シグナル伝達ガイド

シグナル伝達ガイド
抗体を使わない簡便な発光法による解析法
Contents：
• イントロダクション
• レポーター＆センサーを利用した
細胞内シグナルのモニタリング
• 発光法によるセカンド
メッセンジャーの解析
• 発光法によるキナーゼの解析
• 発光法によるプロテアーゼシグナルの
解析
• 細胞メタボリズム（生存性＆毒性）
• 関連製品
イントロダクション
抗体を使わない簡便な発光法によるシグナル伝達研究
よりシンプルでスマートな発光によるシグナル解析法
シグナル伝達研究における各パスウェイの活性化の検出や創薬分野におけるスクリーニングでは、抗体あるいは蛍光物質と組
み合わせた方法が広く用いられています。抗体を用いたウェスタン分析やELISAはコストが高く、操作が煩雑であるため多検
体の処理には適しません。また、TR-FRET を代表例とするスクリーニング用の蛍光アッセイ法は有用ですが、シグナル/バック
グラウンド比は発光法にはおよびません。プロメガでは高感度でダイナミックレンジの広い発光法を駆使した、シグナル伝達
解析ツールをそろえており、GPCR シグナル、cAMP、キナーゼ活性、転写応答に至る一連のシグナルを簡便に測定することが
できます。
発光法の利点
• 優れた定量性：発光によるアッセイ法は、抗体法や蛍光
法に比べて高感度で、化合物の蛍光による干渉もありま
せん。
• 簡便性：試薬を加えて混ぜるだけのシンプルな操作なの
で、多検体処理や自動化が容易です。また、細胞ベース
基質など
バッファー
のアッセイでは抽出/分離などの煩雑な操作は不要です。
混和
• シンプル：標的分子ごとに抗体を揃える必要が無く、
実験系をシンプルにまとめることができます。
検出試薬
PRO
10
試薬添加
ISO
1
0
混和
FSK
5
10
15
測定
Time (minutes)
GloSensorTM cAMP System と ELISA 法との相関性
HEK293 細胞の内在性アドレナリンβ 2 レセプターをイソプロテレノー
ル :ISO（アゴニスト）、プロプラノロール :PRO（アンタゴニスト）およ
びフォルスコリン :FSK（アデニル酸シクラーゼ作用薬）で順次刺激し、
GloSensorTM cAMP System および ELISA 法で cAMP レベルをモニタリング
した。
2
ルミノメータ
シンプルな発光アッセイ法の操作例
8105MA
Fold induction
100
GloSensorTM cAMP
Immunoassay
シグナル伝達ガイド
イントロダクション
ページ
GPCR
4
7
2) センサー
cAMP
PDE
8
9
1) レポーター
Nuclear
receptor
Kinase
3) シグナル分子の
アッセイ
10
11
Kinase
Caspase
12
13
Proteasome
-Ubiquitin
Transcription
Factor
Cell Viability
13
14
ベクター
15
発光法のアプローチ
1）各種シグナル応答配列を含むレポーターベクターを用いたレポーターアッセイ
一般的にルシフェラーゼレポーターアッセイはその高い感度や簡便性により転写制御など幅広い研究に使用されています。
各シグナル経路に特異性を有する応答配列をレポーター遺伝子に付加することでシグナル経路の活性化を容易に捉えること
ができるため、シグナル伝達解析にも多用されています。プロメガのpGL4ルシフェラーゼベクターはオフターゲット効果の
低減や誘導倍率が飛躍的に改善されているため、複雑な細胞内のシグナルを検出する上で最適のベクターです。
2）細胞内シグナル分子の結合を高感度に感知するバイオセンサー
プロメガのGloSensorTM テクノロジーは、特定の分子に反応する感受領域を導入したルシフェラーゼセンサーをコードするプ
ラスミドを用いて細胞内（あるいは in vitro）で発現させ、標的分子が感受領域に特異的に作用することにより不活化したル
シフェラーゼが活性化するシステムを採用しています。プロテインキナーゼAのcAMP結合領域であるRIIβBサブユニットをル
シフェラーゼに組込んだGloSensorTM cAMP Systemは、細胞内のcAMPをリアルタイムでモニタリングすることができます。
3）発光反応とカップリングさせたシグナル分子のアッセイ
ルシフェラーゼ反応を構成する分子であるATPおよびルシフェリンは様々な生体分子のアッセイに利用されており、それぞ
れ 1）ATPを介した酵素反応とルシフェラーゼ発光反応のカップリング（例：キナーゼ、
ADP、
ATPaseなど）。 2）修飾ルシフェ
リンを標的とする活性によりルシフェリンを産生する反応とルシフェラーゼ発光反応のカップリング（例：カスパーゼな
どのプロテアーゼ）により標的分子を発光シグナルとして検出することができます。
Luciferase
Luciferin
ATP
〈ルシフェラーゼ反応〉
OH
Reporter and Sensor Vector
S
N
N
S
COOH
Apoptosis (Caspase 3/7, 8, 9)
Caspase-Glo® Assay
Cell Viability (ATP)
CellTiter-GloTM Assay
細胞内 ATP の測定
3
各種シグナル経路のモニタリング (レポーター)
Cell Based
pGL4 Response Element Vectors
Cell Based
主要なシグナル伝達経路を高感度にモニタリング
ルシフェラーゼレポーターは、シグナル伝達経路の研究やGPCRなどの受容体活性を制御する物質の探索に有効です。例え
ば、細胞内のcAMPレベルを調節している受容体の挙動は、一般にcAMP 応答配列（CRE）によってルシフェラーゼの転写と連
In Vitro
動します。しかし、従来のレポーターベクターでは標的とするシグナルに応答する配列以外にも転写に影響を及ぼすコンセン
サス転写因子結合サイトがベクター内に点在することでオフ-ターゲット効果が現れたり、レポーター酵素の半減期が長いため
に応答性が鈍く鋭敏なシグナルの検出を困難にしていました。
pGL4 Vectorシリーズは哺乳動物細胞における最適な発現を可能にする次世代のルシフェラーゼレポーターベクターです。レポーター
遺伝子の発現や安定性に対する最適化を始め、プラスミドベクター内の転写因子結合サイトの除去、最小限プロモーター
（minP）の導入など様々な改良を加えております。これらの技術革新により、従来のレポーターベクターでは実現できない微細
な細胞内シグナルの変化を検知し、応答配列に応じた様々なシグナルを正確に測定することができます。
pGL4 応答配列導入ベクターには現在7種類のシグナル経路に対応した応答配列を有するベクターがあり、応答配列の最適化も行わ
れています。また、これらのpGL4 応答配列導入ベクターを安定にトランスフェクションした細胞株もございます。また、任意の
応答配列をpGL4に組込み、標的とする様々なシグナルを捉えることができます。
luc 2CP
luc 2P
luc 2
250
Synthetic
poly(A)
Ampr
200
Fold Induction
ori
Response
Element
Hygror
pGL4 Response Element Vectors
minP
SV40 early
enhancer/
promoter
Backbone
Luc gene
AD-b
Nkx2.5
Cut-like
E2F
STAT5
TALE
ELF-2
Gut
Prom L
CCAAT
GBF3
Elk-1
B-cell
PAR
GBF3
Mamm.C
Msx-1 HNF 1
E2F
Hox1.3
HLF
NFAT
Myo
AC-t
STAT5
LHX3
SF1
E2F Pax2/5/8
ST/TA
CREB
HMX3
HNF1 SRF
HNF4
NKX3.1 MIS
B-cell
MEIS1
CDE HNF3
MOK-2
HNF 1
EBV
RP58 Elk-1
FOXL1
KLF3
Neu1/3
CCAAT
B-cell
Lmo2
CPBP
GBF1
Pax1
Cone-rod
Arnt
Pax-3
Ras
PAR
Tax/CREB
FLI
Pax1
C2HC1RFX1
Pbx1
CDP
CCAAT
Pax1
Musc.
