JP 2013-501007 A 2013.1.10
(57)【要約】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏ
ｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に対する免疫応答
を誘発するための組成物および方法が本明細書に提供さ
れる。組成物および方法はポルフィロモナス・ジンジバ
リス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチドおよび
そのフラグメントと変異体、ならびにポルフィロモナス
・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症（
例えば歯周炎）の診断、予防および治療に有益な、対応
するポリヌクレオチドに関する。ポリペプチドに対する
抗体、およびこれらの抗体を含む組成物および方法も開
示される。本開示は、さらにポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症（例えば歯
周炎）の検出、予防および治療のための方法も記述する
。
(2)
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの単離されたポリペプチドおよび薬剤的に許容できる担体を含む免疫原
性の組成物であって、前記少なくとも１つのポリペプチドは、
ａ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０４
９５、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体；
ｂ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
５４、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｃ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１３
７４、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
10
ｄ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１７
９５、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｅ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
１３、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｆ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ２１
７２、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｇ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１３
２６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｈ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１７
９８、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
20
ｉ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０１
８６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体；および
ｊ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
１６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体、
からなる群から選ばれることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの単離されたポリペプチドおよび薬剤的に許容できる担体を含む免疫原
性の組成物であって、前記少なくとも１つのポリペプチドは、
ａ．配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
30
ｃ．配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｄ．配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｅ．配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｆ．配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｇ．配列番号１３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｈ．配列番号１５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｉ．配列番号１７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；および
ｊ．配列番号１９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
からなる群から選ばれることを特徴とする、組成物。
【請求項３】
40
前記組成物がさらにアジュバントを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の組
成物。
【請求項４】
対象に請求項１または２に記載の組成物の治療上有効量を投与することを含むことを特
徴とする、前記対象のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感
染症を治療するまたは予防する方法。
【請求項５】
対象に請求項３に記載の組成物の治療上有効量を投与することを含むことを特徴とする
、前記対象のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症を治
療するまたは予防する方法。
50
(3)
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【請求項６】
請求項１または２に記載の組成物を対象に投与するステップを含むことを特徴とする、
前記対象において免疫応答を誘導する方法。
【請求項７】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症の予防または治
療のための免疫原性の組成物への単離されたポリペプチドの使用であって、前記単離され
たポリペプチドは、
ａ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０４
９５、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体；
ｂ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
10
５４、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｃ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１３
７４、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｄ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１７
９５、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｅ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
１３、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｆ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ２１
７２、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｇ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１３
20
２６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｈ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１７
９８、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｉ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０１
８６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体；および
ｊ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
１６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体、
からなる群から選ばれることを特徴とする、使用。
【請求項８】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症の予防または治
30
療のための免疫原性の組成物への単離されたポリペプチドの使用であって、前記単離され
たポリペプチドは、
ａ．配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｄ．配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｅ．配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｆ．配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｇ．配列番号１３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｈ．配列番号１５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
40
ｉ．配列番号１７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；および
ｊ．配列番号１９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド。
からなる群から選ばれることを特徴とする、使用。
【請求項９】
対象に少なくとも１つの単離された核酸を含む組成物の治療上有効量を投与することを
含む、前記対象のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症
を治療、または予防する方法であって、前記単離された核酸は、
ａ．配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核
酸；
ｂ．配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核
50
(4)
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酸；
ｃ．配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核
酸；
ｄ．配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核
酸；
ｅ．配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核
酸；
ｆ．配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする
核酸；
ｇ．配列番号１３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする
10
核酸；
ｈ．配列番号１５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする
核酸；
ｉ．配列番号１７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする
核酸；および
ｊ．配列番号１９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする
核酸、
からなる群から選ばれることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
前記組成物がさらにアジュバントを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
20
【請求項１１】
ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、前記ポリペプチドが、
ａ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０４
９５、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体；
ｂ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
５４、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｃ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１３
７４、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｄ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１７
９５、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
30
ｅ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
１３、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｆ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ２１
７２、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｇ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１３
２６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｈ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１７
９８、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｉ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０１
８６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体；および
40
ｊ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
１６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体、
からなる群から選ばれることを特徴とする、抗体。
【請求項１２】
ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、前記ポリペプチドが、
ａ．配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｄ．配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｅ．配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
50
(5)
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ｆ．配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｇ．配列番号１３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｈ．配列番号１５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｉ．配列番号１７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；および
ｊ．配列番号１９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
からなる群から選ばれることを特徴とする、抗体。
【請求項１３】
対象に請求項１１の抗体を投与することにより、前記対象を治療することを特徴とする
方法。
【請求項１４】
10
対象に請求項１２の抗体を投与することにより、前記対象を治療することを特徴とする
方法。
【請求項１５】
対象に請求項１１の抗体を投与することを含むことを特徴とする前記対象のポルフィロ
モナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症を治療する方法。
【請求項１６】
対象に請求項１２の前記抗体を投与することを含むことを特徴とする対象のポルフィロ
モナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症を治療する方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの単離されたポリペプチドを含む対象のポルフィロモナス・ジンジバリ
20
ス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症の存在を検出するためのキットであって、前記ポ
リペプチドが、
ａ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０４
９５、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体；
ｂ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
５４、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｃ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１３
７４、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｄ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１７
９５、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
30
ｅ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
１３、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｆ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ２１
７２、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｇ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１３
２６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｈ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ１７
９８、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体
ｉ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０１
８６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体；および
40
ｊ．ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質ＰＧ０６
