蛋白質構造のダイナミクス田中文夫・又賀
最 近, 時 間
曻分 解 蛍 光 偏 光 異 方 性 の測 定 に よ り, 多 くの 蛋 白 質 で 内 部 に 埋 ま って い る トリ
I
プトファ
ン残 基 が ピ コ秒 領 域 で 分 子 内 回転 の 運 動 自由 度 を も っ てい る こ とが わ か って き
た。 ま た,
トリプ トフ ァ ン残 基 が1つ
しか な い に も か か わ らず,
その蛍光強度は非指数関
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数 的 に 減 衰 す る場 合 が 多い 。 これ ら の両 方 法 か ら トリプ トフ ァ ンの 分 子 内 運 動 に つ い て互
い に相 補 的 な 知 見 が 得 られ る。 本 稿 で ほ 単 一 の トリプ ト7ア ン 残 基 を もつ 蛋 白 質 を 中 心
に,
そ の超 高速 時 間分解分学 法 に よ って 得 られ た蛋白 質構造 の 動 的な側面に ついて解 説 す
る。
X線 解 析 に よ る 蛋 白質 の 立 体 構 造 の 解 明
そ れ 自身 で は蛋 白質 内部 で は ほ とん ど運 動 の 自由 度 を も
は, そ の機 能 を理 解 す る うえ で 非 常 に 重 要 な 役 割 を果 た
は じめに
た な い。 した が っ て イ ン ドール 環 は近 接 して い る他の ア
して きた 。1970年 代 ま では 蛋 白質 構 造 は 静 的 な もの と考
ミノ酸 残 基 の隙 間 で運 動 す る の で な く, これ らの 残 基 の
え られ,
動 きに 従 っ て運 動 す る の で あろ う。 超 高 速 時 間 分 解 分 光
リガ ン ドの 結 合 に 伴 うそ の 立 体 構 造 の 変 化 も,
あ る静 的 な 構 造 か ら別 の静 的 な構 造 に 突 然 に 変わ る もの
法 は, 直 接, ナ ブ ピコ秒 か ち ナ ノ秒 領 域 の この よ うな 蛋
と考 え られ てい た 。 しか しな が ら, さ ま ざ まな 実 験 的 ・
白質 の動 的 な 性 質 に つ い て の知 見 を 得 る も っ と も有 力 な
理 論 的 研 究 の結 果 か ら, 蛋 白質 構 造 は 本 質 的 に 動 的 な も
方 法 であ る^<3,4)>
(解 説1参 照)。こ こ で は単 一 の ト リプ ト
の で あ る こ とが わ か って きた^<1,2)>。
フ ァ ン残 基 を もつ 蛋 白 質 を中 心 に, そ め時 間 分 解 蛍 光 の
蛋 白質 の分 子 内 運 動 は 次 め よ うな 時 間 領 域 に 分 類 され
解 析 や 過 渡吸 収 スペ ク トル の測 定 に よ り得 られ た蛋 白質
る^<2)>。(1)
原 子 や分 子 の局 所 運 動 (サ ブ ピ コ秒), (2)小規 模
な集 団 運 動 (数10ピ
構 造 め ダイ ナ ミク ス につ 小 て解 説 す る。
コ秒 以下), (3) 大 規 模 な 集 団運 動
.
(ナ ノ秒 以 下), (4)サ ブユ ニ ッ ト間 運 動 (サ ブマ イ ク ロ秒
時間分解蛍光法
か ら ヤ イ クロ秒)。 この よ うな さ ま ざ まな分 子 内運 動 は,
蛋 白質 の 立 体 構 造 の 変 化 に た い へ ん 重 要 な 役 割 を果 た
測 定 方 法 に つ い て に 解 説2を 参 照 して いた だ く こ とに
す 。 た とえ ば, 蛋 白質 に リガ ン ドが結 合 す る際 に起 こる
して, こ こで は解 析 方 法 た ら い て 概 説 す る。
誘 起 適 合 効果 は, ピ コ秒 や オ ノ秒 領域 で起 こる集 団運 動
が 関 与 す る と考 え られ て い る^<2)>。
1.
蛍 光 強 度
一 般 に 溶液 中 に 単 一 の 蛍 光 成 分 しか な く
, しか も励起
トリプ トフ ァ ンの 蛍光 特 堆 は周 りの媒 体 に よ って微 細
に 変 化 す るの で, そ の蛍 光 か らい ろ い ろ な知 見 が 得 られ
状 態 で後 に 述 べ る よ うな 特 別 の 相 互 作 用 (II-4項 参 照)
る。蛋 白 質構 造 の分 子 模 型 か らみ る と, イ ン ドール 環 は
を しな い と き, 励 起 分 子 の 濃 度, す な わ ち 蛍 光 強 度 は指
Fumio
Tanaka,
Noboru
Science,
Protein
三 重 県 立 看 護 短 期 大 学
Mataga,
大 阪 大 学 基礎 工 学 部
(〒514津
(〒560豊
Osaka University, Toyonaka
Dynamics
Revealed
by an Ultrafast
市 鳥 居 町
100番
地)
中 市 待 兼 山 町 1番1号)
[Mie
Nursing
[Depaftment
College,
of
Toril-cho,
Chemistry,
Tsu
Faculty
514,
of
Japan]
Engineering
560, Japan]
Time-resolved
Spectroscopy
of Tryptophan
Key【トリブ
word
トフ ァン】 【時 間 分 解 分 光 】 【蛋 白 質 の ピコ 秒 ダ イ ナ ミク ス 】
2223
52
蛋 白 質
核 酸
酵 素
Vol. 35
No. 13
(1990)
数 関数 的 に減 少す る。
F(t)=exp(-t/τ)
(1)
こ こで τは 蛍 光 寿 命 であ る。 励 起 分 子 が 他 の 分 子 と相 互
作 用 す る と, 蛍 光 消 光 定 数 が 大 き くな り, 蛍 光 寿 命 が 短
くな る。 消 光 定 数 ほ, 蛍 光 分 子 と消 光 作 用 を もつ 分 子 と
の相 対 距 離 や 配 向 に 依 存 して 変 わ る。 溶 液 中 の 低 分 子 で
は, 分 子 運 動 が速 い た め にナ ノ秒 や サ ブナ ノ秒 領 域 で 消
光 定 数 が 平 均 化 され 定 数 とみ な せ るが, 分 子運 動 が 蛍 光
寿 命 に比 べ て と くに 速 くな け れ ば, 消 光 定 数 は 時 間 に 依
存 す る こ とに な る^<5)>。
蛋 白質 中 の トリプ トフ ァ ン残 基 は
溶 液 中 の 分 子 とは 異 な り, そ れ ほ ど速 く運 動 で きな い た
め, 蛍 光 強 度 は 周 りめ ア ミノ酸 残 基 の種 類 だ け で な く,
トリプ トフ ァ ン の分 子 内 運 動 と も密 接 に 関 係 す る 。 さ ま
ざ まな理 由 で 蛍 光 強 度 の減 衰 が 指 数 関 数 か らず れ て く る
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と, 便 宜 的 に 蛍 光 強 度 は 式 (2)
の よ うに 多指 数 関数 で
図1.
分 子 の 首 ふ り運 動
分 子 に 固 定 され た 遷 移 モ ー メ ン トが 半 頂 角 θ
の コ ー ン内 で 首 ふ り運 動 を す る。
表 わ され る。
F(t)=Σ^^n__<i=1>αiexp(-t/τi)
(2)
こ こで αiは 成 分比 で あ る。
2.
(解 説3参
照)
ter,Sを
定 義 した 。
蛍 光 偏光 異 方 性
蛍 光 偏 光 異 方性 は,
試 料 を 偏 光 フ ィル ター を 用 い て
縦 方 向 偏 光 で励起 し, 縦 方 向[I_<￨￨>(t)]と横 方 向[I⊥(t)]
の偏 蛍 光 を 測 定 して 次 式 で得 られ る (解 説2参 照)。
r(t)=[I_<￨￨>(t)-I⊥(t)]/[I_<￨￨>(t)+2I⊥(t)]
(5)
に よ っ て order
parame
S^2=β_2/(β_1+β_2)
(5)
S =cosθ(1+cosθ)/2
(6)
ここで θは コーンの 半頂角で あ る
r(t)
(3)r
に 従 っ て,
(図1)。F(t)
と
は と も に ト リ プ トフ ァ ン 残 基 の 分 子 内 運 動 と 関 連
し て お り, 後 に 述 べ る よ うに こ れ ら か ら 蛋 白 質 構 造 の ダ
(t) は次 の よ うな 因 子 に よ って 影 響 を うけ る (解 説3
イ ナ ミ ク ス に つ い て 互 い に 相 補 的 な 知 見 が 得 ら れ る^<9)>。
参 照)。(1)蛍 光 分 子 の回 転 運 動^<6∼9,11)>,
励起
(2)エ ネル ギ ー
移 動^<8,10)>,二(3)
状 態 発光^<10)>,
な どで あ る。二 状 態 発 光 とは
II.
