実践的な免疫組織染色の方法 ~特に酵素抗体法を中心に~ 病理診断学 常山幸一、野本一博、林伸一、三輪重治、西田健志、八田秀樹 免疫染色 組織標本の中にある、或る“タンパク質”の場所を目で 見えるようにするための方法。 目的とするタンパク質＇抗原（にだけくっつく事ができる 物質＇抗体（を使う。 抗体＝抗原とくっつく 抗原＝タンパク質 簡単な原理 １（まず抗原に抗体＇一次抗 体（がくっつく ２（くっついた一次抗体に特 異的にくっつく二次抗体を applyする。 抗原 • 二次抗体が蛍光標識され いれば蛍光で光っている 場所に抗原が存在 • 二次抗体に酵素が付いて いれば、基質で様々な色 に発色＇酵素抗体法（ 酵素抗体法の場合 酵素と基質の組み合わせを変えれば、見たいものを何色 にすることもできる。 Peroxidase ⇒ DABで茶色 AECで赤色 アセトニトリルで黒青色 など Alkaline Phosphatase ⇒ Fast Redで赤色 Fast blueで青色 など Peroxidase＇PO)の基質 Alkaline Phosphatase＇AP) の基質 酵素と基質の組み合わせを変える事で何重染色も可能に！ ~特に、異なる細胞にそれぞれ標的とする抗原が存在する場合に有用~ ＇但し、一つの染色を終えるたびに、それまでにapplyした抗体を wash outしたり、変性させたりする必要あり（ しかし実際にはうまくいかない事も多い………….. 原因（ •抗原が壊れてしまっている 修復不能 •抗原がマスクされてしまっている 抗原賦活ができる事も •抗体が免疫染色に不適である どうしようもない＇事が多い（ •抗体の結合性が弱い 感度を上げてみる × 抗原賦活の方法 抗原賦活液 クエン酸バッファー TRS溶液 Immunosaver L.A.B. Solution など 熱をかける オートクレーブ 圧力釜 電気ポット 酵素処理を行う Pepsin処理 Protease K 処理 Hyarulonidase 処理 ＇室温~３７℃、3-30分（ Immunosaverのホームページより引用 DAKO のPascal 電子レンジ用のPressure cooker 感度を上げる工夫 蛍光抗体法＜＜酵素抗体法 ABC法 LSAB法 ポリマー法 iAEP法 抗原抗体反応の強化・時間短縮＇マイクロウエーブ、超音波など（ ABC法(avidin-biotinylated peroxidase complex) 一次抗体を反応した後にビオチン標識二次抗体を作用させ、 引き続き標識酵素を反応させる３ステップ法。 直接法に比べて感度が高いが、LSABやポリマー法には敵わ ない。 注意（ 熱による抗原賦活化処理で内因性ビオチンの非特異 的反応が起こる LSAB法(labeled streptavidin biotinyated antibody) 基本的にはABC法と同様であるが、ビオチンと酵素標識ストレプ トアビジンの両者はきわめて親和性が高く非可逆的な結合性を示 し、更なる高感度が得られる。キット商品も多数市販されている。 注意（ ABC法同様、熱による抗原賦活化処理で内因性ビオチン の非特異的反応が起こる 標識酵素ポリマー法 従来の間接法と比較して著しく高感度で汎用性が高い。２ステッ プ法なので短時間に反応が終了できる。 アビジンビオチン反応とは無関係なので内因性ビオチンによる非 特異的反応がない。 Envision method (DAKO) (hyper-sensitive polymer method) 1.Apply primary antibody 2.Apply peroxidase-Envision 3.Apply substrate for color (DAB) Quick (three steps) & Sensible Standard method for the routine immunostaining! DAKO Envision マウス一次抗体用 ラビット一次抗体用 マウス＆ラビット用 Peroxidase標識 Peroxidase標識 Peroxidase標識 マウス＆ラビット Alkaline Phosphatase標識 ニチレイ ヤギ一次抗体用Peroxidase標識 ラット一次抗体用Peroxidase標識 iAEP法 iAEP法 DAKO社のホームページより 自験例 抗原抗体反応をマイクロウエーブを用いて迅速化する方法 Standard immunostaining procedure Specimens are placed in a 60℃ oven beforehand. ① Deparaffinization (5 min) ② Antigen retrieval (microwave; 10 min; enzyme; 6 minutes) ③ Rinsed in running water ④ 100% methanol with 3% H2O2 (5 min) ⑤ Rinsed with running water, distilled water, and TBS-Tween ⑥ Soaked in TBS with 5% BSA (5min) ⑦ Exposure to the primary antibody ( 60 min-over night) ⑧ Rinsed in TBS with shaking (5min) ⑨ Application of the secondary antibody (Envision or Simple Stein) ( 60 min-over night) ⑩ Rinsed in TBS with shaking (5 min) ⑪ Immersed in DAB/H2O2 solution (5-15 min) ⑫ Rinsed in TBS and running water ⑬ Counterstaining Dehydration, mounting and cover slipping It takes more than 3 hours (~one day!) One-hour immunostaining procedure Specimens are placed in a 60℃ oven beforehand. ① Deparaffinization (5 min) ② Antigen retrieval (microwave; 10 min; enzyme; 6 minutes) ③ Rinsed in running water ④ 100% methanol with 3% H2O2 (5 min) ⑤ Rinsed with running