１６、またはその免疫原性のフラグメントもしくは変異体、
からなる群から選ばれることを特徴とする、キット。
【請求項１８】
少なくとも１つの単離されたポリペプチドを含む対象のポルフィロモナス・ジンジバリ
ス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症の存在を検出するためのキットであって、前記ポ
リペプチドが、
ａ．配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
50
(6)
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ｄ．配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｅ．配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｆ．配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｇ．配列番号１３に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｈ．配列番号１５に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
ｉ．配列番号１７に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；および
ｊ．配列番号１９に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
からなる群から選ばれることを特徴とする、キット。
【請求項１９】
対象のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症のリスク
10
を減少させる方法であって、前記対象に請求項１または２に記載の組成物の治療上有効量
を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記対象が、症候性のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）
感染症を発症する危険性がある、または症候性のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症を有することを特徴とする、請求項４または５に記載の方
法。
【請求項２１】
前記対象が、症候性のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）
感染症を有することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
20
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００９年８月２日に出願された、米国仮特許出願６１／２３０，７１７号
の優先権を主張し、この出願全体を参照によって本明細書に組み込む。
【技術分野】
【０００２】
本発明は免疫学の分野に関し、特にポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉ
ｖａｌｉｓ）抗原、ならびに免疫化および治療でのこの抗原の使用に関する。
【背景技術】
30
【０００３】
歯周病（または歯周疾患）は歯の支持組織の炎症疾患である。疾患進行は、歯周ポケッ
ト（菌苔が内部に存在）の形成、支持結合組織の破壊の進行、歯槽骨の減少、を特徴とし
、その結果、次第に歯を支えることができなくなり、歯を失うこととなる。歯周疾患は歯
肉下の歯垢にある特定の細菌に関連している。ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒ
ｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）は、歯周病とその進行に関連する最も重
要な病原体の１つとみなされている。この黒色色素産生、糖非分解性、グラム陰性嫌気性
菌は、エネルギーを特定のアミノ酸の代謝に依存する。ポルフィロモナス・ジンジバリス
（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）は、鉄を、好ましくはヘムまたはその鉄（ＩＩＩ）酸化物
ヘミンの形態で、必須とし、過剰ヘミン条件下で増殖した場合、実験動物において強い毒
40
性を有する。
【０００４】
莢膜、付着因子、細胞毒および細胞外の加水分解酵素等の病原因子のいくつかがポルフ
ィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の病原性に関係している。ポル
フィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の主な病原因子およびワクチ
ン候補は、細胞外のシステインプロテイナーゼまたはジンジパイン（ＲｇｐＡ、ＲｇｐＢ
およびＫｇｐ）である。これらは広範囲に調査されている（非特許文献１∼８）。ジンジ
パイン複合体だけが予防動物モデルの歯槽骨退縮を防ぐことが証明された。また、この複
合体に特異的な抗体は、人体研究（非特許文献９、１０）において予防効果が証明されて
いる。にもかかわらず、毒性およびポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖ
50
(7)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
ａｌｉｓ）の疾病を引き起こす能力は多因子性であり、多くの決定要因がかかわっている
と考えられ得る（非特許文献１１）。 ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３株およびＡＴＣ
Ｃ３３２７７株のゲノムはそれぞれ配列決定されている（非特許文献１２、１３）が、こ
こから、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）抗原が免疫原性
で他にも有益であるかどうかについての情報を何ら得ることはできない。
【０００５】
したがって、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症の
効果的な治療が求められている。
【先行技術文献】
10
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌ．Ｆｒａｚｅｒら、“Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ ａｄｈｅｓｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ ｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅ−ａｄｈｅｓｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ
ｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”２４ （４
２−４３），６５４２（２００６）
【非特許文献２】Ｎ．Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎら、“Ｓｅｒｕｍ ｉｍｍｕ
ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ （ＩｇＧ） ａｎｄ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓ ｒｅｓｐ
ｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ａｓｈｅｓｉｎ
20
ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ ６８（５）２７０４（２０００）
【非特許文献３】Ｎ．Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎら、“Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｒｇ
ｐＡ， ＲｇｐＢ ａｎｄ Ｋｇｐ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃ
ｅ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ５０ ｉｎ ａ ｍ
ｕｒｉｎｅ ｌｅｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ，”６９（１２），７５２７（２００１）
【非特許文献４】Ｎ．Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎら、“ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ ｐ
ｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉ
ｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｃｈａｌ
ｌｅｎｇｅ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ，”６８（７），４０
30
５５（２０００）
【非特許文献５】Ｎ．Ｍ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎら、“Ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ａｎｄ ａｄｈｅ
ｓｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｐｔｏｐｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓ
ｔ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｅｒｉｏ
ｔｏｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｌｏｎｅ，”１７５（６），３９８０（２００５）
【非特許文献６】Ｎ．Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎら、“Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏ
ｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ａｄｈｅｓ
ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｐｅｎｅｔｒａｔｅ ｇｉｎｇｉｖａｌ ｔｉｓｓｕｅ ａ
ｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｒ 40
ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ ｍ
ａｎｎｅｒ”，（２００８）
【非特許文献７】Ｎ．Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎら、“Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏ
ｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ
”，３５，１０１（２００４）
【非特許文献８】Ｖ．Ｔａｍら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−
Ａｄｈｅｓｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉ
ｖａｌｉｓ ｉｎ ＢＡＬＢ／ｃ Ｍｉｃｅ，”１８１（６），４１５０（２００８）
【非特許文献９】Ｂｏｏｔｈ．Ｖら、Ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉ
50
(8)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
ｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｏｒｐｈｙｒ
ｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｉn ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｏ
ｄｏｎｔｉｔｉｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． １９９６ Ｆｅｂ；６４（２）：４
２２−７
【非特許文献１０】Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｇｇ ｙｏｌｋ ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｇｉｎｇｉｐａｉｎｓ
ｉｎ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｊ Ｏｒａｌ Ｓｃｉ． ２００７ Ｓｅｐ；４９（３）：２０１−６
【非特許文献１１】Ｈｏｌｔ ＳＣ，Ｋｅｓａｖａｌｕ Ｌ，Ｖｉｒｉｕｌｅｎｃｅ ｆ
ａｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｐ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ２０００．
10
１９９９ Ｊｕｎ ２０：１６８−２３８
【非特許文献１２】Ｎｅｌｓｏｎ ＫＥら、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐ．
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ Ｗ８３．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３ Ｓ
ｅｐ；１８５（１８）：５５９１−６０１
【非特許文献１３】“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｓｔｒａｉ
ｎ ＡＴＣＣ ３３２７７ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ
Ｓｔｒａｉｎ Ｗ８３ Ｒｅｖｅａｌｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅ
ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ”，ＤＮＡ Ｒｅｓ．２０
20
０８ Ａｕｇｕｓｔ；１５（４）：２１５−２２５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に対する免
疫応答を誘発するための組成物および方法を提供する。さらに、ポルフィロモナス・ジン
ジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症（例えば歯周病）の予防または治療のため
の方法が提供される。一例において、組成物は、ＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３
７４、ＰＧ１７９５、ＰＧ２１７２、ＰＧ０６１３、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ
０１８６およびＰＧ０６１６からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリペプチドを含
30
む。さらに、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体、ならびにこのような抗体を
含む組成物、およびこのような抗体の使用方法も提供される。
【０００８】
１つまたは複数のポリペプチドを含む医薬品組成物等の組成物（例えばワクチン組成物
）が提供される。場合により、組成物はアジュバントを含むことができる。
【０００９】
本発明はいくつかの利点を提供する。例えば、本発明の組成物を対象に投与すると、ポ
ルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）による感染症に対する免疫
応答が誘発される。
【００１０】
40
本発明の他の特徴および利点は下記の発明を実施するための形態、図面および特許請求
の範囲から明らかとなる。
【００１１】
図に関しての以下の記述により本発明への理解が深まるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】パネルＡおよびＢからなり、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉ
ｖａｌｉｓ）に特異的なＩｇＧ応答を示す。図１ａは、実施例３の血清抗タンパク質Ｉｇ
Ｇ抗体応答を示す。また、図１ｂは、実施例３の血清の総ＩｇＧ抗体応答を示す。
【図２】フローサイトメトリーに基いた分析によって計測された、定常期における、ポル
50
(9)
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フィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｗ５０株）の細胞表面上の
タンパク質の接近性を示す。Ｙ軸上の点はそれぞれ、得られた結果を表す。結果の平均値
を、水平方向のダッシュ（─）で表す。Ｘ軸上には同定された各タンパク質の名前を示す
。ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の外膜分画におけるタ
ンパク質の存在も評価した（実施例４で議論する）。結果をＸ軸上に示す。（例えば、＋
は、タンパク質がＯＭ分画において検出されたことを示す；−はタンパク質がＯＭ分画に
存在しなかったことを示す；＊は、タンパク質がある実験ではＯＭにおいて検出されたが
他の実験では検出されなかったことを示す）
【図３】抗ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質Ｉ
ｇＧ抗体応答を示す。マウス群を水酸化アルミニウムの存在または非存在下でポルフィロ
10
モナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチドで免疫化した。ポルフ
ィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）特異的ＩｇＧ抗体価を計測した
。バーはそれぞれ平均の抗体価を表し、記号は各群の単一のマウスに相当する。
【図４】タンパク質で免疫化されたマウスから得た血清サンプルの血清殺菌力を表す。
【図５】特定の抗タンパク質血清のオプソニン作用の調査での活性を表す。
【図６】フローサイトメトリーに基いた分析によって計測される、ポルフィロモナス・ジ
ンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｗ５０、Ｗ８３、ＡＴＣＣ３３２７７）の３
つの株の細胞表面上のタンパク質の接近性を表す。さらに、異なる増殖相まで生育したポ
ルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ５０のタンパク質の接近
性も評価した。Ｙ軸上の点はそれぞれ、タンパク質特異的抗血清を使用して実施された分
20
析で得られた結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、対象に投与した場合、免疫応答を誘発するポルフィロモナス・ジンジバリス
（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸を提供する。例
えばＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、ＰＧ２１７２、ＰＧ０
６１３、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６およびＰＧ０６１６のポリペプチド
、これらのポリペプチドをコードする核酸配列、およびこれらのポリペプチドに特異的に
結合する抗体を提供する。少なくとも１つのポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチドを含む免疫原性の組成物、ならびにポルフィロモナス・
30
ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症のリスクを予防し、治療し、減少させ
るための方法、およびこれら組成物を使用して対象において免疫応答を誘発、または誘導
