日本貝オ団補助金による
____llli一生存~貝オBfl主去入、日ヰコ臣三寺会昔話壬雲母右足定幸良壬告書書
一調査並びに研究に対する助成一
/
デ
タ F年 3月
財団法人
日中医学協会
中
理事長
/日
島
章
殿
附 表 者 氏 名 紳 ム 主 方 魚
署働宕造業医 i
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品会新免汁
所属機関名 l
職
名訴長
S2才
年齢
削除)1同命婦l..
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所 在 地 〒Z
電話 044-効~-6{11
内線
今 ら 備 削 減 ポ 材 料 開 u去アス M トイ汗
繊 維 の 絢 胞J
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三γ
主 左 物 性 k巧 比 較 祈 九
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2
. 研究期間
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」笠I.J...~平一主FI
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，
、
，
至
1998 年___1一月
15一日
3
. 研究組織
日本側研究者氏名神ム望丸
(
f
1
.才)
所属機関糊沼産屋所
中国側研究者氏名島
所属機関
l世イ薬
職名
笠二島
職名
Z
1
会吃孝之
(係才)
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気長弟ト犬笠 i
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1
乙
也
事
項L
Z34Q
.
.
JFM繊 維 状 標 準 試 料 を 用 い た ア ス ベ ス ト 代 替 繊 維 の
細胞毒性と物性との比較研究
日本側研究代表者 神山宣彦
中 国 側 研 究 代 表 者 劉 世傑
1.はじめに
アスベスト曝露によって肺線維症、肺ガン、中皮腫等が引き起こされることが判明し、先進国では
アスベスト使用は厳しく管理・制限されている。しかし、発展途上国では、アスベストは依然として
重要な工業材料・資源として採掘、加工及び製品生産が盛んに行なわれている。アスベスト関連疾患
の予防の面から現在可能な対策としては、 (1)作業環境のアスベスト濃度の減少、 (2)使用可能
な代替物質の開発、 (3)アスベストの毒性軽減のための繊維表面性状の改質方法の研究、などがあ
る。これらの点を日中両国の関係で見てみると(1)については、日本や欧米の環境測定や管理の方
法が良く知られており、今後は中国側の経済事情が環境改善の成否の多くを占めるであろう。(3)
については、中国で種々の研究が進んでいる。まだ決め手になるような改質方法は完成していないよ
うだが、今後も中国独自に進められるものと見られる。(2)については、最近、特に日本で多種多
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s;MMMF)がアスベスト代替繊維として製造されている。
様な人造鉱物繊維 (Manmadem
また、中国ではアスベスト代替繊維として人造鉱物繊維とは別に豊富な鉱物資源産出国として、アス
ベスト以外の種々の天然鉱物繊維を大量に採掘・生産・輸出しており、日本にもかなり輸出している。
日本も含めて欧米先進国では、製造物責任という観点からの法律整備がなされ、こうした人造鉱物
繊維についても予め使用に先立つ有害性調査が重要視されている。アスベストに限らず繊維状物質の
生体影響は、一般に細くて長い繊維サイズと体内耐久性が重要な因子と見られていることから、アス
ベスト代替繊維についても十分な生体影響研究の実施が必要である。しかし、それらの生体影響につ
いてはまだ不明なものが多い。この状況は日中ともにまだその研究の端緒についたばかりで同様であ
る
。
1種類の MMMFやウイスカ一類、有機繊維などか
本研究は、最近日本で新たに調整・準備された 1
ら成る JFM標準試料とその他、アスベスト代替繊維試料として数種の天然鉱物繊維について、生化
学および遺伝毒性的手法による i
nv
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r
oの細胞毒性と線維状物質の様々な物性とを比較検討して、個々
の繊維状試料の毒性評価とともに毒性発現機序の解明にも迫ろうとするものである。
2
.研 究 の 概 要
本研究に用いた繊維状試料の調整とキャラクタリゼーションを日本側が行った。日本側の産医研で
は、過去にアスベストを始めとして種々の繊維状鉱物を調整し、それらの一部についてラットを用い
nv
i
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o試験を行ってきたが、現在それらの試験を行える研究者
た発癌試験と染色体異常試験などの i
はいない。今回は、中国側グループによって既に発癌性試験成績のある試料も含めて JFM試料につい
て次のような細胞毒性試験や変異原性試験を行った。中国側の行った試験は. [日種々の細胞との反
) 細胞膜透過性への影響. 3
) 細胞膜流動性への影響、 4
) アルカリ性染色
応性試験:1)溶血性. 2
剤の吸着、 5
) 細胞内 濃度に対する影響、 6
) 細胞内グルタチオン (
G
S
H
)濃度に対する影響、 [
1日遺
) A549細胞 DNA
鎖の断裂、 2
) HEL
細胞染色体異常、 [
I
I
I
]表面改質の試み:くえん
伝的損傷影響: 1
酸アルミニウムの溶血性抑制作用などである。
c
a
3
.試料と方法
研究試料は、
11種類の JFM標準繊維状試料を中心に、アスベスト、天然拡物繊維、などである
(左上)。毒性評価のための細胞には、人の赤血球、モルモットの肺胞マクロファージ、人の血中リ
ンパ球などを用いた。 J F M標準繊維状試料についてのキャラクタリゼーション(物性解析)は、既
にX線回折、熱分析、蛍光 X線分析、サイズ分布測定、などが行われており、今回は、高分解能電子
顕微鏡による繊維横断面観察を主に行った。
