クイックガイド Quick Guide Quantum Prep Plasmid 所要 時間 約 Maxi Prep Kit あらかじめWash Buffer には95−100％EtOHを 1：1になるように（270ml）加えておきます。 90 分 ■キット構成内容： ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ Maxiprep Resuspension Solution ……………………………………………………165ml Cell Lysis Solution …………………………………………………………………………250ml Neutralization Solution……………………………………………………………………165ml Quantum Prep Matrix ……………………………………………………………………110ml Maxiprep Wash Buffer ……………………………………………………………………270ml Maxiprep Spin Baskets ……………………………………………………………………10 本 5M NaCl …………………………………………………………………………………………5ml ■キット以外に必要な試薬： 95−100％エタノール／TE もしくは滅菌済超純水 操 集 菌 上清廃棄 作 手 順 100∼500mlを5000×gで5min遠心 TBや2×YT 8OD／ml→ 250ml LB 4OD／ml→ 500ml 細胞ペレット 再懸濁 Cell Resuspension Solution 15ml 完全に再懸濁する。 アルカリ溶菌 Cell Lysis Solution 23ml 穏やかにチューブを転倒懸濁。 中 和 Neutralization Solution 15ml 穏やかに振り混ぜて懸濁。 5min以上放置せず次のステップへ。 遠心 8∼10000×g 20min 10分以上放置せず次のステップへ。 沈殿廃棄 吸 着 上清廃棄 洗 浄 上清廃棄 上清を回収 Quanturm Matrix 10ml 15-30sec穏やかに懸濁 遠心 3000×g 5min Wash Buffer 25ml を加え懸濁 遠心 3000×g 3∼5min 沈殿物を取らないように十分気をつける。 マトリクスを完全に懸濁する。 懸濁は穏やかに行う。 スイングロータを使用してください。 50ml遠沈管に25mlスピンバスケット を収める。必要であればアダプターリ ングを使用する。 Wash Buffer 15ml を加え懸濁 スピンバスケット／遠沈管 へ懸濁液を入れる スピンバスケットのフィルターを 傷つけないないように注意。 ふたはしない。 遠心 3000×g 5min 流出液廃棄 洗 浄 流出液廃棄 Wash Buffer 10ml 遠心 3000×g 5min スピンバスケットを新しい遠沈管 へ移す 溶 出 滅菌水またはTE 5ml 70℃に温めて溶出することにより 遠心 3000×g 5min よい収率が得られる。 必要であればEtOH沈殿を行う。 精製プラスミドDNA ※詳細は英文取扱説明書を参照してください。 Quantum Prep プラスミドプレップキット トラブルシューティング 問 題 考えられる原因 確認してください Trouble Shooting 解決方法 ローコピー プラスミド ローコピープラス ミドを使用していま せんか？ 濃厚培地を使用し、細胞量を増やしてくださ い。もしくはハイコピープラスミドを使用 してみてください。 細胞数が 不十分 大腸菌のオーバー ナイト培養していま すか？ 濃厚な培地を使用してください；培養時間、 容量を調節してください。OD 600 を測定し OD ／ml を確認してください。 培養液が 古い 大腸菌はどのようなも のを使用していますか? 単離した大腸菌を 37 ℃でオーバーナイト培 養し、培養後すぐに使用してください。 回収されて いない マトリクスに吸着さ れているか確認する 溶出バッファー（dw か TE）を 70 ℃に温めて 溶出してください。溶出バッファー量を増や す、あるいは 2回にして溶出してください。 ゲノムの コンタミネーション 低から高分子量のス メアがありますか？ 溶菌後なるべく穏やかに懸濁してください。 培養液を減らしてください。 Endonuclease A のコンタミネーション 低分子量のスメアが ありますか？ 洗浄ステップの回数を増やしてください。 ホスト株を変えてみてください。 細胞のオーバー ロード；Cell Resuspension Solution の劣化 260／280＞2.0で すか? 泳動した際、ゲ ルに低分子量のバン ドが見られますか? オーバーロードを避けてください；新しい CellResuspensionSolution を用いてくだ さい。 （CellResuspensionSolution には RNaseが含まれています） タンパク質のコン 細胞構成タンパク タミネーション が混入している 260 ／280 ＜1.5 ですか？ クリアライセートを回収する際、白色の沈殿 が混入しないように気をつけてください。 スピンカラム からマトリク スが漏れる キット指定の速度で遠心してください。rpm 遠 心 機 の 回 転 速 度 （revolutions per minute）への変換方法 （rpm）2 r は速すぎませんか？ RCF（g）=（1.12×10-5 ） r：ローターの中央からチューブの中央までの半径（cm） 回収率が 低い スメアリング RNA コンタ ミネーション スピンバスケット の破損 遠心をした際マ スピンバスケットへ トリクスが遠心 のオーバーロード 機内に飛び散る マトリクス＋クリア ライセートの量が 多すぎませんか？ マトリクス＋クリアライセート懸濁液がスピ ンカラムに入りきらない場合は遠心を 2 回に 分けて行なってください。 塩基配列が 決定出来ない 泳動によるバンドの 確認をしていますか? 260 ／280 比率測 定していますか？ 培養のOD600 を確認してください。細胞の オーバーロードを避けてください。 260／280比率を測定し、 260／280＜1.5 の場合はタンパク質、 260／280＞2.0 の場合はRNAが混入し ている可能性があります。 精製度が不十分 日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社 ライフサイエンス事業本部 本 社 神奈川営業所 つくば営業所 大阪営業所 名古屋営業所 福岡営業所 〒 116-0014 〒 222-0033 〒 305-0031 〒 532-0025 〒 465-0093 〒 812-0013 東京都荒川区東日暮里 5-7-18 横浜市港北区新横浜 2-7-3 つくば市吾妻 1-15-1 大阪市淀川区新北野 1-14-11 名古屋市名東区一社 3-121-1 福岡市博多区博多駅東2-18-30八重洲博多ビル ※技術的なお問い合わせは 1（03）5811-6270 1（045）476-0351 1（029）852-0835 1（06）6308-6568 1（052）702-2358 1（092）475-4856 1（03）5811-6271 FAX（03）5811-6272 FAX（045）476-0350 FAX（029）852-0829 FAX（06）6308-3064 FAX（052）702-2812 FAX（092）475-4858 FAX（03）5811-6272
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