Mus
Ikaros2
v-Mar
FAST-1/Smad
B-cell
ATF
NUDR
MyT1NUDR
EKLF
CCAAT MIBP-1
HOX
CDF-1OBF1
NF-kB
RFX1 E4BP4
Gut
AD-b
MEIS1
CREB
PAX9
Elf-2E2F
IS NRF2
CCAAT GBF1
NF-kB
Brn-2
IRF-3 HIF-1
Neu-rGBF1
HLF BACH1
HLF
Barb Ikaros3
v-Myb Pit1 STAT5 OBF1
MEIS1
MEIS1
c-Myb OBF1
MEF2
WTS Neu-r
Pbx-1
Sox-5
VIS1
ST/TA
luc+
Pax1
Arnt CDP
NKX3.1
AC-t
Nco I
PL
Baso
CDF-1
AP1
MIT/TFE
Runt-2
pGL4
Runt-2
v-Myb
Avian C
Pax
Hox-1.3
NF-kB
p53
E4BP4
HNF1 GBF1
NKX3.1
p53
Avian C
r
p
Am
E4BP4 NKX3.1
PAX9
Cart-1
CDF1
VDR/RXR
Mamm C
Cart-1
NUDR
TCF/LEF1
GBF1
FOXC1
OBF1
Pbx1
CDP
Bel-1
FKHRL1
LBP1c/LSF
Cart-1
v-Myb
AD-b
GBF3
Tal-1a
COMP1
luc2
Pdx-1
Nkx2.5
Cdx-2
Brn-3
ori
PAX9
3
4
5
6
7
Baso
RP58
p53
変則的な発現要因となるコンセンサス配列の pGL3 と pGL4 の違い
従来型のルシフェラーゼレポーターベクターのレポーター遺伝子
およびベクター骨格に存在する転写因子結合サイトの多くが pGL4
ベクターでは除去されている。
4761MAj
TEF-1
1 × 106
1 × 105
1 × 104
Pbx-1
Nco I
1 × 107
CDF1
Clox
Avian C
1 × 108
pGL4.11-CRE-TK 誘導無し
pGL4.11-CRE-TK 誘導有り
pGL4.24-CRE-minP 誘導無し
pGL4.24-CRE-minP 誘導有り
c-Myb
PAR
IRF1
4
2
4 Hours
6325MA
v-Myb
E2F
v-Myb
PAX-6 Myo
FoxA2
c-Myb
Ikaros2
PAR HLF NUDR
GBF1
E4BP4 NKX3.1
AC-t
E4BP4
Elk-1 Cart-1 NKX3.1
Mamm.C
Pdx1 Cart-1
RP58 PAR
Clox
Pbx-1
IF1
PXR/CAR/RXR
CCAAT
SRF
BRN-23
GBF3
RFX1
OBF1
VIS1 HEN1 SRF
NMP4
SRF
HNF1 AhR VIS 1
Lmo2
NFY
Lmo2
MEF
Pit1
GFI1
GSh-1
POZ
CDF-1
v-Myb
MESI1
Pax-3
Gfl-1B
En-1
NKX3.1 AREB6
Otx2
ATF4
VIS 1
MyT1
TCF/LEF-1
Mt
OBF 1
E2F
Pbx1/Meis1
MIBP-1/RFX1
FAST-1/S MAD
COMP1
E2F
Tst-1/Oct-6
MEIS 1
E2F Ikaros 3
ST/TA
E4BP4
CBF 3
WHP
TCF/LEF-1
CDE/CHR
MSX1/MSX-2 MyT1
P53
C-Ets-1 GBF3
AD-b
HNF1
GABP
E4BP4
E2
Oct1,2
NGN1/3
PAR
Brn3
v-Myb
FOXF2
CCAAT
Pbx1
OBF1
TEF-1 OBF1
C2HC
SRE
Cut-like
FOXF2
Elk-1
ST/TA
SOX-5
MEIS1
C2H2
GBF2
Pbx1
v-Myb
POZ
Brn2
c-Ets-1
MOK-2
CCAATHIF1
MMC
VIS1
COMP1
PBX/MEIS1 Tst-1/Oct-6
Pax1
ATF
ST/TA
E4BP4
MEF2
COMP1
Brn23
SRF MOK-2
RF-7
GATA
Clox
GBF1
POZ
B-cell
c-Myb TATA GLI-k
ZF
HNF6
TALE
MEF
Cut-like TCF/LEF-1 Lmo2
HEN1 Smad4
Albumin D-box
Pbx1
MIBP1
C-r
HNF4 CREB
v-Myb
ST/TA
CDE/CHR
RFX1 CHOP
NKX3.1
WHP
FLI
ST/TA
Pax-6 Tax/CREB FAST-1/SMAD NF-KB
Se-CtRNA
PXR/RXR/CAR
Thing1
MZF-1
AP 2
MAZ BPV
CREB
c-Myb
CREB NMP4
GLI-K
COMP1 C-r
PAR
Pbx1/Meis1
E2F
PAX2/5/8
P53FLI
HAND2
E4BP4
NMP4 E2F
CREB
Avian C
MyT1 c-Myb
PAR
MOK-2
NUR77/Nurr1/Nor-1
TALE
Pax-3 Cut-like
Pbx-1
ST/TA
Ikaros-3
CREB
Cut-like
RAR
Elk-1
CREB
E2F
Elk-1
C-Abl PAR
GFI1 E2F
E2F
c-Myb v-Myb
CDF-1 ST/TA
SRF
C-Myb
Luminescence (RLU)
HoxC-Rel
FAST-1
POZ CREB
ST/TA OBF1
My11
GBF1 MREMMC RFX1
POZ
B-cell TTF1
STs
Pro L
S8
Tax
EG3
Myo E2F
GBF1
Bright
X-Box
Cdf1 Brn-3
NF Y
c-Myb
Neu-r Gsh-1Sox-5
CCAAT
E2F
NUDR Gfi-1B
E2F
HAND2
TATA
PAR
Neu1/3
HNF4
Lmo2
E2F
Tal-1a
TCF PAX6 HNF1
RFX1
IRF2
GBF1
CCAAT
GBF3
Nkx2.5
TCF11
Cdx-2
AB-D Tal-1a
Brn-3
OBF-1 COMP1
Brn-3 Cart-1
CDP
FOXC1
AC-t
Pbx1
PR
CDP
NUDR
MyT1
OBF1
Elk-1
AD-b
1
Cut-like
r
p
Am
TALE
AD-b
Dec1
0
不安定化ルシフェラーゼによる反応性の向上と
最大誘導到達時間の短縮
luc2；ホタルルシフェラーゼ、luc2P；hPEST 配列を付加したホ
タルルシフェラーゼ、luc2CP；hCL1、hPEST 配列を付加したホ
タルルシフェラーゼ。これらのルシフェラーゼは cAMP 応答配列
（CRE）の反応をモニタリングするために用いられた。CRE-luc を
安定発現させた HEK293 細胞を 1µM イソプロパノール /100µMRo20-1724 で誘導し、4 時間ごとに細胞を収集して測光した。
4897MA
応答配列を導入した典型的な pGL4 ベクターのサークルマップ
Pax1
50
Time (hours)
luc2P
ori
100
0
SV40 late
poly(A) signal
pGL3
150
5280MA
Poly(A) block
(for background
reduction)
CRE-minP を含む pGL4 の誘導倍率
luc2P レポーター遺伝子上流に CRE および HSV-TK プロモーター
の一部を含む pGL4.11 (pGL4.11-CRE-TK)、CRE および minP を
含む pGL4.24 (pGL4.24-CRE-minP) をそれぞれ内部標準用ベク
ター（pGL4.74）とともに HEK293 細胞にトランスフェクション
した。24 時間後、1µM イソプロテレノールを添加して内在する
受容体を刺激し、4 時間後のレポーター活性を測定した。
シグナル伝達ガイド
各種シグナル経路のモニタリング (レポーター)
Modulator
Plasma
Membrane
Gαi
Gαs
Modulator
Modulator
Gβγ
Gαq
PLC
AC
DAG
IP3
PKC
Ca2+
Raf
MEK-1
PKA
Gα12/13
PIP2
Ras
ATP cAMP
Modulator
RhoGEF
RhoA
Calcineurin
MAPK
fos/jun
NFAT
NFAT-P
Rsk-2
CREB-P
ELK-P
CRE
SRE
Actin
dynamics
SRF
Nucleus
RE
NFAT-RE
SRF-RE
Luciferase
Glo
5257MA
AP-1
ルシフェラーゼレポーターを利用した GPCR シグナル伝達経路の解析
TNFα 5-hr stimulation HEK293
2000000
ベクター
pGL4.29[luc2P/CRE/
Hygro] Vector
（カタログ番号 E8471）
pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/
Hygro] Vector
（カタログ番号 E8481)
TNFα induced
noninduced
254-fold
induction
1500000
1000000
500000
24-fold
induction
0
pGL4.32 vector
NF-κB response element
Competitor
vector 1
