LAAN-C-XX033 Application Note No. 32 LC/MS を用いたメタボリック・プロファイリング法の応用 — 農産物の生体調節機能の評価 — Application of LC/MS-based Metabolic Profiling Evaluation of Health-promoting Function of Agricultural Products 藤村由紀 *1 三浦大典 *1 割石博之 *1-3 谷川哲雄 *4 立花宏文 *1-3 LifeScience ライフサイエンス 1. はじめに メタボリック・プロファイリング法は，生体内の代謝物を網 メタボリック・プロファイリング法は，複数サンプルの多彩 羅的に測定するメタボローム解析（メタボロミクス）技術の な成分プロファイルを同時に把握できるため，機能性評価の 一つで，複数のサンプル間の代謝物パターン（プロファイル） 有用な解析ツールとなりえることが期待されますが，現在の の類似性や相違性を見出すことができるため，医薬品分野に ところ，食品機能性研究への応用はほとんどなされていませ おいて，バイオマーカー探索や病因解析，薬効・毒性評価な ん。 どへの応用が進められています。また，近年では食品（農林 そこで本稿では，比較的幅広い代謝物の測定で汎用されてい 水産物）の品質管理・鑑定・予測やそれら要因解析の新たな る液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS）を用いたメ 手法として，食品中の低分子量成分（代謝物）を標的とした タボリック・プロファイリング解析によって，農産物の様々 プロファイリング解析が試みられています。 な品種の成分プロファイルを取得し，機能性を有する品種の 食品機能性（三次機能：生体調節機能）研究分野では，食品 識別化や機能性予測モデルの構築，さらには機能性関与成分 のどのような成分・複合成分パターンが生体調節機能に関与 や共存成分バランスの解明を試みた研究例をご紹介します 1)。 するかを高精度に捉える科学的評価法が模索されています。 *1 九州大学 先端融合医療レドックスナビ研究拠点 メタボリック・プロファイリンググループ *2 九州大学 大学院農学研究院 *3 九州大学 バイオアーキテクチャーセンター *4 ㈱島津製作所 分析計測事業部 グローバルアプリケーション開発センター 1 Application Note No. 32 2. 食品機能性研究におけるメタボロミクス技術の有用性と着眼点 メタボロミクス（メタボリック・プロファイリング）は，化 機能性とその多彩な成分プロファイル間の相関関係を計量化 学的性質が異なる様々な分子種（糖，アミノ酸，有機酸，脂 学的アプローチにより導出することで，食品機能性研究で求 質など）の同時計測が可能な技術であるため，多彩な共存成 められる，１）機能性を有する食品素材の発掘，２）食品中 分の複雑な動きを特徴とする食品の性質を包括的に捉えるた の機能性成分の同定（直接的な機能性因子や間接的な機能性 めには極めて有効な手段であり，理論的には，既存の食品機 賦活因子など），３）機能性を享受できる食品の活用法の発見 能性評価法で汎用される単一成分評価法と比べて遥かに多く （食べ合わせや機能性成分の組合せ）などを個別にまたは同時 の有用情報を得ることができます。すなわち，食品が有する に行うことを可能にします（図 1）。 食品の機能性研究に必要なこと 機能性（生体調節機能）を有する食品素材を見つけること 食品中の機能性成分を見つけること 機能性を享受できる食品（成分）の活用法を見つけること 現在の問題点：既存の機能性評価法の多くは単一成分評価系 （食品は複合成分系なので単一系では対応しきれない） 食品 複合成分 複雑な 挙動を 捉える ためには複合成分評価技術が必要！ メタボロミクス （糖・アミノ酸・有機酸等、物性の異なる多様な分子種を対象） 食品中の複雑な成分の状態を捉え、今、何が起こっているかを 正確に捉えるためにはメタボリック・プロファイリング法が有効！ 生体調節機能 の発現 食品成分の有効性や安全性の理解 には共存成分パターン情報が必須 図１ 食品機能性研究の問題点とその解決法 3. 食品を対象とした LC/MS によるメタボローム解析 2 代謝物の網羅的な分析には，種々のクロマトグラフィーによ ています。