LC Technical Note カラムスイッチングHPLCによる 食品中のビタミンKの分析 35 GL Sciences Inc. GL-7400シリーズを用いた、カラムスイッチングHPLCに シリ を用 、 ラ イッチ グ よるビタミンKの分析をご紹介します。 ビタミンKは脂溶性ビタミンの一つで、天然にはビタミン K1（フィロキノン）とビタミンK2（メナキノン類）が存在しま す。ビタミンK1は緑色植物に多く含まれ、K2は、チーズや 納豆に多く含まれます。K2は、その側鎖のイソプレンの数 に応じて、メナキノン-n（MK-n）と呼ばれています。一般的 にはMK-4が、納豆にはMK-7が多く含まれています。 ビタミンK3は、 は、工業的に合成された成分で自然界には存 業的に合成された成分で自然界には存 在しません。 ビタミンKの分析の流れとして、食品中のビタミンKを溶 媒で抽出し、固相抽出で精製した検液をカラムスイッチン グHPLCシステムに注入し分析する手法を採用しました。 GL-7400シリーズでは、スイッチングバルブのコントロー ルが行え、目的成分の濃縮や夾雑物質の除去にが容易 に行えます。 （K.Suzuki） ビタミンKの分析例 1. Vitamin K2 (MK-4) 2. Vitamin K1 3. Vitamin K2 (MK-7) ( 5μg/L) ( 5μg/L) ( 5μg/L) 10 FLU 2 1 0 3 0 10 20 Time (min) 標準液のクロマトグラム 4000000 Vitamin K1 HPLC 条件 条 3500000 ・ プレカラム Inertsil ODS-3 (5μm, 50 x 4.6 mm I.D.) ・ 分析カラム Inertsil ODS-3 (5μm, 250 x 4.6 mm I.D.) （Pump ①） ・ 溶離液 （Pump ②） ・ 温度 2500000 面積値 : A) C2H5OH B) CH3OH A/B = 5/95 v/v , 1mL/min : A) C2H5OH R2 = 0.999 Vitamin K2(MK-7) 3000000 ・ 還元カラム 白金黒カラム ・ 溶離液 Vitamin K2(MK-4) 2000000 R2 = 0.999 1500000 B) CH3OH A/B = 50/50 v/v , 1mL/min 1000000 R2 = 0.999 40℃ ・ 検出器 FL Ex 320 nm Em 430 nm ・ 注入量 50μL 500000 0 注入2.5分後、試料をプレカラムから分析カラムに導入 0 5 注入6分後に再度バルブ切換え 10 15 濃度（μ /L） 濃度（μg/L） 検量線 構造式 O O H H n 3 O O Vitamin K1 (Phylloquinone) Vitamin K2 (Menaquinone-n：MK-n ) Structures are created using Chemistry 4-D Draw which is provided by ChemInnovation Software, Inc. バックナンバーやアプリケーション検索はこちらから・・・ http://www.gls.co.jp/hplc.html 20 GL Sciences LC Technical Note カラムスイッチングについて 分析カラム プレカラム Pump ① 試料 カラムスイッチング法は夾雑の除去やカラム濃縮を行う 法 雑 濃 う ために頻繁に使用されています。一方で、手作業による 前処理では、再現性の精度管理が問題となる場合があ り、この解決策としても、機械による自動化が可能なカラ ムスイッチングシステム法は非常に有効な方法として知ら れています。 ① 試料注入 Pump ② ⑥ 平衡化 ：流路 ：試料 下図にカラムスイッチングシステムの流路図、右図に試 料導入の流れを示します。まず、オートサンプラーにより 注入した試料をプレカラムに導入し 夾雑成分の除去や 注入した試料をプレカラムに導入し、夾雑成分の除去や 目的成分の濃縮を行います。その後、目的成分がプレカ ラムから溶出する直前に、6方バルブを切り替え、逆方向 からプレカラムに異なる組成の溶媒を流します。この結 果、プレカラムに保持した目的成分が溶出され、分析カラ ムへ導入されます 。試料が分析カラムに導入された後、 再度バルブが切り替わり、プレカラムの洗浄および平衡 化を行います。この行程により濃縮効果と夾雑成分の除 去が可能なため 分析カラムでは 目的成分をさらに分離 去が可能なため、分析カラムでは、目的成分をさらに分離 することができます。 ：目的成分 +夾雑成分 ：夾雑成分 ② プレカラム分離 ⑤ 分析カラム分離 ：目的成分 ③ バルブ切換え ④ 分析カラムへ導入 分析条件・流路図 Column Oven （40℃） Autosampler Pump ① FL Detector カラムスイッチング プレカラム GL-7420 GL 7420 GL 7410 GL-7410 デガッサー内蔵 A/B = 5/95 v/v 分析カラム GL-7453A GL 7453A 還元カラム Ex : 320 nm Em : 430 nm GL-7430 Drain Pump ② GL-7410 B： CH3OH デガッサー内蔵 A/B = 50/50 v/v A： C2H5OH 還元カラムによるビタミンKの蛍光物質化 ビタミンK（キノン型）を還元させハイドロキノン型になると蛍光を発する物質になります。 還元の方法には、白金黒など還元触媒と接触させる方法や還元試薬を作用させる方法があります。 後者は試薬の失活が大きいのに加え、送液ポンプがさらに1台必要となるデメリットがあります。 本報では前者の方法を採用し、白金黒をカラムに詰めて充填カラムのように使用しました。 O OH R R 1. Vitamin K2 (MK-4) 2 Vitamin K1 2. 