i nnovation アジレント 2100 バイオアナライザを 用いた RNAi 効果のチェック アジレント 2100 バイオアナライザには、電気泳動システム 【操作の概要】 とセルアッセイシステムが用意されています。電気泳動用の siRNA のCy5 標識は Label IT ® siRNA TrackerTM CyTM5 Kit を カートリッジをフローサイトメトリー用のカートリッジに交 用いて行い、キットに添付の Trans IT ®-TKO を用いてトラン 換することにより、細胞の簡易型フローサイトメトリーアッ スフェクションを行った。Cy5 siNC の細胞内への取り込み セイを行うことができます。 量は、以下のようにして測定した。トランスフェクションの ここでは、アジレント 2100 バイオアナライザの 2 つのシス 24 時間後に Calcein-AM で細胞を染色した後、細胞を回収 テムについて簡単にご説明するとともに、セルアッセイシス し、アジレント2100 バイオアナライザ・セルアッセイシステム テムを用いて siRNA のトランスフェクション条件の設定と を用いて生細胞に由来する緑色蛍光とCy5 siNC に由来する RNAi 効果の確認を行った実験例をご紹介します。 赤色蛍光を測定し、生細胞にゲートをかけて Cy5 の取り込 ＊アジレント 2100 バイオアナライザシステムは Agilent Technologies 社の製品です。 み量（Cy5 mean）をモニターし、データ解析を行った。 （1）siRNAトランスフェクション試薬の添加量の検討 ■アジレント2100 バイオアナライザの電気泳動システム siRNA 濃度を10 nMに固定し、24 well プレートでトランスフェ DNA や RNA、タンパク質の電気泳動および解析を全自動で クション試薬（Trans IT ®-TKO）量を 1 ∼ 5 µl/well の範囲で 行うことができます。これまで別々の装置で行われていたゲ 変えた条件でトランスフェクション実験を行った。トランス ルの作製から電気泳動、バンドの検出、データ解析までのす フェクション効率をCy5 の取り込み量でモニターした結果を べてを1 台の装置で行うことができます。 図1 に示す。 ■アジレント2100 バイオアナライザのセルアッセイシステム 50 セルアッセイシステムには、1 サンプルあたり20,000 個程度の 40 されており、緑色の蛍光（525 nm）と赤色の蛍光（680 nm）を 検出することができます。ただし、FSC（前方散乱光） 、SSC （側方散乱光）を測定することができないため、細胞は緑色 または赤色の蛍光物質で染色する必要があります。 Cy5 mean 細胞しか含まれていなくても細胞分析が行える機能が搭載 30 20 10 このシステムは、例えば蛍光標識アネキシンV 染色によるア ポトーシスの検出や、緑色蛍光タンパク質（GFP：Green Fluorescent Protein） の発現を指標としたトランスフェクショ 0 293 細胞 10 nM （control） 1μl ン効率のモニタリングなどに利用できます。 10 nM 3μl 10 nM 4μl 10 nM 5μl siRNA 添加量（上） Trans IT®-TKO 添加量（下） 専用のセルアッセイキットには専用チップと分析に必要な試 薬が含まれており、1 チップで最大 6 サンプルを分析でき、 10 nM 2μl 図1 siRNAトランスフェクション試薬の添加量の検討 1 チップの分析に必要な時間は約 24 分です。 siRNA の使用濃度が 10 nM の場合、Trans IT ®-TKO の使用 ■ siRNA のトランスフェクション条件の検討 量が 2 µl 以上であれば siRNA の導入量は変わらないことが siRNA のトランスフェクション実験では、最初に目的の細胞 わかりました。 ごとにトランスフェクション試薬の量とsiRNA の濃度を最適 化する必要があります。ここでは、293 細胞のmRNA に対し て作用しない配列の siRNA を Cy5 で標識し、この Cy5 標識 （2）siRNA の濃度とsiRNAトランスフェクション試薬の 添加量の検討 siRNA（以下 Cy5 siNC と略記）を 293 細胞に Trans IT ®-TKO 次に示す2 つのパターンでsiRNA 濃度とTrans IT ®-TKO 添加 を用いて種々の条件でトランスフェクションし、最適な条件 量を変えて最適な条件を検討した。 を検討した実験を例として示します。なお、この系では、Cy5 ① siRNA 10 nM に対して Trans IT ®-TKO を 3 µl とすること siNC の導入によってmRNA がノックダウンされることはなく、 を基本にして、その比率を一定にして両者の量を同時に トランスフェクション効率のみをモニターすることになります。 変動させた。 8 ● BIO VIEW No.46 i nnovation siRNA：Trans IT ®-TKO ＝ 5 nM：1.5 µl、10 nM：3 µl、 図 3-A、B より、Cy5 標識したsiRNA も非標識のsiRNA と同 15 nM：4.5 µl、20 nM：6 µl、25 nM：7.5 µl 等のRNAi 効果（ノックダウン効果）を示すことが確認されま に示します。