島津高速液体クロマトグラフ質量分析計 “LCMS-IT- る分離（ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィー） TOF” は，高速スキャンと高速極性切替による分析が可能で， と質量分析による検出とを組合せた分析法が有力なツールと 超 高 速 LC に 適 し た MS で あ り， 島 津 超 高 速 LC“Prominence して用いられており，なかでも液体クロマトグラフィー質量 UFLC” とこれら MS との組合せは，大量の試料を扱うメタボ 分析法（LC/MS）は，不揮発性化合物や低極性から高極性ま ローム解析に適したシステムとなります。さらに，LCMS-IT- での幅広い代謝物に適用できる特徴があります。LC/MS が分 TOF では MSn 分析を用いた精密質量測定により，高精度な組 析対象とするアミノ酸，有機酸，糖などの高極性代謝物やポ 成推定および部分構造情報の取得が可能となるため，プロファ リフェノール類などの二次代謝物は，食品（農林水産物）中 イリングやマーカー探索とともに，未知代謝物の化合物情報 の機能性成分探索の極めて有用なターゲットとして注目され を得るのに有効な装置です。 超高速液体クロマトグラフ “Prominence UFLC” 高速液体クロマトグラフ － イオントラップ － 飛行時間型質量分析計 “LCMS-IT-TOF” ＜特長＞ 高速高分離によるハイスループット分析 高いスキャン感度 高精度 MSn 分析による未知代謝物の化合物情報を取得 4. LC/MS を用いた緑茶品種のメタボリック・プロファイリング解析 4. 1 概要 世界中で広く愛飲されている茶（Camellia Sinensis L. ）には ン酸化抑制活性 , 図 2）の異なる代表的な緑茶品種（42 種類） 多彩な生体調節機能が報告されており，日本で流通・消費さ から分析試料を調製し，Prominence UFLC/LCMS-IT-TOF を用 れている緑茶の約 80% は “ やぶきた ” と呼ばれる単一品種が いて測定しました。得られた測定データを多変量統計解析（主 占めています。しかしながら，“ やぶきた ” 以外にも様々な特 成分分析 / 判別分析 / 回帰分析）に供し，品種間の成分プロ 性を有する緑茶品種が存在しており，これらの特性（今回は， ファイル（共存成分バランス）の違いを明らかにするとともに， 成分プロファイル情報と生体調節機能との相関関係）を把握 機能性予測モデルの構築やその機能性関与成分の同定に成功 するため，生体調節機能（血管内皮機能改善効果：MRLC リ しました。 ストレスなど 循環器系疾患の発症 血管の損傷・病変 血管内皮障害 トロンビン 104.8 75.8 74.4 67.6 66.0 65.5 64.2 62.3 60.8 52.3 45.4 43.2 42.0 40.3 39.4 38.2 37.1 32.6 29.5 28.3 27.9 機能性ランク 品種 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 抑制活性(%) りょうふう べにふうき はつもみじ ふくみどり おくゆたか とよか 印雑 131 こまかげ うじひかり やぶきた ほくめい さえみどり あさひ みなみさやか あさつゆ さやまかおり ごこう ゆたかみどり おおいわせ おくみどり めいりょく 14.4 14.3 9.6 8.4 7.1 5.5 1.0 -4.1 -4.4 -13.9 -24.5 -31.3 -32.6 -33.8 -34.8 -41.0 -42.3 -46.8 -49.2 -85.4 -112.6 MLCP 炎症細胞の浸潤 内皮機能障害 - + + + pMRLC MRLC （活性型） MRLC リン酸化抑制 トロンビン MLCK （不活性型） サンルージュ 抑制活性 (%) サンルージュ 青心大ぱん ふうしゅん みなみかおり たまみどり やまとみどり べにほまれ さやまみどり あさぎり さみどり くりたわせ しゅんめい べにひかり やえほ いずみ するがわせ べにふじ 大葉烏龍 青心烏龍 みねかおり かなやみどり Ca 2+ 内皮透過性上昇 未添加 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 細胞膜 トロンビン刺激亢進 緑茶の42品種の生体調節機能（血管内皮機能改善効果） 機能性ランク 品種 トロンビン受容体 ・ ・ ・ など トロンビン受容体 内皮細胞 平滑筋細胞 トロンビン ・ 高血圧症 ・ 動脈硬化症 ・ 心筋梗塞 やぶきた 血管 P MRLC 細胞骨格の再編（内皮透過性上昇） MLCP : ミオシン軽鎖ホスファターゼ MLCK : ミオシン軽鎖キナーゼ ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるトロンビン 誘導性MRLCリン酸化に及ぼす影響 （サンルージュによりMRLC*のリン酸化が抑制） ＊：ミオシン調節軽鎖 図 2 生体調節機能（血管内皮機能改善効果） LC/MS を用いたメタボリック・プロファイリング法の応用 — 農産物の生体調節機能の評価 — 3 Application Note No. 32 4. 