Letters to the Clinical Microbiology Laboratory ２０１１年 12 月号 Vol.３２ No.12 大阪府臨床検査技師会 学術部 微生物検査部門 -1- Vol.32, No.12（平成 23 年 12 月号） 白 金 耳 ごあんない ・来月の 来月の定期講習会 はじめての塗抹検査 ・はじめての 塗抹検査 ～基礎技術講座 基礎技術講座～ 講座～ 赤木 征宏 定期講習会報告 ・『抗酸菌検査の 抗酸菌検査の現状』 現状』 仁木 誠 ばくとおやじの ばくとおやじの知識箱 ・『黒色酵母 Aureobasidium Aureobasidium pullulans』 佐子 肇 バイキン Quiz・・・ Quiz・・・今回 ・・・今回はお 今回はお休 はお休みです m(_ _)m （敬称は略させていただきました） 新年の 新年の１回目の 回目の定期講習会は 定期講習会は、 １月２４日 ２４日（火） 大阪医療技術学園専門学校で 大阪医療技術学園専門学校で開催いたします 開催いたします。 いたします。 -2- ん 講習会 な い あ （他職種公開講座） テ−マ： 「ＨＩＶ感染症 ＨＩＶ感染症・ 感染症・AIDS診療 AIDS診療の 診療の現状」 現状」 講師 ： 独立行政法人国立病院機構 姫路医療センター 姫路医療センター 薬剤科 HIV 感染症薬物療法認定薬剤師 冨島 公介 日時： 平成２４ ２４年 日時： 平成 ２４年１月２４日 ２４日（火） １８： １８：３０～ ３０～２０： ２０：００ 場所： 場所 ： 大阪医療技術学園専門学校 （〒530 530（〒 530 -0044 大阪市北区東天満 2-1-30） 30） 評価点：専門－２０点（会員証をお持ちください） 参加費：一律５００円 連絡先：（財）大阪府警察協会大阪警察病院 赤木 征宏 e-mail：[email protected] HIV 感染症や AIDS（エイズ） 、この疾患に対してみなさんはどういった知識や印象をお持 ちでしょうか？「死の病」 、「特別な人がなる病気」こういった言葉とともに広がったこの疾 患。現在ではこういった言葉はほとんど当てはまりません。 1983 年に HIV（ヒト免疫不全ウィルス）が発見されて以来 1990 年代中ごろまでは治療法 のない致死的疾患でした。しかし現在では早期発見されれば治療法のある慢性疾患となって います。 その反面で日本における HIV 感染者、AIDS 発症者は増加し続けています。厚生労働省エイ ズ動向委員会のコメントにて「国民は HIV・AIDS についての理解を深め、身近な問題とし て積極的に予防に努めるべきである。」とあります。我々医療従事者においても、もはや「珍 しい疾患」ではありません。 誰もが知る有名な病名であるにも関わらず、疾患の知識、治療の方法は有名ではありませ ん。そういった知識不足が患者差別や、医療従事者の不十分な安全対策へとつながります。 本講習会では HIV 感染症や AIDS の診療現場においてどのような診療が行われており、ど ういった知識が必要であるかを基礎の基礎からお話させていただきます。今回の講習会で疾 患に対する理解が深まり、今後の診療の発展と針刺し事故対策など医療従事者の安全対策に 活かしていただければと思います。 -3- 基礎技術講座のご 基礎技術講座のご案内 のご案内 『検体検査管理加算』を算定するための要件として「排泄物、滲出液又は分泌物の細菌顕 微鏡検査 (その他のものに限る。)」が記載されています。その他とは、蛍光顕微鏡，位相差 顕微鏡，暗視野装置等，保温装置使用のアメーバ検査を除外したもの、となり、通常の光学 顕微鏡での検査が該当します。 微生物検査室で実施される光学顕微鏡での検査はチール・ネールゼン染色とグラム染色が 一般的に行われ、どちらを選択しても算定することは可能と考えられますが、臨床的な必要 性からすればどちらも実施すべきです。 