14-fold
induction
7882MC
Luminescence (RLU)
2500000
Competitor
vector 2
NF-kB 応答配列を有する pGL4 と他社ベクターとの発光レベルの比較
SRE
SRF-RE
% of Control
100
75
pGL4.32[luc2P/NF-kBRE/Hygro] Vector
（カタログ番号 E8491）
pGL4.33[luc2P/SRE/
Hygro] Vector
（カタログ番号 E1340）
pGL4.34[luc2P/SRF-RE/
Hygro] Vector
（カタログ番号 E1350）
pGL4.36[luc2P/MMTV/
Hygro] Vector
（カタログ番号 E1360）
50
25
0
応答エレメント
cAMP 応答エレメント
(cyclic AMP Response
Element; CRE)
NFAT 応答エレメント
(Nuclear Factor of Activated
T-Cells Response Element;
NFAT-RE)
pGL4.35[luc2P/9X
GAL4 上流活性化配列
GAL4UAS/Hygro] Vector (GAL4 upstream activating
（カタログ番号 E1370）
sequence; GAL4UAS)
Control
U0126
シグナル経路
cAMP/PKA
カルシウム / カルシ
ニウリン
多様（GAL4-DNA
結合ドメインによ
る結合と活性化を
要する )
NF-kB
NF-kB 応答エレメント
(Nuclear Factor kB Response
Element; NF-kB-RE)
血清応答配列 (Serum
MAPK/ERK
Response Element; SRE)
血清応答因子応答配列
(Serum Reponse Factor
Response Element; SRFRE)
マウス乳癌ウイルス末端
反復配列 (Murine Mouse
mammary Virus Long
Terminal Repeat; MMTVLTR)
RhoA
アンドロゲン受容
体、グルココルチ
コイド受容体を含
むいくつかの核内
受容体
C3
pGL4 に含まれる SRE と SRF-RE の明瞭な応答性の違い
HEK293 に SRE-luc2P または SRF-RE-luc2P を含むベクターとウミ
シイタケレポーターベクターをコトランスフェクションし、U0126
（MEK 阻害剤）または C3 Transferase（RhoA 阻害剤）で前処理し、
SRE は PMA、SRF は FBS で誘導した。
5
各種シグナル経路のモニタリング (レポーター)
Fold Induction
核内受容体のリガンド結合ドメイン (LBD) を酵母のGAL4
転写因子のDNA結合ドメインに融合した発現タンパク質を
利用するワン-ハイブリットシステム[A]とアンドロゲン受容
体、グルココルチコイド受容体などが結合することが知ら
れているマウス乳癌ウイルス (MMTV) 末端反復配列を利用
する方法 [B]があります。
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0
0.10
60,000
50,000
40,000
30,000
20,000
10,000
1.00
0
100.00
10.00
[dihydrexidine] µM
A.
・pBIND-ERα Vector
・pBIND-GR Vector
・pFN26A (BIND) hRluc-neo Flexi® Vector
NR-LBD
Gal4の
DNA結合ドメイン
核内受容体の
リガンド結合ドメイン
内部標準により明らかになった擬陰性（化合物の毒性による誘導倍率の
低下）
CRE-luc2P を含み、DRD1 受容体を発現する HEK296 細胞を
Dihydrexidine で処理した後、Dual-Glo ™ Assay System ( カタログ番号
E2920) でホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを検出した。
リガンド
GAL4 DBD
Glo
Gal4UAS
luc
製品名
・pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector
・GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line
Glo
5456MAj
luc
・pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] Vector
核内受容体によるシグナル解析のための 2 つのアプローチ
デュアル-ルシフェラーゼアッセイ
スクリーニングなどで化合物を添加する場合、細胞毒性が
正味のレポーター発現を低下させ、擬陰性としてあらわれ
る場合があります。しかし、第2のレポーターを用いれば内
部標準レポーターの正味の発現も低下するため、このよう
な擬陰性を避けることが出来ます。
pGL4-RE-luc2P
RE
luc2P
PSV40
Hygr
PSV40
Rluc-Neor
GPCR
Dual-Luciferase® GPCR アッセイに使用する 2 種類のプラスミドの概略図
RE；Response Element/ Promoter、luc2P；hPEST 配列を付加した
Rapid Response ™ ホタルルシフェラーゼ、PSV40；SV40 プロモーター、
PCMV；CMV プロモーター、Rluc-NEOr；ウミシイタケルシフェラーゼ
とネオマイシン耐性遺伝子のフュージョン
6
5251MB
pF9A CMV hRluc-Neor
PCMV
価格（￥）
pGL4 転写因子応答配列
pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] Vector
20μg E8471
64,000
pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro] Vector
20μg E8481
64,000
pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] Vector
20μg E8491
64,000
pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro] Vector
20μg E1340
64,000
pGL4.34[luc2P/SRF-RE/Hygro] Vector
20μg E1350
64,000
pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector
20μg E1370
64,000
pGL4 核内受容体応答配列
pGL4.31[luc2P/Gal4UAS/Hygro] Vector
20μg C9351
64,000
pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] Vector
20μg E1360
64,000
pGL4 任意応答配列導入用
pGL4.24 [luc2P/minP] Vector
20μg E8421
64,000
pGL4.27 [luc2P/minP/Hygro] Vector
20μg E8451
64,000
※上記以外の pGL4 については www.promega.co.jp/lit/pgl4.html をご覧
下さい
安定発現細胞株
715,000
GloResponse™ NF-kB-RE-luc2P HEK293 Cell Line
2 バイアル E8520
715,000
GloResponse™ CRE-luc2P HEK293 Cell Line
2 バイアル E8500
715,000
GloResponse™ NFAT-RE-luc2P HEK293 Cell Line
2 バイアル E8510
715,000
GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line 2 バイアル E8530
核内受容体融合タンパク質発現
pBIND-ER Vector
20μg E1390
64,000
pBIND-GR Vector
20μg E1581
64,000
20μg E1380
64,000
pFN26A (BIND) hRluc-neo Flexi® Vector
受容体発現
20μg C9361
58,000
pF9A CMV hRluc-neo Flexi® Vector
アッセイ試薬
Dual-Glo™ Luciferase Assay System
10ml E2920
33,000
100ml E2940
264,000
100 回分 E1910
27,500
Dual-Luciferase® Reporter Assay System
10×100 回分 E1960
218,000
ONE-Glo™ Luciferase Assay System
10ml E6110
18,500
100ml E6120
121,000
NR
RE
サイズカタログ番号
pGL4 Response Element Vectors
内在性あるいは
外来性の核内受容体
B.