2 実験 4. 2. 1 試料および測定 （ 独 ） 農 業・ 食 品 産 業 技 術 総 合 研 究 機 構 野 菜 茶 業 研 究 所 内 を水で 10 倍希釈後，0.22 µm PTFE フィルターにてろ過し， で 栽 培 さ れ た 42 品 種 の 緑 茶 葉 微 粉 末（ 一 番 茶 , 荒 茶 ）200 Prominence UFLC/LCMS-IT-TOF に供しました（分析条件は mg を 10 mL の 100℃熱水で 10 分間抽出後，遠心濾過した 表 1 を参照ください）。 上澄みを原液サンプルとしました。各種緑茶葉熱水抽出物 表 1 LC/MS 分析条件 装置 ［LC 条件］ カラム 移動相 A 移動相 B グラジエントプログラム 流量 カラム温度 ［MS 条件］ イオン化モード 測定範囲 CDL 温度 HB 温度 Prominence UFLC, LCMS-IT-TOF Luna 5u C18(2) 100A (250 mm L. × 1.0 mm I.D., 5 µm) 0.05% ギ酸水溶液 0.05% ギ酸 / 99.95% メタノール B 濃度 5% (0-2 min) – B 60% (7.5 min) – B100% (17-23 min) – B 5% (24 min) – STOP (30 min) 0.1 mL/min 40℃ ESI (+) m/z 70 - 700 200℃ 200℃ 4. 2. 2 データ解析 データ処理には，ピーク抽出ソフトウェア Profiling Solution タ間で保持時間調整を行いピークのズレの補正が可能です。 Ver.1.1（LCMS-8040，LCMS-8030，LCMS-2020，GCMS- さらに，興味対象のピークについて，各データファイルの QP2010 シリーズなどにも対応）を用いて，MS 分析の結果 クロマトグラムやマススペクトルを一覧表示することがで から得られたピークを自動検出し，各ピーク面積値を用いて きます。取得したピークリストは，統計計算ソフトウェア ピークリストを作成しました。本ソフトウェアは，フィルタ SIMCA-P+ Ver.12（Umetrics 社）に供し，多変量解析を行い リング機能やノーマライズなどの各種演算機能によって多変 ました。 量解析のデータ前処理を行うことができます。また，デー Profiling Solution によるピークリストの作成 4 統計計算ソフトウェアによる 多変量解析 4. 3 結果 4. 3. 1 主成分分析による緑茶品種の代謝物プロファイルの概要 図 3 に LC/MS で検出された 42 品種の代謝物のピークリスト “ やぶきた ” や中程度の効果を示す “ べにふうき ” を含む大き を用いて，主成分分析（PCA）を行った結果（スコアプロット） な集団と最も高い効果を示す品種である “ サンルージュ ” に を示しました。各品種の代謝物プロファイルの相対的な関係 わかれました。この結果は，両グループ間で明らかに代謝物 を見ますと，品種により異なる分布（プロファイル）を示し， プロファイル（共存成分バランス）が異なっていることを示 特に，日本の代表的緑茶品種で血管内皮機能改善効果がない 唆しています。 数字：各品種の機能性ランク 15000 PC2 (10.4 %) % 10000 5000 0 - 5000 - 10000 - 15000 42 やぶきた 4 31 16 12 3 5 22 2 37 24 14 7 25 4021 39 15 20 18 35 28 36 23 34 べにふうき 41 32 26 19 17 6 38 13 10 11 27 30 9 33 8 1 29 - 25000- 20000- 15000- 10000 - 5000 0 サンルージュ 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 PC C 1 ((20.2%) 0 %) 図 3 LCMS による緑茶品種の主成分分析（PCA） 4. 3. 