2つ の 電 子状 態 か ら 同 時 に 蛍 光 が で る 現 象 で あ る。r
(t) もF(t)
蛋 白質 トリプ トフ ァ ンの超 高 速 時 間 分
解 分光 と そ の励 起 状 態 の ダ イナ ミク ス
と同 様 い くつ か の指 数 関 数 の和 と して表 わ
され る。
1.
r(t)=Σ^^n__<i=1>βiexp(-t/φi)
遊 離 トリプ トフ ァ ンの 時 間 分 解 蛍 光
トリプ トフ ァ ンの芳 香 環 で あ る イ ン ドール の蛍 光 特 性
(4)
は, た い へ ん 複 雑 で あ る。近 紫 外 部 (250∼300nm)
には
こ こ で βiは 偏光 異方 性 の成 分比 で あ り, 偏 光 解 消 が(1)
L_aとL_bの
の 原 因 で 起 こ る と き, φi=ηVi/kTは
回転
お り^<13,18)>,
こ の波 長 領 域 で光 照 射 す る とこれ ら の両 方 が
回 転拡 散 係数 に逆 比例 す る。 η, k,
励 起 され る。1964年 又 賀 ら^<13)>は,
イ ン ドール の蛍 光 スペ
相 関 時 間 と よば れ,
Tは
それ ぞれ 媒 体 の 粘度, Boltzmann
る。 またViは
回転 体iの
記 号 で記 され る2つ の 電 子 状 態 が 重 な っ て
定 数, 温 度 であ
ク トル の極 大 波 長 が 溶 媒 の極 性 に依 存 して大 き く長 波 長
回 転 体iの 体 積 で あ る。 トリプ トフ ァ ン
側 に移 動 す る こ とを最 初 に見 い だ した (図2)。 彼 らは こ
や 共 有 結 合 性 の蛍 光 標 識 色 素 が あ る角 度 の コー ンの 内部
の現 象 を, L_a状 態 の双 極 子 モ ー メ ン トがL_b状
(図1)
も大 き いた め に, 溶 媒 と の相 互 作 用 に よ りL_aの ほ うが
で, 励 起 寿 命 の間 に速 く 分 子 内 回 転 運 動 を す る
と き [式 (4)]
は, 近 似 的 に二 指 数 関 数
(n=2)
で表 わ
よ り安 定 化 す るた め で あ る と結 論 した 。 非 極 性 溶 媒 中 で
され^<6,8)>,
φ1と φ2は それ ぞれ 蛍 光 分 子 の分 子 内 お よび,
は, 蛍 光 スペ ク トル は300nm付
球 状 蛋 白質 全 体 の 回 転 相 関 時 間 で あ る。Lipari
構 造 を示 す 。 これ はL_b状
Szabo
2224
と
は^<12)>蛍
光 分 子 の 運 動 に 関 す る 木 下 ら^<11)>の
モ デル
態より
近 に 極大 を もち, 振 動
態 か らの 発 光 で あ る。 また ア
セ トニ ト リル の よ うな極 性 溶 媒 中 で は330nm,
水中 で
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トリプ トファンの超 高速時 間分解分 光 と蛋白質構 造のダイナ ミクス
図2.
1:
は355nm付
イ ン ドー ル の 蛍 光
シ ク ロヘ キ サ ン,
53
・吸 収 ス ペ ク トル の 溶 媒 効 果^<13)>
2:
ア セ ト ニ ト リ ル.
近 に 極 大 を もち, 振 動 構 造 が な く な り,
表1.
L_a状 態 か ら発 光 す る。 中程 度 の極 性 溶 媒 中 や イ ン ドー
3: 水
。
遊 離 ト リプ トフ ァ ン と3-メ
の 蛍 光 寿 命^<16)>
チ ル イ ン ドール
ル の誘 導 体 で は両 方 の電 子 状 態 か ら蛍 光 をだ す, い わ ゆ
る二 重 発 光 の現 象 が み られ る。 しか しこ の場 合 で も両 状
態 問 の移 動 が 非 常 に速 いた め, 蛍 光 は 指 数 関 数 的 に 減 衰
す る。 イ ン ドール の蛍 光 スペ ク トル に 影 響 を 及 ぼ す も う
1つ の 因子 は, シ ク ロヘ キサ ンな どの 非 極 性 溶 媒 中 で の
NHと
プ ロ トン受 容 体 との 水 素 結 合 で あ る。 この と き
も, L_b状 態 か らの 振 動 構 造 を もつ 蛍 光 スペ ク トル が若
干 長 波 長 側 に シ フ トして幅 広 にな る^<13)>。
トリプ トフ ァ ンの 蛍 光 特 性 は イ ン ドール と よ く 似 て
極 短 時 間 内 では 数10ピ
コ秒 以 上 の時 間 領 域 とは 異 な る
い る。 ト リプ トフ ァ ンで は イ ン ドール 環 の3位 に 側 鎖-
現 象 が 観 測 され た 。 彼 ら は1.6psの
CH_2CH(NH_2)COOHを
L_b状 態 か らL_a状
もつ。 この側 鎖 は溶 液 のpHの
値 に よ りさ ま ざ まな 荷 電 状 態 を 示 し, これ が イ ン ドール
寿 命成 分 を 観 測 し,
態 お よび そ の逆 の 遷 移 の速 度 定 数 を
そ れ ぞ れ0.625と0.044
(ps^<-1>)と得 て い る。Valeur
環 の蛍 光 強 度 と 時 間 分 解 蛍 光 に 大 きな 影 響 を 及 ぼ す。
と Weber^<18)>によ り定 常 光 励起 で 測 定 され て い た イ ン ド
1978年
ー ル の 極 限 異方 性r_0=0 .33(λ_<ex><300nm)
Rayner
と Szabo^<14)>および Fleming
ら^<15)>は
水
溶 液 中 で トリプ トフ ァ ンが 二 指 数 関数 の 時 間分 解 蛍 光 を
法 で は理 論 値 と等 しい0.4で
は,
こ の方
あ った 。
示 す こ とを見 いだ した 。 そ れ ぞ れ の 寿 命 の値 は, 表1に
示 した よ うにpHに
よ り変 化 した^<16)>。
ト リプ トフ ァ ンが
イ ン ドール よ りも蛍 光 寿 命 が 短 くな る の は, 励 起 イ ン ド
ール 環 か ら-NH_3^+へ の 電 子 移 動 に よる と 考 え られ て い
2.
蛋 白 質 トリプ トフ ァ ン残 基 の 時 間 分 解 分 光 と そ の
分子内運動についての一般的な考察
蛋 白質 内 の ト リプ トフ ァ ン残 基 の 蛍光 強 度 は, ほ とん
る。3-メ チル トリプ トフ ァ ンで は単 指 数 関数 で減 衰 す る
ど非 指 数 関数 的 に 減 衰 す る^<19)>。
こ の場 合, 実 測 の蛍 光 減
の で, 彼 らは-NH_3^+グ ル ー プ とイ ン ドー ル環 の 相 対 的
衰 曲 線 は, 通 常, 式 (2)
な 位 置 に 関 して2種
の 減衰 関数 を用 い て 表 わ され る (表2)。
類 の コ ン フ ォ ーマ ーが あ り, それ
で 示 され た よ うな 多 指 数 関 数
ア ミ ノ酸 残 基
ぞ れ が 固 有 の 蛍 光 寿命 を もつ と 考 えた 。 最 近 Fleming
の な か で ト リプ トフ ァ ン蛍 光 に 対 し消 光 作 用 を もつ と考
ら^<17)>は,
サ ブ ピ コ秒 の 時 間 分解 能 で トリプ トフ ァ ンの蛍
え られ る のは, 正 電 荷 を もつ ア ミノ酸 側 鎖 やC=O基,
光 強 度 と偏 光 異 方 性 の減 衰 過 程 を測 定 した 。 こ の よ うな
あ る い はS-S結
合 な どで あ る。Szabo ら^<20)>は
遊 離 ト リプ
2225
54
蛋 白 質
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表2.