Luminescence (RLU)
Firefly induction
Renilla RLU
90.0
レポーターを利用した核内受容体のシグナル解析として、
5938MA
核内受容体
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/pgl4.html
※製品購入における注意点 : pGL4 の使用は非営利組織（大学、公的研究
機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容
(www.promega.co.jp/license/) をご確認頂く必要があります。
シグナル伝達ガイド
cAMPのモニタリング（センサー）
Cell Based
GloSensorTM cAMP Assay
Cell Based
組換えルシフェラーゼセンサーによる直接的なcAMPモニタリング
GloSensor™ cAMP Assayは、細胞内のcAMPレベルを測定する新しいアプローチを提供します。cAMPはGαsおよびGαiタンパク
質を介したGPCRのシグナル伝達に関与する重要なセカンドメッセンジャーです。ホタルルシフェラーゼの内部にcAMP結合部位
In Vitro
を組み込んであるため、cAMPが結合すると構造が変化して発光量が増加します。この生細胞アッセイはcAMPを通じたシグナル
伝達のカイネティックスやモジュレーションの研究に最適です。
選択した細胞株で標的受容体およびバイオセンサーを一過性に発現させてGloSensor™ cAMP Assayを行います。また、バイオ
センサーと受容体を安定に発現する細胞株を調製して実施することもできます。プロトコルはシンプルで、細胞をGloSensor™
cAMP Reagentで事前に約2時間平衡化します。その後、特異的なアゴニスト/アンタゴニストあるいは化合物で処理し、10～30分
後に発光を測定します。それ以外に試薬の添加や手作業は不要です。インジェクターが付属する標準的なルミノメーターで測定
することができます。GloSensor™ cAMP Reagentは、本アッセイでの使用に必要です。
C
Luminescence (RLU)
C
N
1 × 105
N
1 × 104
1 × 103
PRO
FSK
ISO
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Time (minutes)
359–544
RIIβB
4–355
アロステリック cAMP バイオセンサー
生細胞（37℃）におけるシグナルのカイネティクスと可逆性。cAMP
バイオセンサーを一過性に発現する HEK293 細胞を 10µM イソプロ
テレノール (ISO) または 10µM フォルスコリン (FSK) それぞれ単独
で処理した。変調を加える細胞は、10µM ISO, 10µM プロプラノール
(PRO) および 10µM FSK で連続的に処理した (n=3)。Fan, F. et al. (2008)
ACS Chem. Biol. 3, 346-51. より許可を得て転載した。
C
7707TA
N
GloSensorTM cAMP Assay の発光原理
Allosteric（アロステリック型）改変ルシフェラーゼ遺伝子：cAMP が結
合するドメイン (RII β B ) の構造変化により発光シグナルが調節される。
製品名
RVprimer4
binding site
Synthetic poly(A)
signal
Ampr
ベクターおよび安定発現細胞株
pGloSensor™-20F cAMP Plasmid
GloSensor™ cAMP HEK293 Cell Line
アッセイ試薬
GloSensor™ cAMP Reagent
RVprimer3
binding site
CMV Immediate/Early
Enhancer/Promoter
pGloSensor™-20F cAMP
Plasmid
(6990bp)
T7 promoter
価格（￥）
20μg
2 バイアル
E1171
E1261
100,000
800,000
1 vial
(25mg*)
E1290
50,000
1 vial
(250mg*)
E1291
230,000
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/glosensor.html
SV40 Early
Enhancer/Promoter
* 25mg は 384 ウェル形式で 817 ウェル分
GloSensor™ cAMP
coding region
7649MA
SV40 Late
Poly(A)
サイズカタログ番号
GloSensorTM cAMP Assay
ori
Hygr
20
7708MA
・シンプルなアッセイ :HTS や ultra HTS ( 例 : 3456- ウェル形式 )
に理想的な 0 ステップアッセイ
・リアルタイムの測定 : 処理後 15 分で cAMP レベルを検出
・より生体反応に近いデータ : 非溶解性の生細胞アッセイによる
カイネティックなデータ取得
MOD
FSK
ISO
NA
※製品購入における注意点 : GloSensor™ cAMP Assay の使用は非営利
組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンス
プログラムの内容 (www.promega.co.jp/license/) をご確認頂く必要が
あります。
pGloSensor ™ -20F cAMP Plasmid のベクターマップ
7
cAMPアッセイ
Cell Based
cAMP-GloTM Assay
Cell Based
細胞内cAMPを発光法により高感度に検出
cAMP-GloTM Assayは、細胞内のcAMPレベルを測定するための試薬で、発光法によるホモジニアスなハイスループットアッセイ
を可能にします。cAMP-GloTM Assayは、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）におけるアゴニストまたはテスト化合物の影響に
In Vitro
よって変動する細胞内cAMP量をモニタリングします。アデニル酸シクラーゼと共役するGPCR は細胞内 cAMPを増加あるいは
減少させます。本アッセイは、cAMPがプロテインキナーゼA
ホロ酵素活性を刺激し、ルシフェラーゼ反応に利用可能なATP量
を減少させ、それに伴い発光レベルが低下するという原理に基づいています。cAMP-GloTM Assayは96、384または1536ウェルプ
レートでアッセイすることができます。cAMPレベルが変化する適切な時間をかけて、細胞をテスト化合物で誘導します。誘導
後、cAMPを遊離させるために細胞を溶解し、プロテインキナーゼAを含む cAMP detection solutionを添加します。次にPKA反
応を停止させ、ルシフェラーゼ反応により残存するATPを検出するKinase-Glo® Reagentを加えます。プレートはマイクロプレー
ト用のルミノメーターで測定します。cAMP標準曲線を用いることにより発光レベルからcAMP濃度が決定されます。発光シグ
ナルの半減期は4時間以上です。シグナルの半減期が長いため、ルミノメーターにインジェクターは不要で、マルチプレートの
バッチモード処理を可能にします。
･迅速で簡便：細胞溶解後 2 ステップで完了するシンプルなホ
モジニアスフォーマット（所要時間約 45 分）
･優れたシグナル / バックグラウンド比（S/B 比）：優れた S/B
比（>200 [cAMP], >15 [ 細胞 ] ）を示し、1536 ウェルプレー
ト以上のフォーマットにも簡単に変更可能
･優れた発光技術を採用：定評のある Ultra-Glo ™ Recombinant
Luciferase を使用しており、蛍光化合物による干渉もありま
せん（Non-RI）
。
Ligand
G protein-coupled
receptor
R R
cAMP
R R
ATP
400,000
luciferin
+ O2
200,000
2
4
6
8
10
組織抽出液を用いた cAMP-GloTM Assay
ラット脳抽出液 2 ml/gm を、0.5 mM IBMX および 100 µM Ro201724 を含有する cAMP-GloTM Lysis Buffer でホモジナイズし、70℃で
5 分間加熱した。0、2、4、6、8 および 10 µl のサンプルに等量の
Krebs Ringer バッファーを添加した後、cAMP-GloTM 反応バッファー
を添加することにより試験を行った。反応液を室温で 20 分間イン
キュベーションした後、等量の Kinase-Glo® Reagent を添加した。
10 分後の相対発光量を測定し、溶解バッファーのみの RLU 値から
各サンプルの RLU 値を減じることにより、Δ RLU を算出した。Δ
RLU = RLU (0µl) - RLU ( サンプル )
1,250,000
C C
Active protein
kinase A
Inactive protein
kinase A holoenzyme
Protein kinase A
substrate
luciferase
oxyluciferin
+ AMP
+
Light
cAMP-GloTM Assay の原理の概略図
細胞内 cAMP 濃度の変化により、ヘテロ四量体として存在する不活性状
態の cAMP 依存性プロテインキナーゼ (PKA) が修飾され、調節サブユ
ニット二量体から酵素活性を有する触媒サブユニット 2 個が遊離する。
PKA の活性化は、キナーゼ反応における ATP 基質の減少によりモニター
でき、残存する ATP はルシフェラーゼ反応により定量できる。
IC50 = 9nM
750,000
SCH23390
Alprenolol
500,000
製品名
cAMP-Glo™ Assay
–8
–7
–6
Log Drug Concentration (M)
–5
6125MA
–9
サイズ
カタログ番号
価格（￥）
AMP-Glo ™ Assay
250,000
0
–10
C
6127 MA
0
Extract Volume (µl)
Luminescence (RLU)
cAMP
C
600,000
1,000,000
ATP
P
800,000
6872MA
Luminescence (∆RLU)
ADP
cAMP
G protein
γ
Phosphorylated
protein kinase A
substrate
GTP
γ
β
1,000,000
0
SCH23390 の IC50 の決定
D1 受容体を発現する HEK293 細胞を 100nM SKF38393（アゴニス
ト）の存在下で表示量の SCH23390 で処理した後、cAMP-GloTM で
測定した。
8
α
GDP
r2 = 0.9937
Active
adenylate
cyclase
α
β
1,400,000
1,200,000
Inactive
adenylate
cyclase
300 ウェル分
3,000 ウェル分