するための方法も提供され、組成物を産生する方法も同様に提供される。本発明のポリペ
プチドおよび核酸配列は、本明細書の一部を形成する配列リストに示した特定の核酸およ
びアミノ酸配列を含むが、これに限定されない。これらのポリペプチド、組成物および方
法は以下に詳細に記述される。 定義
用語「抗原」は、本明細書で使用される場合、免疫応答を刺激できる物質を指す。抗原
により刺激される免疫応答は、液性免疫および細胞性免疫のいずれかまたは両方でもよく
、一般に抗原に特異的である。抗原は、対象へ導入されると、対応する免疫体（抗体）の
40
形成を開始し媒介できる。抗原は複数の抗原決定基を有してもよく、この場合、対象が抗
原に接触すると、異なる特異性を有する対応抗体が複数産生され得る。抗原にはタンパク
質、ペプチド、ポリペプチド、核酸およびフラグメント、その変異体およびそれらの組み
合わせがあり得るが、これに限定しない。
【００１４】
ペプチド、タンパク質およびポリペプチドという用語は本明細書では区別なく使用され
る。
【００１５】
「単離された」ポリペプチドはその自然環境から除去されたポリペプチドである。例え
ば、単離されたポリペプチドは、原形質または細胞膜から除去されたポリペプチドであり
50
(10)
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、その自然環境のポリペプチド、核酸および他の細胞形質成分の多くは、もはや存在しな
い。「単離できる」ポリペプチドは特定のソースから分離できるポリペプチドである。「
精製された」ポリペプチドは、ポリペプチドが天然で結合している他の構成成分を少なく
とも６０％、好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％含ま
ないポリペプチドである。ポリペプチドが天然に生じる生物体の外部で産生されるポリペ
プチド、例えば、化学的な方法、または組み換え法により生産されるポリペプチドは、自
然環境に一度も存在したことがないため、定義により単離され精製されたとみなされる。
【００１６】
用語「表面に接近可能なタンパク質」は表面が露出したタンパク質全てを指し、例えば
、内膜および外膜タンパク質、細胞壁に付着するタンパク質ならびに分泌されたタンパク
10
質を含む。
【００１７】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「フラグメント」は少なくとも長さ約４０
残基、または６０残基であることが好ましく、少なくとも長さ約１００残基であることが
好ましい。ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチド
のフラグメントは当業者が周知の方法で産生できる。 用語、「抗体」はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を指し、未精製の、も
しくは部分的に精製された形態（すなわちハイブリドーマ上澄部、腹水、ポリクローナル
抗血清）、または精製された形態の完全抗体またはフラグメント化抗体を含む。実施形態
のいくつかにおいて、抗体の抗原結合部分はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、
20
Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）の変異体、単鎖の抗体（ｓｃＦｖ）、キメ
ラ抗体（ヒト化の抗体等）、二特異性抗体、ならびにポリペプチドへの特異的抗原結合に
とって十分な抗体の少なくとも一部分を含むポリペプチドを含んでいる。
【００１８】
「精製された」抗体は、それが最初に（すなわちハイブリドーマ上澄部または腹水調製
の一部分として）見出されるタンパク質の少なくとも約５０％から分離されるものである
。
【００１９】
明細書および添付された請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔ
ｈｅ」は、文脈により明らかにそうでないと示されない限り、複数の指示対象を含む。し
30
たがって、例えば、フラグメントに言及する場合、複数のフラグメントの混合物を含んで
もよく、医薬品の担体またはアジュバントに言及する場合、このような担体またはアジュ
バントの２つ以上の混合物を含んでもよい。
【００２０】
本明細書で使用される場合、対象または宿主は固体であることを意味する。対象は、ネ
コとイヌ等の飼育動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよびヤギ等の家畜、およびマウス、
ウサギ、ラット、モルモット等の実験動物を含み得る。一態様において、対象は霊長類ま
たはヒト等の哺乳動物である。
【００２１】
任意選択の、または任意選択的に、とは、続いて記述した事象または状況が生じても、
40
生じなくてもよいことを意味し、また、記述には、事象または状況が生じる場合、および
生じない場合が含まれることを意味する。例えば、句、「組成物は、任意選択的に、組み
合わせを含むことができる」は、組成物が異なる分子の組み合わせを含んでも、または含
まなくてもよいことを意味するため、この記述は組み合わせおよび組み合わせがない状態
（すなわち組み合わせの個々の要素）の両方を含む。
【００２２】
範囲は、本明細書では、ある特定の値の近似値から、および／または別の特定の値の近
似値までを表し得る。そのような範囲が表される場合、別の態様では、ある特定の値から
、および／または別の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞である約、または、およ
そを使用して近似として表される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されよ
50
(11)
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う。さらに、範囲の各端点は他の端点に関連して、および他の端点とは独立しての双方に
おいて、有意であることが理解されよう。
【００２３】
用語、予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）、予防する(ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ)、および予防(
ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ)は、本明細書においては、所与の症状に対する所与の予防的治療
（例えばポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）による感染症の
予防）に関して使用され、治療された対象が臨床的に観察可能なレベルの症状を全く発症
しないか、または緩徐に発症、および／またはその対象が治療を受けなかった場合より軽
度に症状を発症することを意味する。これらの用語は、対象において、あらゆる症状のい
かなる側面も見られないという状況に対してだけ使用されるのではない。例えば、所与の
10
症状の顕在化をもたらすと予想される刺激に対象がさらされている際に治療が行われた結
果、その患者において、治療を受けなければ予想されたであろう症状がより少ない、およ
び／または軽度である場合に、治療により症状が予防されたと言えるであろう。対象が軽
度の感染症の症状のみを示す結果となる場合、治療により感染症を「予防」できることと
なるが、これは感染微生物がどの細胞にも侵入しなかった、ということを意味するわけで
はない。
【００２４】
同様に、減少する（ｒｅｄｕｃｅ）、減少する(ｒｅｄｕｃｉｎｇ)、および減少(ｒｅ
ｄｕｃｔｉｏｎ)は、所与の治療による感染症のリスクに関連して本明細書で使用される
場合（例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症の
20
リスクの減少）、治療を受けなかった場合の感染症発症の制御または基礎レベルと比較し
て、対象がより緩徐に、またはより軽度な症状を発症すること指す。感染症のリスクが減
少すると、対象は感染症の目立った症状を軽度にのみを示すか、感染症を緩徐に発症し得
るが、感染微生物（すなわちポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ））がどの細胞にも侵入しなかった、ということを意味するわけではない。
【００２５】
用語、治療する（ｔｒｅａｔ）または治療する(ｔｒｅａｔｉｎｇ)は、本明細書におい
て、所与の症状に対する所与の治療に関連して使用され（例えば、ポルフィロモナス・ジ
ンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）により引き起こされた感染症、または疾病（症
候性感染）を治療）、治療された対象が臨床的に観察可能なレベルの症状を全く示さない
30
、またはその患者彼が治療を受ける前より軽度な症状を示すことを意味する。対象が感染
症の明らかな症状をより軽度に示す結果となった場合、治療により感染症または疾病を「
治療」できることとなるが、これは感染微生物（すなわちポルフィロモナス・ジンジバリ
ス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ））を徹底的に根絶したことを意味するわけではない。 ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチドおよび核酸
本発明は、免疫原性の組成物の構成成分、および／またはポルフィロモナス・ジンジバ
リス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症を診断するための試薬（例えばプローブ）とし
てとりわけ有益な、単離されたポリペプチド、およびポルフィロモナス・ジンジバリス（
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に由来する核酸を提供する。本発明の好ましい実施形態は、
ＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、ＰＧ２１７２、ＰＧ０６１
40
３、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６およびＰＧ０６１６の１つまたは複数の
ポリペプチド、およびこれらのポリペプチドをコードする単離された核酸を含む。ＰＧ０
４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、ＰＧ２１７２、ＰＧ０６１３、Ｐ
Ｇ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６およびＰＧ０６１６のそれぞれは、実施例１で
詳述したパラメータおよび方法を使用して、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３株のゲノムを、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ５０株（ＡＴＣＣ５３９７８）からその後単離された候補に対してマ
イニングすることにより同定した。
【００２６】
本発明の組成物は、ＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、ＰＧ
50
(12)
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２１７２、ＰＧ０６１３、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６およびＰＧ０６１
６の少なくとも１つのポリペプチドを含む。ＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４
、ＰＧ１７９５、ＰＧ２１７２、ＰＧ０６１３、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１
８６およびＰＧ０６１６の各々について、使用に適切なポリペプチドは、完全長アミノ酸
配列（シグナル配列の有無は問わない）、ならびにその免疫原性フラグメント、変異体（
天然、またはそうでなければ、例えば合成由来）、および融合タンパク質を含む。 本明細書に記述された組成物への使用に適切なＰＧ０４９５ポリペプチドは、ポルフィ
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ
３３２７７、ならびにＰＧ０４９５を発現する任意の他の株から単離されても、誘導され
てもよい。ＰＧ０４９５はＰＧＮ＿１４７６としても知られている。ポルフィロモナス・
10
ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムの完全長Ｐ０４９５のアミノ酸
配列は、ジェンバンク受入番号ＡＡＱ６５６８９．１により入手可能で、配列番号１とし
て本明細書の配列リストに示される。本発明での使用に好ましいＰ０４９５ポリペプチド
は、配列番号１に対して５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８
５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以上）
を有するアミノ酸配列を含む。本発明での使用に好ましいポリペプチドは、配列番号１の
少なくとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続したアミノ酸
のフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号１の抗原決定基を含む。他の
好ましいフラグメントは、配列番号１の少なくとも１つの抗原決定基を保有するが、配列
20
番号１のＮ末端から１つまたは複数の酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号１のＣ末端から１つまたは複
数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配列番号１のＮ末端からシグナル
配列を欠く。
【００２７】
本明細書に記述した組成物への使用に適切なＰＧ０６５４ポリペプチドは、ポルフィロ
モナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ３
３２７７、ならびにＰＧ０６５４を発現する他の株から単離されても、誘導されてもよい
。ＰＧ０６５４はＰＧＮ＿０６９３としても知られている。ポルフィロモナス・ジンジバ
リス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムの完全長Ｐ０６５４のアミノ酸配列は、
30
ジェンバンク受入番号ＡＡＱ６５６８３３．１によって入手可能で、本明細書の配列リス
トに配列番号９として記載する。本発明での使用に好ましいＰ０６５４ポリペプチドは、
配列番号９に対して５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、
９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以上）を有
するアミノ酸配列を含む。本発明での使用に好ましいポリペプチドは、配列番号９の少な
くとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、
６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続したアミノ酸のフ
ラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号９の１つの抗原決定基を保有する
。他の好ましいフラグメントは、配列番号９の少なくとも１つの抗原決定基を保有するが
、配列番号９のＮ末端から１つまたは複数の酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８
40
、９、１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号９のＣ末端から１つま
たは複数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配列番号９のＮ末端からシ
グナル配列を欠く。 本明細書に記述された組成物への使用に適切なＰＧ１３７４ポリペプチドは、ポルフィ
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ
３３２７７、ならびにＰＧ１３７４を発現する他の株から単離されても、誘導されてもよ
い。ＰＧ１３７４はＰＧＮ＿０８５２としても知られている。ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムの完全長Ｐ１３７４のアミノ酸配列は
、ジェンバンク受入番号ＡＡＱ６６４３８．１によって入手可能で、本明細書の配列リス
トに配列番号７として記載する。本発明での使用に好ましいＰ１３７４ポリペプチドは、
50
(13)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
配列番号７に対して５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、
９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以上）を有
するアミノ酸配列を含む。本発明での使用に好ましいポリペプチドは、配列番号７の少な
くとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、
６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続したアミノ酸のフ
ラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号７の１つの抗原決定基を保有する
。他の好ましいフラグメントは、配列番号７の抗原決定基を少なくとも１つ保有するが、
配列番号７のＮ末端から１つまたは複数の酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号７のＣ末端から１つまた
は複数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配列番号７のＮ末端からシグ
10
ナル配列を欠く。
【００２８】
本明細書に記述された組成物への使用に適切なＰＧ１７９５ポリペプチドは、ポルフィ
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ
３３２７７、ならびにＰＧ１７９５を発現する他の株から単離されても、誘導されてもよ
い。ＰＧ１７９５はＰＧＮ＿１７７０としても知られている。ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムの完全長Ｐ１７９５のアミノ酸配列は
、ジェンバンク受入番号ＡＡＱ６６７９５．１によって入手可能で、本明細書の配列リス
トに配列番号１７として記載する。本発明で使用するのに好ましいＰ１７９５ポリペプチ
ドは、配列番号１７に対して５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０
20
、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以
上）を有するアミノ酸配列を含む。本発明で使用するのに好ましいポリペプチドは、配列
番号１７の少なくとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５
、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続し
たアミノ酸のフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号１７の１つの抗原
決定基を保有する。他の好ましいフラグメントは、配列番号１７の抗原決定基を少なくと
も１つ保有するが、配列番号１７のＮ末端から１つまたは複数の酸（例えば１、２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号１
７のＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配列
番号１７のＮ末端からシグナル配列を欠く。 30
本明細書に記述された組成物への使用に適切なＰＧ２１７２ポリペプチドは、ポルフィ
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ
３３２７７、ならびにＰＧ２１７２を発現する他の株から単離されても、誘導されてもよ