核 酸
酵 素
Vol. 35
No. 13
(1990)
単 一 の トリプ トフ ァ ソ残 基 を もつ 蛋 白 質 の 蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 の 減 衰 パ ラ メ ー タ
τ_i,
やβ_iは
φ_i (2) と(4) で定義 され てい る。また τ_iとφ_iはナノ秒 の単位 で表わ した。
a) φ_2は算 出され なか った。b) 蛍光 強度は3寿 命を もつ減衰関数 よ りも4寿 命を もつ減衰 関数 のほ うが よく実 測データ と適合 し
たが, ここでは3指 数関数のデ ータを載せた。偏光異方性 も3指 数関数 で記述 されたが, 短い2つ の φの平均値を φ_1としてあげた。
トフ ァ ンで の コ ン フ ォーマ ーの 考 え 方 を 適 用 して, これ
[事 例1]
ら の消 光 作 用 基 とイ ン ドール環 と ゐ相 対 距 離 が蛋 白 質分
に減 衰す る。
子 に よ って 異 な る も の と解 釈 した 。 も し蛍 光 減 衰 関 数 が
[事 例2]
二 指 数 関 数 で あ れ ば,
2種 類 の分 布 を 示 し, 三 指 数 関 数
で記 述 で きれ ば3種 類 の分 布 が あ る と考 え る の であ る。
Gratton
ら^<21)>や
そ の 他 多 くの 可 変 周 波 数 位 相 差 蛍 光 法
(解説4参 照) に よ っ て蛍 光 寿 命 を 測 定 す る 研 究 者 た ち
は^<22,23)>,
Szabo
らの よ うな寿 命 の整 数 個 の蛋 白質 内分 布
を考 え る の で は な く, た とえば 式 (7)
の よ うに寿 命 の
連 続 的 な分 布 関 数 を導 入 して い る。
f(τ)=A/[1+{(τ-C)/(W/2)}^2]
こ こでf(τ)
は Lorentz
(2)
(7)
C,
蛍 光 強 度 は 非 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る [式
でn≧2]
が, 偏 光 異 方 性 は 指 数 関 数 的 に減 衰す る
[式 (4)でn=1]。
[事 例3]
蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 が 同 時 に 非 指数 関数
的 に減 衰 す る。
[事 例4]
蛍 光 強 度 は 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る が, 偏 光
異 方 性 は非 指 数 関 数 的 に減 衰 す る。
表2,
型 の 分 布 関 数 で あ る。A,
蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 が 同 時 に 指数 関数 的
表4の 結 果 か ら事 例1,
2, 3に 相 当 す る蛋 白 質
は存 在 す るが, 事 例4に 相 当 す る も のは1例
もな い。
蛋 白質 内 の トリプ トフ ァ ン残 基 の蛍 光 強 度 と偏 光 異 方
Wはそ れ ぞ れ 分 布 関 数 の 最 大 値, 寿 命 分 布 の中 心, 分 布
性 の減 衰 の挙 動 を説 明す るた め に, 次 の よ うな モデ ル が
の半 値 幅 で, 実 測 デ ータ と も っ と も よ く合 う よ うに き め
考 え られ た^<9)>。
球 状 の蛋 白質 に結 合 した イ ン ドール環 が
る。
励 起 寿 命 の間 に分 子 内回 転 運 動 を し, そ の蛍 光 消 光 定 数
これ ら の考 え方 は, 蛍 光 強度 の減 衰 関数 や可 変 周 波 数
が 回転 角 に依 存 して変 化 す る。 イ ン ドール 環 は Favro の
位 相 差 蛍 光 法 の測 定 結 果 を よ く説 明 で き るが, 蛍 光 偏 光
回 転 拡 散 方 程 式^<24)>に
従 っ て分 子 内運 動 を す る も の と仮 定
異 方 性 の結 果 を解 釈 す る の に何 の指 針 も与 え な い。
す る (図3)。 得 られ た 蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 の 時 間 依 存
蛍 光 減 衰 関 数 と時 間 分 解 偏 光 異 方 性 のふ る ま い につ い
て, 次 の4つ の場 合 が 考 え られ る。
2226
性 を表 わ す 理 論 式 を数 但 計 算 して, 次 の よ うな 定 性 的 な
結 論 が 得 られ た^<9)>。(1)
蛍 光 強 度 と 偏 光 異 方 性 は互 い に 相
トリプ トファンの超高速時間身解分光 と蛋白質構造 のダイナ ミクス
関 して減 衰 し, と もに 分 子 内 画 転 の拡 散 係数 に大 き く依
あ るい は な にか 他 の 原 因 で イ ン ドール が 完全 に と ま っ て
存 す る, (2)拡 散 係 数 が 小 さ くな る, す な わ ち回 転 が 遅 く
い る とき, 全 蛋 白質 分 子 の ト リプ ドフ ァ ン残 基 が ま った
な る ほ ど蛍 光 強 度 は 指 数 関 数 か ら のず れ が 大 き くな る,
く同 じ環境 にお か れ るた め, 蛍 光 は 当然 指 数 関 数 的 に 減
(3)こ の とき偏 光 異 方 性 は分 子 内運 動 に よ る効 果 が な くな
衰 す る で あ ろ う。 こ の場 合 偏 光 解 消 も蛋 白質 の 回 転運 動
り, 蛋 白質 の回 転 運 動 だ け で偏 光 解 消 が 起 こ り指 数 関 数
で のみ 起 こ る の で, も し蛋 白質 が 球 状 とす る と指 数 関数
的 に減 衰 す る, (4)偏 光 異 方 性 か ら イ ン ドール 環 の分 子 内
的 に 減 衰 す る こ とに な る。 これ は事 例1に 相 当 す る。
回 転 が 観 測 され れ ば, 蛍 光 強 度 は 必 ず 非 指 数 関 数 的 に 減
エ ラ ブ トキ シ ンbは 分 子 量 が7,000程
度 で単 一 の ト リ
衰 す る, (5)分 子 内回 転 が 平 均 の消 光 定 数 に 比 べ て 非 常 に
プ トラ ァ ン残 基Trp-29を
速 けれ ば, 蛍 光 強 度 は 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る, (6)両 方 の
活 性 が 失 わ れ る の で, Trp-29は
減 衰 関 数 は分 子 内回 転 の ポ テ ン シ ャル エ ネ ル ギ ーに も依
タ ー と結 合 す る と き重 要 な役 割 を果 た して い る と考 え ら
存 す る。
れ て い る^<25)>。
エ ラ プ トキ シ ンbの 立 体 構 造 はX線 解 析 に
こ の結 果 を も とに して事 例1∼4に
よ う。 事 例3は,
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55
つ い て考 察 してみ
拡 散 係 数 が 回 転 角 に つ い ての 平 均 の消
もつ。 これ を化 学 修 飾 す る と
よ り解 明 され て い る^<26)>
(図4)。
ア セ チル コ リ ン レセ プ
これ に よ る と, Trp-29
イ ン ドール 環 は 蛋 白質 の窪 み に あ っ て水 と接 してお り,
光 定 数 に比 べ て極 端 に は違 わ な い 場 合 に 相 当 して い る。
Thr-35と
した が っ て, 強 度 も偏 光 異 方 性 も と もに非 指 数 関数 的 に
ル で 得 られ た 蛍 光 減 衰 関 数 の理 論 式 を用 い て, 海 ヘ ビの
減 衰 す る こ と にな る。 事 例2で は 分 子 内 回 転 の拡 散 係 数
ヘ ビ毒 であ る エ ラ ブ トキ シ ンbの 蛍 光 解 析 が 行 な わ れ
が 平 均 の消 光 定 数 に 比 べ て 小 さい た め に, 蛍 光 強 度 は 指
た^<27)>
(図5)。
数 関 数 か ら大 き くず れ るが, 偏 光 異 方 性 は 分 子 内 回 転 が
に 減 衰 した 。Trp-29の
遅 くて観 測 で きず, 蛋 白質 自身 の回 転 に よ って指 数 関 数
作用 を もつ と思 わ れ るの はLys-27で
的 に減 衰 す る こ とを 示 して い る^<6,8)>。
また, イ ン ドー ル の
構 造 で のTrp-29の
分 子 内 回 転 が 偏 光 異 方 性 の 減 衰 と して観 測 され れ ば, 蛍
し, X線 回折 で 得 られ た これ ら の座 標 を用 い て, 蛍 光 消
光 強 度 は必 ず 非 指 数 関数 的 に減 衰 す るの で, 事 例4に
光 定 数 や ポ テ ン シ ャル エ ネ ル ギ ー の回 転 角 依 存 性 が 決 め
該
ペ プチ ド鎖 に 挟 まれ て い る。 こ の よ うな モ デ
エ ラ ブ トキ シ ンbの 蛍 光 も 非 指 数 関 数 的
イ ン ドール 環 の近 傍 で蛍 光 消 光
あ る。 また, 結 晶
位置が もらとも 安定 で ある と 仮定
当 す る系 は 存 在 しな い こ とに な る。一 方, イ ン ドー ル環
られ た 。分 子 内 の 回 転 拡 散 係 数, 平 均 の 消 光 定 数 (k_q^0),
のNHと
ポ テ ン シ ャル エ ネ ル ギ ー の高 さ (p)
他 の ア ミノ酸 残 基 が 水 素結 合 して い るた め か,
な どを 可 変 パ ラ メ
ー タ と して 実 測 した 蛍 光 減 衰 曲線 とも っ と も よ く合 う よ
うに 決 め られ た (表3)。 表3の 結 果 か ら, (1)回 転 拡 散 係
数 が 温 度 に 比 例 す る, (2) z軸が 関 与 す る拡 散 係 数 が も っ
図3.
