技術情報 接着細胞型 ̶ セットアップ これらの手順は全ての細胞に適応されません。 下記にアクセスをお願いします。 www.lonza.com/cellbioinstructions 詳細は個別の手順に従って下さい。 1. フラスコ数を計算して準備します。凍結保存バイアル ださい。この計算の調整方法については、 377ページ の T-25 フラスコを用意する利点は、大多数の細胞を失うリ スクを軽減することにあります。つまり、最初の T-25 フラ スコのトリプシン処理に問題が生じた場合には、別の T-25 フラスコを使用できるということです。 2. てください。 3. 以下の計算方法を使用して容器数を決定し、推奨播種密度と して2,500細胞/cm2、3,500細胞/cm2または5,000細胞/cm2を 設定します。 細胞数 × 生存率 = フラスコ数 フラスコの増殖面積 cm2毎に1 mlの増殖培地を追 加することにより、培地を新しい培養容器に無菌的に 移します。 例：25 cm2フラスコに対して5 ml増殖培地 4. 最大播種面積（cm2） 無菌環境で添加因子入り増殖培地のボトルを注意深く 開封し、フラスコ表面 5 = 最大播種面積（cm2） 推奨播種密度 継代数、細胞型、ロット番号、日付を明記したラベル を各フラスコに貼ります。 「プラスチック容器における増殖面積」の表を参照し 初代細胞/方法 の正確な細胞数については、試験成績書を参照してく 25 cm2の実質増殖領域をもつ T-25を使用する場合大きなフ ラスコとは対照的に、最初の冷凍保存バイアルからこの数 容器の通気口付きキャップを締めます。通気口付き キャップが使用されていない場合、キャップを一旦締 めてから約半回転緩めます。培養容器を37℃、5% 例：細胞数520,000で80%の生存率のHMVEC-Lの凍結細胞の場合 CO2 存在下で温めて平衡化し、培養器内で少なくとも30分 間加湿します。 520,000 × 0.80 = 5,000 83 cm2 T-25のフラスコで増殖面積が25 cm2の場合 83 cm2 25 cm2 = フラスコ3つ 接着細胞型 ̶ 細胞の解凍 推奨された量の培地をフラスコに無菌的に加え、 5% CO2、37℃の培養器で少なくとも30分間平衡化します。 理想的には、解凍後の凍結保存バイアルの色はピンク となります。ピンクでない場合は、その色を記録し、 播種が成功しない場合は技術サポートに報告してくだ 1. 解凍前にマイクロピペットを準備します。 さい。 2. 注記： 細胞入りの凍結保存バイアルを取り出します。開封前 に、エタノールまたはイソプロパノールで凍結保存バ イアルを拭きます。無菌環境内で、キャップを軽く 4分の1回転して、内圧を緩和してから再度締め直しま す。完全には開封しないでください。 3. 凍結保存バイアルを持ち、その下部 4 分の 3 を 37 ℃の 水槽に浸して、1∼2分間ゆっくりと回しながら内容物 を解凍します。凍結保存バイアルを注意深く観察して ください。最後の氷片が溶けたら取り出します。また 容器を完全に水槽に沈めないでください。細胞の解凍 時間が 2 分未満の場合、最適な結果が得られない可能 性があります。 4. 凍結保存バイアルを直ぐに取り出し、拭いて乾かしま す。その後無菌環境に移します。平衡化されたフラス コを準備します。70%のアルコールで凍結保存バイア ルを洗浄し、余分なアルコールをふき取ります。 5. 解凍後の凍結保存バイアルの色に注目してください。 ロンザジャパン株式会社 – 2つ以上の冷凍保存バイアルを解凍する場合、1回に1本の 凍結保存バイアルを解凍し、他の凍結保存バイアルは使用 準備が整うまで液体窒素内に保管します。 – 凍結保存された細胞は非常に痛みやすくなっています。こ れらを解凍して復元する場合は可能な限り素早く、最小限 の手順で行ってください。 – 凍結細胞を取り扱う際は、保護眼鏡を着用してください。 急速な温度変化によって液体窒素が飛び散るおそれがあり ます。 – 遠心分離を行って凍結細胞から懸濁液細胞を分離しないで ください。これを行うと、培養中のDMSO残余による影響 よりも重大なダメージが起きます。 – 凍結細胞を直接、ガラススライド、チャンバースライド、グ リッドプレートまたはマルチウェルプレート（ 6 、 12 、 24 、 96 …）で解凍することは推奨されません。最適なパ フォーマンスを得るには、凍結保存状態からの最初の播種 を T-25 フラスコに対して行います。詳細な手順について は、提供されている細胞培養手順書内のセットアップのセ クションに記載された指示に従ってください。細胞特異的 なプロトコルについては、技術サポートにお問い合わせく ださい。 バイオサイエンス事業部代表：03-6264-0660 http://www.lonza.co.jp/bioscience デモ・見積もり依頼：03-6264-0660 技術サポート：03-6264-0660 受注・在庫照会：03-6264-0620 LBS-W0001-020 技術情報 接着細胞型 ̶ 播種 播種後 1. 