い。ＰＧ２１７２はＰＧＮ＿０１２３としても知られている。ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムの完全長Ｐ２１７２のアミノ酸配列は
、ジェンバンク受入番号ＡＡＱ６７１２１．１によって入手可能で、本明細書の配列リス
トに配列番号３として記載する。本発明で使用するのに好ましいＰ２１７２ポリペプチド
は、配列番号３に対して５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８
５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以上）
を有するアミノ酸配列を含む。本発明での使用に好ましいポリペプチドは、配列番号３の
40
少なくとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続したアミノ酸
のフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号３の１つの抗原決定基を保有
する。他の好ましいフラグメントは、配列番号３の抗原決定基を少なくとも１つ保有する
が、配列番号３のＮ末端から１つまたは複数の酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号３のＣ末端から１つ
または複数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配列番号３のＮ末端から
シグナル配列を欠く。
【００２９】
本明細書に記述された組成物への使用に適切なＰＧ０６１３ポリペプチドは、ポルフィ
50
(14)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ
３３２７７、ならびにＰＧ０６１３を発現する他の株から単離されても、誘導されてもよ
い。ＰＧ０６１３はＰＧＮ＿０６５６としても知られている。ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムの完全長Ｐ０６１３のアミノ酸配列は
、ジェンバンク受入番号ＡＡＱ６５７９７．１によって入手可能で、本明細書の配列リス
トに配列番号１１として記載する。本発明で使用するのに好ましいＰ０６１３ポリペプチ
ドは、配列番号１１に対して５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０
、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以
上）を有するアミノ酸配列を含む。本発明で使用するのに好ましいポリペプチドは、配列
番号１１の少なくとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５
10
、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続し
たアミノ酸のフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号１１の１つの抗原
決定基を保有する。他の好ましいフラグメントは、配列番号１１の抗原決定基を少なくと
も１つ保有するが、配列番号１１のＮ末端からの１つまたは複数の酸（例えば１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号
１１のＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配
列番号１１のＮ末端からシグナル配列を欠く。 本明細書に記述された組成物への使用に適切なＰＧ１３２６ポリペプチドは、ポルフィ
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ
３３２７７、ならびにＰＧ１３２６を発現する他の株から単離されても、誘導されてもよ
20
い。ＰＧ１３２６はＰＧＮ＿１１１５としても知られている。ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムの完全長Ｐ１３２６のアミノ酸配列は
、ジェンバンク受入番号ＡＡＱ６６３９６．１によって入手可能で、本明細書の配列リス
トに配列番号５として記載する。本発明で使用するのに好ましいＰ１３２６ポリペプチド
は、配列番号５に対して５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８
５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以上）
を有するアミノ酸配列を含む。本発明で使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号
５の少なくとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０
、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続したアミ
ノ酸のフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号５の１つの抗原決定基を
30
保有する。他の好ましいフラグメントは、配列番号５の抗原決定基を少なくとも１つ保有
するが、配列番号５のＮ末端からの１つまたは複数の酸（例えば１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号５のＣ末端か
ら１つまたは複数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配列番号５のＮ末
端からシグナル配列を欠く。 本明細書に記述された組成物への使用に適切なＰＧ１７９８ポリペプチドは、ポルフィ
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ
３３２７７、ならびにＰＧ１７９８を発現する他の株から単離されても、誘導されてもよ
い。ＰＧ１７９８はＰＧＮ＿１７６７としても知られている。ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムのＰ１７９８の完全長のアミノ酸配列
40
はジェンバンク受入番号ＡＡＱ６６７９７．１により入手可能であり、配列番号１３とし
て本明細書の配列リストに記載される。本発明での使用に好ましいＰ１７９８ポリペプチ
ドは、配列番号１３と５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５
、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以上）を
有するアミノ酸配列を含む。本発明での使用に好ましいポリペプチドは、配列番号１３の
少なくとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続したアミノ酸
のフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号１３の１つの抗原決定基を含
む。他の好ましいフラグメントは、配列番号１３の少なくとも１つの抗原決定基を保有す
るが、配列番号１３のＮ末端からの１つまたは複数の酸（例えば１、２、３、４、５、６
50
(15)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
、７、８、９、１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号１３のＣ末端
から１つまたは複数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配列番号１３の
Ｎ末端からシグナル配列を欠く。 本明細書に記述された組成物への使用に適切なＰＧ０１８６ポリペプチドは、ポルフィ
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ
３３２７７、ならびにＰＧ０１８６を発現する他の株から単離されても、誘導されてもよ
い。ＰＧ０１８６はＰＧＮ＿０２９４としても知られている。ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムの完全長Ｐ０１８６のアミノ酸配列は
、ジェンバンク受入番号ＡＡＱ６５４２１．１により入手可能で、本明細書の配列リスト
に配列番号１５として記載する。本発明で使用するのに好ましいＰ０１８６ポリペプチド
10
は、配列番号１５に対して５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０、
８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以上
）を有するアミノ酸配列を含む。本発明で使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番
号？の少なくとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４
０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続したア
ミノ酸のフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号１５の１つの抗原決定
基を含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号１５の抗原決定基を少なくとも１つ保
有するが、配列番号１５のＮ末端から１つまたは複数の酸（例えば１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号１５のＣ末
端から１つまたは複数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配列番号１５
20
のＮ末端からシグナル配列を欠く。 本明細書に記述された組成物への使用に適切なＰＧ０６１６ポリペプチドは、ポルフィ
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５０およびＡＴＣＣ
３３２７７、ならびにＰＧ０６１６を発現する他の株から単離されても誘導されてもよい
。ＰＧ０６１６はＰＧＮ＿０６５９としても知られている。ポルフィロモナス・ジンジバ
リス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノムの完全長Ｐ０６１６のアミノ酸配列は、
ジェンバンク受入番号ＡＡＱ６５８００．１によって入手可能で、本明細書の配列リスト
に配列番号１９として記載する。本発明での使用に好ましいＰ０６１６ポリペプチドは、
配列番号１９に対して５０％以上の同一性（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５
、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％以上）を
30
有するアミノ酸配列を含む。本発明での使用に好ましいポリペプチドは、配列番号１９の
少なくとも８、９、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上の連続したアミノ酸
のフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、配列番号１９の１つの抗原決定基を保
有する。他の好ましいフラグメントは、配列番号１９の抗原決定基を少なくとも１つ保有
するが、配列番号１９のＮ末端から１つまたは複数の酸（例えば１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１５、２０または２５以上）および／または配列番号１９のＣ末端
から１つまたは複数のアミノ酸を欠く。さらに好ましいポリペプチドは、配列番号１９の
Ｎ末端からシグナル配列を欠く。 本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および本発明のポリ
40
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハ
イブリダイズするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチド配列の相補体を
含む。さらに本発明には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２
０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４０のいずれかのよ
うな同定された参照核酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくと
も６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％
、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なく
とも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３
％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少な
くとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドも含まれる
50
(16)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
。単離された、または本明細書に開示された配列に従って合成された本発明の核酸はポル
フィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ペプチドまたはポリペプチド
の組換え体の産生に有益である。
【００３０】
本発明の核酸は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株（
例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３、Ｗ５
０およびＡＴＣＣ３３２７７等があるがこれに限定しない）、および適用可能なＤＮＡ遺
伝子配列を保有する他のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）
株のＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して（ＰＣＲ， Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、ＱｕｉｒｋｅおよびＴａｙｌｏ
10
ｒ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９９１））に記載されているように
）、または当業者が認識する標準的な代替技術を使用して、直接得てもよい。本発明の一
実施形態では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２２、２４、
２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４０のいずれかに対応する配列を有す
る単離された核酸分子が提供される。本発明は、これらの配列の配列保守的変異体および
機能保守的変異体を包含する。 本発明のポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１
９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５、３７および３９、およびそれらの変異
体のポリペプチドを含む、開示され単離された核酸によりコードされたポリペプチドを包
含する。機能保守的変異体を含む本発明のポリペプチドは、ポルフィロモナス・ジンジバ
20
リス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の表面に接近可能なタンパク質に対応することが好ま
しい。
【００３１】
本発明のポリペプチドは標準的な分子生物学の技術および発現系を使用して産生できる
（例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、２００１を参照のこと）。例えば、免疫原性のポリペプチド
をコードする遺伝子（または遺伝子のフラグメント）は単離されてもよく、免疫原性のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドは、任意の市販の発現ベクター（例えば、ｐＢ
Ｒ３２２およびｐＵＣベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，
30
Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、または発現／精製ベクター（例えば、ＧＳＴ融合ベクター（Ｐ
ｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．、または本明細書の実施例に記
述されたもの）にクローニングして、その後、適切な原核生物、ウイルス、または真核生
物の宿主内で発現させてもよい。その後、従来の方法により、または市販の発現／精製シ
ステムの場合には、製造者の指示に従って精製してもよい。 あるいは、変異体を含む本発明のポリペプチドは、これに限定しないが、例えばポルフ
ィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の野生型または突然変異体の細
胞から単離されてもよく、または、排他的固相合成、部分的固相方法、フラグメント縮合
または液相合成等の市販の自動化手順を使用する化学的な合成により単離されてもよい。
40
本発明のポリペプチドには免疫原活性があることが好ましい。「免疫原活性」は、ポリ
ペプチドが対象において免疫応答を誘発する能力を指す。ポリペプチドに対する免疫応答
は、対象におけるポリペプチドに対する細胞性および／または抗体を介した免疫応答であ
る。通常、免疫応答には、抗体の産生、ポリペプチドの１つまたは複数の抗原決定基への
、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞毒性Ｔ細胞の遊走と
いうような作用が１つまたは複数含まれる、これに限定されない。用語「抗原決定基」は
、抗原上の部位を指し、これに対して特定のＢ細胞および／またはＴ細胞が応答して抗体
が産生される。免疫原活性は予防的であってもよい。用語「予防的免疫原活性」は、ポル
フィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）による感染症を予防、または
阻止する対象の免疫応答を誘発するポリペプチドの能力を指す。
50
(17)
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【００３２】
本発明のポリペプチドは、分子量、質量フィンガープリント、アミノ酸配列、ポリペプ
チドをコードする核酸塩基配列、免疫学的活性、またはこのような特徴の２つ以上の任意
の組み合わせを特徴としてもよい。典型的にはキロダルトン（ｋＤａ）で表されるポリペ
プチドの分子量は、通例の方法を使用して測定できる。この方法には、例えば、ゲルろ過
、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）、
キャピラリー電気泳動法等のゲル電気泳動法、質量分析法、液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣを含む）、および確認されたまたは予測されたアミノ酸配列からの分子量の算定が
ある。
【００３３】
10
一実施形態において、ポリペプチド、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１
３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５、３７および３９、
またはその変異体のうちのいずれかをコードする核酸が提供される。縮重変異体を含む、
これらの配列の変異体も提供される。ある実施形態においては、下記に詳述するように、
ポリペプチドおよび／またはそのフラグメントをコードする核酸分子を、１つまたは複数
の発現ベクターに導入してよい。そのような実施形態では、ポリペプチドおよび／または
フラグメントは、アミノ酸配列に対応するヌクレオチドによりコードされる。下記表１に
示すように、多様なアミノ酸をコードするヌクレオチドの特定の組み合わせは当技術分野
において周知であり、当業者が用いるさまざまな参照文献に記載されている（例えばＬｅ
ｗｉｎ，Ｂ．Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １
９９４，および続版）。核酸変異体は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチドの
任意の組み合わせを使用してもよい。
20
(18)
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【表１】
10
20
30
40
【００３４】
50
(19)
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本明細書に記述されたＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、Ｐ
Ｇ２１７２、ＰＧ０６１３、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６およびＰＧ０６
１６の免疫原性のポリペプチドは、このようなポリペプチドおよび／またはフラグメント
の免疫原性のフラグメントおよび変異体を含む。変異体はアミノ酸修飾を含んでもよい。
例えば、アミノ酸配列修飾には置換、挿入、または欠失による変化がある。変異体が免疫
原性である限り、置換、欠失、挿入またはその任意の組み合わせは単一の変異体において
併用されてもよい。挿入はアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、および単一のア
ミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、一般的に、アミノま
たはカルボキシル末端の融合の場合よりも小規模な挿入（例えば約１∼４残基）となるだ
ろう。欠失は、１つまたは複数のアミノ酸残基をタンパク質配列から除去することが特徴
10
である。わずか約２∼６残基が、タンパク質分子内の任意の一部位で欠失するのが典型的
である。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチドの部位突
然変異によって作成され、それにより変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後、組み
換え細胞培養でＤＮＡを発現させる。
【００３５】
既知の配列を有するＤＮＡ内の所定の部位で置換突然変異を誘発する技術はよく知られ
ており、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＴ突然変異誘発があるがこれに限定さ
れない。アミノ酸置換は典型的には単一の残基であるが、異なるいくつかの部位で生じさ
せることができる。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる
残基が挿入されたものである。このような置換は、一般に下記の表２に従って生成され、
保存的置換（非保存的置換も可能であるが）と呼ばれる。他のものは当業者に周知である
。
【００３６】
保存的なアミノ酸置換では、その位置のアミノ酸残基の大きさ、極性、電荷、疎水性ま
たは親水性にはほとんど、または全く影響しないよう、特に、免疫原性の減少を招かぬよ
う、天然のアミノ酸残基を非天然の残基で置換してもよい。適切な保存的なアミノ酸置換
を表２に示す。
20
(20)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
【表２】
10
20
30
40
【００３７】
選択された特定のアミノ酸置換は、選択された部位の位置に依存してもよい。ある実施
50
(21)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
形態において、ポリペプチドおよび／またはフラグメントをコードするヌクレオチドは、
遺伝コードの縮重に基づいて置換されている（すなわち、「ゆらぎ」仮説との一致）。核
酸が細胞内でのポリペプチドの発現に有益な組換えＤＮＡ分子である場合（例えば発現ベ
クター）、ゆらぎ型置換は、ＤＮＡ分子によりコードされたその元々のアミノ酸と同じア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを発現することとなる。しかしながら、上述のように、
置換は保存的、または非保存的、またはその任意の組み合わせであってよい。 当業者は、よく知られている技術を使用して、本明細書で提供されたポリペプチドおよ
び／またはフラグメントの適切な変異体を特定することができるだろう。生物活性（例え
ば免疫原性、ＭＨＣ結合、赤血球（ＲＢＣ）凝集、ＲＢＣ溶血）を破壊せずに変化可能な
分子の適切な領域の同定に際して、当業者は、その活性にとって重要だとは思われない領
10
域を標的としてもよい。例えば、同一の種、または他の種から同様の活性を有する誘導体
が知られている場合、当業者はポリペプチドのアミノ酸配列をこのような類似のポリペプ
チドと比較してもよい。このような分析を実施すれば、保存される分子の残基および部分
を同定できる。このような類似の誘導体に関連して保存されない分子の領域での変化は、
ポリペプチドの生物活性および／または構造にはほとんど悪影響を及ぼさないことが認識
されるだろう。しかしながら、ＭＨＣへの結合の減少を招く修飾は、多くの場合適切では
ないであろう。当業者は、比較的保存された領域においても、ポリペプチドおよび／また
はフラグメントの望ましい特性を保有したまま、天然の残基を化学的に類似のアミノ酸と
置換し得ることも認識しているだろう。したがって、生物活性、または構造にとって重要
と思われる領域においても、生物活性を破壊せずに、または誘導体の構造に悪影響を与え
20
ずに、保存的なアミノ酸置換を行える。
【００３８】
類似体は、天然のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリ
ペプチドとは、アミノ酸配列において、および／または非配列修飾により異なる可能性が
ある。非配列修飾は、アセチル化、メチレーション、ホスホリレーション、カルボキシル
化またはグリコシル化の変化を含む。本発明のポリペプチドの「修飾」は、１つまたは複
数の構成アミノ酸において化学的に、または酵素学的に誘導体化されたポリペプチド（ま
たはその類似体、例えばそのフラグメント）を含む。そのような修飾には例えば、側鎖修
飾、主鎖修飾および、Ｎ末端およびＣ末端修飾、例えばアセチル化、ヒドロキシル化、メ
チレーション、アミド化および糖または脂質成分の付加、補因子等、およびこれらの組み
30
合わせを含み得る。本発明の修飾ポリペプチドは、無修飾のポリペプチドの生物活性を保
有してもよく、またはその生物活性が減少、または増加を示してもよい。
【００３９】
ポリペプチド配列の類似性およびポリペプチド配列の同一性
２つのポリペプチドの構造的類似性は２つのポリペプチド残基（例えば候補ポリペプチ
ドと、例えば配列番号１のポリペプチド）をアラインさせて、これらの配列の長さに沿っ
て同一のアミノ酸の数を最適化することにより測定できる。各配列のアミノ酸はそれらの
本来の順のままであるが、片方の、または両配列内のギャップは、同一のアミノ酸の数を
最適化するためにアラインメントする際には容認される。候補となるポリペプチドは参照
ポリペプチドと比較されるポリペプチドである。候補ポリペプチドは、例えば微生物（例
40
えばポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ））から単離でき、ま
たは、組み換え技術を用いて産生しても、または化学的もしくは酵素学的に合成してもよ
い。
【００４０】
アミノ酸配列の対比較分析はグローバルアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗ
ｕｎｓｃｈ）を使用して行なうことができる。あるいは、ポリペプチドは、Ｔａｔｉａｎ
ａらにより記述されたように（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ，１７４：２
４７−２５０（１９９９））、ローカルアラインメントアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ
２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを使用して比較してもよい。これは、国立
バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトで利用可能である。全ＢＬＡ
50
(22)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
ＳＴ２検索パラメータに対してデフォルト値を使用してもよい。デフォルト値はｍａｔｒ
ｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１１、ｅｘｔｅｎｓｉｏ
ｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１、ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、ｅｘｐｅｃｔ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝３、およびｆｉｌｔｅｒ ｏｎを含む。Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅ
ｒｍａｎアルゴリズムは、使用可能な別のローカルのアラインメントツールである（１９
８８）。
【００４１】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造上の類似性を、「同一性」パーセント、また
は、「類似性」パーセントとして言及してもよい。「同一性」は、同一のアミノ酸の存在
を指す。別記しない限り、用語「同一性パーセント」は、２つのアミノ酸の対比較分析が
10
グローバルアルゴリズムを使用して行なわれたことを意味する。「類似性」は、同一のア
ミノ酸の存在だけでなく保存的置換の存在をも指す。本発明のポリペプチドにおけるアミ
ノ酸の保存的置換は、表２に示すように、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選
択されてもよい。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５
５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少
なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも
８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、
少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくと
20
も９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポ
リペプチドを含み得る。
【００４３】
融合
他の実施形態において、本明細書に記述されたポリペプチドおよび／またはフラグメン
トは、ポリペプチドの精製または検出を支援する融合ポリペプチドセグメントを含んでい
てもよい。融合は、対象ポリペプチド変異体のアミノ末端、またはカルボキシ末端で生成
できる。融合はリンカーまたはアダプター分子なしで直接的に、またはリンカーまたはア
ダプター分子によってなされてもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つまたは複
数のアミノ酸残基であってもよく、典型的には約２０∼約５０のアミノ酸残基である。リ
30
ンカーまたはアダプター分子も、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ、または融合成分の分離
を可能とするタンパク分解酵素の切断部位とともに設計されてもよい。融合ポリペプチド
が一度構築されれば、本明細書に記述された方法に従って誘導可能であることが理解され
るであろう。適切な融合セグメントには、特に、金属結合ドメイン（例えばポリヒスチジ
ンセグメント）、免疫グロブリン結合ドメイン（すなわちプロテインＡ、プロテインＧ、
Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｃ受容体または補体タンパク質抗体結合ドメイン）、糖結合ドメイン
（例えばマルトース結合ドメイン）、および／または「タグ」ドメイン（すなわち、ガラ
クトシダーゼの少なくとも一部分、連鎖球菌タグペプチド、Ｔ７タグペプチド、ＦＬＡＧ
ペプチド、またはモノクローナル抗体等のドメインに結合する化合物を使用して精製でき
る他のドメイン）が含まれる。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現においてポ
40
リペプチドに融合され、宿主細胞から目的のポリペプチド配列をアフィニティー精製する
ための手段として機能する。アフィニティー精製は、例えばカラムクロマトグラフィーで
、アフィニティマトリクスとしてタグに対する抗体を使用して行うことができる。その後
場合により、タグを、切断にある種のペプチダーゼを使用する様々な方法によって、目的
のポリペプチドの精製した配列から除去できる。精製を支援するためにＮ末端に付加され
たセグメント／ドメインを有する融合タンパク質の例を本明細書に提供する（例えば配列
番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５、３７および３９を参照）。
【００４４】
ある実施形態において、ポリペプチドおよび／またはフラグメントは、検出できるよう
、直接的または間接的に（すなわち、抗体を使用して）標識またはタグ付けされてもよい
50
(23)
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。標識には、フルオレッセイン等の蛍光色素、ローダミン、フィコエリトリン、ユウロピ
ウムおよびテキサスレッド、ジアミノベンジジン等の発色染色、ラジオアイソトープ、巨
大分子のコロイド粒子または着色ラテックスビーズ等の分散粒子、磁性または常磁性、ビ
オチンおよびジゴキシゲニン等の結合剤、およびＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロ
ット、ＴＲＦＩＡ、免疫組織化学的検査、消散、ルミネックスビーズアレイ、またはディ
ップスティックもしくは他のラテラルフロー分析フォーマット等において、直接的にまた
は間接的に、検出可能な信号を視認可能に、電子的に検出可能に、またはそうでなければ
記録可能にする生物学上はまたは化学的に活性な薬剤が含まれる。このような方法で使用
される適切な抗体結合分子には、免疫グロブリン結合抗体、例えば抗ヒトＩｇ抗体、抗ヒ
ト抗体、Ｉｇイソタイプ、もしくはＩｇＧのサブクラスに特異的な、またはポルフィロモ
10
ナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質に特異的な抗ヒト抗体を含
み得る。
【００４５】
好ましい蛍光性のタグタンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）として知られてい
るクラゲタンパク質由来のものを含む。ＧＦＰおよび他の蛍光体についての詳細は下記の
論文に示されている：Ｔｓｉｅｎ Ｒ Ｙ，“Ｔｈｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ”Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １９９８； ６７：５０９−５４４、Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ，ＶおよびＬｕｋｙａｎｏ
ｖ，Ｋ．“Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｈｏｚａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａ
20
ｎｄ Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０
０４；２２：２８９−２９６。幅広い蛍光性のタグタンパク質をコードするプラスミドベ
クターは、様々な供給者から入手可能であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．より入手可能な“Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｏｌｏｕｒｓ＆＃８４８２；Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”アレイが含まれる。類似のベクターもＩｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎおよびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ等の他の供給者から入手
可能である。ＧＦＰ由来の適切な蛍光性タンパク質には、赤に変換された変異体ＥＧＦＰ
、青に変換された変異体ＥＣＦＰ、および黄色に変換された変異体ＥＹＦＰである。ＥＧ
ＦＰは標的抗原の抗原特性への影響を最小限に抑えながら明るい蛍光を発するため、蛍光
マーカーとして好まれている。別の蛍光性マーカータンパク質は市販されている。生物学
30
上はまたは化学的に活性な薬剤は酵素を含んでおり、酵素は例えば色を発色させるため、
または変化させる反応を触媒したり、電気的性質の変化を引き起こしたりするため有益で
ある。酵素は分子的に励起可能なため、エネルギー状態間の電子遷移により特有のスペク
トルが吸収または放出される。酵素には、バイオセンサーと共に使用される化学成分を含
んでもよい。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリフ
ォスファターゼ検出体が使用されてもよい。さらなる例にはホースラディッシュペルオキ
シダーゼおよび化学蛍光も含まれる。実施形態のいくつかにおいては、非固定化抗体結合
分子またはポリペプチドは、前記非固定化抗体結合分子またはポリペプチドと結合する抗
体を使用して検出されてもよい。適切な検出抗体は蛍光によって標識されてもよい。標識
は、標的抗原を直接標識するために使用される蛍光マーカー（タグ）でもよく、これによ
40
り抗原と蛍光マーカーが融合タンパク質を形成する。
【００４６】
標的抗原に対する抗体が生物学的試料中にある場合、抗原は、抗体に結合されたタグで
標識されてもよく、形成された複合体は、免疫沈殿法を使用して検出される。その後、タ
グに関連した蛍光は、タンパク質の沈降の判断に（定性的測定）、または沈降したタンパ
ク質の量を測定する（定性的測定）ために使用されてもよい。例えば、蛍光タグをつけた
抗原の可溶性抽出物を、適切な期間、例えば４℃で一晩、対象血清でインキュベートして
抗体を抗原に結合させてもよい（典型的には抽出物３００−５００μｌ（３００−５００
ｍｍ３）以下に対して血清１０−１５μｌ（１０−１５ｍｍ３））。プロテインＡまたは
プロテインＧのセファロースビーズを、非特異的な結合を防止するために低ＩｇＧウシ胎
50
(24)
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児血清（Ｓｉｇｍａ）でプレインキュベートし、その後タグ付きタンパク質／抗体複合体
を含む抽出物／血清混合物に付加し、室温で１∼２時間、ゆっくり回転させて混合した。
タグ付きタンパク質に特異的に結合するものを含む、血清内の抗体は、タンパク質Ａ／Ｇ
ビーズにより結合される。その後、タンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズを適切な緩衝液
で洗浄し（典型的には１０ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ７．４、１００ｍＭ塩化ナトリウム／１
ｍＭ ＥＤＴＡ／１％トリトンＸ−１００）、結合しなかったタグ付きタンパク質を除去
する。これは、遠心分離を３回行い、上澄部を除去し、緩衝液で再懸濁して行ってもよい
。その後ビーズを、そのうちいくつかにはタグ付きタンパク質が付着しているが、回収し
、蛍光読取り装置、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．のＳｐｅｃｔ
ｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダーに入れる。本来の血清試料の特異的
10
自己抗体／抗体の存在が定量化される。ＧＦＰの場合には、波長４７２ｎｍでの励起、お
よび５１２ｎｍでの発光を使用する。蛍光励起は、使用される蛍光体／タグに依存するが
、同時にいくつかの異なるタグ付きタンパク質を組み合わせることは可能だろう。例えば
、異なるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチド（
