マーカーＡをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程であ
って、該選択マーカーＡが、神経幹細胞特異的プロモーターの制御下で発現され得る、工
程；
（ｂ）該ＥＳ細胞の神経幹細胞への分化することを促進する工程；
（ｃ）該選択マーカーＡを発現する細胞について選択する工程であって、該選択された
細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該選択され
た細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマー
カーの発現に対して陽性である、工程；および
（ｄ）基材に付着した該選択された細胞を、
（ｉ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
；および
（ ii） Ｆ Ｇ Ｆ レ セ プ タ ー か ら 下 流 の シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の ア ク チ ベ ー タ ー
を含む培地で培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記選択マーカーＡが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項１
に記載の方法。
【請求項３】
前記神経幹細胞特異的プロモーターが、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、および
ＢＬＢＰからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法の工程が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の順に実施される、請求項１から
３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）により調製された前記選択された細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂
している神経幹細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）により調製された前記選択された細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂
している神経幹細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターが、
ＥＧＦレセプターのアゴニストである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記アゴニストが、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、エ
ピレグリン、ベータセルリン、ニューレグリン１、２、３もしくは４、およびＣｒｉｐｔ
ｏ−１からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターが、ＦＧＦレセプ
ターのアゴニストである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
(48)
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【請求項１０】
前記アゴニストが、ＦＧＦ−２である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記請求項のいずれかに記載の方法により得られ得る神経幹細胞の集団であって、該細
胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％
以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対する発現マーカーに対
して陽性である、集団。
【請求項１２】
前記集団中の神経幹細胞が、それらがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、およびＢＬＢＰの発
現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項１１に記載の神経幹細胞の集団
。
【請求項１３】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイス
Ｘ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項１２に記
載の神経幹細胞の集団。
【請求項１４】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項１２また
は１３に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１５】
前記集団中の神経幹細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１
の発現に対して陰性である、請求項１１から１４のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１６】
前記集団中の神経幹細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、また
は該神経幹細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項１１から１５のいずれかに記載の神経
幹細胞の集団。
【請求項１７】
神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経
幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突
起膠細胞に対する発現マーカーに対して陽性である、集団。
【請求項１８】
神経幹細胞を調製する方法であって、
請求項１から１０のいずれかに記載の方法に従って神経幹細胞を培養し、それによって
神経幹細胞の培養物を得る工程、および
該培養物から神経幹細胞を単離する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法により得られ得る神経幹細胞。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法により得られ得る神経幹細胞であって、該細胞が、それがマー
カーＲＣ２、３ＣＢ２、およびＢＬＢＰの発現に対して陽性であることで特徴付けられて
いる、神経幹細胞。
【請求項２１】