トリプ トフ ァ ン残 基 の 分 子 内 回転 モ デ ル^<9)>
イ ン ドール 環 は 蛋 白質 の 座 標 系 (x'y'z') か ら イ ン ドー ル 分
子 の 座 標 系 (xyz) ま で オ イ ラ ー 角, α, β,γ だ け 回転 す る 。 ま
た, イ ン ドール の 蛍 光 は あ る消 光 作 用 を もつ グ ル ー プ に よ り消
光 され る と 仮 定 。 消 光 作 用基 の 位 置 は (x'y'z') 系 の 極 座 標
(β_qα_q)
で 表 わ さ れ て い る。
図4.
エ ラ ブト キ シ ンbの 立 体 構造^<26)>
単 一 めTrp-29の
イ ン ドー ル環 に も っ と も近 い ア ミノ酸 残 基
ほThr-35で
あ る。 傍 ら に あ って イ ン ドー ル の 蛍 光 を 消 光 す る
と考 え られ る ア ミノ酸 はLys-27で
ある。
2227
56
蛋 白 質
核 酸
酵 素
Vol. 35
No. 13
ドの1つ
(1990)
で あ る-S^-か
に よ る。4種
(Pae),
らCu
(II)
類 の ア ズ リ ン,
Pseudomonas
へ の 電 荷 移動 相 互 作 用
Pseudomonas aeruginosa
fluorescens
(Pfl),
Alcaligenesfaecalis
(Afe), Alcaligenes denitrificans (Ade)
PaeとPflは
の う ち,
ト リ プ トフ ァ ン残 基 を1つ
(Trp-48)
も
つ 。 こ れ ら の ア ミ ノ酸 配 列 は ほ と ん ど 同 じ で あ る 。 ま た
AfeはTrp-118を1つ
Trp-118の2つ
だ け も つ 。AfeはTrp-48と
の
トリプ トフ ァ ン残 基 を も って い る 。
こ れ ら の う ちPae^<42)>とAde^<43)>の
立 体 構 造 がX線
回折で
決 定 さ れ て お り, 構 造 が た い へ ん よ く 似 て い る
こ れ に よ る と,
Trp-48は
(図6)。
板 状 の β 構 造 部 分 に あ り,
疎 水 性 の ア ミノ酸 残 基 に囲 まれ て い る。 この 蛍 光 スペ ク
トル の 極 大 は307nmで
あ り, シ ク ロ ヘ キ サ ン 中 の イ ン
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ド ー ル の ス ペ ク トル と よ く似 て い る
(図2)。
ま たTrp-
118は
蛋 白 質 表 面 の 近 く に あ り, 蛍 光 ス ペ ク トル は335
nmに
極 大 を もつ 。 これ らア ズ リンの 時 間 分解 蛍 光 が い
ろ い ろ な 研 究 者 に よ っ て 研 究 さ れ た^<20,28,34,44)>。
図5.
蛍 光 強 度 と 偏 光 異 方 性 の 減 衰 パ ラ メ ー タ を 表2に
エ ラ ブ トキ シ ンbの 蛍 光 減 衰 曲線^<27)>
あげ
観 測 され た 蛍 光 強 度 はCの 点 で表 わ され て い る 。aは 分 子 内
回 転 モデ ル に よ る理 論 式 の蛍 光 減 衰 関 数, bは 二 指 数 関 数 で 表
わ され た 蛍 光 減 衰 関 数 [(2)でn=2]。cは
励 起 パ ル ス 。A
た 。PaeとPflの
とBは そ れ ぞ れ 観 測 され た 蛍 光強 度 と理 論 曲 線aお
の 偏 光 異 方 性 も指 数 関 数 的 に 減 衰 し, φ=4.9nsで
これ
は 蛋 白質 の回 転相 関 時 間 に相 当す る。
Pae
衰 関 数bと
の重 み 付 き差 異 (deviation)
実 測 値 と よ く合 った 。 時 間 軸 は100チ
で あ る。
よび 蛍 光 減
を 表 わす 。aの
ほ うが
ア ポ蛋 白 質 で は 蛍光 強度 は指 数 関数 的
に 減 衰 す る 。 蛍 光 寿 命 は ほ ぼ 同 じ τ=5nsで
やPflのTrp-48の
とも大 き く回 転 が 速 い, (3)平 均 の 蛍光 消光 定数 は 温 度 と
時 間 分 解 蛍 光 は, 事 例1の
な どいず れ も 合 理 的 な 結 論 が 得 られ
ら れ て い る た め に 動 け な い の で あ ろ う。
Afe
やAdeのTrp-118は
ぞれ
こ こで は 前 節 で述 べ た 一 般 的 な 考 察 に 基 づ い て, い く
事 例3の
φ_1=160psと690psの
る^<31)>。Trp-118は
い くつ か の 例
場合 に該
(コ ー ン の 半 頂 角
θ≦
20°)。 こ の 理 由 は イ ン ド ー ル 環 が β構 造 部 分 に 押 し 付 け
た。
3.
した が っ て,
ャ ン ネル あた り5,12ns
当 し, ほ と ん ど分 子 内 運 動 が な い
とも に増 加 す る,
あ る 。Pae
回 転 が 可 能 で,
こ れ に 対 し,
場 合 に 相 当 し, そ れ
分 子 内運 動 が 観 測 され て い
蛋 白 質 表 面 近 く に あ り, か な り分 子 内
コ ーン の 半 頂 角 θ はAfeで38°, Ade
つ か の蛋 白質 の トリプ トフ ァ ン残 基 の時 間 分 解 蛍 光 とそ
で26°
の構 造 の ダ イナ ミ クスに つ い て 議 論 す る。
が 結 合 す る と 事 情 が 一 変 す る 。 ま ず 非 常 に 短 い 蛍 光 寿命
ア ズ リン は典 型 的 な青 色 銅 蛋 白質 で"土 壌 中 の脱 窒 素
バ ク テ リアな ど に存 在 し, 電 子 伝 達 系 に 関 与 して い る と
考 え られ て い る。 そ の 性 質 は 山 中 ら^<41)>に
よ り最 初 に 詳 し
く調 べ られ た 。 蛋 白質 が 青 色 を して い る原 因 は,
表3.
エ ラ ブ トキ シ ンb
リガ ン
Trp-29の
と 得 ら れ て い る^<34)>。Paeの ア ポ 蛋 白 質 にCu
成 分 が 現 わ れ,
(II)
長 寿 命 成 分 も ア ポ 蛋 白 質 よ り も 短 くな
る^<25)>。
Fleming
か らCu(II)
ら^<34)>は
こ の 原 因 と し て, 励 起 ト リ プ トフ ァ ン
へ の 電 子 移 動 を 考 え て い る 。Trp-48と
分 子 内 回転 モ デ ル で 得 られ た 減 衰 パ ラ メ ー タ^<27)>
k_q^0
とpは それぞれ分子内の回転角 (図2参 照) に依存す る蛍光消光定数の回転角についての平均値 と, 回転 の際 のポテンシャル
エネルギーの高さであ る。
2228
トリプ トフ ァン の超 高 速 時間 分 解 分 光 と蛋 白質 構 造 の ダ イ ナ ミクス
ァン残 基 を1つ
(Trp-59)
57
もつ 。Trp-59は
芳香環を も
つ疎 水性 の ア ミノ酸 残基 に 囲 まれ て い る。 蛍 光 スペ ク ト
ル は,
ア ズ リンのTrp-48と
り, 320nmに
NHの
似て 振動構造を もって お
極 大 を もつ^<35)>。
結 晶 構 造 で はTrp-59の
そ ば に構 造 水 分 子 が あ り, これ と水 素 結 合 して い
る た め に アズ リン よ りも10nmほ
ど長 波 長 側 に シ フ ト
した もの と思わ れ る。
RNase
T1の
タを表2に
蛍 光 弾 度 と偏 光 異 方 性 の減 衰 パ ラ メー
あ げ た^<35)>。
蛍 光 強 度 はpHが6以
下 で指 数 関
数 的 に 減 衰 す る。 しか し6.5以 上 で は 非指 数 関 数 的 であ
った 。 偏 光 異 方 性 は どのpHや
温 度 (5∼45℃)
数 関 数 的 に減 衰 した 。 これ らの結 果 か らpH6以
事 例1に 該 当す る が, pH6.5以
Cuは
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-46お
子 系 とTrp-48,
7.3Å で あ る 。
ル 環 は止 ま って お り, 偏 光 解 消 も蛋 白質 の回 転 だ け で起
配 位 結 合 してい る。 これ らの π電
Trp-118の
下 では
上 で は 事 例2の 場 合 に
相 当す る こ とが わ か る。 す な わ ち, 酸 性 側 では イ ン ドー
図6.