微生物検査室の有無にかかわらず全ての施設でこの要件が加わったため、新たに塗抹検査 を実施する施設も多いかと思われますが、塗抹検査は顕微鏡と染色液さえあれば出来るとい う検査ではありません。 グラム染色を中心として，検体の取り扱い・標本作製・染色・顕微鏡観察・抗酸菌や真菌 や稀な感染症の供覧などを、実技と講義とディスカッションを織り交ぜた塗抹検査の基礎技 術講座を実施します。 これから塗抹検査を始めようという方々は、特に奮ってご参加下さい。 日時 ： 平成 24 年 2 月 11 日（土・祝日） 祝日） 10： 10：00～ 00～17： 17：00（ 00（受付 9:30） 9:30） 場所 ： 大阪市立大学医学部基礎学舎 5Ｆ微生物実習室（ 微生物実習室（最寄り 最寄り駅：各線天王寺駅） 各線天王寺駅） 受講料： 受講料： 2000 2000 円 定員 ： 先着 40 名 申込み 申込み方法： 方法： ①氏名、 氏名、②会員番号、 会員番号、③施設名、 施設名、④所属部署、 所属部署、連絡先（ 連絡先（TEL・ TEL・Ｅメール） メール）、 ⑤細菌検査の 細菌検査の経験（ 経験（有無 or 年数） 年数）、⑥ 、⑥施設で 施設で使用している 使用しているグラム しているグラム染色 グラム染色の 染色の方 法名（ 法名（ハッカー・ ハッカー・フェイバー・ フェイバー・B&M など） など）、⑦ 、⑦実習後の 実習後の「懇親会」 懇親会」の参加可 否、を記載のうえ 記載のうえ、 のうえ、下記メールアドレス 下記メールアドレスに メールアドレスに申込み 申込み下さい（ さい（携帯からの 携帯からの申込 からの申込 は、下記メールアドレス 下記メールアドレス受診可能 メールアドレス受診可能であれば 受診可能であれば「 であれば「可」です） です） ※ 1 週間以内に 週間以内に参加登録可否の 参加登録可否のメールを メールを送信いたします 送信いたします。 いたします。返信がなけれ 返信がなけれ ばお電話下 ばお電話下さい 電話下さい り 申し込み先： （財）浅香山病院 中央臨床検査部 [email protected] -4- そうた 李 相太 072（ 072（229） 229）4882 ９月定期講習会報告 『抗酸菌検査の 抗酸菌検査の現状』 現状』 大阪市立大学医学部附属病院 仁木 誠 去る 9 月 27 日に『抗酸菌検査の現状』と題しまして、NHO 近畿中央胸部疾患センター 臨 床検査科の富田 元久先生にご講演いただきましたので、その報告をさせていただきます。 【日本の 日本の結核の 結核の現状】 現状】 2010 年に結核予防会結核研究所疫学情報センターにより実施された疫学調査によると、 罹患率(人口 10 万人対の新登録 結核患者数)は 18.2（対前年比 0.8 減）で、患者数は減少傾向にある ものの、いまだ 2 万 3000 人を超え る新規患者が発生している 70 歳以上の高齢結核患者は新登録 結核患者の半数以上を占めさらに 増加傾向にある 働き盛りの感染性のある結核患者 では、受診の遅れ(2 か月以上の割 合)は依然大きい -5- 外国籍結核患者割合の増加傾向は 続いており、特に 20 歳代の新登録 結核患者の外国籍結核患者割合は 29％に達している 結核罹患率の地域差は依然大きく、 大都市で高い 世界的に見て、日本は依然として 結核中蔓延国である 患者数が減少傾向にあるとは言え、例年、結核の集団感染事例も数多く報告されており、 確実に、また、迅速に結核菌を検出することが重要である 【抗酸菌検査の 抗酸菌検査の現状】 現状】 抗酸菌の鏡検、培養、同定、薬剤感受性検査には、 ・集菌塗抹検査 染色法：蛍光法、Z-N 法、キニヨン法 ・液体培養検査 BACTEC MGIT960、バクテアラートシステム、血液培養用ボトル -6- ・遺伝子検査 コバスアンプリコア、コバス TaqMan、DNA プローブ「FR」-MTD、TRC、ジェノスカラー Rif-TB ・薬剤感受性検査 BACTEC MGIT960AST、PZA、ブロスミック MTB-1、結核菌感受性 PZA 液体培地 等、種々の検査がある。 