前記細胞がさらに、それが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイス
Ｘ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項２０に記
(49)
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載の神経幹細胞。
【請求項２２】
前記細胞がさらに、それが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項２０また
は２１に記載の神経幹細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して
陰性である、請求項１９から２２のいずれかに記載の神経幹細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または該細胞が、不
死化幹細胞ではない、請求項１９から２３のいずれかに記載の神経幹細胞。
【請求項２５】
神経幹細胞株を樹立する方法であって、
（ａ）単一の神経幹細胞を得る工程、
（ｂ）請求項１から１０のいずれかに記載の方法の工程（ｄ）に従って該神経幹細胞を
培養する工程
を含み、
それによって神経幹細胞の集団を得る、方法。
【請求項２６】
前記神経幹細胞の集団が、クローン集団であり、そして該細胞の全てが、単一の神経幹
細胞の子孫である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記単一の神経幹細胞が、請求項１８に記載の方法に従って得られる、請求項２５また
は２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２５から２７のいずれかに記載の方法によって得られ得る細胞株であって、該細
胞が、それらがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、Ｓｏｘ−２、およびＢＬＢＰの発現に対して
陽性であることで特徴付けられている、細胞株。
【請求項２９】
前記細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイス
Ｘ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項２８に記
載の細胞株。
【請求項３０】
前記細胞がさらに、それらが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項２８また
は２９に記載の細胞株。
【請求項３１】
前記細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して
陰性である、請求項２８から３０のいずれかに記載の細胞株。
【請求項３２】
前記細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細
胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカー
の発現に対して陽性である、請求項２８から３１のいずれかに記載の細胞株。
【請求項３３】
前記細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または該細胞が、不
死化細胞ではない、請求項２８から３２のいずれかに記載の細胞株。
(50)
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【請求項３４】
神経変性疾患および脳損傷の治療用調製物の製造のための、請求項１１から１７に記載
の集団、請求項２８から３３に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項１９か
ら２４に記載の単一の神経幹細胞の使用。
【請求項３５】
神経変性疾患および脳損傷の治療方法であって、請求項１１から１７に記載の集団、請
求項２８から３３に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項１９から２４に記
載の単一の神経幹細胞の患者への移植を含む、方法。
【請求項３６】
請求項１１から１７に記載の集団、請求項２８から３３に記載の細胞株中に存在する神
経幹細胞または請求項１９から２４に記載の単一の神経幹細胞をトランスフェクトする方
法であって、
（ａ）選択マーカーＢをコードする構築物で該神経幹細胞をトランスフェクトする工程
であって、該選択マーカーＢが、組織特異的プロモーターの制御下で発現され得る、工程
；および
（ｂ）該選択マーカーＢを発現する神経幹細胞について選択する工程
を含む、方法。
【請求項３７】
前記選択マーカーＢが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項３
６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１１から１７に記載の集団、請求項２８から３３に記載の細胞株中に存在する神
経幹細胞または請求項１９から２４に記載の単一の神経幹細胞であって、選択マーカーＢ
をさらに含む、細胞。
【請求項３９】
核再プログラミング方法であって、ドナー核が、請求項１９から２４のいずれかに記載
の神経幹細胞または請求項１から１０、１８、もしくは２５から２７のいずれかに記載の
方法に従って得られた細胞に由来する、方法。
【請求項４０】
核再プログラミング方法であって、
ドナー細胞を得る工程；
レシピエント細胞を得る工程；
該ドナー細胞の核を該レシピエント細胞に移入する工程であって、該ドナー細胞が、（
ｉ ） 請 求 項 １ ９ か ら ２ ４ の い ず れ か に 記 載 の 神 経 幹 細 胞 、 ま た は 、 （ ii） 請 求 項 １ か ら １
０、１８、もしくは２５から２７のいずれかに記載の方法に従って得られた細胞である、
工程；および
該細胞を培養して該ドナー細胞の核を再プログラミングし、それによって再プログラミ
ングされた細胞を得る工程
を含む、方法。
【請求項４１】
必要に応じて前記ドナー細胞の核の移入前におよび必要に応じて該ドナー細胞の核の移
入後に、前記レシピエント細胞の核を除去する工程を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ドナー細胞の核を遺伝子操作する工程を含む、請求項４０または４１に記載の方法
。
【請求項４３】
疾患原因遺伝子配列または推定疾患原因遺伝子配列を前記ドナー細胞の核に導入する工
程を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、
(51)