いずれの場合も siRNA の濃度の上昇に伴い、 siRNA の細胞への取り込みが増大することが分かりました。 顕微鏡観察をしたところ、①の場合では高濃度の siRNA と 高容量の Trans IT ®-TKO を用いた条件では細胞毒性が認め られましたが、Trans IT ®-TKO を3 µl に固定した②の場合で は死細胞はほとんど認められませんでした。 以上のことから、テストした範囲のsiRNA 濃度（5 ∼25 nM） とがわかりました。 100 siRNA：Trans IT®-TKO 添加量比一定 Trans IT®-TKO 添加量 3μl 固定 Cy5 mean 80 システムで1,000 events 程度カウントして分析した結果（図 3C）がほぼ一致しており、アジレント2100 バイオアナライザで はより少量のサンプルでも分析が可能なことがわかりました。 また、図 3-C より、Cy5 標識 siGFP の取り込み（▲）の増大に 伴ってGFP 蛍光強度（◆）が減少している（RNAi 効果が増大 している）ことがわかりました。 （A）80 GFP positive cells（%） では、添加する Trans IT ®-TKO の量は 2 ∼ 3 µl 程度でよいこ （図 3 -B）とアジレント2100 バイオアナライザ・セルアッセイ 60 120 100 60 80 60 40 40 20 20 0 0 10 nM siNC pUC18 40 20 10 nM siNC pQBI25 50 nM siNC pQBI25 GFP positive cells 293 細胞 5 nM （control） 10 nM 15 nM 20 nM 25 nM siRNA 添加量 図2 siRNAの濃度とsiRNAトランスフェクション試薬の添加量の検討 ■ RNAi 効果の分析 前述の実験で決定した293 細胞に対するトランスフェクショ ン試薬の量（Trans IT ®-TKO 3 µl）を用いて、実際にノックダ を行った。 なお、コトランスフェクションは、プラスミド導入用試薬 Trans IT ®-293 と siRNA 導入用試薬 Trans IT ®-TKO（3 µl）の 120 80 60 40 40 20 20 0 10 nM 10 nM 50 nM 10 nM 25 nM 50 nM Cy5 siNC Cy5 siNC Cy5 siNC Cy5 siGFP Cy5 siGFP Cy5 siGFP pUC18 pQBI25 pQBI25 pQBI25 pQBI25 pQBI25 GFP positive cells Relative GFP mean （C）80 GFP positive cells（%） 従来型のフローサイトメーター（FACS Vantage）による分析 Relative GFP mean 100 GFP のターゲット配列に対する siRNA（以下 siGFP と略記） ルアッセイシステムで分析し、RNAi 効果を調べた。併せて、 50 nM siGFP pQBI25 60 【操作の概要】 ションし、48 時間後にアジレント2100 バイオアナライザ・セ 25 nM siGFP pQBI25 0 ウン実験を行った例を以下に示します。 と GFP 発現ベクター pQBI25 を 293 細胞にコトランスフェク 10 nM siGFP pQBI25 （B）80 GFP positive cells（%） 0 120 100 60 80 60 40 40 20 20 混合液を用いて、Trans IT ®-TKO のコトランスフェクション プロトコールに従って行った。 実験には、種々の濃度（10∼50 nM）の Cy5 標識または非標 識の siGFP を用い、またネガティブコントロールとして前述 Relative GFP mean（%） 上記の条件でトランスフェクション実験を行った結果を図 2 FACS Vantage で 10,000 events カウントして分析した結果 Relative GFP mean（%） 5 nM、10 nM、15 nM、20 nM、25 nM と変動させた。 した。 0 0 Relative GFP or Cy5 mean（%） ② Trans IT ®-TKO の添加量を3 µl に固定し、siRNA の濃度を 10 nM 10 nM 50 nM 10 nM 25 nM 50 nM Cy5 siNC Cy5 siNC Cy5 siNC Cy5 siGFP Cy5 siGFP Cy5 siGFP pUC18 pQBI25 pQBI25 pQBI25 pQBI25 pQBI25 GFP positive cells Relative GFP mean Relative Cy5 mean の、mRNA に作用しない siRNA（siNC）を用いた（表 1） 。Cy5 標識 siRNA を用いた場合の分析にはFACS Vantage（図 3-B） およびアジレント2100 バイオアナライザ・セルアッセイシステ ム（図 3-C）を、非標識 siRNA を用いた場合の分析にはFACS Vantage（図 3-A）を用いた。 図3 RNAi 効果の分析 （A）非標識 siRNA を使用、FACS Vantage で分析。 （B）Cy5 標識 siRNAを使用、FACS Vantage で分析。 （C）Cy5 標識 siRNA を使用、アジレント2100 バイオアナライザ・セルアッセイ システムで分析。 BIO VIEW No.46 ● 9 i nnovation 表1 実験で使用したプラスミドとsiRNA プラスミド Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 Sample 7 Sample 8 Sample 9 Sample 10 Sample 11 Sample 12 pUC18 ＊1 pQBI25 ＊1 pQBI25 pQBI25 pQBI25 pQBI25 pUC18 pQBI25 pQBI25 pQBI25 pQBI25 pQBI25 ■おわりに ご紹介した実験例からわかるように、アジレント2100 バイオ siRNA siRNA NC ＊2 NC NC GFP GFP GFP NC NC NC GFP GFP GFP 蛍光標識 添加濃度 なし なし なし なし なし なし Cy5 Cy5 Cy5 Cy5 Cy5 Cy5 10 nM 10 nM 50 nM 10 nM 25 nM 50 nM 10 nM 10 nM 50 nM 10 nM 25 nM 50 nM アナライザ・セルアッセイシステムを用いることによって、 siRNA のトランスフェクションに用いる試薬の最適条件を検 討することができ、また従来のフローサイトメーターと比較 して、より少量のサンプルで同等の精度で RNAi 効果の分析 を行うことができます。 ＊1：pQBI25 はGFP を発現するプラスミド。pUC はGFP を発現しないプラス ミド（コントロール） 。プラスミドの量はすべて 0.5 µg。 ＊2：NC はネガティブコントロール ■関連製品 製品名 Code 容量 価格 V7200 V7201 V7202 V7203 V7204 V7205 Labels 50 µg Labels 50 µg Labels 50 µg Labels 50 µg Labels 50 µg Labels 50 µg ¥69,000 ¥69,000 ¥63,000 ¥63,000 ¥63,000 ¥63,000 V2150 V2110 V2300 V2400 V2700 V2750 V2900 V2170 V2180 VR2190 V2140 V2120 V2130 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 1 ml ＊1 ¥67,000 ¥70,000 ¥30,000 ¥46,000 ¥52,000 ¥52,000 ¥57,000 ¥56,000 ¥56,000 ¥56,000 ¥56,000 ¥56,000 ¥56,000 AG3140 AG3141 AG3142 AG3143 AG3148 AG4488 AG4486 一式 一式 一式 一式 一式 1 キット 1 キット ¥2,975,000 ¥3,151,000 ¥3,140,000 ¥3,316,000 ¥856,000 ¥57,000 ¥25,000 【siRNA の標識・細胞内導入・トラッキング用キット】 Label IT ® siRNA TrackerTM CyTM3 Kit Label IT ® siRNA TrackerTM CyTM5 Kit Label IT ® siRNA TrackerTM CX-Rhodamine Kit Label IT ® siRNA TrackerTM TM-Rhodamine Kit Label IT ® siRNA TrackerTM Biotin Kit Label IT ® siRNA TrackerTM Fluorescein Kit 【siRNA およびプラスミド導入用試薬】 Trans IT ®-TKO Trans IT ®-siQUEST NEW Trans IT ®-LT1 Trans IT ®-LT2 Trans IT ®-293 Trans IT ®-Keratinocyte Trans IT ®-HeLaMONSTER Trans IT ®-CHO Trans IT ®-3T3 Trans IT ®-COS Trans IT ®-Neural Trans IT ®-Jurkat Trans IT ®-Prostate ＊2 【アジレント2100 バイオアナライザおよび関連製品】 アジレント2100 バイオアナライザ電気泳動 デスクトップシステム アジレント2100 バイオアナライザ電気泳動 ノートシステム アジレント2100 バイオアナライザセルアッセイ デスクトップシステム アジレント2100 バイオアナライザセルアッセイ ノートシステム アジレント2100 アプリケーション（セルアッセイ）追加セット セルアッセイキット セルアッセイチェックキット ＊1： 1 ml 包装のほかに、0.4 ml、1 ml × 5、1 ml × 10 包装のものもあります。 ＊2：本システムのパンフレットをご用意しております。各販売課へお問い合わせください。 10 ● BIO VIEW No.46
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