マイコース・プログラム活動報告書学生番号：0601216030 氏名：切通祥子所属分野名：放射線遺伝学教室期間：2012 年 8 月 10 日∼10 月 6 日活動内容（概略）：スイスのジュネーブ大学に２ヶ月間留学し、Department of Molecular Biology の Thanos Halazonetis Lab で研修しました。研究内容は分子レベルでのがんのメカニズムの解明で、日本人のポスドクの方のもと、基本実験手技を多く学ばせていただきました。 1.渡航前の準備以前からマイコースの期間を利用しての海外研修に非常に興味があったので、３回生の秋頃に友人と共に武田先生にご相談させていただきました。いくつか候補を挙げていただいたのですが、その中でも環境が良く、日本人のポスドクの方がいらっしゃるスイスのジュネーブをおすすめしていただきました。治安も比較的良いとのことだったので、ジュネーブに決め、年始にアプライしました。受け入れが決まったあと、私はそれまで実験の経験がなかったため、武田先生に紹介していただいた小松教授の研究室で、友人と一緒に基本手技を教わりました。ラボでは小林先生がプランを考えて下さり、４月から７月にかけてお忙しい中ご指導してくださりました。出発までに細胞培養、ウエスタンブロッティング、RT-PCR、免疫染色といった基本の手技を習いました。海外渡航の準備として上記の実験準備以外に、飛行機の予約、宿舎の手配、スイスフランへの両替、国際学生証作成、クレジットカードの手続きなどを行いました。宿舎に関しては、Halazonetis Lab の秘書の方が予約してくださり、また宿舎の代金も大学側が出してくださりました。ジュネーブはインターンなどが住む安い宿舎が不足しており、自力で探すのにかなり苦労するようなので、これは本当にありがたかったです。国際学生証は必須ではありませんが、大学のカフェテリアや旅行先の観光スポットでディスカウントしてもらえることがあったので、持っていて損はないと思います。クレジットカードは Visa を持っていきましたが、特に不自由なかったです。スイスは物価が高いとのことだったので、日用品もある程度は日本で揃えて行きました。実際、同じ商品でもスイスの方が断然高いことも多く、買っていってよかったなと思いました。 2.ラボでの活動 Halazonetis Lab での研究目的は、分子レベルでがんの仕組みを解明し、がんの新しい治療法に発展させることです。私はポスドクとして研究されている香崎さんに、２か月間ご指導していただきました。香崎さんのプロジェクトは、DNA 損傷に対するチェックポイント機構の仕組みを解明することで、特にチェックポイントに関わっているとされる Rev7,Rad9,Timeless などの機能や相互作用といった pathway の詳細を明らかにすることが主な目的です。私は研修期間の間にこのプロジェクトに参加させていただき、様々な実験を学びました。期間中、一連の流れを一人で担当したというよりは、プロジェクトの中で扱う様々な実験について、その都度手技を教えていただきました。習った実験は以下の通りです。 ①細胞培養：浮遊細胞、接着細胞の 2 種類。さらに血球計算も行い、次に培養する分量を決める。 ②Transfection ：２通り学んだ。１つは SiRNA 投入後、HyperFect を加えるもの。もう１つは DNA 投入後、X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent を加えるもの。それぞれ液を作成したのち、細胞が入っている well にゆっくり回し入れ、インキュベーターで培養する。 ③DAPI を用いた Immuno Fluorescence のサンプル作りとその解析方法：スライドガラスに付着させた細胞に DAPI を加え 1 分待つ。次に PBS で洗浄したあと、 Fluoromount-G で固定し、しばらく暗所に置いておく。その後、パソコンの Axio Vision というソフトで 300 個を目安に細胞の写真を撮影する。写真の metaphase と interphase の数をそれぞれ数え、metaphase/metaphase+interphase の値を計算し、どの薬剤を加えれば、metaphase に入る割合が増加もしくは減少するのかを調べる。 ④FACS のサンプル作りとその解析方法：Edu を用いる方法と抗体を用いる方法の２通り学んだ。蛍光抗体で特定の対象を認識させ、染色した細胞を液流し、専用の機械で測定する。その後、Kaluza というソフトを用いて、自分の実験目的に沿ったように解析を行う。 ⑤Western Blotting、Whole Cell Extract ：目的に応じた濃度のゲルを作成し、サンプルをアプライする。電気泳動後、一晩トランスファーを行い、翌日ブロッキング後にそれぞれに対応する一次抗体、二次抗体の順につける。その後、数回 TBST で洗浄したあと、AP Buffer に浸して目的のタンパク質を detect する。 ⑥CO-immunoprecipitation ：Lysis Buffer を作る。細胞を回収し、並行して Beads と抗体を各々準備する。抗体を回転させている間に、whole cell extract を行い、細胞を完全につぶす。これに Mgcl2 と DNase を加え、4℃の水に 1 時間つける。その後、ブロッキングしたあと、それぞれの抗体が入っているエッペンに分け入れ、cold room で 2 時間ほど回転させる。 ⑦Miniprep ：Resuspention Solution, Lysis buffer, Neutralization Solution を手順通り加え、エタノールで洗浄したあと乾燥させ、TE buffer を加える。その後今回は制限酵素の cut が出来ているかの確認に用いた。 ⑧Midiprep ：Midiprep の kit を用いた。Resuspention Solution, Lysis buffer, Neutralization Solution を手順通り加えて操作したあと、Endotoxin Removal Water→Column Wash で洗い、最後に Nuclease Free Water を加えて遠心する。終わったら DNA 量を計測し、シークエンスに用いた。 ⑨Foci の解析方法：DAPI,RED,GFP にそれぞれ染色された細胞を Axio Vision で撮影し、criteria を決めて foci の数を数える。今回は１つのサンプルにつき、20 30cells ずつ確認した。これらのなかでも、私が主にやらせていただいた仕事は、①様々なノックアウトやノックダウンを組み合わせ、それに ATR inhibitor や ATM inhibitor など色々な試薬を投与し解析することによって、metaphase に入る割合を見て、どのような相互作用があるのか調べること、②CO-IP で落としてきたタンパク質を Western Blotting で検出することでした。そのため特に IF、FACS、 Western Blotting に関しては、研修期間中に何度もやらせていただいたので、かなり慣れることが出来ました。２か月という短い研修期間にも関わらず、香崎さんは毎回研究につながる実験の解釈を説明してくださりました。 3.スイスでの生活平日は毎朝 9:30 から夜 19:00 頃まで毎日実験していました。宿舎からラボまでは徒歩 25 分弱でしたが、気候も良く歩いて行くのにとても気持ちよかったです。ランチは大学のカフェテリアでラボの方たちと一緒に食べていました。ジュネーブは物価がかなり高いので、夕飯は宿舎で自炊していましたが、スーパーは大抵 19 時には閉まってしまうので、その点は少し不便でした。宿舎はサンピエール大聖堂の真横という最高の立地でした。トイレ・シャワー・キッチンが共用でしたが、部屋の掃除も週１回してくれますし、清潔でとても過ごしやすかったです。女性専用のユースホステルだったのですが、国連関係の同世代のインターンの人が 40 人ほど滞在していて、様々な話をすることが出来ました。宿舎でバースデーパーティーがあったり、みんなで飲みに出掛けたりと本当に楽しかったです。ジュネーブの公用語はフランス語です。ラボの official language は英語ですが、軽い会話はフランス語のことも少なくありませんでした。