抗酸菌検査における問題点としては、 ・集菌塗抹を行っているが、本当に集菌ができているのか？ ・遺伝子検査の増幅阻害 ・液体培養の陽性率と雑菌率 ⇒ いずれにおいても検体処理が重要なポイントとなる 近畿中央胸部疾患センター細菌室における抗酸菌検査の流れ 喀痰―＞均質化(プレソルブ） 集菌（3000×ｇ、4℃、20分） 塗抹検査（蛍光染色） （＋） アルカリ処理（2%NaOH液）15分処理 酸処理（ｽﾌﾟﾀｰﾒﾝﾄｿﾞﾙ：極東）12分処理 ＭＧＩＴ(6週間培養） ＴＢ－ＰＣＲ （－） MAC-PCR 小川培養(6週間培養） （＋） （＋） （－） 陰性報告 同定 ｼﾞｪﾉｽｶﾗｰRif・TB ＴＢ MAC その他抗酸菌 （感受性実施せず） 薬剤感受性 液体培地（ＭＧＩＴ） ドライプレート（MIC) 耐性の場合or Kansasii 小川比率法 《喀痰の 喀痰の前処理法》 前処理法》 ・喀痰の溶解、均質化 SAP(セミアルカリプロテアーゼ) ・喀痰の消化、汚染除去 NALC-NaOH 法 自家製、マイコプレップ、CC-E、セントラップ MB -7- 均質化処理後の喀痰 ・左が正しく均質化されたサンプル ・右は粘液糸等によりきちんと遠心集菌でき ておらず、菌の回収率も低下する ⇒粘液糸等がなくなるように確実に処理 することが重要 抗酸菌は他の一般細菌よりもアル カリに対して抵抗性が高いが、適切 なアルカリ濃度で処理しないと抗 酸菌もダメージを受けて生存率が 低下する ⇒アルカリの終濃度を 0.2%以下 に調整するのが望ましい 《PCR の阻害物質》 阻害物質》 ・ヘパリン、ヘモグロビン ・粘液糸？ ・アルカリで溶解しない物質……組織？、食物残渣？ 《遠心集菌の 遠心集菌の問題点》 問題点》 ・遠心操作によるロス。 ・デカント時のロス。 ・デカント時のエアロゾル発生。 ・冷却、3000g の高速遠心器の準備(高額) ⇒ 対策 ・共沈剤 ・磁性ビーズ……Tricore 集菌キット(ジェネテイン社)、TB-beads 法(極東製薬) -8- ※磁性ビーズについては、塗抹・培養は報告があるが、遺伝子検査に適用できるか が課題である 《液体培養における 液体培養における問題点 における問題点》 問題点》 ・目視では何が発育したのか判断できない ・雑菌混入のための検体の再処理 ・複数の抗酸菌の混在 ↓ 液体培地の抗酸菌陽性確認 ・液体培地と小川培地の併用 ・培養陽性菌液の雑菌確認、塗抹検査による抗酸菌の確認 ・陽性菌液を小川培地または Middlebrook7H11 にサブカルチャー また、結核菌群と非定型抗酸菌との混在を証明する方法として PNB 法がある ↓ 結核菌群は発育せず非定型抗酸菌は発育する PNB 加 7H11 培地は、液体培養陽性検体の 目視観察を容易にし、複数菌存在時などにも素早く対応でき非常に有用である -9- 《まとめ》 まとめ》 ・喀痰の SAP 処理の注意 粘液成分を溶解させる 細胞、食物残渣を除去する 蓋側に付着した喀痰をボルテックスで落とす ・アルカリ処理の注意 処理する容器の容量にあった消化液の量で処理する アルカリの終濃度を調整する 緩衝液を添加時、アルカリ濃度を 0.2%以下に調整する 作用時間をオーバーしない、抗酸菌もアルカリに弱い(特にⅣ群) ・液体培地のみの培養は危険(雑菌、混在菌) 【抗酸菌の 抗酸菌の遺伝子検査の 遺伝子検査の最新情報】 最新情報】 資料：青木 正和 結核研究所 97/02/24 1990 年代から頻用されてきた AccuProbe や DDH Mycobacteria 等の遺伝子検査キットは、 迅速性に欠けたり、また手技が煩雑、誤判定を生じやすい等、昨今の遺伝子解析技術の進歩 の中においては、それだけでは不十分となってきた。