30,000 ウェル分
V1501
V1502
V1503
・表示のサイズは 384 プレートの場合。
・バルク注文については別途お問合わせください。
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/campglo.html
53,000
286,000
お問い合せ下さい
シグナル伝達ガイド
Cell Based
Cell Based
PDEアッセイ
PDE-Glo™ Assay
In Vitro
発光法によるcAMP & cGMP-ホスホジエステラーゼアッセイ
PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay は、精製物よりサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（PDE）活性を発光で
測定するハイスループットスクリーニング（HTS）を行うためのシステムです。サイクリックヌクレオチドPDEは加水分解能
を持ち、セカンドメッセンジャーであるシグナル分子cAMPやcGMPのレベルをコントロールするため、様々な細胞内プロセス
に関与します。PDEに対する選択的阻害能は、サイクリックヌクレオチドのシグナリングの研究や細胞・組織の病理における
PDEの役割を調べる上で有用です。本製品は化合物ライブラリーから阻害剤を同定するための候補化合物の探索に使用するこ
とができます。アッセイは384ウェルプレート用にデザインされていますが、アッセイボリュームは96や1536ウェルプレート
フォーマットへ容易に変更することができます。PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay はcAMPおよびcGMP依存性ホスホジエ
ステラーゼの両方の測定に最適化されています。アッセイの所要時間はPDE反応後1時間以内です。
cAMP
cGMP
3.5 × 106
3.0 × 106
Luminescence (RLU)
・柔軟性：cAMP および cGMP PDE の両方を測定可能
・高感度：優れたシグナル / バックグラウンド比、1536 ウェル
フォーマットにも対応
・迅速・簡便：ホモジニアスフォーマットで 1 時間以内にアッセ
イ完了
・信頼性の高い発光技術： Ultra-Glo ™ Luciferase を使用した
Non-RI アッセイ
・安心：蛍光化合物による阻害もなし
2.5 × 106
EC50 (cAMP) = 6.81nM
EC50 (cGMP) = 597nM
2.0 × 106
1.5 × 106
1.0 × 106
0.5 × 106
0
PDE
Phosphorylated
protein kinase A
substrate
ADP
–10.0
–7.5
NMP
–5.0
–2.5
6148MA
–12.5
cNMP
Log10 cNMP (M)
P
PDE-Glo ™ Assay による cAMP および cGMP 用量反応曲線
cNMP
cNMP
R R
R R
luciferin
+ O2
C C
Active protein
kinase A
Inactive protein
kinase A holoenzyme
Protein kinase A
substrate
luciferase
oxyluciferin
+ AMP
100,000
75,000
50,000
25,000
0
–3
+
cNMP = cAMP or cGMP
NMP = AMP or GMP
–2
–1
0
Log10 IBMX Concentration (µM)
6289MA
Light
IC50 = 0.1µM
6387MA
ATP
C
Luminescence (RLU)
C
ウシ脳 PDE を用いた阻害剤 IBMX のタイトレーション
PDE-Glo ™ Assay の測定原理
製品名
サイズ
カタログ番号
価格（￥）
V1361
V1362
お問い合せ下さい
PDE-Glo ™ Assay
PDE-Glo™ Assay
1,000 ウェル分
10,000 ウェル分
95,500
・表示のサイズは 384 プレートの場合。
・バルク注文については別途お問合わせください。
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/pdeglo.html
9
Cell Based
Cell Based
ADPアッセイ（キナ—ゼ、ATPase）
ADP-Glo™ Assay
In Vitro
初めてのADP発光測定システム
ADP-Glo™ Kinase Assay は、キナーゼ反応より生成するADPを発光法により測定するキナーゼアッセイシステムです。ADPは
ATPに変換され Ultra-Glo™ Luciferaseにより発光シグナルを生じます。発光シグナルはキナーゼ活性と正の相関性を有します。
このシステムは広範な精製キナーゼの活性に対する化合物の影響を測定する際に有効で、1次スクリーニングおよびキナーゼ選
択性のプロファイリングにも利用することができます。また、ADP-Glo™ Kinase Assayは最大1mM ATPを使用してADPを生成
するあらゆる酵素（例.
キナーゼ、ATPase）の活性をモニタリングすることができます。アッセイは2段階のステップにより行
われます。まず、キナーゼ反応後に等量のADP-Glo™ Reagent を加えてキナーゼ反応（ADP 生成反応）を停止させ、残存する
ATPを枯渇させます。次に、Kinase Detection Reagent を添加し、ADPからATPへの変換反応とルシフェラーゼ/ルシフェリン/生
成ATPによる発光反応が同時に行われます。ADP-Glo™ Kinase Assay は広いダイナミックレンジを有し、低いATP/ADP変換率
においても高いシグナルを生じるため、成長因子受容体チロシンキナーゼなど活性の低いキナーゼのスクリーニングにも最適で
す。このアッセイ法では擬陽性も低く、Z’値は0.8以上を示します。
・ATP/ADP 変換率が低くても高いシグナル強度：研究者はより生
体内に近い条件でキナーゼ活性を測定可能
・高感度：低濃度の ADP でも高感度に測定可能なことから、他の
アッセイ法に比べ使用する酵素量を低く抑えられ、低コストを
実現可能
・ユニバーサル：実質的にあらゆるキナーゼ測定に使用でき、研
究者は広範なキナーゼを 1 つのシステムで測定可能（費用の高
いキナーゼ選択性プロファイリングのアウトソーシングは不要）
・正確：様々な初期 ATP 濃度で正確に ADP レベルが測定できる
ため、キナーゼ活性を反映した測定値が保証され、RI ベースの
アッセイ法と同等の正確な IC50 値が得られます
・広範な ATP レベルで測定可能：最大 1mM の ATP 濃度で利用で
きるため、ATP に対する Km 値の高いキナーゼにも適応
・安定な発光シグナル：厳密に時間制御されたインキュベーショ
ンは不要で、プレートでのバッチ処理が可能
・ATP 非活性・活性阻害を見分けられる
Kinase or
ATPase Reaction
Step 1: ATP Depletion
ADP-Glo™
Reagent
Step 2: ADP Detection
Kinase
Detection
Reagent
8051MA
ATP
ADP
Luminescence
ADP-GloTM Kinase Assay の測定原理
PI3 kinase
Protein Kinase A
35000
200000000
30000
25000
20000
-3
-2
-1
0
log10 [PKA], units
0
-1
2
log10 [ERK2], ng
3
4
20000000
18000000
16000000
14000000
12000000
10000000
8000000
6000000
4000000
2000000
0
-1
0
1
2
log10 [Pgp membranes], µg
3
Sodium Pump
(ATP + Na+/K+ )
280000000
210000000
140000000
EC50= 0.2mU
-3
-2
-1
0
1
log10 [Hexokinase], mU
70000000
2
ADP-GloTM Kinase Assay を利用したキナーゼをはじめとする様々な ADP 生成酵素のアッセイ例
10
EC50= 15µg
-2
350000000
RLU
RLU
RLU
1
0
2
Glucose (Sugar)
EC50= 81.6ng
0
1
Hexokinase
MBP (Protein)
-1
0
log10 [PI3 kinase p120γ], ng
Serin-Threonine Kinase
20000000
18000000
16000000
14000000
12000000
10000000
8000000
6000000
4000000
2000000
0
50000000
EC50= 2.79ng
5000
1
150000000
100000000
15000
10000
EC50= 0.376 units
(ATP + Verapamil [Activator] )
250000000
RLU
8.0×106
7.0×106
6.0×106
5.0×106
4.0×106
3.0×106
2.0×106
1.0×106
0
ABC Transporter (MDR)
Phosphatidylinositol (lipid)
40000
RLU
RLU
9.0×10
Kemptide (Peptide)
6
0
EC50= 4.7mU
-2
-1
0
1
2
log10 [Na+/K+ ATPase], mU
3
シグナル伝達ガイド
1µM
2.5 × 105
2.0 × 105
1.5 × 105
R² = 0.99
1.0 × 105
0.5 × 10
5
0
0
20
40
60
1.5 × 105
1.0 × 10
5
0
1.2 × 107
R² = 0.99
0.4 × 107
0
0
20
40
60
40
60
80 100 120
51
41
31
21
11
1mM
1
1.5 × 108
1.2 × 108
0
0.9 × 108
10
20
30
40
50
% ATP to ADP conversion
R² = 0.99
0.6 × 108
0.3 × 108
0
80 100 120
Percent ATP-to-ADP Conversion
B.
20
1.8 × 108
Luminescence (RLU)
Luminescence (RLU)
1.6 × 107
0.8 × 10
0
Percent ATP-to-ADP Conversion
100µM
7
R² = 0.99
0.5 × 105
80 100 120
ADP-GloTM
TR-FRET
61
2.0 × 105
Percent ATP-to-ADP Conversion
2.0 × 107
10µM
2.5 × 105
Fold change
3.0 × 105
Luminescence (RLU)
Luminescence (RLU)
A.
