プロダクトブリテン ® BigDye Direct Cycle Sequencing Kit 正確な DNA シーケンスへの最短ルート BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit 高精度な FAST PCR ダイレクトシー ケンシングワークフロー • わ ず か な 手 作 業 ̶ PCR 後 の 精 製 と シーケンシング反応を 1 ステップに。 • 1 チューブで反応 ̶ 試薬を加えていく だけで PCR からキャピラリ電気泳動 までのすべてのステップを完了。 • シ ン プ ル な ワ ー ク フ ロ ー ̶ M13 universal primer で分注作業を簡単に。 • 短時間で高精度なデータ ̶ POP-7TM ポリマーで電気泳動時間を短縮し、且 DNA シ ー ケ ンシング も 他 の テクノロ プが無くなり、時間を節約し、取り違え ジーと同様、劇的な変貌を遂げてきまし などの操作ミスの可能性を減らします。 た。 Applied Biosystems® の DNA シー また、すべてのステップが１本のチュー ケンサが登場して 20 年以上にわたり、 ブで完結するので、実験のステップを追 ® つプライマー 直後 の 1 ベ ース目から BigDye ケミストリを用いた DNA シー 読み取り可能。 ケンシングは、世界中の多くのラボで実 施されています。ライフテクノロジー ズは絶えずイノベ ーションを進めるこ とで、新しい試薬セットを開発しました。 BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit は、現在の PCR ダイレクトシーケンシン グのワークフローに大幅な改良を加え、 ステップ数や手間、操作時間を減らした 跡することが容易になりました。 BigDye® Direct ワークフローで使用す る PCR プライマー * は、M13 の配列を 付加した M13 tailed プライマーペアを用 います。このプライマーペアと BigDye® Direct PCR マスターミックスで反応す ることにより、すべての PCR 産物は、末 端に M13 プライマーの結合サイトが付 試薬セットです （図 1 および 2） 。この PCR 加 さ れ ま す 。 こ れ に より、す べ て の ダイレクトシーケンシングのために最適 PCR 産物は、キットに付属された M13 化された試薬セットは解析時間を短縮し、 フォワードおよびリバースの ユニバー プライマー 直後から全域に渡って正確 サ ルプライマーペアを使ってシーケン なシーケンスデータを提供します。 シングが可能となります。 1 種類のプラ イマーペアのみでシーケンシング反応 シンプルなワークフロー ® の準備ができるので、シーケンスのセッ BigDye Direct Cycle Sequencing Kit トアップ時のエラーの可能性を減らし、 は、PCR 後の精製用試薬とシーケンシ スループットをより向上させることが可 ング用試薬が 1 本のマスターミックスと 能になりました。 なっており、PCR 後の反応液に直接加 えることができます。これにより既存の Sanger 法によるシーケンシングワーク フローをよりシンプルにします（図 1）。 PCR 後の精製とサイクルシーケンシン グを 1 つにすることで、移し換えのステッ *PCR プライマーはユーザーの DNA ターゲッ ト領域に特異的なデザインを使用するため、 BigDye® Direct Kit では提供されませ ん。 PCR プライマーには M13 配列を付加する 必要があります。 PCR 反応 精製 & シーケンシング反応 シーケンシング反応後の精製 電気泳動 Forward Sequence + BigDye® Direct PCR Master Mix + M13-tailed primer pair + BigDye® Direct Sequencing Master Mix + BigDye® Direct M13 Fwd primer + SAM™ 溶液 + XTerminator® 溶液 + BigDye® Direct Sequencing Master Mix + BigDye® Direct M13 Rev primer + SAM™ 溶液 + XTerminator® 溶液 Reverse Sequence + BigDye® Direct PCR Master Mix + M13-tailed primer pair BigDye® Direct PCR マスターミック スと M13 配列を付加したターゲット領 域を増幅するための M13tailed プライ マーペアをテンプレート DNA に加え、 PCR 反応液（10μL）を調製（20 分）。 PCR 後、BigDye® Direct Sequencing マ スタ ー ミックスと BigDye® Direct M13 プライマーで調製したシーケンシ ング反応ミックス 3μL を同じ反応チュー ブに加える（10 分）。 PCR 後 の 精製と BigDye® Direct シ ー ケ ンシング 反 応 後、BigDye XTerminator® 精製キットの試薬を 同じ反応チューブに加える （20 分）。 PCR 増幅（64 分） PCR 後の精製とシーケンシング反応（80 分） ボルテックス（20 分） ジェネティックアナライザに POP-7TM ポリマーを準備し、サンプルをセット （10 分）。 キャピラリ電気泳動（65 分） 図 1. 1 本 のチューブで 反応を行うシンプ ル なワークフロー BigDye® Direct シー ケンシングワークフロー では、BigDye® Direct PCR マスター ミックスを用いて 10μ L の PCR 反応を実施するところから始まります。 PCR 反応後、3μ L のシーケンシングミックス（BigDye® Direct シーケンシングミック スと PCR 後の精製試薬が含まれます）と、シーケンス用 M13 プライマーを直接チューブに加えることで、PCR 後の精製とシーケンシングを１つのステップ で行います。最後に、BigDye XTerminator® 精製キット（別売品）を直接チューブに加えシーケンシング産物の精製を行い、そのプレートを直接ジェネ ティックアナライザにかけて電気泳動を行います。 また、POP-7TM ポリマーを使用することにより、BigDye® Direct 高いパフォーマンスを実現 ® BigDye Terminator サイクルシーケンシングのケミストリは、 Cycle Sequencing Kit はプライマー直後の 1 ベース目から高 この 20 年間で標準的な手法として確立されました。BigDye® 分解能のシーケンスデータを提供し、キャピラリ電気泳動に Direct Cycle Sequencing Kit も例外ではありません。BigDye® Direct Kit はゴ ー ルドスタンダ ードで ある AmpliTaq Gold® UP 酵素を採用し、ホットスタートの機能により非特異な増幅 を抑え、1 時間程で PCR のステップが完了するように最適化 されています。 かかる時間も短縮します（図 3）。 