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4
.結 果
[1]被検試料の物性解析と表面構造の観察
l
) 被検試料のキャラクタリゼーション
J F M標準繊維状試料 11種類の主な物性をまとめて室主に示した。繊維サイズについても、去2
に示した。
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) 高分解能電子顕微鏡による JFM試料の繊維横断面観察
赤血球の溶血性、マクロファージによる貧食など、いずれも細胞膜と繊維表面の接触という局面が
存在する。表面原子のパッキングが密なほど、すなわち原子オーダーでスムースな表面を持つ粒子ほ
どある種の細胞毒性が低いという結果も報告されている。そういった観点から、実際の表面構造を直
接原子オーダーで観察しその同一物質の詳細な細胞毒性試験との比較検討を行うことは、表面形状と
毒性との関連製を探る上で大きな期待が持てる。表面構造の原子オーダー観察のための試料は、繊維
を樹脂に包埋し、ウルトラミクロトームにより繊維横断面が電顕支持膜に並んだ超薄切片試料を作製
した。観察は最新の高分解能電子顕微鏡により行った。
繊維を電顕支持膜に分散させて観察する通常の方法では、繊維の軸方向に沿った表面構造が見える。
一般にどの繊維の表面も平滑である。一方、繊維の軸方向から繊維を見た場合、繊維横断面に現れた
繊維表面が見える。この方向の繊維表面はその種類によって平滑(スムース)なものから凹凸(ジグ
ザグ)の激しいものまでいろいろであった。そのジグザグ度 (
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)を定量的に表現するのは
難しい問題である。そこで、ジグザグ度 (
r
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s
)を下記のような 4段階に分けて表現した。
結果を同じく蓋2に示した。幾つかの表面形
十十十:凹凸がかなり激しい
態の様子を卑上に示した。
++:中くらい
+:少し凹凸がある
一:原子レベルで全く平滑
PT1
、
¥
ピ':'.~.;.::・:.:<.'，'. ~， :"PT1
図
l
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円i
長TI8017)と 打2(K2TI6013)の繊維形態
を示す)
(パーは 5μm
3
日I]種々の細胞に対する傷害性試験
l
) JFM試料の溶血性
200μg/mlのW 0 1懸濁液と 3%赤血球懸濁液を O、5、30、60分間作用させた。その結果、 W O
1の溶血性は時間の延長とともに強くなり(室主)、異なる量を加えて 60分間作用させると去韮のよ
うに量一反応関係が得られた。 500μg/mlのJFM各試料と赤血球を 60分間させた場合には、表Q
Iこ示
すように対照群クリソタイル (UICCC
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eB) に明らかに溶血性がある他、 T01、W01、
GW1、MG1なども弱い溶血性を示した。
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) JFM試料の細胞膜湧渦件に対する影響
(
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) 赤血球からの K+O)遁且
W01とT01の引き起こした赤血球 K +の漏出は、量一反応関係が認められた(去皇)。しか
も
、 500μg/mlのW 0 1とT01の引き起こした赤血球 K +の漏出は、明らかに UICCBより多かっ
た
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A R1とRF1も赤血球 K +の漏出が認められたが、対照群 UICCC
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) 肺胞マクロファージ (AM) よりの K
+O)温邑
W O lと TOlの引き起こした A MからのK_+漏出は、赤血球と同様に明らかに量}反応関係が
認められた(蓋1
) 0 200μ g/ml を用いた場合、全てのJFM~こ AM からのK_+漏出が認められたが、そ
の中で TOlの起こした A MからのK_+漏出は対照群 UICCC
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eBより更に顕著であったの
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(
.
3
) A Mからの LD H (乳酸脱水素酵棄)の漏出
TOlの引き起こした A Mからの L D H漏出は、時間一反応と量一反応関係が共に認められた
(室主ι~) 0 2
00μ g
/
m
lのJFM試料を A Mと60分間作用させると、 RFl、MGl、GWlを除くその他
のJFM全部に A Mからの L D H漏出が見られた。そのうち ARlと PT 1の値は対照群 UICC
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四回)
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性の指標として蛍光偏光性を測定したところ、そのうち W01だけ顕著に A Mの流動性を低下させた
(蓋斗)。
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lのメチレンブルーを用いて 5
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0
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/
m
lの JFM試料と混合して30分後、 AR1.MG1とRF1
のメチレンブルー吸着量は顕著に増加して、そのうち AR1のメチレンブルー吸着量は大体対照群UICC
C
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eBと等しかった(蓋ヰ)。
Tab.