water, distilled water, and TBS-Tween ⑥ Soaked in TBS with 5% BSA (1 min) ⑦ Exposure to the primary antibody with intermittent irradiation (10 min) ⑧ Rinsed in TBS with Tween with shaking (1 min) ⑨ Application of the secondary antibody (Envision or Simple Stein) with intermittent irradiation (10 min) ⑩ Rinsed in TBS with shaking (1 min) ⑪ Immersed in DAB/H2O2 solution with intermittent irradiation (5 min) ⑫ Rinsed in TBS and running water ⑬ Counterstaining Dehydration, mounting and cover slipping Comparison between standard procedure and ours Step 7 Standard procedure Exposure to the primary antibody ( 60 min-over night) Our procedure Exposure to the primary antibody with intermittent irradiation (10 min) Special microwave equipment (MI-77, Azumaya, Tokyo, JAPAN) Variable •Power (100W-500W) •Irradiation time •Intermittent irradiation mode Microwave has voltex effect. Apply red dye on the oil, calmly No MW irradiation (still standing) Not mixed MW irradiation, 5min Mixed Caution! Antibodies are protein, which is easily denatured by high-temperature. Try to decide the best condition for the microwave irradiation 50ｍｌ water on the bottom of moist chamber 200μPBS+５％BSA MW: power 250W, 300W, 350W (continuous irradiation) 50ｍｌ water on the bottom of moist chamber Temperature of the 200μliquid on the slide 35 30 25 20 250w 300ｗ 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 350W; BSA was denatured within 5 minutes. MW: power 250W 50ｍｌ water on the bottom of moist chamber Temperature of the 200μliquid on the slide degree 35 30 25 continuous 5sec-on, 1sec-off 4sec-on, 2sec-off 4sec-on, 3sec-off 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Duration 9 10 11 12 13 14 15 Most suitable condition of irradiation to avoid excessive temperature increase •250W •4-seconds-on and 3-seconds-off Immunostaining of cytokeratin (CK) 5/6 with intermittent microwave irradiation 5min 10min 30min Evaluation of specific positive reaction could be performed correctly in the specimen with 10 min irradiation Advantage of microwave irradiation for antibodies incubation •Incubation time: very short ＇10 min) •Background: clear Non-specific reaction (NS) increase in proportion to incubation period (I.P.) NS=αｘI.P. Immunostaining of CD79a(Lymphnode) Low magnif. High magnif. 10min without MW 10 min with MW 60 min without MW Immunostaining of cancer cells MIB-1 p53 10min without MW 10 min with MW 60 min without MW 同じ事が超音波を用いてできないか？ 抗原抗体反応を超音波を用いて迅速化する方法 複数の抗体で使用可能 ホルマリン固定パラフィン包埋標本で免疫染色がうまくいかない時 1. 2. 3. 4. 抗体のinformation sheetを確認 抗原賦活法を変えてみる より感度の高い方法を検討する 抗原と抗体のインキュベーションにマイクロウエーブや超音波 を試す それでもダメなら 標本の固定法を変える＇ホルマリン⇒４％PFA,アセトンなど（ 抗原維持に優れた各種固定法を試す＇AMEX、HOPEなど（ それでもダメなら 凍結標本でtry 皆さんのご研究で免疫染色が必要になった場合は遠慮 なく相談してください。 診断用、研究用の各種抗体 を所有しています。 試し染色が必要な場合はご 相談ください。 病理診断用の免疫染色は随時行っています。 見学等が必要な場合はご連絡ください。 常山 or 八田まで
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