3. Vitamin K2 (MK-7) 還元反応 FLU 60 80 100 120 140 OH 1 2 20 40 3 0 0 20 40 FLU 60 80 100 120 140 O 0 10 Time (min) 還元前 20 0 10 Time (min) 還元後 20 GL Sciences LC Technical Note 食品中ビタミンK前処理例 穀物・乾物の抽出 油脂および油脂加工品の抽出 試料 試料 試料 － 0.1g － 5g － 1g 抽出 抽出 抽出 － メタノール 10mL － 振とう 10min － 遠心分離 2500rpm, 5min － n-ヘキサン 10mL － ホモジナイズ － n-ヘキサン 10mL － 振とう 5min － 遠心分離 2500rpm, 5min － アセトン 10mL － ホモジナイズ － n-ヘキサン 10mL － 振とう 5min － 遠心分離 2500rpm, 5min 分取 分取 分取 － メタノール層分取 － 精製水 1mL － n-ヘキサン 8mL － 5mL分取 － 5mL分取 溶媒留去 抽出 溶媒留去 － 減圧下, 40℃以下 － 振とう 5min － 遠心分離 2500rpm, 5min － n-ヘキサン層 5mL分取 － 減圧下, 40℃以下 定容 － n-ヘキサン 2mL その他一般食品の抽出 定容 溶媒留去 － n-ヘキサン 2mL － 減圧下, 40℃以下 精製へ 精製へ 定容 － n-ヘキサン 2mL 精製へ 1. Vitamin K1 2. Vitamin K2 (MK-7) ミルク抽出液 1 0 Mega BondElut SI 1gg / 6mL 200 FLU 400 精製操作 0 米抽出液 0 溶出 － ジエチルエーテル / n-ヘキサン混液 (4:96, v/v) 5mL 20 FLU 0 20 40 60 80 油抽出液 FLU 400 定容 拡大 0 カラムスイッチング HPLC-FL 1 0 10 Time (min) 20 納豆抽出液（100倍希釈） 400 FLU 20 2 1 0 米 必要があれば、薄層クロマトを行い更に精製を行う。 － エタノール 200μL 10 Time (min) FLU －減圧下, 40℃以下 0 200 溶媒留去 2200 FLU －n-ヘキサン 5mL 400 洗浄 1 200 － 試料負荷 20 拡大 0 試料通液 10 Time (min) 0 10 Time (min) 20 GL Sciences LC Technical Note 使用装置 ・ 器具 固相カラム： ロータリーエバポレーター REV10N Cat.No. 3001-79052 Mega BondElut SI 1g / 6mL 30本入り Cat. No. 5010-11415 1 3 5 6 4 2 固相抽出マニホールド： GL-SPE吸引マニホールドシステム Cat.No. 5010-50001 内容： 1.吸引マニホールドキット 2.ダイアフラム真空ポンプ 3.吸引ろ過ビン 4.減圧ホース 5.ストップコック 6 スピッツ管（2種類） 6.スピッツ管（2種類） 濃縮装置： リアクティサーモ Cat. No. 1030-44010 リアクティバップ 針、プラグ付 Cat. No. 1030-44014 HPLC装置：GL-7400 シリーズ 番号 1 品名 キ リアリザ バ キャリアリザーバー カラムオーブン 6方バルブ内蔵 オートサンプラー 蛍光検出器 ポンプ × 2台 2 3 4 5,6 1 型番 GL 7480 GL-7480 GL-7430 4 GL-7420 GL-7453A GL-7410 2 カラム カラム： Inertsil ODS-3 5μm, 250 x 4.6 mm I.D. Cat.No. 5020-01732 Inertsil ODS-3 5μm, 50 x 4.6 mm I.D. Cat.No. 5020-01763 6方バルブ Cat.No.6003-17706 取付金具 金 Cat.No.6003-17705 5 3 6 ジーエルサイエンスでは、分析ノウハウときめこまやかなフォローもお付けしたシステム提案を行っております。 お近くの営業所や カスタマーサポートセンター までお気軽にお問い合わせください。 ホームページはこちらから・・・ http://www.gls.co.jp/hplc.html 〒163-1130 東京都新宿区西新宿6丁目22番1号 新宿スクエアタワー30F TEL.03(5323)6611 FAX.03(5323)6622 TEL.03(5323)6611 TEL.06(6357)5060 TEL.024(533)2244 TEL.029(858)3700 TEL.043(248)2441 TEL.048(667)1611 TEL.045(475)1144 TEL.052(931)1761 TEL.082(233)1101 TEL.092(291)5200 FAX.03(5323)6622 FAX.06(6357)4580 FAX.024(536)1518 FAX.029(858)3780 FAX.043(248)2485 FAX.048(667)1656 FAX.045(475)1145 FAX.052(931)1814 FAX.082(233)1110 FAX.092(291)2552 ｶｽﾀﾏｰｻﾎﾟｰﾄｾﾝﾀｰ T E L . 0 4 ( 2 9 3 4 ) 1 1 0 0 FAX.04(2934)3361 東 大 東 筑 千 北 横 名 広 九 京 営 業 阪 支 北 営 業 波 営 業 葉 営 業 関 東 営 業 浜 営 業 古 屋 営 業 島 営 業 州 営 業 部 店 所 所 所 所 所 所 所 所 ジーエルサイエンス LC テクニカルノート
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