アズ リン (Ade)
の立 体 構 造^<43)>
銅 イ オ ンの結 合 部 位 を 表 わ す 。Cu(II)
は His
よびHis-117と
で も指
最 短 距 離 はそ れ ぞ れ9.6と
こる。 一 方, アル カ リ側 で は, イ ン ドール 環 が 運 動 す る
よ うに な るが,
蛋 白質 の 回転 運 動 よ りも 遅 い た め に 偏
光 異 方 性 の 減 衰 に は 観 測 され な い の で あ ろ う。Rigler
Trp-118か
9.6Å
らCu(II)
と7.3Å
へ の それ ぞれ の 最 短 距 離 は,
ら^<48)>や
Prendergastら^<49)>はRNase
T1の
ダ イ ナ ミ クス
で あ る。 これ く らい の距 離 で は, 他 の例
に つ い て分 子 動 力 学 の理 論 計 算 を 行 な い, 時 間 分 解 蛍 光
か ら考 え て充 分, 光 誘 起 電子 移動 が可 能 で あ る。 しか し
の観 測 結 果 に つ い て考 察 して い る。 結 晶 構 造 か ら算 出す
還 元 電位 の異 な る い ろ い ろ な金 属 イ オ ンでCu(II)
る とイ ン ドール環 が 動 け る 角 度 は ±5° で あ るが,
を置
計算
換 して も蛍 光 寿 命 は ほ とん ど変 わ らな い の で^<44)>,
電子移
結 果 で は コ ー ンの 半 頂 角 θ=17° で あ る。 これ で は 偏光
動 が 原 因 か ど うか は っき り しな い。 ホ ロ蛋 白質 に な る
解 消 は 観 測 され な い の で, 実 験 結 果 とよ く合 っ て い る と
と, 止 ま って い たTrp-48が
い え る。 蛍 光 減 衰 関 数 が アル カ リ側 で非 指 数 関 数 的 で あ
510ps,
動 く よ うに な る^<28)>。
φ1=
コー ンの半 頂 角 θ=34° で あ る^<25)>。
る原 因 に つ い て は, Trp-59とHis-40の
最 近, ア ズ リン構 造 の ダイ ナ ミクス に つ い て分 子 動 力
相互作用 に よ
り蛍 光 寿 命 にあ る分 布 を もつ 可 能 性 を示 唆 して い る^<49)>。
学 の方 法 で 理 論 的 に 研 究 され た^<45)>。
この方 法 は蛋 白質 の
Photobacterium leiognathi
の ル マ ジ ン蛋 白質 は, 天
結 晶構 造 を ベ ー スに して, 各 原 子 間 のい ろ い ろ な 種類 の
然 の補 欠 因 子 であ る6,7-ジ
相 互 作 用 を考 慮 した 全 原 子 の運 動 方 程 式 を た て て, そ れ
(ル マ ジ ン) や, そ の反 応 生成 物 で あ る6-メ チ ル-7-オ キ
らの位 置 の時 間 依 存 性 を 計 算 す る の で あ る^<2)>。
この 方 法
ソ-8-リ ビチル ル マ ジ ン (オ キ ソル マ ジ ン) お よ び リボ
に よ っ て もTrp-48が
フ ラ ビ ン と結 合 す る。 これ ら芳 香 族 化 合 物 の 時 間 分 解 蛍
や, Trp-118が
ほ とん ど動 け な い こ と (θ=9°)
よ り 大 きな 運 動 の 自 由度 が あ る こ と
メ チル-8-リ ビチル ル マ ジ ン
光 は事 例1の 場 合 に相 当 し, これ らが蛋 白 質 内 で固 定 さ
(θ=20°) な ど の結 論 が 得 られ てい る。 しか し 分 子 内回
れ て い る こ とを示 して い る^<39)>。
また,
転 の相 関 時 間 につ い て は, 実 測 値 よ りも は るか に速 い計
の トリプ トフ ァ ン残 基 の 時間 分 解 蛍 光 は, ル マ ジ ンや そ
算 値 を与 え る。
の ア ナ ロ グが結 合 して い て もい な くて も, 事 例3に 相 当
リボ ヌ ク レア ー ゼT1
(RNase
に よっ て 発 見 され た 酵 素 で,
T1)
は佐 藤 と江 上^<46)>
104個 の ア ミノ酸 か らな
る。 この酵 素 は, 中性pHでRNAを2段
階 で3'-リ ン
酸 モ ノ, お よび オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドに分 解 す る。 こ の酵
素 と阻 害 剤 で あ る2'-GMPと
Heinemann
と Saenger
の結 合 に は, Glu-58,
関 与 す る。RNase
して減 衰 した。 この こ とは ト リプ トフ ァ ン残 基 が か な り
速 く分 子 内運 動 を して い る こ とを 示 して い る (表4)。
θは5,
20, 35℃
で それ ぞれ38,
45, 52° と, 温 度 と
とも に広 が った^<38)>。
の 複合体 の 結晶構造が
に よ り決 定 され て い る^<47)>。
基質
His-92,
T1は,
この 蛋 白質 の唯 一
His-40,
Arg-77な
どが
基 質 の結 合 部 位 に トリプ トフ
4.
蛍 光 消 光 機 構 の過 渡 吸 収 ス ペ ク トル の 測 定 に よ る
研究
これ まで い ろ い ろ な 場 合 に つ い て,
トリプ トフ ァ ンの
2229
58
蛋 白 質
表4. 蛋
核 酸
酵 素
Vol. 35
No. 13
(1990)
白 質 に 結 合 した い ろ い ろ な 単 一 分 子 の 蛍 光 減 衰 パ ラ メ ー タ
τ_i,φ_iや β_iは式 (2) と式 (4) で 定 義 され て い る。 ま た τ_iと φ_iはナ ノ秒 の 単 位 で 表 わ した 。
a) ル マ ジ ンール マ ジ ン蛋 白質 複 合 体, b) オ キ ソル マ ジ ンール マ ジ ン蛋 白質 複 合 体, c) リボ フ ラ ピ ン-ル マ ジ ン蛋 白 質複 合 体 。d)
蛍 光 減 衰 関 数 は4指
数 関 数 で 記 述 され た が 最 短 寿 命 は省 略 した 。
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時 間 分 解 蛍 光 につ い て述 べ て きた 。 蛍 光 強 度 と偏 光 異 方
性 の い ず れ の時 間 変 化 にお い て も, 蛍 光 の消 光 定 数 が た
い へ ん 重 要 な 役 割 を果 た す 。 一 般 に蛍 光 の消 光 は, (1)励
起エ ネ ル ギ ー移 動, (2)無 蛍 光 性 励 起 二 量 体 また は励 起 錯
体 の 生 成, (3) 重 原 子 との 接触 に よる 三 重 項 状 態 へ の 移
行, (4) 光誘 起 電 子 移 動 とそ れ につ づ く反 応, な ど の原 因
に よる。 これ らの うち, (1)か ら (3)
ま で につ い て は詳 しい
反 応 機 構 が 早 くか ら解 明 され てい た^<50)>。
最 近, 超 高 速 時
間 分 解 過 渡 吸 収 ス ペ ク トル (解 説1参 照) の 測 定 に よ
り, これ ま で原 因 の よ くわ か らな か った 蛍 光 の消 光 が ほ
と ん ど (4)
の機 構 で起 こ る こ とが わ か って きた^<51,52)>。
また
い ろ い ろ な系 で, 光 誘 起 電 子 移 動 の詳 細 な 機 構 が 解 明 さ
れ て き た^<53)>。
溶 液 中 で は 励 起 分 子 と消 光 分 子 は 出 会 い,
しか し, 溶 液 中 の フ ラ ビ ン の蛍 光 が ト リプ トフ ァ ンに よ
錯体 に お け る 電 子 移 動 で,
り消 光 さ れ る場 合 で は, ラ ジカ ル イ オ ン対 の 生成 が過 渡
ラ ジ カル イ オ ン対 を 生成 す
る。
吸 収 ス ペ ク トル の測 定 に よ り観 測 され て い る^<54)>ここで
は電 子 受 容 体 で あ る フ ラ ビ ンが 励 起 され る。 この ラジ カ
ル イ オ ン対 は, D-ア ミノ酸 酸 化 酵 素^<54)>や
フ ラ ボ ドキ シ
ン^<55)>に
お い て も 観 測 され た (図7)。
ラ2カ ル イ オ ン対
こ こ で*印 に励 起 分 子 を表 わ す。DとAは
畳 容 体 で あ る。DとIAが
は, 励 起 後33ps以
電子供与体 と
励 起状 態 の寿 命 の間 に電 子 移 動
が可 能 な 距 離 に固 定 され て い る場 合 に も, 同 様 の現 象 が
起 こ る。 ラ ジ カル イ オ セ対 は, こ の あ とア モ オン とカチ
オン に分 離 す るか, Dの
いは
も とりDとAに
内 に ラ ジ カル イ オ ン対 が 生 成 した 。
フ ラ ビ ンは蛋 白質 の ア ミ ノ酸 残 基 と水 素 結 合 して い る と
考 え られ る の で,
あ ま り 動 け な い で あ ろ う。 した が っ
て, フ ラ ビ ンの近 傍 に あ る トリプ トフ ァ ン残 基 が, こ の
時 間 領 域 で 運 動 して相 互 作 用 した も の と思 わ れ る。
三 重 項 とAに 分 離 す るか, あ る
も ど る。
III.ア ミノ酸 残 基 置 換 と蛋 白質 構 造 の
蛋 白質 内 の トリプ トフ ァ ン蛍 光 が, 正 の電 荷 を もつ ア
ミノ酸 残 基 や=CO,
フ ラ ボ ドキ シ ンで
S-Sな
どに よ り消光 され る場 合,
リプトファン
は電 子 供 与 体 と して働 ぐ と思 わ れ るが, ま
だ ラジ カル イ オ ン対 の 生 成 を 確 認 した 報 告 は な レこ
。
ダ イナ ミク ス
ト
カル モ ジ ュ リンは 分子 量17,000酸
性 蛋 白質 で, 広 く
真 核 細 胞 に 分 布 す る。 こ の蛋 白質 は 多 くの代 謝経 路 にお
い て カル シ ウ 染 の調 節 に関 与 して いる。 また カルシ ウ ム
2230
59
トリプ トフ ァンの超 高速時間分解 分光 と蛋 白質構 造のダイナ ミクス
図8.