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前記再プログラミングされた細胞を培養して該再プログラミングされた細胞に由来する
複数の細胞を得る工程；および
アッセイに該複数の細胞を用いる工程
を含む、方法。
【請求項４５】
請求項４０から４４のいずれかに記載の方法であって、
前記再プログラミングされた細胞に由来する組織を含む動物を得る工程；および
該組織を用いてアッセイを実施する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
前記レシピエント細胞が卵母細胞である、請求項４０から４５のいずれかに記載の方法
。
【請求項４７】
細胞を再プログラミングする方法であって、
細胞の混合集団を提供する工程；
該混合集団から、請求項１９から２４のいずれかに記載の細胞を単離する工程；および
該単離された細胞の核をレシピエント細胞に移入する工程
を含む、方法。
【請求項４８】
前記単離された細胞を、その核を前記レシピエント細胞に移入する前に遺伝子操作する
工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４７または４８に記載の方法であって、
前記単離された細胞を培養して細胞のクローン集団を得る工程；および
前記集団中の１つの細胞の核を前記レシピエント細胞に移入する工程
を含む、方法。
【請求項５０】
非ヒト動物をクローン化する方法であって
（ｉ）該非ヒト動物から神経幹細胞を得る工程；
（ ii） 該 非 ヒ ト 動 物 と 同 じ 種 の 卵 母 細 胞 を 得 る 工 程 ；
（ iii） 該 神 経 幹 細 胞 の 核 を 該 卵 母 細 胞 に 移 入 す る 工 程 ；
（ iv） （ iii） で 得 ら れ た 細 胞 を 該 同 じ 種 の 雌 に 移 植 す る 工 程
を含み、該神経幹細胞が、請求項１９から２４のいずれかに記載の神経幹細胞または請求
項１から１０、１８、もしくは２５から２７のいずれかに記載の方法に従って得られた細
胞である、方法。
【請求項５１】
実施例のいずれかを参照して本明細書中に実質的に記載される、神経幹（ＮＳ）細胞の
対称分裂を促進する方法。
【請求項５２】
実施例のいずれかを参照して本明細書中に実質的に記載される、細胞株。
【請求項５３】
ニューロンを得る方法であって、（ａ）ＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下でかつ
ＥＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、神経幹細胞を培養する工程；および（ｂ）そ
の後、ＦＧＦレセプターのアゴニストの不在下でかつＥＧＦレセプターのアゴニストの不
在下で、該細胞を培養する工程を含み、該神経幹細胞が、請求項１から１０、１８、もし
くは２５から２７のいずれかに記載の方法に従って得られる、方法。
【請求項５４】
単層培養に細胞を播種する工程を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＥＧＦを含まないがＦＧＦ−２を含む培地にＮＳ細胞を移す工程、および少なくとも２
(52)
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日間それらを培養する工程、および次いで該培地からＦＧＦ−２を除去する工程を含む、
請求項５３または５４に記載の方法。
(53)
【国際調査報告】
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(56)
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(57)
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(58)
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.
ＦＩ
Ａ６１Ｐ 25/28
Ａ６１Ｐ 25/02
Ａ６１Ｐ 9/10
Ａ６１Ｐ 25/14
Ａ６１Ｋ 35/30
テーマコード（参考）
(2006.01)
(2006.01)
Ａ６１Ｐ 25/28
Ａ６１Ｐ 25/02
(2006.01)
(2006.01)
Ａ６１Ｐ
9/10
Ａ６１Ｐ 25/14
(2006.01)
Ａ６１Ｋ 35/30
(81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),
EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,
CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,
CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,L
T,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,SY,TJ,TM,TN
,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW
(72)発明者 コンティ，ルチアノ
イタリア アイ−２０１３３ ミラノ，ヴィア バルザレッティ ９，ユニバーシティ オブ ミ
ラン，デパートメント ファーマコロジカル サイエンス アンド センター オブ エクセレン
ス イン ニューロディジェネレイティブ ディジージーズ
(72)発明者 ポラード，スティーブン マイケル
イギリス国 イーエイチ９ ３ジェイキュー エディンバラ，ウエスト メインズ ロード（番地
なし），ユニヴァーシティー オブ エディンバラ，キングス ビルディングズ，ロジャー ラン
ド ビルディング，ザ インスティテュート オブ ステム セル リサーチ
(72)発明者 スミス，オースティン ゲラルド
イギリス国 イーエイチ９ ３ジェイキュー エディンバラ，ウエスト メインズ ロード（番地
なし），ユニヴァーシティー オブ エディンバラ，キングス ビルディングズ，ロジャー ラン
ド ビルディング，ザ インスティテュート オブ ステム セル リサーチ
Ｆターム(参考) 4B024 AA01 DA02
4B065 AA91X AB01 AC20 BB34 CA44
4C084 AA13 MA05 NA13 NA14 ZA012 ZA162 ZA182 ZA222 ZA402
4C087 AA01 AA02 AA03 BB45 BB64 CA04 CA12 MA01 NA14 ZA01
ZA16 ZA18 ZA22 ZA40

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