2 機能性の異なる２品種の判別分析による機能性関与成分の抽出 主成分分析の結果から，各品種の生体調節機能と代謝物プ その結果，“ やぶきたとサンルージュ ” および “ べにふうきとサ ロファイルとの間に何らかの関係性があることがわかった ンルージュ ” のそれぞれの比較において有意に判別可能なモデ た め， 効 果 の 異 な る 代 表 的 な 3 品 種（ や ぶ き た， べ に ふ う ルが作成でき（図 4a, c），両品種間の違い（機能性の違い）に き， サ ン ル ー ジ ュ） を 用 い て， サ ン プ ル 間 の 違 い を 見 出 す 寄与する代謝物ピークを抽出することができました（図 4b, d）。 こ と が で き る 判 別 分 析（OPLS-DA） を 行 い ま し た（ 図 4）。 LC/MS を用いたメタボリック・プロファイリング法の応用 — 農産物の生体調節機能の評価 — 5 Application Note No. 32 機能性ランク： サンルージュ ＞ べにふうき ＞ やぶきた a)スコアプロット サンルージュ b)ローディングプロット（S-plot） やぶきた やぶきた＞サンルージュ 15000 p(corr)[1] to[1 1] 10000 5000 0 -5000 -10000 -15000 -60000 -40000 -20000 0 t[1] 20000 40000 p(corr)[1] to[1] 0 -10000 -20000 -30000 t[1] 10000 30000 -0.10 0.00 w[1] 0.10 0.20 サンルージュ＞べにふうき 10000 -10000 0 サンルージュ＞やぶきた d) ローディングプロット（S-plot） 20000 -30000 スコアプロットで品種間 の分離に寄与する成分 -0.20 60000 c)スコアプロット べにふうき サンルージュ -50000 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 -0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 50000 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 -0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 スコアプロットで品種間 の分離に寄与する成分 べにふうき＞サンルージュ -0.20 -0.10 -0.00 w[1] 0.10 0.20 0.30 図 4 機能性の異なる品種の判別分析（OPLS-DA） 4. 3. 3 機能性に寄与するポリフェノール関連成分の抽出 主成分分析や判別分析の結果から，品種間の違いにポリフェ な わ ち，“ サ ン ル ー ジ ュ ” の 機 能 性 関 与 成 分 を 見 出 す た め， ノールが関与する可能性が考えられたため，機能性の高い PVPP 処理した “ サンルージュ ” と未処理のサンプル間で判 “ サ ン ル ー ジ ュ ” を ポ リ フ ェ ノ ー ル 除 去 剤 で あ る PVPP（ ポ 別分析を行った結果，機能性に関与する代謝物ピークを抽出 リビニルポリピロリドン）で処理したところ，その機能性が することができました（図 5c, d）。 消失しました。そこで，その除去された成分（図 5a, b），す 図 5 判別分析による機能性に寄与するポリフェノール関連成分の抽出 6 4. 3. 4 異なる判別分析の組合せによる機能性関与成分の絞り込み 判別分析で得られた機能性関与成分を更に絞り込むため，図 この結果は，従来のように機能性関与成分を絞り込むために， 4 の結果で品種間の違いにより強く寄与する代謝物ピークの 成分の分画・精製やバイオアッセイを繰り返して行う必要は うち，“ やぶきた ” よりも “ サンルージュ ” に多く，かつ，“ べ なく，LC/MS で得られたサンプルの成分プロファイル情報を にふうき ” よりも “ サンルージュ ” に多いピークを抽出した 多変量解析に供することで極めて容易にかつ効率的に機能性 ところ，そのピークの約 87.5% が図 5 に示した機能性に寄与 関与成分を絞り込むことができる可能性を示唆しています。 するポリフェノール関連ピークと一致していました（図 6）。 サンルージュ > やぶきた や ぶきたより 多いピーク 14 X サンルージュ > べにふうき べにふうきより 多いピーク 32 判別分析の組合せで ピックアップ バイオアッセイから ピックアップ 4 37 5 X サンルージュ PVPP未処理 > PVPP処理 28 X の87.5%がバイオアッセイ由来ピークと重複 判別分析の組合せは関与成分の絞り込みに有効な可能性あり 図 6 機能性関与成分の絞り込み 4. 3. 