また、コバスアンプリコアも 2012 年 8 月末に販売中止となることより、後継機種として real-time PCR を原理としたコバス TaqMan の発売が開始されている。 以下に、結核菌検査指針 2007 に記載されている遺伝子検査法、また、その他の新しい遺伝 子検査法について示す。 - 10 - 《GENECUBE》 GENECUBE》 - 11 - 《LAMP 法》 《Line Probe Assay (LiPA)》 (LiPA)》 ラインプローブアッセイは遺伝子が配列特異的に結合することを利用して標的遺伝子の相 同性を検出する方法。ジェノスカラーRif-TB は、喀痰中の結核菌 rpoB 遺伝子の変異をライ - 12 - ンプローブアッセイを用いて検出するキットであり、既に保険収載され広く利用されてきて いる。 INNO-LiPA Mycobacteria v2 は 16S-23S internal transcribed spacer (ITS)領域をターゲ ットとし PCR 法で増幅された DNA を対象に、ラインプローブアッセイを用いて検出する。一 度に 15 菌種の同定と Mycobacterium 属に共通の Mycobacterium genus のプローブがあること から抗酸菌の確定が可能である。 《遺伝子検査の 遺伝子検査の現状》 現状》 ・Automation 化していない(検査技師の労力に依存) ・高コスト、特別な機器と work station が必要 ・稀な菌種に対応していない同定不能となる新菌種の報告が近年増加 ・主要な菌種以外の同定キットは研究試薬であり保険適応を受けていない ・一度で同定できたら OK だが、結果が出ない場合は検査が増える度に医療施設の持ち出し 日本の結核の現状、抗酸菌の遺伝子検査の最新情報、また抗酸菌検査の現状に関しては注 意すべき点や問題点等、実際に富田先生の経験も踏まえてお話していただきました。日頃、 流れ作業で行っている検体処理が、抗酸菌の検出においては非常に重要であるということを 今更ながらに再認識しました。また、遺伝子検査についても、GENECUBE や LAMP 法、ライン プローブアッセイ等について詳述していただきました。遺伝子検査に関してはコストが高い、 専用の機器が必要である等のために、すべての施設において実施できるわけではないかもし れませんが、新しい検出系の原理等を知ることにより、今後の自施設における抗酸菌検査の 運用を考えていくにあたっても多いに参考になったと思います。富田先生ありがとうござい ました。 - 13 - 黒色酵母 Aureobasidium pullulans 独立行政法人国立病院機構 刀根山病院 佐子 肇 【はじめに】 Aureobasidium 属は、世界的な分布を持ち、植物、土、木材および室内空気環境から分離 される環境由来の『都会的』な黒色酵母真菌である。現在 Aureobasidium 属は 14 種含まれて いるが、これらの中で、A.pullulans は唯一よく知られた種である。 【臨床的意義】 A.pullulans はまれにヒトの皮膚や爪から、汚染菌として分離されるが、phaehyphomycosis （フェオフィホ真菌症）のまれな原因菌の 1 つである。それは角膜真菌症、敗血症、肺真菌 症、皮膚真菌症および持続的携帯型腹膜透析（CAPD）患者における腹膜炎などを引き起こす ことが報告されている。 【培養所見】 CHROM agar、Potato dextrose agar（PDA） 、Sabouraud,s glucose agar（SDA）に 25～35℃ で、7 日以内に成熟する。