0
20
40
60
ADP-GloTM と TR-FRET（蛍光）法との比較
ADP に対する抗体を利用した TR-FRET 法との ATP → ADP 変換率に
ともなう倍率変化の比較
80 100 120
Percent ATP-to-ADP Conversion
Signal-to-Background Ratios
100
80
60
40
20
10
5
4
3
2
1
0
製品名
1µM
80
54
41
28
15
8
4
4
3
2
2
1
ADP-GloTM Kinase Assay
10µM
135
110
84
57
31
16
8
7
6
4
2
1
100µM 125
97
77
56
31
17
9
8
6
5
3
1
117
91
74
51
28
14
8
7
6
4
2
1
1mM
ADP-GloTM Kinase Assay
8052MA
[ATP + ADP]
Percent ADP in an ATP + ADP Mixture
ADP-GloTM Kinase Assay の感度、
直線性と低 ATP/ADP 変換率での高い S/B 比
サイズ
カタログ番号
1,000 回分
10,000 回分
100,000 回分
V9101
V9102
V9103
価格（￥）
97,000
560,000
お問い合せ
下さい
・表示のサイズは 384 プレートの場合。
Cell Based
・バルク注文については別途お問合わせください。
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/adpglo.html
Cell Based
キナーゼアッセイ
Kinase-Glo® Assay
In Vitro
キナーゼが消費するATPを高感度に検出
Kinase-Glo® Luminescent Kinase Assayは、キナーゼ反応後に残存する溶液中のATPを定量することにより、精製キナーゼの活
性を測定するNon-RIのホモジニアスアッセイ法を採用しています。マルチウェルプレートフォーマット用にデザインされてお
り、タンパク質や脂質、糖質のリン酸化アッセイに使用できます。アッセイは1種類の試薬
(Kinase-Glo® Reagent) をキナーゼ
A.
3.0 × 108
Luminescence (RLU)
反応に直接加えます。この添加により、キナーゼ反応が停止し、残存するATP量に比例した発光シグナルが生じます。生じる
r2 = 0.9993
2.5 × 108
光の半減期は5時間以上で、プレートのバッチ処理が可能です。また、このアッセイでは96または384ウェルフォーマットで優
8
2.0 × 10
®
れたZ’
値 (>0.7)を示し、IC
Assay SystemにはATPに対
50値も文献で報告されたデータと同様の値を示しました。Kinase-Glo
1.5 × 108
®
する応答性の異なる3システムがあります。Kinase-Glo
は10µM ATPまでの直線性、Kinase-Glo® Plusは100µM ATPまでの直線
1.0 × 108
®
性を有します。新しいKinase-Glo
Maxは500µM ATPまでの直線性があり、ATPに対して高いKm値を有するキナーゼの測定や
0.5 × 108
0
ATP結合サイトで競合しないキナーゼ阻害剤のスクリーニングなどに適しています。
0
20
40
60
80
100
120
ATP (µM)
製品名
1.6 × 108
1.4 × 108
1.2 × 108
1 × 108
8 × 107
6 × 107
4 × 107
2 × 107
0
y = 280837x + 2 × 1016
r2 = 0.9971
Kinase-Glo®ｨ Luminescent Kinase Assay
Kinase-Glo®ｨ PlusｨLuminescent Kinase Assay
0
100
200
300
サイズ
カタログ番号
価格（￥）
Kinase-GloTM Kinase Assay
6979MB
Luminescence (RLU)
B.
400
500
600
ATP (µM)
ATP 量に応じた発光シグナル
Kinase-Glo® Assay system で得られた発光量は反応液中の ATP 量に比
例する。Kinase-Glo® Max Assay は 500µM ATP までの直線性を有する。
Kinase-Glo®ｨ Max Luminescent Kinase Assay
10ml
100ml
10ml
100ml
10ml
100ml
V6711
V6713
V3771
V3773
V6071
V6073
14,500
55,000
22,000
88,000
26,500
106,500
・10ml は 96 ウェルプレートの場合 200 ウェル分に相当。
・バルク注文については別途お問合わせください。
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/kinaseglo.html
11
Cell Based
Cell Based
カスパーゼシグナリング
Cell Based
Caspase-Glo® Assay
In Vitro
Cell Based
高感度でシンプルなカスパーゼアッセイシステム
Caspase-Glo® Assayは、各種カスパーゼ活性を測定するためのホモジニアスフォーマット発光アッセイシステムです。本アッセ
イでは、プロテアーゼ認識配列を付加した発光基質アミノルシフェリンと特殊な耐熱性ルシフェラーゼを含む試薬がベースに
In Vitro
なっており、カスパーゼ活性に最適化されています。Caspase-Glo® Reagent を添加すると細胞が溶解し、続いてカスパーゼによ
り基質が切断されます。遊離したアミノルシフェリンは耐熱性のUltra-Glo™ Recombinant Luciferaseにより消費され、“グロー
タイプ”の発光シグナルを生じます。このシグナルはカスパーゼ活性に比例します。安定化されたルシフェラーゼおよび特殊な
バッファーシステムは、広範なアッセイ条件でのパフォーマンスを向上させます。本アッセイは、蛍光法や発色法のアッセイに
比べて化合物による影響を受け難くなっています。
Caspase-Glo® 3/7, 8 および 9 Assay は培養細胞あるいは精製酵素を用いたマルチウェルプレートでのアッセイ用にデザイン
されています。Caspase-Glo® 2 および 6 Assay は、精製酵素を用いたアッセイ用に開発されています。Caspase-Glo® 8 および
9 Assay には、非特異的なバックグラウンドをより低減させるプロテアーゼ阻害剤MG-132が新たに添付されています。
Anti-Fas Treated Cells
Untreated Cells
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
–10
1,400
1,200
1,000
800
400
4, 0
00
5, 0
00
6, 0
00
7, 0
00
8, 0
00
0
9,
00
10 0
,0
00
0
00
00
3,
R182
Cell #
0h 24h 48h 72h 0h 24h 48h 72h
B.
p17/p19
Beta-actin
20
16
Jurkat 細胞を用いた場合の Caspase-Glo® 3/7 Assay の感度
Jurkat 細胞は抗 -Fas mAb で 4.5 時間処理し、アポトーシスを誘導した。
10,000
Caspase-Glo® Reagent 添加 1 時間後に測定した。
Caspase-Glo® 3/7
CP70 (DOC sensitive)
R182 (DOC resistant)
12
8
製品名
Luminescence
(RLU, Blank Subtracted)
Active
Caspase-3
1,000
サイズカタログ番号
100
Caspase-Glo® 3/7 Assay
4
0
0
24
48
72
Duration of Docetaxel Treatment (hours)
ウェスタン分析と Caspase-Glo® の相関性
4546TA
Relative Caspase-3/7 Activity
0
1,
CP70
–200
0
200
0
Western Analysis
100 200 300 400 500 600 700
600
2,
Luminescence
(RLU, Blank Subtracted)
1,600
00
・30 分で完了：最も簡便なアポトーシスの判定法（サンプルと等
A.