および／またはそのフラグメント）は別々にタグ付けされ、別々にまたは同時に分析され
てもよい。方法の感受性は検出装置に依存し、より感受性の高い検出装置の使用により相
当に高めることができる。これらの方法では様々な改変が可能である。
【００４７】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）抗原で免疫活性抗体を
検出するために本明細書に記述した分析も、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉ
20
ｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症の検出に有益な他の分析と組み合わせてもよい。例えば、これ
らの分析（すなわちＥＬＩＳＡ）は、生物学的試料中のポルフィロモナス・ジンジバリス
（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）核酸の検出ためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析と
組み合わせてもよい。あるいは、ＥＬＩＳＡ分析は免疫沈殿法分析と組み合わせてもよく
、ＰＣＲに基づいた分析を、免疫沈殿法分析と組み合わせてもよい。本明細書に記述した
様々な分析を組み合わせて、検出の感受性をさらに増加させても、データの陰性的中率を
さらに減少させてもよい。
発現ベクター
さらに本発明は、発現ベクターの使用法を提供する。発現ベクターは一般的に、ポリペ
プチドをコードする異種性の核酸配列（「コード配列」）に操作可能に連結されたフラン
30
キング配列で構成される。他の実施形態において、またはこのような実施形態との組み合
わせにおいて、フランキング配列には、コード配列の複製、転写および／または翻訳に影
響を与えられることが好ましく、コード配列に操作可能に連結される。「操作可能に連結
された」とは、核酸配列がそれらの通常の機能を実施するように構成されることを示す。
例えば、プロモーターがそのコード配列の転写を指示できる場合、プロモーターは、コー
ド配列に操作可能に連結されている。存在可能なプロモーターエレメントは、ポリペプチ
ドをコードする核酸配列に本来関連したもの、および核酸配列に関連しない外来性のエレ
メントも含む。
【００４８】
正確に機能する限り、フランキング配列はコード配列に隣接する必要はない。即ち、例
40
えば翻訳も転写もされない配列をプロモーター配列とコード配列の間に介在させてよく、
この場合プロモーター配列はやはりコード配列と機能的に結合していると見なすことがで
きる。フランキング配列は、相同（すなわち宿主細胞と同一の種および／または株由来）
、異種（すなわち宿主細胞の種または株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち２つ以
上のソースのフランキング配列の組み合わせ）または合成であってもよい。フランキング
配列はさらに宿主のゲノム内でポリペプチドをコードする核酸配列の発現を調節するため
に通常機能する配列であってもよく、また利用してもよい。
【００４９】
ベクターを含む培養細胞も提供される。培養細胞は、ベクターで形質移入された培養細
胞またはその細胞の後代であってもよく、細胞は免疫原性のポリペプチドを発現する。例
50
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えば、適切な細胞株は当業者に知られており、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ
）によって入手可能である。ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ）核酸配列は、例えば哺乳動物細胞、バキュロウィルス、植物、バクテリアおよび酵母
で使用される種々の発現系で発現できる。形質移入された細胞は、免疫原性のポリペプチ
ドを産生する方法において使用できる。この方法には、ポリペプチドの発現を許容する条
件下で、場合により発現配列の制御下で、ベクターを含む細胞を培養することを含む。ポ
リペプチドは標準的なタンパク質精製方法を使用して、細胞または培地から単離できる。
【００５０】
送達技術
ある実施形態において、フランキング配列は標的細胞内で高レベルの遺伝子発現をもた
10
らす転写制御領域であることが好ましい。転写制御領域は例えば、プロモーター、エンハ
ンサー、サイレンサー、抑制エレメントまたはその組み合わせを含んでもよい。転写制御
領域は構成的、または組織もしくは細胞型に特異的であってもよい（すなわち、この領域
により、組織または細胞のある型において、別の型と比較してより高レベルの転写がもた
らされる）。そのため、フランキング配列が、宿主細胞の機構において機能する、および
機構によって活性化され得るならば、転写制御領域のソースは、任意の原核生物もしくは
真核生物、任意の脊椎動物もしくは無脊椎動物、または任意の植物であってもよい。種々
様々の転写制御領域を利用してもよい。
【００５１】
適切な転写制御領域には、中でも、ＣＭＶプロモーター（すなわちＣＭＶ−最初期プロ
20
モーター）；真核生物の遺伝子（すなわちエストロゲン誘導性ニワトリオバルブミン遺伝
子、インターフェロン遺伝子、グルココルチコイド誘導性チロシンアミノトランスフェラ
ーゼ遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子）のプロモーター；および主要初期および後期
アデノウイルス遺伝子プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ
およびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）；Ｒｏｕｓ肉
腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’末端反復配列（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター（Ｙａｍａ
ｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；単純ヘルペスウイルスチミジ
ンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝
子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；
30
βラクタマーゼプロモーター等の原核生物の発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆ
ｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２
７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）が含まれる。組織および／ま
たは細胞型特異的転写制御領域には、例えば、膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ
遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔ
ｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉ
ｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔ
ｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領
域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）；リンパ系細胞
40
において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃ
ｅｌｌ ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３
３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１４
３６−４４）；精巣、乳腺、リンパおよび肥満細胞内のマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌ
ｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；肝臓のアルブミン遺伝子制御
領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７
６）；肝臓のαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓のα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌ
ｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄細胞
50
(26)
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のβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３
８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）脳の乏突起膠細
胞内のミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅ
ｌｌ ４８：７０３−１２）；骨格筋のミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１
９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）；および視床下部の性腺刺激放出ホルモ
ン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８
）、およびメラノーマ細胞内のチロシナーゼプロモーター（Ｈａｒｔ，Ｉ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９６ Ｆｅｂ；２３（１）：１５４−８；Ｓｉｄｅｒｓら、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９８ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；５（５）：２８１−９１）がある
。他の適切なプロモーターは当技術分野において周知である。
10
【００５２】
核酸分子はウイルスおよび非ウイルスベクターの一部分として投与されてもよい。一実
施形態において、ＤＮＡベクターは、標的免疫原および／または会合分子（すなわち同時
刺激の分子、サイトカインまたはケモカイン）をコードする核酸を対象に送達するために
利用される。これを行う際に、多様な方法を使用して、このようなメカニズムの効率を改
善してもよい。このような方法には例えば、自己増殖ウイルスレプリコンの使用（Ｃａｌ
ｅｙら、１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：３１２４−２１３５；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、
２０００．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：７２３−７３２；Ｌｅｉｔｎｅｒら、２０００．Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：５１−５５）、コドン最適化（Ｌｉｕら２０００．Ｍｏｌ．Ｔｈ
ｅｒ．、１：４９７−５００；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ、前出；Ｈｕａｎｇら、２００１．Ｊ．
20
Ｖｉｒｏｌ．７５：４９４７−４９５１）、インビボエレクトロポレーション（Ｗｉｄ
ｅｒａら、２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５−３６４０）、同時刺激分
子、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸の取り込み（Ｘｉａｎｇら
、１９９５．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（２）：１２９−１３５；Ｋｉｍら、１９９８．Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：１０８９−１１０３；Ｉｗａｓａｋｉら、１９９７．Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５９１−３６０１；Ｓｈｅｅｒｌｉｎｃｋら、２００１．
Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：２６４７−２６５）、ＣｐＧ等の刺激モチーフの取り込み（Ｇｕ
ｒｕｎａｔｈａｎ、前出；Ｌｅｉｔｎｅｒ、前出）、形質膜陥入経路またはユビキチン−
プロセシング経路のターゲティングのための配列（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８．Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．７２：２２４６−２２５２；Ｖｅｌｄｅｒｓら、２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
30
ｌ．１６６：５３６６−５３７３）、プライム−ブースト法（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ、前
述；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、２０００．Ｎａｔｕｒｅ、４０８：６０５−６０９；Ｈａｎｋ
ｅら、１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ、１６：４３９−４４５；Ａｍａｒａら、２００１．Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ（２９２）：６９−７４）、プロテアソーム感受性切断部位、およびサルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）等の粘膜送達ベクターの使用（Ｄａｒｊｉら、１９９７．
Ｃｅｌｌ、９１：７６５−７７５；Ｗｏｏら、２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ（１９）：２９
４５−２９５４）。他の方法は当技術分野において知られており、このうちのいくつかは
、以下で記述される。
【００５３】
核酸を宿主に導入するのに使用される様々なウイルスベクターには、特に、レトロウイ
40
ルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスおよびポック
スウイルスがある。多数のこのようなウイルスベクターが当技術分野において有用である
ことは当技術分野において理解されている。ベクターは、当業者に広く利用可能な標準的
な組み換え技術を使用して構築されてもよい。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９
８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，１９９１．Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＰＣＲプロトコル：Ａ Ｇｕｉ
ｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、１９
50
(27)
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９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の一般的な分子生
物学の参考文献で見られる。
【００５４】
好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスの誘導体およびマウスまたは鳥類
のレトロウイルスの誘導体である。適切なレトロウイルスベクターには例えば、モロニー
マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）
、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶ、およびラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）がある。レトロウイルスベクターのいくつかは外来性の核酸配列を複数組
み入れることができる。組換えレトロウイルスは不完全であるので、感染性のベクター粒
子を産生するために支援を必要とする。この支援は例えば、レトロウイルス構造遺伝子を
10
コードするヘルパー細胞株により提供することができる。適切なヘルパー細胞株には特に
ＰＡ３１７とＰＡ１２がある。その後、そのような細胞株を使用して産生されたベクター
のウイルス粒子を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の組織細胞株に感染させ、大量のキメラレトロウ
イルスのウイルス粒子を産生してもよい。レトロウイルスベクターは、伝統的な方法（す
なわち注入）、または標的細胞集団の近接に「プロデューサー細胞株」を埋め込んで投与
してもよい（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．ら、１９９４、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５（３
）：３４３−７９；Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍ
ｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５９：６８５−９０）；Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ．、１９９
３、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４（１）：３９−６９）。プロデューサー細胞株は
ウイルスベクターを産生するために操作され、標的細胞の近くにウイルス粒子を放出する
20
。放出されたウイルス粒子の一部分がターゲット細胞と接触し、細胞を感染させて標的細
胞に核酸を送達する。標的細胞の感染後に、ベクターの核酸の発現が起こる。
【００５５】
アデノウイルスベクターは真核細胞への遺伝子導入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍら、１９
９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２（５００４）：４３１−３；Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．ら、１
９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、８（１）：４２−５１）、真核生物の遺伝子発現に関す
る研究（Ｌｅｖｒｅｒｏ、Ｍ．ら、１９９１，Ｇｅｎｅ，１０１（２）：１９５−２０２
）、ワクチン開発（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．およびＰｒｅｖｅｃ，Ｌ．、１９９２、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０： ３６３−９０）、および動物モデル（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ
−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｌ．ら、１９９２、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐ
30
ｌａｎｔ．，９（Ｓｕｐｐｌ．１）：１５１−２；Ｒｉｃｈ，Ｄ．ら、１９９３、Ｈｕｍ
．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４（４）： ４６１−７６）においてに特に有益であると証明
されている。インビボの異なる組織に対する組み換えＡｄを投与するための経験的な経路
には、気管内投与（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．ら、１９９２、Ｃｅｌｌ，６８（１）：１