Ca結
合 ア ミノ酸 置 換 カル モ ジ ュ リ ンの
時 間 分 解 蛍 光 スペ ク トル^<60)>
カ ル モ ジ ュ リ ンは, チ ロ シ ン を2個
(Tyr-99,
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図7.
フ ラボ ドキ シ ン内 で の フ ラ ビ ン と ト リプ トフ ァ
ン間 の ラ ジ カル イ オ ン対 の 過 渡 吸 収ス ペ ク トル^<55)>
Desulfovibrio vulgaris Miyazaki
フ ラ ボ ドキ シ ンのFMN
を 励 起す る と, こ の近 傍 に あ る トリプ トフ ァン残 基 か ら光 誘 起
電 子移 動 が起 こ り, ラ ジ カル イ オ ン対 (Trp^+…Flavin^-)
成 す る 。 図 中 に光 励起 後 の時 間 が 記 され て い る。
光 ス ペ ク トル は 励 起 後 の 時 間 と と も に 長 波 長 側 に シ フ トす
る 。 励 起 後 の時 間 は, 短 長 側 の ス ペ ク トル か ら そ れ ぞれ,
0.1, 2.2, 6.5, 16.2nsで
あ る。
が生
の構 造 が 伸 び る こ とが 示 唆 され た 。 こ の こ とは Babu
の指 摘 と一 致 す る^<56)>。Small
と Anderson
と 結 合 して サ イ ク リ ッ ク ヌ ク レオ チ ドホ ス ホ ジ エ ス テ ラ
ーゼ ,
ア デ ニ ル シ ク ラ ー ゼ,
ミオ シ ン軽 鎖 ギ ナ ー ゼ な ど
カ ル モ ジ ュ リ ンの 結 晶 構 造 は Babu
れ た 。 こ れ に よ る と, 半 径10Å
ュ
リ ン は2個
ほ ど の2つ
の球 状部 分
例2に
相 当 して ゆ っ く り運 動 してい る可 能 性 も あ る。
Kilhoffer らは^<59,60)>,
遺 伝 子 工 学 に よ りTyr-99を
Trp-99に
置 換 して,
こ の トリプ トフ ァ ン残基 の 時 間 分
の チ ロ シ ン, Tyr-99とTyr-138を
つ い て 研 究 して い る。 こ の置 換 カル モ ジ ュ リ ンは, 機 能
水 と 接 触 で き るが,
互 いセ
こ隣 殆
近 接 レ て い る。Tyr-99は
Tyr-138は
ら に よれ ば^<57)>, 280nmの
れ らの2個
の チ ロ シ ン残 基 が 結 合 して320nmに
を も つ ジ チ ロ シ ン を 生 成 し,
も って
っ て お り,
部分的 に
内 部 に 埋 もれ て い る 。
Anderson
光 を 照 射 す る と,
こ
吸収 帯
こ の ジ チ ロ シ ン が400nm
と Anderson
か ら カ ル テ ジュリ
(表4)。
的 に は も と の カル モジ ュ リン とほ とん ど変 わ らな い。 蛍
光 ス ペ ク トル は348nmに
極 大 を もち, カル シ ウム が結
合 して い て もい な くて も変 わ らな い 。 しか し時 間 分 解 蛍
光 ス ペ ク トル (図8)
い と5ns以
内 に2nmほ
では, カル シ ウ ムが 結 合 して い な
ど シ フ トす るだ け で あ る が,
やル シ ウ ムが 結 合 す る と20ns以
内 に9nmほ
ど長 波 長
側 に シ フ トす る。 ず な わ ち カル シ ウ ムが 結 合 す る と, 結
に 蛍 光 を発 す る。
でいる
相 当 す る と解 釈 して い る。 蛍 光 強 度 は ど の よ うな条 件 で
所 の カ ル シ ウ ム結 合 部 位 を も つ 。 カ ル モ ジ
合 部 位IIIとIVに
Small
は^<56)>,
カル シ
ウム の解 離 に よ り現 わ れ た φ_1成分 は セ グ メ ン ト運 動 に
解 蛍 光 か ら, カル モ ジ ュ リン構 造 とそ の ダ イ ナ ミクス に
い
る。 こ れ ら の チロシン
ca結
ら^<56)>に
よ り決 定 さ
の αヘ リ ッ ク ス で つ な が って い る 。 各 球 状 部 に は
そ れ ぞ れ2ヵ
ら
もす べ て 非 指 数 関 数 的 に減 衰 した の で, ジ チ ロ シ ンは事
を 活 性 化 す る。
が1本
Tyr-138)
も つ が トリプ トフ ァ ンを もた な い 。 ア ミノ酸 置 換 カ ル モ ジ ュ
リ ンで は, Tyr-99が
トリプ トフ ァ ンで 置 換 され て い る。 蛍
は^<58)>,
ジ チ ロ シ ン の 時間 分 解 蛍 光
ン構 造 のダ イ ナ ミク ス に つ い て 研 究 し
カ ル シ ウ ム を 結 合 した カ ル モ ジ ュ リ ン
では,蛍 光偏光の減衰は指数関数的 で φ_1=9.9nsを 得
合 しそ い な い 場 合に 比 べ て,
トリプ トフ ァ ン蛍 光 の溶 媒
効 果 が は や か に大 き くゆ っ く りと起 こ る こ とを 示 して い
る。 この こ とは光 励 起 ど と もにTrp-99が
蛋 白質 構 造 の
変 化 を伴 りて 表 面 に 出 て くる こ とを 示 して い る。
た。 ジチ ロシンでは トリプ トフ ァン残基 の よラな分子 内
回転運 動は不 可能 である。 カル シ ウムを結合 していない
と
き蛍光 偏光 は 非指数関数的 に 減衰 し, φ_1=2.1nsと
φ_2=6.8nsを 得た。φ_2は蛋白質全体の回転相関時間に
相 当 し, カル シ ウ ムが 結 合 す る と カル モ ジュ リン の全 体
おわ りに
ピコ秒か らナ ノ秒領域 の蛋 白質構造 の ダイナミクスは,
アロステリック蛋白質な どの大きな構造変
化にた いへん重要な役割 を果たし てい る と思わ れ る。本
2231
60
蛋 白 質
核 酸
酵 素
稿 の例 か ら明 らか な よ うに, 1つ の蛋 白質 分 子でも
Vol. 35
「か
た い」 部 分 と 「や わ らか い」 部 分 が存 在 す る。 した が っ
て, 蛋 白質 構 造 の ダイナ ミクス と構 造 転 位 との 関連 に つ
19)
20)
い て 明 らか にす る た め に は, 時 間 領域 と空 間領 域 の両 面
か ら検 討 す る必 要 が あ る。 遺 伝 子工 学 的手 法 に よる トリ
プ トフ ァ ンの ア ミノ酸 置換 は,
1つ の蛋 白質 の い ろ い ろ
21)
22)
な部 分 で の動 的 な 性 質 を 知 る の に た い へ ん 有 用 で あ ろ
う。 また 今 後 の課 題 と して,
ト リプ トフ ァ ンの蛍 光 消 光
23)
機 構 を解 明 し, 実 験 結 果 を定 量 的 に解 釈 で き る よ り正 確
な モ デル を確 立 す る こ とも大 切 で あ る。
文
1)
木原
24)
献
25)
裕 ・小 林 孝 嘉 ・木 下 一 彦 ・永 山 国昭 ・広 海
26)
Database Center for Life Science Online Service
啓 太 郎:時 間領 域 か ら見 た 生命 現 象, 分 子 過 程 か
ら機 能 ま で, 本 誌 別 冊 No. 28 (1985)
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28)
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4) “c’†•¶•v: ƒŒ•[ƒU•[Œ¤‹†,
15,
992-1002
(1987)
29)
5) “c’†•¶•v: ‘æ24‰ñ•ªŽq‰ÈŠw‰Ä‚ÌŠw•Z•u‰‰—vŽ|•W
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28,
(1989)
「超 高 速 」 時 間 分 解 分 光 法
超 高 速 時 間 分 解 分 光法 は, 極 短 時 間 パル ス レーザ ー の
開 発 と高速 時 間分 解 測 光 技 術 の進 歩 が あ い ま っ て, こ の
20年 間 に飛 躍 的 に進 歩 した。 「
超 高 速 」 とい う言 葉 は現
ま で蛍 光 を発 しな い と考 え られ て い た 生体 成 分 が フ ェ ム