5 回帰分析による機能性予測モデルの構築 LC/MS によって得られた全品種の成分プロファイル情報を て機能性の予測値と実測値の関係のプロットが得られまし 用いて，緑茶品種の機能性をより客観的に表現するために， た。予測残差（予測値と実測値のズレの程度）は 6.8 であり（機 用いる変数情報が多い場合に有用な多変量解析手法である 能性の全変動値の 3.1% 程度），これは緑茶品種の機能性を客 OPLS 回帰分析を行いました（図 7）。その結果，OPLS によっ 観的に評価（予測）できる可能性があることを示しています。 120 100 機能性の実測値 80 60 40 20 0 -20 -40 40 -60 -80 -100 -120 - 120 1 数字： 各品種の機能性ランク 39 36 34 33 35 37 38 42 - 80 （予測値と実測値のズレの程度） R 2 = 0.981（機能性の98%の変動を説明） Q 2 = 0.891（機能性の全変動の89%を予測） 41 - 100 3 85 6 2 7 4 11 9 12 16 10 20 17 151413 19 2118 24 26 22 23 27 25 30 2928 31 32 予測残差 = 6.8 - 60 - 40 - 20 0 20 40 60 80 100 120 機能性の予測値 図 7 機能性予測モデル LC/MS を用いたメタボリック・プロファイリング法の応用 — 農産物の生体調節機能の評価 — 7 Application Note No. 32 4. 3. 6 “ やぶきた ” と同定化合物の組合せによる機能性の顕在化（組合せ効果） 機能性予測モデルの形成に寄与する成分，および主成分分析 化合物の添加により相対値（MRLC リン酸化比率）が低くな （図 3）や判別分析（図 6）で機能性に寄与する成分のなかで， るほど機能性が高くなります。このようにプロファイリング 単独では機能性を示さないものの , “ やぶきた ” に加えること 解析は，従来法では得ることのできない思いがけないユニー で新たに機能性を付与できる（“ やぶきた ” に少ない）成分 クな知識発見にも威力を発揮します。 がいくつも存在することがわかりました。図 8 に示すように， 相対値（%） 低い 高い 図 8 機能性付与成分の同定 5. まとめ 本稿では，食品機能性研究を志向したメタボリック・プロファ 発や既存品種の有用性発掘に大いに役立つことが期待されま イリング解析の応用例として，緑茶品種の生体調節機能の評 す。また，試料中の複数成分間の相関関係を捉える本法は， 価についてご紹介しました。LC/MS を用いたプロファイリン 食品機能性の理解に不可欠な成分間／食品間相互作用に関す グ法が数十種類の緑茶品種の機能性評価（機能性品種の識別 る基礎情報の取得を可能にし，機能性成分を活用した食品開 化や機能性予測モデルの構築／機能性関与成分や共存成分バ 発や食品の食べ合わせなどに役立つ新たな科学的根拠の創出 ランスの解明など）に極めて有効であることが明らかとなり に寄与することでしょう。 ました。このような知見は，機能性を付与した新たな品種開 ［謝辞］ 本研究を行うにあたり，様々な緑茶品種を提供して頂きました（独）農業・食品産業技術総合研究機構 野菜茶業研究所の山本万里 博士に感謝申し上げます。 ［引用文献］ 1)Fujimura Y, Kurihara K, Ida M, Kosaka R, Miura D, Wariishi H, Maeda-Yamamoto M, Nesumi A, Saito T, Kanda T, Yamada K, Tachibana H. Metabolomics-driven nutraceutical evaluation of diverse green tea cultivars. PLoS One. 2011, 6(8), e23426. 分析計測事業部 http://www.an.shimadzu.co.jp/ 本資料の掲載情報に関する著作権は当社または原著作者に帰属しており、権利者の事前の書面による 許可なく、本資料を複製、転用、改ざん、販売等することはできません。 掲載情報については十分検討を行っていますが、当社はその正確性や完全性を保証するものではあ りません。また、本資料の使用により生じたいかなる損害に対しても当社は一切責任を負いません。 本資料は発行時の情報に基づいて作成されており、予告なく改訂することがあります。 初版発行：2012 年 10 月 © Shimadzu Corporation, 2012 3218-08202-20A-IK
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