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遥かに低かった。 W01は正常対照と統計上差異はないにも拘わらず、 A M細胞内の '
C
a2+，
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増加は、尚量一反応関係が認められた(蓋込)。
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) A M細胞内グルタチオン I
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] F M試料2
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μ g/mlとA Mを 2時間作用させた。 PT1，T01，SC1，W01，MG1，RF2などは、細胞
G
S
H
)濃度を明らかに減少させた。そのうち、 PT1と T01は対照群u
r
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内グルタチオン (
と大体類似していた(圭 1
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)。
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) JFM試料のA549細胞DNA
鎖の断裂
鎖の断裂発生が見られた
]FM試料200μ g/mlとA549細胞を 1時間作用させた。試料全てにDNA
(塞辺)。そのうち PT1が対照群UICCC
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eBと大体類似の値を示した。
Tab.
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μ g/mlのJFM試料をHumanEmbryoLungC
を測定した。大多数のJFM試料は染色体異常を現した。そのうち SC1の起こした染色体異常率は明ら
かに対照群UICCC
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eBより高かった(蓋1
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) 。染色体異常のタイプは単体型の異常であった。
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500μ g/mlの W Ol
.T01と対照群 UICCBを 200及 び 500μ g/mlの く え ん 酸 ア ル ミ ニ ウ ム
(CitAl) を l時 間 混 合 し た 後 、 細 胞 に 作 用 さ せ た 。 そ の 結 果 、 処 理 後 の W01と 対 照 群 UICC
Bの 起 し た 溶 血 性 は 、 未 処 理 の 試 料 の 溶 血 性 に 比 べ て 明 ら か に 減 少 し て い た 。 T01，W01及
び 対 照 群 UICCChrysotileBの 起 し た K +の 漏 出 も 明 ら か に 少 な く な っ た 。
5
. 結論
以 上 の 実 験 結 果 よ り 、 ほ と ん ど の JFM試 料 の 毒 性 は 対 照 試 料 の ク リ ソ タ イ ル (UICC
Chrysotile B)よりも低いといえる。しかし、 JFM試 料 は 各 影 響 指 標 に よ っ て そ の 作 用 程 度 と
順番は同じでなく指標ごとに多様であった。
1
) 繊維試料の表面電荷を現すゼータ電位は、クリソタイルのみプラスで他はマイナスであ
る 。 溶 血 性 は ク リ ソ タ イ ル (UICCChrysotileB) が プ ラ ス 52.54%で 他 は い ず れ も そ の
1110以 下 の 数 % 以 下 で あ っ た 。 表 面 電 荷 が プ ラ ス の も の が 高 い 溶 血 性 を 示 す と 考 え ら れ る 。
2) 細 胞 膜 傷 害 性 の 指 標 と し て の 赤 血 球 、 A Mか ら の K +漏 出 は 、 対 照 試 料 の ク リ ソ タ イ ル
(UICC ChrysotileB
)よ り 強 い か 同 等 レ ベ ル の も の と し て 、 赤 血 球 と A Mの い ず れ に 於 て も
T01，W O1，AR1が 挙 げ ら れ る 。 同 じ く A Mからの L DH (乳酸脱水素酵素)の漏出は、
AR1と PT1が ク リ ソ タ イ ル と 同 レ ベ ル の 値 を 示 し 、 T01とSC1が 比 較 的 高 か っ た 。 こ れ ら
の繊維と細胞との接触に於て細抱膜の傷害が発生すると考えられる。
3) 様 維 試 料 と A Mとの作用の影響を、細胞内 [Ca2+
j i濃 度 と A M細 胞 内 グ ル タ チ オ ン (GSH)
漫度を指標として評価した。その結果、前者は対照試料のクリソタイルに比べいずれも低か
っ た が 、 後 者 は PT1と T01が 対 照 試 料 の ク リ ソ タ イ ル と 同 等 レ ベ ル に ま で 低 下 し た こ と が
確認された。
4) 遺 伝 的 損 傷 影 響 を (1)A549細 胞 DNA鎖 の 断 裂 と (2).HEし 細 胞 染 色 体 異 常 を 指 標 と し て 見 た
場合、対照試料のクリソタイルより強いか同等レベルのものとして、 (
1)では PT1が ほ ぼ 同
レ ベ ル で SC1，MG1，T01，W01 などが比較的高かった。 (
2
)については、 SC1が ク リ ソ タ
イルより強い異常の発生値を示した。
1
)個々の繊維状物質の泰弘椎化能や遺伝毒性な
今後、これらの成果を踏まえて期待されることは、 (
どがアスベストと比較して評価される、 (
2
)繊維状物質表面の微細構造と細胞毒性との関連性が評価
3
)毒性評価のための簡便なスクリーニング法の確立のための基礎データとして用いられる、
される、 (
などである。
関係論文の発表予定(含む既発表)
1
) Kohyama，N
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997.10.10/15
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，日本繊維状物質研
究協議会研究交流会、東京、 1
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7
3
) 神山宣彦、栗盛静江、篠原也寸志: 2種のチタン酸カリウムウイスカの表面形態の直接観察、日本産業衛生
9
9
8
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4
.
2
2 (発表予定)
学会、盛岡、 1
4
) Wang，Q.，
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9
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