ト秒 領 域 で蛍 光 を 出 して い る可 能性 も あ る 。
(2) 過 渡 吸収 ス ペ ク トル 法: 励起 分 子 お よび 励 起 分 子
在 では ピコ秒 (ps; 10^<-12>秒) か ら フ ェ ム ト秒 (fs;
10^<-15>秒) の時 間領 域 の分 光 法 に対 して用 い られ る。 こ
が ひ き起 こす, さ ま ざま な 反 応 の 中 間体 が 時 間 と と も に
の よ うな 分 光 法 に は, 以下 に示 した2つ の方 法 が あ る。
時 間 分 解 吸 収 ス ペ ク トル を 測 定 す る こ とに よ っ て調 べ
(1) 時 間 分 解 蛍 光 法: 蛍 光 強度 や 蛍 光 ス ペ ク トル, 蛍
光 偏 光 異 方 性 な どの 時 間依 存性 を測 定 す る。
変 化 して い くあ りさ ま を, そ れ ら の ピ コ秒 ・フ ェム ト秒
る。
過 渡 吸 収 ス ペ ク トル 法 は, 主 と して 励 起 分 子 が 他 の分
蛍 光 はそ の蛍 光 分 子 の まわ りの環 境 に 敏 感 な の で, 本
子 と相 互 作 用 した 結 果, 新 しい 分 子 種 を 生 成 して い く過
文 で述 べ た よ うに生 体 分 子 の コ ンボ メ ー シ ョン変 化 や構
程 を観 る の であ る。 蛍 光 をだ さな い分 子 の場 合 に は時 間
造 の ダ イ ナ ミク ス につ い て研 究 す る の に適 して い る。 現
分 解 蛍 光 法 は 適 用 で きず, 過 渡 吸収 スペ ク トル 法 に よ っ
在 ピ コ秒 領 域 の パル ス レーザ ーを 用 い て,蛋
白質 中 の ト
て い ろ い ろ な 知 見 が 得 られ る。 現 在 ピコ秒, フ ェム ト秒
リプ トフ ァ ンや チ ロシ ン残 基 の蛍 光, フ ラ ビン蛋 白質 の
領 域 の過 渡 吸 収 スペ ク トル 法 に よ り, 光 合 成 系 や そ の ほ
蛍 光, そ の ほか 生 体 高 分 子 の構 造 と ダ イ ナ ミク ス につ い
か の光 受 容 体, 種 々 の モ デル 系 な ど にお け る光 誘 起 電 子
て研 究 され て い る。 これ ま で ナ ノ秒 パ ル ス で測 定 され て
移 動 の研 究 や, COヘ
い た蛍 光 寿 命 も, ピコ秒 パ ル ス レーザ ー で測 定 す る と,
に伴 うヘ モ グ ロ ビ ンの構 造 変 化 な どに つ い て 研 究 され て
ず っ と短 い寿 命 成 分 が 現 わ れ る こ とが 多 い。 また, これ
い る。
【解 説2】
ー
ー ザ ー に よ っ て 同期 励 起 され た 色 素 レー
ー を発 振 させ る
。 色 素 レー ザ ー で は用 い る 色 素 に よ って
波 長 範 囲 が異 な る が, 約660∼800nmの
ザ ーで あ り, そ の標 準 的 な 性 能 は 以下 の よ うで あ る。
り, パル ス幅 も約300fsと
CWモ
ス圧 縮 器 を用 い る と, パ ル ス 幅 は約60fsま
ー ド同 期YAGレ
幅 約100ps;
ーザ ー, 波 長1.06μm;
く り返 し82MHz)
光解離
「超 高 速 」 時 間 分 解 蛍 光 の 測 定 法
現 在 も っ と も一 般 的 に用 い られ て い る の は, CWモ
ド同期YAGレ
モ グ ロ ビン に お け るCOの
パル ス
か らの 光 パ ル ス は光 フ
ァ イバ ー と グ レーテ ィ ン グの ペ ア に よる パ ル ス圧 縮 器 で
パ ル ス幅 が4psに
な り, 波 長 変 換 器 に よる第 二 高 調 波
発 生 で1.06μmか
ら半 分 の532nmに
変 換 され る。 こ
の レーザ ー光 を励 起 光 と して 同期 励 起 方 式 で色 素 レーザ
間で可変 であ
短 くな る。 これ に さ らに パ ル
で圧縮 でき
る。パ ル ス光 を増 幅 して 出力 を上 げた 場 合, 最 終 的 に は
パル ス幅 は約500fsに
広が る
。 ま た実 際 の 測 定 の 場 合
は, 第 二 高 調 波 を 発 生 させ, 半 分 の波 長 に した パル ス で
励 起 す る場 合 が 多 い 。
蛍 光 測 定 の時 間 分 解 能 は, 測 光 の時 間 分 解 能 に よっ て
2233
62
蛋 白 質
核 酸
酵 素
も左 右 され る。 光 検 出器 に は ス トリー ク カ メ ラ (分 解
能>5ps),
時 間 相 関 単 光 子 計 数 法 (分解 能>30ps)
る。 また 最 近,
があ
ピ コ秒 以下 の 時間 領 域 で の測 定 に は, 蛍
Vol. 35
(1990)
とに交 互 に積 算 して 測 定 す る。 偏 光 子 の 回転 は コ ン ピ ュ
ー タで 制 御 す るか
, あ る い は一 定 時 間 積 算 す る と測 定 が
自動的 に とま る よ うに してお い て, 偏 光 子 を 手 で回 転 さ
光 と超 短 レー ザ ー パル ス の光 混 合 を種 々 の遅 延 時 間 で行
せ て も よい。I_<￨￨>(t)とI⊥(t)
な っ て蛍 光 の生 成 ・減 衰 曲線 を測 定 す る, ア ップ コ ンバ
ー ジ ョン法 (分 解 能>280fs)
が 開発 され て い る
。単 光 子
っ て偏 光 異 方 性r(t)
計 数 法 の時 間 分 解 能 は, コ ン ピュ ー タに よ るデ コ ンボ リ
て か ら強 度 を 測 定 す る こ とが大 切 で あ る。 ピ コ秒 ・フ ェ
ュ ー シ ョンに よ って 約10ps以
ム ト秒 時 間 分解 分 光法 のす ぐれ た解 説 書 が Fleming
下 に 向上 さ せ る こ とが で
き る。
か ら本 文 の式 (3)
によ
が 得 られ る。 偏 光 異 方 性 の 測 定 に
は分 光 器 の前 に散 乱 板 を 置 い て, 偏 光 を 完 全 に解 消 さ せ
に
よ って 著わ され て い る^<1)>。
時 間 分解 蛍 光 偏 光 異 方 性 の 測 定 は, 発 光 側 に偏 光 子 を
1)
設 置 して測 定 す る。 励 起 パ ル ス レーザ ー はす で に偏 光 し
て い るの で, 偏 光 子 を 回 転 させ て, この 偏 光 面 に平 行 な
蛍 光 強 度 I_<￨￨>(t)
と垂 直 な 蛍 光 強 度I⊥(t)
Fleming, G.: Chemical Applications of Ultra
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Oxford University Press,
New York (1985)
を一 定 時 間 ご
【解 説3】
Database Center for Life Science Online Service
No. 13
時 間分解蛍光偏光異方性
蛍 光 偏 光 異 方 性 の 理 論 や 測 定 法 お よび 生体 系 へ の応 用
依 存性 を表 わ す 理 論 式 を得 るた め に は, 分 子 の拡 散 方 程
に つ い て は, 主 と して Weber^<1)>によ り開 発 され て きた 。
式 を解 か な くて は な らな い。 また, 蛋 白質 の よ うな球 状
蛍 光 偏 光 異 方 性 の 測 定 法 や解 析法 に つ い て は, 本 誌 の別
分 子 に トリプ トフ ァ ン残 基 や 蛍 光 標 識 色 素 が 結 合 してい
冊 号^<2)>や
木 下 ・御 橋 の 著 書^<3)>に
詳 し く 述 べ られ て い る の
る場 合 に は, 偏 光 異 方 性 は 近 似 的 に 二 指 数 関 数 的 に 減 衰
で, こ こ で は原 理 的 な解 説 に止 め てお く。
分 子 の電 子状 態 問 で遷 移 が起 こるた め に は, 分 子 は有
限 の遷 移 モ ー メ ン トを も っ て い な くて はな らな い。 遷 移
し, 小 分 子 の分 子 内運 動 の回 転 拡 散 係 数 と蛋 白 質 全 体 の
拡 散 係 数 が 求 め られ る。
木 下 ら は生 体 膜 の脂 質 層 に 棒 状 の 蛍 光 色 素1,6-ジ
フ