街中でも英語が通じないこともしばしばありましたが、特に深刻な事態になったことはなく、ジェスチャーと簡単な英語でなんとかなりました。先ほども書きましたが、スイスは物価がかなり高かったです。マクドナルドのセットで約 1000 円、チェーン店の中華でもワンプレートで約 1500 円くらいでした。スーパーは比較的安いので、食材をスーパーで買って友人と一緒に出来るだけ自炊していました。Euro 圏の方が圧倒的に安いので、宿舎では週末にバスでフランスまで行って買い出ししている人もいました。食べ物が合わないということはなく、またスイスはチーズとチョコレートが有名なので、よく買って食べていました。 ←宿舎での Birthday Party 今回の留学でかかった費用ですが、航空券は Air France で約 20 万円、食費や雑費で約 35 万円でした。やはり宿舎代を出していただけたのが、かなりありがたかったです。週末の旅行ではほとんど飛行機を利用したため、その費用が高かったように思います。週末旅行を考えているならば、出来るだけ早く安いうちに予約することをおすすめします。鉄道を多く利用するならば、鉄道パスを購入しておいた方がよいでしょう。 4.週末の旅行土日は完全にフリーだったので、ヨーロッパで研修している友人達と合流して様々な国を旅行したり、海外に住む友人に久しぶりに再会することが出来ました。ジュネーブは小さい街なので、駅も空港もバスですぐ行くことができ、旅行するにはとても便利です。ただスイス以外は Euro 圏なので、ユーロとスイスフランの両方を両替して準備しておかなければならず、その点は少し不便でした。フランス、イタリア、ベルギー、オーストリア、スペイン、ドイツと計６ヶ国ほど旅行しました。イタリアでは、２年前に知り合った現地の友人の家に泊めてもらい、街も案内してもらえて、とても良い経験となりました。ベルギー、スペインは食べ物が本当に美味しくて、スイスに比べたらだいぶ安いのでおすすめです。他国への旅行がない週末はスイス国内を旅行していました。山に行ってみたり、ローザンヌやモントルーといった街に出掛けてみたりしましたが、どこも穏やかで治安も比較的良く、とても素敵な国でした。 ←ミラノで食べたピザ ←スペインのサグラダファミリア ←ドイツで集合した、マイコース海外組 5.最後にジュネーブでの生活は、最初こそ慣れるまで大変でしたが、本当に充実していて楽しかったです。海外での生活やラボでの研修など、日本では出来ない貴重な経験をたくさんすることが出来ました。ちょうど慣れてきた頃に帰らなければならず、２か月という期間の短さを痛感しました。帰る時にはまだ帰りたくないという思いが強かったです。ジュネーブではラボのみなさんをはじめ、宿舎の同世代の女の子達、インターンをしている人達など、様々な人と出会うことでき、かなり刺激を受けました。特に宿舎では医療関係以外の人達とも多く知り合うことができ、自分の知らないそして経験できない世界の話をたくさん聞くことができて、とても興味深かったです。このような素晴らしい機会を与えてくださった武田先生には本当に感謝しています。武田先生がジュネーブを紹介してくださっていなかったら、こんな貴重な２か月を送ることは出来なかったでしょう。また、実験未経験者にも関わらず、留学までの間受け入れてくださった小松先生、私達の実験プランを一から考えご指導してくださった小林先生にも大変お世話になりました。本当にありがとうございました。そして、初心者にも関わらず、私を受け入れてくださった Halazonetis 教授と香崎さんには感謝してもしきれません。香崎さんは、お忙しい中、何も出来ない私を一からご指導してくださりました。慣れない実験で失敗してしまうこともあり、本当に申し訳なかったですが、そんな時も失敗した原因を一緒に考えてくださり、次は成功出来るようにと親身に教えてくださいました。最後に、両親、祖父母も私の海外研修を心から喜んで、様々な面で支援してくれました。家族の支援がなければ、海外で２か月も生活することは出来なかったと思うので、本当に感謝しています。この２か月は私の将来に対する考え方を変えてくれました。携わってくれた全ての方々に感謝の気持ちでいっぱいです。本当にありがとうございました。