４３−５５）、筋肉注入（Ｑｕａｎｔｉｎ，Ｂ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（７）：２５８１−３）、末梢静脈注入（Ｈｅｒｚ
，Ｊ．、およびＧｅｒａｒｄ，Ｒ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０（７）：２８１２−６）、および脳への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｇ．ら，１９９３およびＳｃｉｅｎｃｅ，２５９（５０９７）：９８
８−９０）が含まれる。
40
【００５６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は宿主細胞ゲノムへ組み込む際に高レベルの感染力、幅
広い宿主域および特異性を示す（Ｈｅｒｍｏｎａｔ，Ｐ．ら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１（２０）：６４６６−７０）。また、単純
ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）も、好ましいベクター系であり、向神経性特性を有
するためのため特に神経系で使用される。（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．ら、１９９１、Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４（１０）：４２８−３２；Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、１９９
５、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４（１）：８７−９９；Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、１
９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：６７５−７１０）。
【００５７】
50
(28)
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ポックスウイルスも有益な発現ベクターである。（Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｇｅｎｅ
，２５（１）：２１−８；Ｍｏｓｓら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：
３４５−６２；Ｍｏｓｓら、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，１５８：２５−３８；Ｍｏｓｓら、１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１
６６２−１６６７）。有益であると証明されたポックスウイルスには特に、ワクチニア、
ＮＹＶＡＣ（商標）、アビポックス、鶏痘、カナリア痘、ＡＬＶＡＣ（商標）およびＡＬ
ＶＡＣ（２）が含まれる。
【００５８】
ＮＹＶＡＣ（商標）（ｖＰ８６６）は、ワクチニアウイルスのコペンハーゲンワクチン
株から、既知の病原因子または潜在的な病原因子をコードするゲノムの６つの不必要な領
10
域を欠失させることにより誘導された（例えば、米国特許第５，３６４，７７３号明細書
および５，４９４，８０７号明細書を参照）。欠失座も外来遺伝子の挿入のため受入座と
して操作された。欠失領域は次のとおりである：チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ
）ｖＰ４１０；出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；Ａ型封入体領域（Ａ
ＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；宿主域
遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；およびリボヌクレオチドレダクターゼ大サブ
ユニット（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６。ＮＹＶＡＣ（商標）は、毒性および宿主域に関する遺伝
子産物をコードする１８のオープンリーディングフレームを特異的に欠失させて産生した
遺伝子改変のワクチニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣ（商標）は、ＴＡを発現するのに
有益であることが証明されている（例えば、米国特許第６，２６５，１８９号明細書を参
20
照）。ＮＹＶＡＣ（商標）（ｖＰ８６６）、ｖＰ９９４、ｖＣＰ２０５、ｖＣＰ１４３３
、ｐｌａｃＺＨ６Ｈ４Ｌｒｅｖｅｒｓｅ、ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３およびｐＣ３Ｈ６ＦＨ
ＶＢも、ブダペスト条約の条項下、ＡＴＣＣへ、それぞれ寄託番号ＶＲ−２５５９、ＶＲ
−２５５８、ＶＲ−２５５７、ＶＲ−２５５６、ＡＴＣＣ−９７９１３、ＡＴＣＣ−９７
９１２およびＡＴＣＣ−９７９１４で寄託された。
【００５９】
ＡＬＶＡＣに基づく組換えウイルス（すなわちＡＬＶＡＣ−１およびＡＬＶＡＣ−２）
も使用に適切である（例えば、米国特許第５，７５６，１０３号明細書を参照）。ＡＬＶ
ＡＣ（２）は、ＡＬＶＡＣ（２）ゲノムがワクチニアプロモーター制御下でワクチニアＥ
３ＬおよびＫ３Ｌ遺伝子を有する点を除き、ＡＬＶＡＣ（１）と同一である。（米国特許
30
第６，１３０，０６６号明細書；Ｂｅａｔｔｉｅら、１９９５ａ、１９９５ｂ、１９９１
；Ｃｈａｎｇら、１９９２；Ｄａｖｉｅｓら、１９９３）。ＡＬＶＡＣ（１）およびＡＬ
ＶＡＣ（２）の両方とも、ＴＡ等の外来性ＤＮＡ配列を発現するのに有益であることが証
明されている。（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３ａ、ｂ；米国特許第５，８３３，９７
５号明細書）。ＡＬＶＡＣは、ブダペスト条約の条項下、アメリカ培養細胞系統保存機関
（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓ
ａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）へＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−２５４７で寄託
された。
【００６０】
別の有益なポックスウイルスベクターはＴＲＯＶＡＣ（商標）ベクターである。ＴＲＯ
40
ＶＡＣ（商標）は弱毒化鶏痘のことで、鶏痘ウイルスのＦＰ−１ワクチン株からプラーク
クローニングで単離され、１日齢のヒナへの接種が許可されている。ＴＲＯＶＡＣ（商標
）ベクターのサンプルは、ブダペスト条約の条項下、ＡＴＣＣへ寄託番号２５５３で寄託
された。
【００６１】
「非ウイルスの」プラスミドベクターもまた、ある実施形態において適切であり得る。
好ましいプラスミドベクターは、細菌、昆虫および／または哺乳類の宿主細胞と適合性が
ある。そのようなベクターには例えば、ＰＣＲ−ＩＩ、ｐＣＲ３およびｐｃＤＮＡ３．１
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
50
(29)
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）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、
ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（Ｂｌｕ
ｅＢａｃＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ国際公開第９０／１４３
６３号パンフレット）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎ
ｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（
高コピー数のＣＯＬＥ１系ファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物のクローニングのために
設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばＴＯＰＯ（商標）ＴＡ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ（登録商標）ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）がある。細菌ベクターも使用されてもよい。これらのベクタ
10
ーには例えば、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ビ
ブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）、ウシ型弱毒結核菌ワクチン（ＢＣＧ）（Ｂａｃｉｌｌｅ ｃａｌｍｅｔ
ｔｅ ｇｕｅｒｉｎ）およびストレプトコックス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例え
ば国際公開第８８／６６２６号パンフレット；国際公開第９０／０５９４号パンフレット
；国際公開第９１／１３１５７号パンフレット；国際公開第９２／１７９６号パンフレッ
ト；および国際公開第９２／２１３７６号パンフレットを参照）がある。他の多数の非ウ
イルスのプラスミド発現ベクターおよび発現系が当技術分野において知られており、これ
を使用してもよい。
【００６２】
20
他の送達技術も利用でき、例えば、ＤＮＡリガンド複合体、アデノウイルスリガンドＤ
ＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ４沈降、遺伝子銃技術、エレクトロポレーショ
ンおよびコロイド分散系が含まれる。コロイド分散系は高分子複合体、ナノカプセル、マ
イクロスフェア、ビーズ、および脂質系、例えば水中油滴型エマルション、ミセル、混合
ミセルおよびリポソームが含まれる。好ましいコロイド系はリポソームであり、インビト
ロのおよびインビボで送達手段として有益な人工膜小胞である。リボ核酸、ＤＮＡおよび
無傷のウイルス粒子を水性内部に封入して、生物学上活性な形態で細胞に送達され得る（
Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．，ら、１９８１、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（６）：
７７）。リポソームの組成物は通常リン脂質、特に相転移温度が高いリン脂質と、通常ス
テロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質を使
30
用してもよい。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に
依存する。リポソーム産生に有益な脂質の例には、フォスファチジルグリセロール、フォ
スファチジルコリン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン等の
フォスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドがある。
特に有益なものはジアシルフォスファチジルグリセロールであり、脂質部位は１４∼１８
の炭素原子、特に１６∼１８の炭素原子を含み飽和している。リン脂質の例には卵子フォ
スファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルフォス
ファチジルコリンがある。
【００６３】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチド特異的抗体
40
本開示はさらに、抗体に関し、抗体は防衛および／または中和抗体であることが好まし
く、ＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１７９５、ＰＧ２１７２、ＰＧ０６１３、ＰＧ１
３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６、またはＰＧ０６１６もしくはそのフラグメントま
たは変異体の１つを使用して産生され、結果として生ずる抗体は、ポルフィロモナス・ジ
ンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチドおよび／またはそのフラグメント
もしくは変異体と反応、または特異的に結合する。さらに、抗体の産生を誘発する方法が
提供されるが、この抗体は防御抗体および／または中和抗体であり、ポルフィロモナス・
ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチドおよび／またはそのフラグメン
トと反応する。抗体は能動免疫および受動免疫の両方を誘発してもよい。ポリペプチドお
よび／またはそのフラグメントも抗体を同定し単離するために使用されてもよく、この抗
50
(30)
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体は防御抗体および／または中和抗体であり、それは、天然のポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質により誘発されたものと交差反応する。
【００６４】
精製された抗体は、抗体が最初に見出されるタンパク質の少なくとも約６０％、７５％
、８０％、８５％、９０％または９５％から分離されることが好ましい。当技術分野にお
いて知られているように、適切な誘導体にはフラグメント（すなわち、Ｆａｂ、Ｆａｂ２
またはＦｖ等の単鎖抗体）が含まれ得る。抗体は、任意の適切な起源または形態、例えば
、マウス（すなわち、マウスのハイブリドーマ細胞により産生された）であってもよくヒ
ト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体などとして発現されてもよい。
【００６５】
10
様々な型の抗体を調製および利用する方法は、当業者によく知られており、使用に適切
だろう（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８
８；Ｈａｒｌｏｗら、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．１，１９９８；Ｋｏｈｌｅ
ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））；Ｊｏｎｅｓ
ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａ
ｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔ
ｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．
20
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２２２：５８１（１９９１）；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７
（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（
１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１
９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４）；Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ
ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９
６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
30
３ ６５−９３（１９９５）；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，
５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号
明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；および同
第５，６６１，０１６号明細書を参照のこと）。ある適用において、抗体はハイブリドー
マ上澄部または腹水内に含まれていてもよく、そのまま直接的に使用しても、標準的な方
法を使用して濃縮してから使用してもよい。他の適用において、抗体は例えば、塩分別お
よびイオン交換クロマトグラフィー、またはアガロースビーズ等の固体担体に共有結合す
るタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇおよび／またはタンパク質Ｌのリガン
ドを使用するアフィニティークロマトグラフィー、またはこれらの技術の組み合わせを使
用して、さらに精製してもよい。抗体は任意の適切な形態で貯蔵してもよく、凍結調製（
40
すなわち−２０℃または−７０℃）として、凍結乾燥形態で、または通常の冷蔵条件（例
えば４℃）で貯蔵してもよい。液体の形態で貯蔵された場合、適切な緩衝液、例えばトリ
ス緩衝食塩水（ＴＢＳ）またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を利用することが好ましい
。抗体およびそれらの誘導体は、インビトロまたはインビボで使用するため、本明細書に
記述した組成物へ組み入れられてもよい。当業者に利用可能な抗体を産生および使用する
他の方法も、使用に適切でありえる。
【００６６】
組成物
開示されたポリペプチドおよびこれらのポリペプチドをコードする核酸は、例えばワク
チン組成物等の免疫原性の組成物（免疫学的な組成物とも呼ばれる）の構成成分としてと
50
(31)
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りわけ有益である。免疫原性の組成物は、対象（例えば哺乳動物）対して投与されると、
組成物内に含まれる抗原（または免疫原）に対する免疫応答を誘発、または増強する。こ
の応答には、（例えばＢ細胞の刺激作用による）抗体の産生、またはＴ細胞ベースの応答
（例えば細胞溶解応答）が含まれてもよい。これらの応答は防御作用、または中和作用で
あってもなくてもよい。防御的または中和的な免疫応答は、抗原に対応する感染性の生物
体（つまり、抗原が由来する）に有害であり、宿主に有益である（例えば感染症の減少ま
たは予防によって）。本明細書で使用される場合、防御抗体または中和抗体は、対応する
野生型ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）抗原またはそのフ
ラグメントに対して反応してもよく、動物でテストされた場合、ポリペプチドまたはその
フラグメントがそこから由来し、対応するポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎ
10
ｇｉｖａｌｉｓ）抗原による致死性を減少または阻害された。対象に投与されると、防御
的な、または中和的な免疫応答を引き起こす免疫原性の組成物はワクチンとみなしてもよ
い。ワクチン組成物は予防および／または治療を目的として機能してもよい。本発明のポ
ルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチド（抗原）を１
つまたは複数を含む免疫原性の組成物（例えばワクチン）は、歯周炎および歯肉炎等の歯
周疾患を治療かつ／または予防するために使用されてもよい。免疫応答はその病気に対す
る完全な防御および／または治療を提供する必要はない。
【００６７】
本発明の免疫原性の組成物の好ましい実施形態は、下記のタンパク質の１つまたは複数
を含む組成物を含んでいる：ＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５
20
、ＰＧ２１７２、ＰＧ０６１３、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６およびＰＧ
０６１６。さらに好ましい実施形態は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５
、１７、１９、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０に対