1,000 µlのマイクロピペットを800 µlに設定して使用 細胞は急速な温度変化や栄養の欠乏した培地に耐性があり し、先端を凍結保存バイアルに入れて、優しく、ゆっ ません。温めた新鮮な増殖培地で増殖を行うことによっ くりと、一定のリズムでピペットを最大 5 回上下させ て、問題を回避できます（必要な分量だけ温めるようにし ながら、細胞を再懸濁します。再懸濁は急いで行わな てください）。週末や休日の間も、以下に従って細胞の確 いでください。ピペットの先端をバイアルの下部近く 認と培地追加を行ってください。 に保ち、気泡の発生を防いでください。 1. 2. DMSO および未接着の細胞を取り除くため）。ただし 参照］で指定されている通り）細胞を同量ずつ、事前 毎日状態をチェックしてください。 に準備しておいたフラスコに移します。 4 つの T-25 フ 注記：培地の交換を行うには、細胞が接着しているフラスコ の反対面で滅菌ピペットによる吸入を行い、培地を除去する 必要があります。その後、温かい新しい培地を追加します。 ラスコを準備した場合は、マイクロピペットを 250 µlに設定して移してください。8つのT-25フラスコ を準備した場合は、マイクロピペットを 125 µl に設定 3. 4. 播種後は 2 日毎に増殖培地を交換してください（残余 （「細胞/バイアルの推奨播種密度と数」［355ページ 2. 培養に成功し回収された細胞は以下のようなものとな して移してください。 ります。 注記：凍結保存バイアルの全量を1つのT-25フラスコに使用し ないでください。 a. 透明の非顆粒細胞質をもつ細胞 b. 2日目以降に多数の分裂核 キャップまたはカバーを取り外し、容器をそっと振 3. 細胞がコンフルエントな状態になったら、より多い分 り、細胞を均等に分散させます。ガス交換を行う必要 量の培地を追加します。ガイドラインとして以下を参 がある場合は、キャップを緩めます。 照してください。 培養容器を、5% 細胞の状態： 25%コンフルエント未満… 25∼45%コンフルエント… 45%コンフルエント超… CO2の37℃の培養器に戻します。容器 を棚に平らに並べ、接着する細胞の表面積が最大にな るようにします。細胞はフラスコ底部に堆積します。 4. 初代細胞/方法 内部を指でさわらないようにキャップを取り外す。 指定の培地分量： 5 cm2につき1 ml 5 cm2につき1.5 ml 5 cm2につき2 ml 60∼90%コンフルエントな状態になるまで細胞への培 地追加を続けます。特定の細胞型がコンフルエントに なり過ぎた場合（表皮細胞など）、 3 日以上コンフル エントな状態を保つ場合、不可逆的な接触阻止が発生 し、フラスコから剥離する、またはトリプシン処理が 難しくなる、あるいはその両方が生じる可能性があり ます。 接着細胞型 ̶ 増殖 1. 培養細胞を顕微鏡検査し、輸送中の損傷（剥離、ラウ 4. ンドアップまたは異常な形態）がないかを確認しま ル全体を温めると培地の有効期限が短くなる可能性が す。相対細胞密度を確認し、コンフルエンスを % で予 あります。温流水またはその他温度制御不能な方法で 測します。受領時、培養細胞の密度は 30 ∼ 100% と 培地を温めないでください。電子レンジは使用しない なっているはずです。いくつかの細胞が剥離している でください。 場合がありますが、これは正常です。細胞が大きく損 傷を受けているようにみえる場合は、直ぐに技術サ 5. 新鮮な培地と交換します。微生物による汚染を防ぐた 70%エタノールまたはイソプロパノールで拭き取り、 め、容器の首まわりやキャップ内にある培地を無菌的 細胞培養フラスコまたはマルチウェルプレートの外部 に取り除いてください。 表面を滅菌します。 3. 無菌環境で注意深く細胞培養フラスコまたはマルチ ウェルプレートを開封し、培地を除去して、温かい、 ポートに電話でご連絡ください。 2. 適量の増殖培地を滅菌容器で37℃まで温めます。ボト 6. 密封したフラスコまたはマルチウェルプレートを 37℃、5% CO2 の条件で3∼4時間インキュベートし、 通気口のないキャップのついたフラスコを使用してい 5% CO2 の 37℃の加湿培養器内に最低24時間置きます。 る場合は、キャップをゆるめ、フラスコを 平衡化します。 ロンザジャパン株式会社 バイオサイエンス事業部代表：03-6264-0660 http://www.lonza.co.jp/bioscience デモ・見積もり依頼：03-6264-0660 技術サポート：03-6264-0660 受注・在庫照会：03-6264-0620 LBS-W0001-021
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