コロニーは滑らかで湿潤し粘液状の酵母様に発育する。表面は初 め淡い白～ピンク色になり、培養を継続すると灰色から褐色、黒色となる（写真 1,2）。 【形態学的所見】 菌糸の隔壁周辺から出芽,あるいは分生子形成細胞から芽がでて、次第にふくらみ、厚い壁 を有する出芽型分生子（分生子）を形成する。分生子柄は形成しない。母細胞から分生子を 生じる菌種が Aureobasidium 属の特徴である。また培養が長くなるにつれて菌糸は太 太く多隔 になる。 - 14 - Sabouraud,s glucose agar（SDA）25℃、5 日間 写真 1 表面は湿潤し、粘液様から粥状の外観を呈する。薄い黄色からピンク色になる。 Sabouraud,s glucose agar（SDA）25℃、10 日間 写真 2 薄い黄色からピンク色で、次第に淡褐色～黒色になる。 - 15 - Cornmeal agar （Tween80 を 0.3％添加） ｘ400 菌糸の隔壁周辺から出芽し、厚い壁をもつ分節型分生子及び出芽型分生子をもつ。 Cornmeal agar （Tween80 を 0.3％添加） ｘ400 培養が長くなるにつれて菌糸は太く多隔になる。 - 16 - 【まとめ】 Aureobasidium 属の分類は糸状不完全菌類に属する子嚢菌の一属である。俗名として黒色 黒色 酵母様菌あるいは黒酵母 黒酵母とも呼ばれている。好湿性で、湿度の比較的高い環境中に存在して 酵母様菌 黒酵母 いる。植物寄生菌でもあり、果実や柑橘類に寄生するがカビ カビ毒 カビ毒は産生しない。 最初は白やピンクの粘液性の酵母様コロニーを形成するが、古くなると菌糸が発達し、メ メ ラニン色素 培養期間は PDA あるいは SDA に 25℃～30℃で 7 日間必 ラニン色素を 色素を生成して黒褐色になる。 生成 要である。その他の補助的同定検査法として、尿素分解試験（陽性） 、菌膜形成試験（陰性） である。簡易同定キットでは RapID Yeast Plus のみ同定可能である。解析プロファイルコー ド 147675 から A.pullulans を同定することができる。また本菌は酵母と間違えられやすい カビであるため、注意が必要である。抗真菌薬感受性試験法は検査室レベルでの測定法およ び判定基準などの標準化について未だ確率されていない。 今年もあと少しで終わりです。この数日、ちょっと体調不良でした。いや、忘年会が続 いたせいとか、飲みすぎたとかいう訳ではないですよ･･･たぶん。体調不良になるちょっ と前くらいから、彼女（妻）の声がおかしく咳き込んでいたので、うつされたのだと思い ます。仕事を休むほどではなかったのですが、うつしてはいけないので、参加できない忘 年会があって残念でした。ぼちぼちインフルエンザも出てきましたので、皆さんもお気を つけて下さいね。 ２月にはまた塗抹検査の実習をします。夜間当直時など、微生物検査を普段されていない 方、初心者対象の実技講習ですが、是非皆さん奮ってご参加ください。 赤木 征宏 【白金耳】 Vol.３２. No.12. 2011.（平成２３年 12 月号） 発行日：平成 23 年 12 月 23 日発行 発 行：大阪府臨床検査技師会 表 紙：井邊 学術部 微生物検査部門 幸子 発行者・編集：赤木 征宏（財団法人 大阪警察病院） 〒543-0035 大阪市天王寺区北山町 10-31 TEL: 06 - 6771 – 6051 e-mail: [email protected] 許可なく転載および複写はご遠慮下さい - 17 - 白 金 耳 Vol．３２, No．12 （12 月号） 大阪府臨床検査技師会 学術部 微生物検査部門 - 18 -
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