量の試薬を 1 種類加えるのみ）
・高感度：感度の優れる発光法（20 個の細胞でも検出）
・優れた S/N：蛍光法に比べ、低いバックグラウンド
・優れたパフォーマンス：細胞ベース、酵素ベースのアッセイと
も優れた Z’
-factor 値を提示。
・長時間発光：3 時間安定なグロータイプのシグナルによりバッ
チ法によるプレート処理も可能。
・マルチアッセイ：他のセルベースアッセイとの併用が可能
細胞・酵素ベースアッセイ
Caspase-Glo® 3/7 Assay
2.5ml
G8090
10ml
G8091
66,000
100ml
G8092
319,000
2.5ml
G8200
17,500
10ml
G8201
66,000
2.5ml
G8210
10ml
G8211
Caspase-Glo® 2 Assay
10ml
G0940
66,000
Caspase-Glo® 6 Assay
10ml
G0970
66,000
10
Caspase-Glo® 8 Assay
Caspase-Glo® 9 Assay
1
10
酵素ベースアッセイ
100
1,000
Cell #
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/caspglo.html
* 10ml は 96 ウェル形式で 100 ウェル分
* バルク注文については別途お問合わせください。
12
価格（￥）
17,500
17,500
10,000
66,000
0.5 hour
1 hour re
2 hour re
3 hour re
シグナル伝達ガイド
Cell Based
Cell Based
ユビキチン・プロテアソームシグナリング
Proteasome-Glo™ Assay
In Vitro
DUB-Glo™ Protease Assay (DUB/SENP/NEDP)
プロテアソームおよび脱ユビキチン化酵素（DUB）の発光測定
Proteasome-GloTM System は、
プロテアソームに関連する3種類のプロテアーゼ活性を測定するためのホモジニアスな発光試薬3
種類で構成されており、細胞ベースあるいは酵素ベースの測定フォーマットを採用しています。3つの発光基質は、プロテアソー
ムのキモトリプシン様（Suc-LLVY-aminoluciferin）、トリプシン様（Suc-LRR-aminoluciferin）、力スパーゼ様（Z-nLPnLD-aminoluciferin）の活性モニタリングに使用します。DUB-Glo™ Protease Assay（DUB/SENP/NEDP）は、脱ユビキチン化（DUB）、脱
SUMO化（SENP）
、脱NEDD化（NEDP）プロテアーゼを含む脱結合酵素の活性を測定します。各発光基質を含む試薬をテストサン
プルに加えると、基質が切断されてルシフェリンが遊離します。このルシフェリンがルシフェラーゼ反応により消費され、酵素活
性あるいは阻害効果に応じたグロータイプの発光を生じます。
製品名
サイズカタログ番号
価格（￥）
Proteasome-GloTM & DUB-GloTM Protease Assay
100,000
Signal-to-Noise Ratio
10,000
Ub-AMC, 30 minutes
Z-RLRGG-aminoluciferin, 30 minutes
Z-RLRGG-aminoluciferin, 90 minutes
Z-RLRGG-AMC, 90 minutes
10ml
G8660
88,000
Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Cell-Based Assay
10ml
G8760
88,000
Proteasome-Glo™ Caspase-Like Cell-Based Assay
10ml
G8860
88,000
各 10ml
G1180
216,500
Proteasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Assay
10ml
G8621
58,500
Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Assay
10ml
G8631
58,500
Proteasome-Glo™ Caspase-Like Assay
10ml
G8641
58,500
Proteasome-Glo™ 3-Substrate System
10ml
G8531
143,000
DUB-Glo™ Protease Assay
10ml
G6260
72,000
10ml
G6261
260,000
Proteasome-Glo™ 3-Substrate Cell-Based Assay System
酵素ベースアッセイ
1,000
100
10
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1,000
UCH-L3 (nM)
8100MA
1
0.0001
細胞ベースアッセイ
Proteasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay
UCH-L3 を用いた DUB-GloTM と蛍光アッセイ法との比較
プロメガ資料：
www.promega.co.jp/lit/proteasomeglo.html
www.promega.co.jp/lit/dubglo.html
* 10ml は 96 ウェル形式で 100 ウェル分
・上記以外のサイズについてはお問い合せください。
その他のプロテアーゼアッセイ
Protease Assay Solution
任意のプロテアーゼを発光で検出
認識配列設計タイプ：プロテアーゼ認識配列を自由に設計で
きるProtease-Glo™ Assayは、遺伝子改変したホタルルシフェ
認識配列設計タイプ
ラーゼセンサー（GloSensor™）を含むベクターに任意のプ
無細胞発現
タンパク質
分解反応
ロテアーゼ認識配列をコードするオリゴヌクレオチドを導入
ルシフェリン試薬
N
N
C
C
します。無細胞発現系で発現させたバイオセンサーはプロテ
アーゼにより分解されると発光酵素として活性化します
（詳細は www.promega.co.jp/lit/proteaseglo.html）。
修飾ルシフェリンタイプ：プロテアーゼ認識配列が付加され
修飾ルシフェリンタイプ
ルシフェラーゼ試薬
た修飾ルシフェリンを利用すれば、タンパク質分解反応後に
生成されるルシフェリンが発光反応に利用され、プロテアー
S
N
N
S
COOH
H
-H2-N
-
どはこのような修飾ルシフェリンを利用したシステムです。
詳細についてはお問い合せください。
H
-N
-
ゼ活性に比例した発光シグナルを生じます。Caspase-Glo TMな
タンパク質
分解反応
S
N
N
S
COOH
プロテアーゼ活性測定のための 2 つの発光アッセイ法
13
細胞メタボリズム
Cell Based
CellTiter-Glo® Assay
Cell Based
細胞内ATPをベースとした代謝活性を鋭敏に測定
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assayは、代謝活性のある細胞に由来するATPを定量することで培養中の生存細胞数を測
定するワン-ショットタイプの細胞増殖・毒性システムです。マルチプレートのアッセイ用にデザインされており、自動化された
In Vitro
ハイスループットスクリーニング（HTS）にも最適です。優れた感度を示すため、発色法では困難な浮遊細胞を用いる場合にも
威力を発揮します。1種類の試薬を培養細胞（血清含有）に加えるだけで、培地の除去・細胞の洗浄や複数回のピペッティングは
不要です。試薬を加えると細胞溶解が始まり、存在するATP量に比例した発光シグナルが生じます。また、この試薬にはATPase
阻害剤が含まれ、細胞溶解時にATPの減少を防ぐことができるため、より正確なATP測定が可能です。このシステムで生じる発光
は、半減期の長い“グロータイプ”（5時間以上）なのでインジェクターを必要とせず、連続モードあるいはバッチモードの自動
・ホモジニアス：ワン - ショットタイプ（添加→混合→測定）なので
他の ATP 測定システムに較べプレートのハンドリングが最小限。
・迅　速：試薬添加 10 分後にデーターが得られます。
・高感度：標準的な発色または蛍光定量法に較べ優れた感度
（細胞 10 個［384 プレート］、細胞 50 個［96 プレート］を検出）。
・正確：発色法より正確な定量性
・安定性：発光が非常に安定（5 時間以上）。
・応用性：様々なマルチプレートに適応し、ルミノメーターある
いは CCD
1,800
1,600
1,400
1,200
1,000
20
800
10
600
400
200
0
0
0
100
200
300
400
3171MB04_1A
Luminescence (RLU)
化システム両方に適応します。
10,000 20,000 30,000 40,000 50,000
0
Cells per Well
細胞数と発光量の相関関係
CellTiter-Glo® Assay で測定した場合、発光量と細胞数には直接的な
相関関係が認められる。
Absorbance
Relative Values (Percent)
Inhibitor
120
Activity (% RLU)
100
80
60
40
0
0
50
100 150 200 250 300
Time (minutes)
3422MA05_1A
20
CellTiter-Glo® Reagent による ATPase 活性の阻害
10% ウマ血清を含む DME/F-12 (1:1) に懸濁した L929 細胞 (1.5 ×
105 cells/ml) から凍結 / 融解により調製したライセートを 2 つのプー
ルに分けて、22℃でインキュベーションした。一方のプールには等
量の 50mM HEPES (pH 7.5;no inhibitor) を加え、もう片方には等量の
CellTiter-Glo® Buffer (inhibitor) を添加した。60 分毎（計 5 回）に 100µl
を分取し 5X CellTiter-Glo® Substrate を 20µl 添加し、混和した。各タイ
ムポイントで測定したサンプル数は 4 つ
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
3
10
3T3 Cells
1
3
10
A-12 Cells
Cell Number (x 103)
CellTiter-Glo Assay と従来法との比較
従来法は細胞内酵素によりテトラゾリウム塩 WST-1 から変換したホルマザ
ン産物を測定。NIH3T3 および A-12（PARP-1 欠損）を表示量 96 ウェルプ
レートに播種した
（100µl）。CellTiter-Glo® Reagent (100µl) または WST-1 (10
µl) を添加、混和し、インキュベーションした後に発光または吸光度を測定
した。各測定は 4 ウェルずつ行い、細胞を含まないバックグランド値は差
し引かずに計算した。
®
製品名
サイズ
カタログ番号
価格（￥）
CellTiter-Glo® Assay
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay
10ml
G7570
13,000
10X10ml
G7571
55,000
100ml
G7572
49,500
10X10ml
G7573
418,000
・10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで
400 ウェル分。
・バルク注文については弊社までお問い合わせください。
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/celltitglo.html
14
4146MA05_3A
Luminescence
No Inhibitor
シグナル伝達ガイド
細胞メタボリズム
Cell Based
CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay
Cell Based
プロテアーゼマーカーによる新しい細胞毒性試験
CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay は、細胞集団中の死細胞数を測定するための発光アッセイシステムで、死細胞由来プロテアーゼ