モ ー メ ン トは ベ ク トル な の で 固 有 の 方 向性 を も って い
ェニル ヘ キ サ トリエ ン (DPH)
る。 した が っ て, 試 料 に あ る特 定 の偏 光 面 を もつ 光 を 照
度 の 円錐 内 で首 ふ り運 動 を す る場 合 (本 文 図1)
射 す る と, 遷 移 モ ー メ ン トが こ の偏 光 面 と同 じ方 向 に あ
異 方 性 の理 論 式 を 導 き, 生 体膜 の 流 動 性 に つ い て 解 析 し
を標 識 し, これ が あ る角
の偏 光
る分 子 だ け が 励 起 され る。 また 蛍 光 も個 々 の分 子 は そ の
て い る (本 文 の文 献11)。
遷 移 モ ー メ ン トの方 向 の偏 光 を発 す る。 偏 光 異 方 性 は こ
子 軸 と遷 移 モ ー メ ン トの 方 向 が一 致 して い るの で, 得 ら
の両 方 向 の 差 に依 存 す る。 も しラ ン ダ ムに 配 向 して い る
れ た 式 は 比 較 的 簡 単 で あ った。 蛋 白 質 中 の トリプ トフ ァ
ン残 基 は 分 子 が 完 全 に 非 対 称 で あ るの と, 共 有結 合 に よ
全 分 子 が, 吸 収 時 点 と発 光 時 点 でそ れ らの 遷 移 モ ー メ ン
トを 変 え な けれ ば, 偏 光 異方 性 は0.4で
あ る。遷 移 モ ー
メ ン トの方 向 を変 え る 原 因 に は つ ぎの よ うな もの が あ
る。
木 下 らの用 い たDPHは,
分
り束 縛 され て い る ので, 問題 が も っ と複 雑 で あ る。
これ ら の理 論 式 は, い ず れ も蛍 光 強度 が指 数 関数 的 に
減 衰 す る こ とが 前 提 に な って い る。 す な わ ち, 蛍 光 消 光
(1) 励 起 状 態 で の 電 子状 態 の 変化: 各 電 子 状 態 に は 固
定数 が 分 子 の回 転 運 動 に よ って変 化 しな い と仮 定 して い
有 の遷 移 モ ー メ ン トが あ る の で, 励 起 の瞬 間 か ら発 光 の
る の で あ る。 しか し 蛋 白質 中 の ト リプ トフ ァ ン 残 基 で
瞬 間 ま で の あ いだ に電 子 状 態 が 変 化 す る と, 時 間 に依 存
は, 蛍 光 が あ る 特定 の他 の ア ミノ酸 残 基 に よっ て消 光 さ
して偏 光 異 方 性 が 減 少 す る。 こ の場 合 は, 全 分 子 が 蛍 光
れ る の で, 蛍 光 消光 定 数 は回 転 角 に よ っ て変 化 す る はず
寿 命 のあ いだ に固 定 され て い て も偏 光 解 消 が 起 こ る。 た
で あ る。 この よ うに消 光 定 数 の分 子 内回 転 角 依 存 性 を 考
とえ ば, 励 起 エ ネル ギ ー移 動 や 電 子 エネ ル ギ ー緩 和 な ど
慮 す る と, これ ま で得 られ て いた 偏 光 異 方 性 の理 論 式 と
で あ る。
事情 が か な り異 な っ て くる。 蛍 光 強 度 の減 衰 と, 偏 光 異
(2) 分 子 の運 動: 吸収 と発 光 の遷 移 モ ー メ ン トが 同 じ
で も, そ れ を 担 っ て い る分 子 が 回 転 や 横 揺 れ運 動 を す る
方 性 の減 衰 が 互 い に相 関 して く る よ うに な る。
1) Weber, G.: Polarization of the Fluorescence
と遷 移 モ ー メ ン トの方 向が 変 わ り, 時 間 に 依 存 しで偏 光
Solution,
異 方 性 が 減 少 す う。 回 転 運 動 の場 合, 偏 光 異方 性 が 減 少
cenceAnalysis
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す る速 さ は 分 子 の 回 転 運 動 の拡 散 定 数 に よ って きま る。
も し分 子 が球 状 で あ れ ば, 拡 散 定数 は1種 類 で あ り, 偏
2)
数関
数の 和 で表 わ きれ る。 ま た 完全 に非対 称 な分 子 で は
3種 類 の拡 散 定 数が あ り, 5つ の指 数 関数 の和 で減 衰 す
る。
偏光解消が (2)
の原 因で起 こる とき, 偏光異方性 の時間
Fluorescence
and
of
Phosphores
pp. 217-
金 岡 祐 一 ・柴 田和 雄 ・関 根 隆 光 ・高 木 俊 夫 編:
「蛍 光 測 定 の 原 理 と 生体 系 へ の 応用 」, 本誌 別 冊
光 異方 性 は 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る。 回転 楕 円体 で あれ
ば, 拡 散定 数 は2種 類 で, 偏 光 異方 性 の減 衰 は3つの 指
in
3)木
(1974)
下 一 彦 ・御 橋 廣 眞 編: 蛍 光測 定 一
の応 用, 学 会 出 版 セ ンタ ー (1983)
生 物-学 へ
ト リプ トフ ァ ン の超 高 速 時 間 分 解 分 光 と蛋 白質 構 造 の ダ イ ナ ミ クス
63
【解説4】 可変周波数位相差蛍光法
蛍 光 寿 命 を 測 定 す る方 法 に は2通 りあ る。1つ は短 い
パ ル ス 光 源 で 励 起 して 蛍光 強度 の 時 間変 化 か ら寿 命 を測
あ られ る。 一 般 に, 変 え る周波 数 の種 類 が 多 け れば 多い
定 す るの に 対 し, 位 相 差 蛍 光法 は 強度 が周 波 数fで 変 化
す る連 続 光 を 用 い て試 料 を励 起 す る。 励起 光 をI(t)と
光 法 は, レーザ ー光 の強 度 を レーザ ー の偏 光 面 を 変 え る
ポ ッケル ズ セ ル に よ り 任 意 に 変 化 させ て 試 料 を 励 起 す
す る と,
る。蛍 光 の 位相 差 と キ ジ ュ レー シ ョンを 周 波 数 の関 数 と
I(t)=a+bsin2πft
して プ ロ ッ トして, い ろ い ろ な モ デ ル の 蛍 光 減 衰 関 数 に
蛍 光 は 同 じ周 波 数 で 変 化 す る連 続 光 と して 得 られ るが,
あ うか ど うか を 最 小 自乗 法 で 検 定 す る の であ る。 位 相 差
励 起 光 とは 位 相 が 異 な る。
F(t)=A+BcOsφsin(2πft+φ)
蛍 光法 は 主 と して イ リノ イ大 学 の Weber
が 理 論 を,
Spencer (Weber
研 の卒 業 生 で現 在SLM-AMINCO社
こ こで, 位 相 φは
Database Center for Life Science Online Service
ほ ど多 くの 寿命 成 分 が 分 離 で き る。 可 変 周 波 数 位 相 差 蛍
の 社長) が 装置 を 開 発 して発 展 さ せ て きた 。 可 変 周 波 数
tanφ=2πfτ
位 相 差 蛍光 法 は 同 大 学 物 理 学 科 の Gratton に よ り開 発 さ
で あ る。 した が って, φ を 測 定 す る と蛍 光 寿命 τが 求 め
られ る。 こ の式 か らのfの 逆 数 は 寿 命 と向 程度 で な けれ
れ, 原 理 的 に は ピ コ秒 領 域 のパ ル ス法 と ま った く同等 な
寿 命 測 定法 とな つた 。 イ リノイ 大 学 に は 蛍 光 解 析 の研 究
ぼ な ら な い。 ほ か に 測 定 で き る量 は モ ジ ュ レー シ ョ ン,
所 が あ り, 位相 差 蛍 光 法 の 世 界 的 な メ ジカ と な っ て い
cosφ で あ る。 も し試 料 が2種 類 の 寿 命 を も って い る と
るご ア メ リカ め 生 化 学 分 野 では Weber
き は, 周 波 数fを3種
相 差 蛍 光 法 が隆 盛 を 誇 って い る。
類 に 変 え て そ れ ぞれ の位 相 とモ ジ
学 派 を 中心 に 位
ュ レー シ ョ ンを測 定 す れ ば, そ れ らの 寿命 と成 分 比 が求
2235
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