5′ 側の Mobility を改善する ことで、ベースコールの精度が向上し、シーケンスデータを マニュアルで再解析しなければならないケースも減少します （図 4）。また、シーケンシング反応では、M13 universal primer ペアを使用するので、分注作業などにおけるスループットを より加速することが可能です。 POP-7TM ポリマーを用いる BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit のワークフロー 4 つのステップで所要時間は約 5 時間です。 PCR 増幅 84 min PCR 産物の精製と シーケンシング反応 精製 90 min 40 min 電気泳動 75 min POP-6TM ポリマーを用いた従来のサイクルシーケンシングのワークフローの一例 5 つのステップの所要時間は約 8 時間です。 PCR 産物の PCR 増幅 精製 シーケンシング 反応 140 min 60 min 90 min 精製 50 min 電気泳動 145 min 図 2. 標準的なシーケンシングと BigDye® Direct Kit のワークフローの比較。 従来のシーケンシングのワークフローでは、5 つのステップの処理を完了す るまでに 8 時間以上が必要でした。一方、BigDye® Direct の一般的なワークフローで必要なのは、4 つのステップでたった 5 時間です。その結果、操作時間 を減らしシーケンス読み取りを 40% スピードアップします。 [PCR やシーケンシングのステップには、試薬の分注操作の時間や Veriti® サーマルサイクラー による反応時間が含まれます。] 利便性の向上 ライフテクノロジーズのすべての BigDye® サイクルシーケン シング製品は、幅広いシーケンシングアプリケーションにおい BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit は、Applied Biosystems® 3130、3130xl、3500、3500xL、3730、3730xl のシーケンシン て安定した高品質のデータを提供し、シーケンシングケミスト グプラットフォームでの使用がサポートされており、また、シー リのゴールドスタンダードとして認識されています。 BigDye® ケンシング反応後には、BigDye XTerminator® 精製キットも使 Direct Cycle Sequencing Kit は、この BigDye® テクノロジー 用可能です。 BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit は、あな を元に生み出されました。このキットで使用されるワークフロー たのラボにある既存の機器で使用でき、使用するために新た には、PCR マスターミックス、シーケンシングマスターミック に費用を投じる必要はありません。お使いのジェネティックア ス（PCR 後の精製とサイクルシーケンシング反応を 1 ステップ ナライザでわずかなソフトウェアのアップデートを行うのみです。 で行います）、コントロール DNA、M13 ユニバーサルシーケ それだけで、BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit を既存の ンシングプライマー（フォワードおよびリバース）が含まれます。 研究ルーチンに容易に組み込むことができ、新たな試薬が提 これらすべてが最高のパフォーマンスをするようにデザイン 供するメリットをすべて利用することができます。 されており、さまざまな試薬を分注、調製する作業や、ラボで 行わなければならない最適化のための実験の回数も減らせ ます。 また、しっかりと品質管理 が 行 わ れて いる BigDye® Direct PCR マスターミックスとシーケンシングマスターミッ クスによって、再現性が保証され、実験間のばらつきも最小に パネル33 Panel 図 3. BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit は、5′ 側のプライマー直後か ら高精度に解析することができます。POP-7TM ポリマーは、POP-6TM ポリマー と比較して電気泳動の時間を短縮するために開発されましたが（ 145 分を 75 分に短縮）、シーケンシングプライマー 直後の最初の 20 から 30 ベース の分解能に影響を与える可能性があります （パネル 3）。 BigDye® Direct Kit の M13 ユニバーサルシーケンシングプライマーペアおよび最適化され たケミストリは、POP-7TM ポリマーを使用して電気泳動を行った場合でも、 シーケンシングプライマー近傍のベースコールを高品質に行うことを可能 にします（パネル 1）。分解能は BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit v1.1 と POP-6TM ポリマーを使用した場合と概ね同等かそれ以上です （パネル 2）。 パネル Panel 11 パネル Panel 2 パネル Panel22 パネル Panel 11 抑えることができます。 図 4. POP-7 TM ポリマ ー を 使用した 正確 な ベ ー スコ ーリング BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit v1.1 で 反応し、POP-6TM ポリマ ー を 側の C/A あるいは A/G で時々モビリティ 使って解析したサンプルでは、5′ シフトが生じることがあり、不正確なベースコールになる場合があります 側の （パネ ル 1）。 BigDye® Direct Kit で解析を行ったサンプ ルでは、5 ′ モビリティが改善するので、正確なベースコールができるようになります （パネル 2）。 1キットあたりの反応数 P/N サイズ 24反応 4458689 100反応 4458687 1000反応 4458688 プロトコール 品名 BigDye® Direct Sequencing Kit Protocol* www.appliedbiosystems.jp/website/BDD BigDye® Direct Sequencing Kit Quick Reference Card* www.appliedbiosystems.jp/website/BDD 上記 URLよりダウンロードをしてください。 ＊ ソフトウェアアップデート（無償） 品名 BigDye® Direct Installer* 上記 URLよりダウンロードをしてください。 ＊ 詳細はｗｗｗ.appliedbiosystems.jp もしくはお近くの代理店にお問い合わせください。 Life Technologies offers a breadth of products DNA | RNA | PROTEIN | CELL CULTURE | INSTRUMENTS 4/2011, DNP021-A1104OB www.appliedbiosystems.jp/website/BDD
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