トランスフェクショングレードのプラスミド精製 DN-Sure Plasmid Maxi Kit Cat No. HS-13-10 【目的・用途】 DN-Sure Plasmid Maxi Kit は、陰イオン交換クロマトカラムによる高純度プラスミド精製ができるキットです。DN-Sure Plasmid Midi Kit と同じトランスフェクショングレードのプラスミドを最大 1.5mg まで得ることできる、スケールアップに最適なキットです。精製可能な大腸菌の培養液量は、60〜 240mL（High-copy）/200〜480mL（Low-copy）です。【使用方法】１）カラムの準備 Midi Column を 50mL 遠沈管にセットし、12.5mL の Column-EQ Buffer を加え、自然重力によってカラムを通します。通過した溶液は除去します。２）大腸菌の回収【特徴】 1）トランスフェクショングレードのプラスミド精製が可能 2） 60〜240mL（High-copy）/200〜480mL（Low-copy） 3）プラスミド最大結合容量は 1.5mg 大腸菌培養液を 6,000×g、15 分間遠心して上清を除去します。３）大腸菌の再懸濁 20mL の Resuspension Buffer（※）を加え、ボルテックスもしくはピペッティングにより大腸菌ペレットを完全に再懸濁します。大腸菌のペレットが完全に攪拌されていることを確認してください。 ※ 最初に使用する前に RNase A を必ず添加してください【キット内容】 DN-Sure Plasmid DNA Maxi Kit 内容４）大腸菌溶解液の調製① 10 回分 20mL の Lysis Buffer を加え、15 回転倒混和し混合します（ボルテックス Column-EQ Buffer 135mL は使用しないでください）。その後、室温で 3 分間静置すると、ライセー Resuspension Buffer 215mL トが半透明になります。 Lysis Buffer 215mL Neutralization Buffer 215mL Wash Buffer 315mL Elution Buffer 215mL RNase A (50mg/ml) 430μL Midi Column 10 ５）大腸菌溶解液の調製② 20mL の Neutralization Buffer を加え、ただちに 10 回の転倒混和により混合します（ボルテックスは使用しないで下さい。また、Neutralization Buffer 添加後すぐに混合しないと不均一な沈殿が生じてしまいますのでご注意ください）。その後、4℃、15,000×g、20 分間遠心します。６）カラムへの結合【使用期限】５）で得た上清を、１）で平衡化した Maxi Column に移します。このと室温にて 12 ヶ月（直射日光や湿気を避ける）き、沈殿をカラムに移さないように注意してください。自然重力によっなお、RNase A を添加した Resuspension Buffer は、2-8℃では 1 ヶ月程度、て溶液をカラムに通過させます。一度 Column を遠沈管からはずして通 -20℃では 12 ヶ月安定に保存することができます。過した溶液を除去します。【本品以外に準備が必要な試薬・器具】 • 菌体培養用試薬類 • 70％エタノール • イソプロパノール • 核酸溶解用試薬： TE Buffer あるいは Nuclease-Free 水など • 試薬希釈用器具 • ディスポーザブル手袋７）カラムの洗浄 30mL の Wash Buffer をカラムに加え、自然重力によって溶液をカラムに：：：特級試薬をご使用ください通過させます。特級試薬をご使用ください容器・メスシリンダー・ピペット等 • ボルテックスミキサー • 冷却遠心機 • 遠沈管（15mL 容、50mL 容）【試薬の準備】 RNase A のチューブを軽くスピンダウンして全量を Resuspension Buffer のボトルに加えます。その後は 2-8℃で保管してください。 Lysis Buffer に析出物がないか確認します。もし析出がある場合は、37℃ で加温し溶解してください（激しく振らないようにご注意ください）。８）プラスミドの溶出カラムを新しい 50mL 遠沈管にセットし、15mL の Elution Buffer を加え、自然重力によって溶液をカラムに通過させます。９）イソプロパノールによる沈殿７）で得られたプラスミド溶液に 11mL のイソプロパノールを加え 10 回の転倒混和により混合します。その後、4℃、20,000×g、30 分間遠心します。 10） DNA ペレットの洗浄注意深く上清を除去し、5mL の 70％エタノール（室温）を加え、穏やかに混合し、DNA ペレットを洗浄します。その後、4℃、20,000×g、10 分間遠心します。 11）プラスミドの再溶解注意深く上清を除去し、チューブが完全に乾燥するまで空気乾燥させます（または 70℃にて 10 分間インキュベートします）。乾燥させたペレットに 300μL 程度の TE か Nuclease-Free 水を加え溶解します。得られたプラスミド溶液は-20℃で保存してください。【Q&A】 Q1 DNA の収量が低い菌細胞が完全に溶解していない・細胞数を減らす・工程５）の Neutralization Buffer を加えた後に転倒混和で沈殿を確実に崩す。ただしボルテックスは厳禁。・工程 11）で DNA ペレットを確実に溶解する。 Q2 得たプラスミド DNA が後の実験でうまく作用しない RNA のコンタミネーション・ Resuspesion Buffer に RNaseA を確実に添加する。・ RNase A を添加した Resuspension Buffer は、2-8℃では 1 ヶ月程度、-20℃では 12 ヶ月安定に保存可能。期限を過ぎた場合は、RNase A を 50μg/mL となるように再添加する。・細胞数が多すぎる場合は減らす。ゲノム DNA のコンタミネーション・ Lysis Buffer を添加した後は穏やかに転倒混和する。また、 Lysis Buffer 添加後のインキュベート時間は 5 分以内とする。・過剰培養した菌体は使用しない。 DNA ペレットに塩ペレットに塩が残存している・DNA ペレットを 70％エタノールで 2 回洗浄する。