活性を細胞毒性のマーカーとして使用します。発光性細胞非透過性ペプチド基質（AAF-aminoluciferin）は、細胞膜の完全性を
In Vitro
失った細胞から放出される死細胞由来プロテアーゼ活性を測定するために使用します。遊離したアミノルシフェリンは、アッセイ
試薬に含まれるUltra-Glo™ Recombinant Luciferaseにより生じるグロータイプの発光として測定されます。AAF-aminoluciferin
substrateは、生細胞のインタクトな細胞膜は透過できないため、生細胞集団からシグナルは生じません（検出限界以下）。本製品
に添付される細胞溶解剤を加えることにより、各アッセイウェル内の総細胞数に応じた発光シグナルを得ることもできます。その
ため、この総細胞数の発光値から死細胞の発光シグナルを差し引くことにより生存性を算出することもできます。CytoTox-Glo™
Assayは、細胞生存性を測定する他の方法と非常に良く相関します。
･高感度：少数の死細胞を検出（10 個）できるため初期ネクロー
シスも観察できます。
･デュアルアッセイ：同一サンプルから死細胞と生細胞を計測可
能（全溶解プロトコル）。生細胞の減少による裏付けにより、安
定で正確なデータを提示。
･簡便＆迅速：細胞に試薬を加えて 15 分後に測定。
･簡便： 1 種類の試薬を添加するだけのホモジニアスな添加 - 混
和 - 測定プロトコル（全溶解プロトコルでは 2 液）。
･発光法：安定な発光測定により蛍光物質による干渉問題が排除
され、擬陽性も低減。
CytoTox-Glo™ Assay
2,000
Fluorescent LDH Assay
1,500
1,000
500
0
6802MA
Signal to Noise Ratio
2,500
0
2,500
5,000
7,500
10,000
Dead Cells/Well
LDH 蛍光アッセイ法に較べ優れた CytoTox-Glo ™ Assay の感度、
ダイナミックレンジ
500,000
総細胞数
溶解剤の添加
Luminescence (RLU)
400,000
300,000
死細胞数
200,000
100,000
0
15
30
45
60
Time (minutes)
6693MA
生存性100%コントロール
0
細胞毒性と生存性の連続測定
製品名
サイズ
カタログ番号
価格（￥）
CytoTox-GloTM Assay
CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay
10ml
G9290
16,500
5X10ml
G9291
67,000
2X50ml
G9292
103,500
・10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで
400 ウェル分。
・バルク注文については弊社までお問い合わせください。
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/cytotoxglo.html
全溶解プロトコルによる細胞毒性と生存性の測定例
15
関連製品
Signaling
シグナル伝達研究サポート製品
製品名
サイズ
カタログ番号
価格（￥）
阻害剤
MEK Inhibitor U0126
SB 203580
PD 98059
LY 294002
Olomoucine (cdc2 Protein Kinase Inhibitor)
Olomoucine (cdc2 Protein Kinase Inhibitor)
cAMP-Dependent Protein Kinase Peptide Inhibitor
Myristoylated Protein Kinase C Peptide Inhibitor
InCELLect™ AKAP St-Ht31 Inhibitor Peptide
InCELLect™ St-Ht31P Control Peptide
5mg
1mg
5mg
5mg
0.5mg
10mg
1mg
1mg
150μl
150μl
V1121
V1161
V1191
V1201
V2372
V2373
V5681
V5691
V8211
V8221
32,000
20,000
20,000
20,000
9,000
36,000
24,000
10,000
45,000
45,000
500μl
500μl
5mg
1mg
V6411
V6421
V1171
V1181
6,000
6,000
20,000
15,000
基質
cdc2 Protein Kinase Peptide Substrate
Kemptide (PKA) Peptide Substrate
Neurogranin28-43 (PKC) Peptide Substrate
Casein Kinase II Peptide Substrate
DNA-Dependent Protein Kinase Peptide Substrate
Casein Kinase I Peptide Substrate
cGMP-Dependent Protein Kinase Peptide Substrate
1mg
1mg
1mg
1mg
1mg
1mg
1mg
V2211
V5601
V5611
V5661
V5671
V7441
V7451
31,000
5,500
20,000
23,000
30,000
25,000
32,000
酵素
キナーゼ
cAMP-Dependent Protein Kinase, Catalytic Subunit
cGMP-Dependent Protein Kinase (α-Isozyme)
Protein Kinase C
EGF Receptor
Casein Kinase II
Casein Kinase I
DNA-Dependent Protein Kinase
ホスファターゼ
Protein Phosphatase-2A
Protein Phosphatase-2B
2500U
6000U
2x0.5µg
10U
100U
100U
2500U
V5161
V5171
V5261
V5551
V5621
V5631
V5811
25,000
25,000
68,000
66,000
22,000
22,000
23,000
25U
10U
V6311
V6361
59,000
20,000
40μl
50μl
40μl
40μl
120μl
100μl
1 セット
40μl
40μl
V8031
V8081
V1141
V7931
V7932
V1211
V3281
V1111
G7441
65,000
65,000
35,000
65,000
130,000
65,000
46,000
65,000
45,000
抗体
Anti-ACTIVE® MAPK pAb, Rabbit, (pTEpY)
Anti-pT183 MAPK pAb, Rabbit
Anti-ERK 1/2 pAb, Rabbit
Anti-ACTIVE® JNK pAb, Rabbit, (pTPpY)
Anti-ACTIVE® p38 pAb, Rabbit, (pTGpY)
Anti-ACTIVE® MAPK Family Sampler
Anti-ACTIVE® CaM KII pAb, Rabbit, (pT286)
Anti-pS473 Akt pAb
サイズ
カタログ番号
価格（￥）
キナ－ゼ＆ホスファターゼアッセイシステム
活性剤
cGMP, 1mM
cAMP, 1mM
PMA
4α-PMA
製品名
キナーゼアッセイ（蛍光）
ProFluor® PKA Assay
4 プレート分
8 プレート分
4 プレート分
8 プレート分
120 回分
120 回分
V1240
V1241
V1270
V1271
V5330
V5340
127,000
220,000
127,000
220,000
53,000
53,000
SignaTECT® cdc2 Protein Kinase Assay System
96 回分
V6430
50,000
SignaTECT® Protein Tyrosine Kinase (PTK) Assay System
96 回分
V6480
59,000
SignaTECT® Protein Kinase C (PKC) Assay System
96 回分
V7470
50,000
SignaTECT® cAMP-Dependent Protein Kinase (PKA)
Assay System
96 回分
V7480
50,000
ProFluor® Src-Family Kinase Assay
PepTag® Non-Radioactive PKC Assay
PepTag® Non-Radioactive cAMP-Dependent Protein
Kinase Assay
キナーゼアッセイ（RI）
SignaTECT® DNA-Dependent Protein Kinase Assay System
96 回分
V7870
50,000
SignaTECT® Calcium/Calmodulin-Dependent Protein
Kinase (CaM KII) Assay System
ホスファターゼアッセイ（蛍光）
96 回分
V8161
50,000
4 プレート分
8 プレート分
4 プレート分
8 プレート分
V1280
V1281
V1260
V1261
127,000
220,000
127,000
220,000
Serine/Threonine Phosphatase Assay System
96 回分
V2460
52,000
Tyrosine Phosphatase Assay System
96 回分
V2471
52,000
10 回分
G9451
180,000
10ml
50ml
10ml
50ml
G8501
G8502
G8350
G8351
60,500
247,500
60,500
247,500
5µg
5µg
5µg
100µg
25µg
25µg
100µg
10µg
5µg
G1491
G1501
G2781
G5021
G5071
G5111
G5141
G5241
G5591
54,000
54,000
54,000
22,000
42,000
43,000
49,500
44,000
32,000
ProFluor® Tyrosine Phosphatase Assay
ProFluor® Ser/Thr Phosphatase Assay
ホスファターゼアッセイ（発色）
プロテアーゼアッセイ
プロテアーゼアッセイ（蛍光）
Protease-Glo™ Assay
Calpain-Glo™ Protease Assay
DPPIV-Glo™ Protease Assay
（ジペプチジルペプチダーゼ IV）
成長因子
Brain-Derived Neurotrophic Factor (rhBDNF)
Neurotrophin-3 (rhNT-3)
Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (rhGDNF)
Epidermal Growth Factor (rhEGF)
Fibroblast Growth Factor, Basic (rhFGF, Basic)
Insulin-Like Growth Factor-I (rhIGF-I)
Nerve Growth Factor, 2.5S (mNGF, 2.5S)
Tumor Necrosis Factor-α (rhTNFα)
Interleukin-4 (rhIL-4)
日本語 Web site：www.promega.co.jp
テクニカルサービス　● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : [email protected]
プロメガ株式会社
販売店：
本　社　〒103-0011
東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル
Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982
大阪事務所　〒532-0011
大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室
Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052
※製品の仕様、価格については2009年10月現在のものであり予告なしに変更することがあります。
PK0910-01

Download Report