して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む免疫
原性の組成物である。
【００６８】
本発明の組成物のある実施形態は実施例６において記述される。本発明の好ましい予防
的組成物は、動物に投与された場合、Ｔｈ２−抗体偏向反応を誘発し、このような反応は
歯槽骨退縮予防マウスモデルでの予防に関連している（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ 30
Ｓｅｐ．１５；１８１（６）：４１５０−８）。
【００６９】
本発明の組成物（例えばワクチン組成物）はアジュバントがある、または無い状態で投
与されてもよい。アジュバントは一般に抗原の免疫原性を強化できる物質である。アジュ
バントは獲得免疫および先天免疫の両方で働いてもよく、様々な方法で機能し得るが、そ
れらすべてが理解されているとは限らない。
【００７０】
アジュバントも、免疫応答を刺激または強化するために、本明細書に記述された組成物
および方法に含まれていてもよい。適切なクラスのアジュバントの例には、ゲル型［例え
ば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム（「アルミニウムアジュバント」）、リン酸
40
カルシウム、微生物起源（ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）］、細菌外毒素［例えばコレラ
トキシン（ＣＴ）、天然のコレラトキシンサブユニットＢ（ＣＴＢ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）の不安定毒素（ＬＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＢＣＧ
配列、破傷風トキソイド、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｅｘｓｅｒｉ）の
モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）］、粒子性アジュバント（例えば、生分解性、高分子
化合物マイクロスフェア）免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、油−エマルジョンおよび界面
活性剤に基づいたアジュバント［フロインド不完全アジュバント（ＦＩＡ）、微流動化エ
マルジョン（例えばＭＦ５９，ＳＡＦ）、サポニン（例えばＱＳ−２１）］、合成ムラミ
50
(32)
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ルペプチド誘導体（ｍｕｒａｂｕｔｉｄｅ、ｔｈｒｅｏｎｙ−ＭＤＰ）、非イオン性ブロ
ック共重合体（例えばＬ１２１）、ポリホスファゼン（ＰＣＣＰ）、合成ポリヌクレオチ
ド（ポリＡ：Ｕ、ポリＩ：Ｃ）、サリドマイド誘導体（ＣＣ−４４０７／ＡＣＴＩＭＩＤ
）、ＲＨ３リガンド、またはポリ乳酸グリコリド（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアが含まれ
るがこれらに限定されない。これら記述した毒素のいずれかのフラグメント、ホモログ、
誘導体、および融合物がアジュバントとしての活性を保有すれば、これらも適切である。
アジュバントの適切な突然変異体または変異体は、例えば国際公開第９５／１７２１１号
パンフレット（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ ＣＴ突然変異体）、国際公開第９６／６６２７号パ
ンフレット（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ ＬＴ突然変異体）および国際公開第９５／３４３
２３号パンフレット（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ ＰＴ突然変異
10
体）に記述されている。加えて、ＬＴ突然変異体、例えば、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓ， Ａ
ｌａ−６９−Ｇｌｙ，Ｇｌｕ−１１０−ＡｓｐおよびＧｌｕ−１１２−Ａｓｐ突然変異体
も含まれる。
【００７１】
アルミニウム塩のアジュバント（または化合物）は、本発明を実施するのに有用なアジ
ュバントである。有用なアルミニウム塩のアジュバントの例としては、水酸化アルミニウ
ム（例えば、結晶性オキシ水酸化アルミニウムＡｌＯ（ＯＨ）、および水酸化アルミニウ
ムＡｌ（ＯＨ）３）がある。特定の実施形態において、アルミニウムアジュバントはオキ
シ水酸化アルミニウム（例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標））である。アルミニウ
ム塩のアジュバントを有する組成物は極端な温度、つまり、凍結（０℃）温度未満、また
20
は超高温（例えば≧７０℃）にさらすと、安定性、および吸着抗原およびアジュバントの
両免疫原性に悪影響が出るため、このような温度にさらすべきではないことは、当技術分
野においてよく知られている。
【００７２】
アルミニウムアジュバント等の金属塩アジュバントは、安全な賦形剤にアジュバント活
性を与えているため当技術分野において良く知られている。これらのアジュバントの作用
機構には、抗原が投与後最長３週間注入部位に留まるように抗原貯留物を形成することと
、抗原提示細胞により容易に取り込まれる抗原／金属塩複合体が形成されることが含まれ
ると考えられている。アルミニウムに加えて、他の金属塩、例えば亜鉛、カルシウム、セ
リウム、クロム、鉄分およびベリリウムの塩も抗原を吸着するために使用されている。ア
30
ルミニウムの水酸化物とリン酸塩は最も一般的である。アルミニウム塩、抗原、および追
加の免疫賦活剤を含んでいる製剤または組成物は、当技術分野において知られている。免
疫賦活剤の一例は３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）である
。別の例は製品Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号２８７１８０−６３−６）である。ある実施形態
において、組成物は水酸化アルミニウムとＥ６０２０を含む。製品Ｅ６０２０は米国特許
出願公開第２００７／００８２８７５明細書において記述されている。（その全体が参照
により本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
アジュバントを加えた免疫化の一実施形態において、例えば、ポリペプチドおよび／ま
たはそのフラグメントは、多糖類複合物を形成するために細菌性多糖類に共有結合させて
40
もよい。そのような複合物は、ポリペプチドおよび／またはそのフラグメントと複合体を
形成する細菌性多糖類に対するＴ細胞依存型の免疫原性反応を誘発するための免疫原とし
て有用であり得る。
【００７４】
１つまたは複数のサイトカインも、ポリペプチドとして、または、核酸によりコードさ
れたものとして、本発明の組成物での使用に適切な同時刺激要素であり得る。（Ｐａｒｍ
ｉａｎｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２０００ Ｓｅｐ １５；７４（１）：４１−
３；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２０９−２１９）。適
切なサイトカインには例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら
、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：３２１−３２７（１９９８））、ＩＬ−４、ＩＬ−７、Ｉ
50
(33)
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Ｌ−１２（Ｐａｒｄｏｌｌによりレビューされた、１９９２；Ｈａｒｒｉｅｓら、Ｊ．Ｇ
ｅｎｅ Ｍｅｄ．２０００ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；２（４）：２４３−９；ＲａｏらＪ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５６：３３５７−３３６５（１９９６））、ＩＬ−１５（ＸｉｎらＶａｃ
ｃｉｎｅ，１７：８５８−８６６，１９９９）、ＩＬ−１６（Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋら、
Ｊ．Ｌｅｕｋ Ｂｉｏｌ．６７（６）：７５７−６６、２０００）、ＩＬ−１８（Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００１．１２７（１２）：７１８−７２
６）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｄｉｓｉｓら、Ｂｌｏｏｄ，８８：２０２−２１０（１９９６））
、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、およびインターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）がある
。当技術分野において知られているように、他のサイトカインも使用に適切であり得る。
【００７５】
10
ある実施形態において、組成物は、少なくともスクアレンを含む水中油滴型エマルショ
ン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン界面活性剤、疎水性
非イオン性界面活性剤を含むアジュバントが存在する状態で投与され、前記水中油滴型エ
マルションは転相温度法により得ることができる。油滴の容量による集団の９０％は、２
００ｎｍ未満、および場合により１５０ｎｍ未満の大きさを有する。そのようなアジュバ
ントは国際公開第２００７００６９３９号パンプレット（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｓ
ｉｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ Ｔｈｅｒｍｏｉｎｖｅｒｓａｂｌｅ Ｅｍｕｌ
ｓｉｏｎ）において記述されており、その全体が本明細書に組み込まれる。組成物はさら
に、または記述されたスクアレン水中油滴型エマルションに加えて、またはその代わりに
、製品Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号２８７１８０−６３−６）を含んでいてもよい。
20
【００７６】
ある実施形態において、組成物はＴＬＲアゴニスト（例えばＴＬＲ４アゴニスト）単独
でまたはアジュバントと組み合わせて含む。例えば、アジュバントはＴＬＲ４アゴニスト
（例えばＴＬＡ４）、スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル基に
属する非イオン性の親水性界面活性剤、および非イオン性の疎水性の界面活性剤を含んで
もよく、熱可逆的であってもよい。このようなアジュバントの例は、国際公開第２００７
０８０３０８号パンフレットに記述されており、この全体が参照により本明細書に組まれ
る。一実施形態において、組成物は、ＣｐＧおよびアルミニウム塩アジュバント（例えば
水酸化アルミニウム）を組み合わせてアジュバント化される。
【００７７】
30
医薬製剤
本発明の組成物は好ましくは液体の形態であるが、凍結乾燥されてもよく（標準的な方
法で）、または、乾燥発泡体（国際公開第２００９０１２６０１号パンフレット、Ａｎｔ
ｉｇｅｎ−Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓにお
いて記述）であってもよい。本発明の一実施形態による組成物は液体形態である。免疫化
用量は０．５∼１．０ｍｌ（０．５∼１．０ｃｍ３）の容積で調剤されてもよい。液剤は
、投与に適切な任意の形態、例えば水溶液または懸濁剤であってもよい。
【００７８】
本発明の組成物の医薬製剤はさらに任意で「薬剤的に許容できる担体」を含んでいても
よい。用語「薬剤的に許容できる担体」は、生物学的ではない、またはそうでなければ望
40
ましくない物質を指す（すなわち、物質は、いかなる望まれない生物学的作用も引き起こ
さず、この物質が含まれる医薬品組成物の他の構成成分のいずれとも有害な方法で相互作
用せずに、対象に投与され得る）。当業者によく知られているように、担体は本来、活性
成分（例えば免疫原性のポリペプチド）のあらゆる分解を最小限し、かつ対象におけるあ
らゆる副作用を最小化するために選択されるだろう。
【００７９】
適切な担体およびその製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｄａｖｉ
ｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，編、Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（
２００５）に記述されている。典型的には、薬剤的に許容可能な塩の適正量は等張製剤と
50
(34)
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するために製剤中で使用される。薬剤的に許容可能な担体の例には、滅菌水、食塩水、Ｒ
ｉｎｇｅｒ溶液等の緩衝液およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されな
い。溶液のｐＨは、約５∼約８、または約７∼約７．５が一般的である。他の担体には、
ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリックス等
の徐放性製剤がある。マトリックスは、造形品、例えばフィルム、リポソーム、微粒子の
形態であってもよい。ある担体が、例えば投与される組成物の投与経路および濃度に依存
することが好ましいことは、当業者には明らかであろう。担体は、ヒトまたは他の対象に
対する、ポリペプチドおよび／またはそのフラグメントの投与に適切なものである。
【００８０】
本発明の組成物の医薬製剤は、さらに任意で、当技術分野においてよく知られている１
10
つまたは複数の賦形剤（例えば希釈剤、増粘剤、緩衝液、保存剤、表面活性剤、界面活性
剤および／または免疫賦活剤）を含んでいてもよい。当技術分野においてよく知られてい
るように、適切な賦形剤は、組成物中にある抗原、およびあらゆるアジュバントと適合す
るであろう。希釈剤には例えば結合剤、崩壊剤、またはデンプン、セルロース誘導体、フ
ェノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセリン等の分散剤
を含む。界面活性剤の例には、Ｔｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）が含ま
れる。医薬品組成物はさらに、抗菌剤、消炎鎮痛剤および麻酔剤等の１つまたは複数の活
性成分を含んでもよい。本発明の組成物に適切な賦形剤は当技術分野において知られてい
る。
【００８１】
20
組成物は例えばこれらに限定しないが、歯磨き粉、磨歯剤、液体の歯磨剤、歯肉クリー
ム、ゲル、カプセル、ロゼンジおよびチューインガム等の経口使用用に調剤されてもよい
。
【００８２】
組成物は、組成物および使用説明書を含むキットの形態であってもよい。一例において
、組成物は、組成物およびアジュバント、または従来のまたは他のデバイスを使用して、
哺乳動物に対して投与するために組成物の再構成を促進する１つまたは複数の薬剤的に許
容できる希釈剤を含む再構成溶液を含むキットであってよい。このようなキットには、任
意選択的に液体形態の組成物を投与するためのデバイス（例えば皮下注射器、マイクロニ
ードルアレイ）および／または使用説明書を含んでいてもよい。
30
【００８３】
使用方法
本発明の予防および治療方法は、例えば治療それ自体行う際に、後の感染症を予防する
際に、または後の受動免疫で使用される抗体の産生の際に、開示された免疫原性のポリペ
プチドの１つまたは複数を有するワクチンを投与することを含む。
【００８４】
本発明の免疫原性の組成物は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ）に関連した疾病、障害、症状または徴候を予防または治療するための方法におい
て使用される。疾病、障害および症状という用語は区別なく本明細書で使用されるだろう
。特に、予防および治療方法は、対象に対する医薬品組成物の治療上有効量の投与を含む
40
。特定の実施形態において、症候性ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ）感染症に関連した歯周疾患を予防または治療する方法が提供される。
【００８５】
本明細書で使用される場合、疾病または障害の予防は、ポルフィロモナス・ジンジバリ
ス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が関連する特定の疾病または障害の発症から対象を保護
するために、対象に本発明の医薬品組成物の治療上有効量を投与することを意味する。
【００８６】
疾病または障害の治療は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ）により引き起こされた疾病で苦しむか、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ）にさらされた対象に対して、本発明の医薬品組成物の治療上有効量の
50
(35)
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投与することを意図し、そこでの目的は、その疾病の症状または徴候を治療する、治癒す
る、緩和する、軽減する、変更する、改善するか、回復させる、好転させる、またはそれ
に作用することである。
【００８７】
治療上有効量は、所与の症状および投与計画に対して治療効果を与える量を指す。一般
の熟練した医療従事者は、対象特性（歳、体重、性別、症状、合併症、他の疾病等）に基
づいて治療上有効量を決定できる。治療上有効量は、組成物の投与経路によりさらに影響
されるだろう。
【００８８】
本発明の組成物は適切な経路、例えば経皮運搬（例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮
10
下）、経皮性、粘膜性または外用により、当業者により適切であると決定された量および
投与計画で投与できる。
【００８９】
本方法は対象に本発明の組成物の有効量を投与することを含む。態様のいくつかにおい
て、この方法にはさらに、二次免疫応答を増強するか刺激するために、対象に組成物を追
加で投与することが（例えば１つまたは複数の追加免疫投与）含まれてもよい。追加免疫
は、最初の投与後に一度に投与でき、例えば、組成物の最初の投与１∼８週後に、好まし
くは２∼４週後に投与する。続く追加免疫は年間で、１、２、３または４回であってもよ
い。理論による制限を目的としないが、本発明の態様のいくつかにおいて、対象は、屋外
で、微生物（ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ））にさらさ
20
れることで感染するが、この微生物は、組成物中にあるポリペプチドを発現し、対象に投
与された組成物のポリペプチド上にある抗原決定基と同一の、または構造的に関連した抗
原決定基を有するため、毎年の追加免疫は必要ではないことが予想される。
【００９０】
一態様において、本発明は、例えば、対象において抗体の産生を誘導することによって
、または組み換え技術によって抗体を産生する方法を対象としている。産生された抗体に
は、組成物の中にある少なくとも１つのポリペプチドの少なくとも１つの抗原決定基に特
異的に結合する抗体が含まれる。本発明のこの態様において、「有効量」は、対象での抗
体の産生をもたらすのに効果的な量である。対象が本発明の組成物中にあるポリペプチド
に特異的に結合する抗体を産生したかどうか決定する方法は、当技術分野においてよく知
30
られており、および本明細書で記述するように特定ができる。本発明はさらに、特異的に
本発明のポリペプチド結合する抗体、およびそのような抗体を含む組成物を含む。
【００９１】
方法は微生物（ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ））によ
り発現されたポリペプチドを特異的に結合する抗体を産生するために使用されてもよく、
組成物のポリペプチドはここから単離される。本明細書で使用される場合、ポリペプチド
と「特異的に結合できる」抗体は、抗体の合成を誘導する抗原の抗原決定基と相互作用す
る、または構造的に関連する抗原決定基と相互作用する抗体である。本発明の組成物中に
あるポリペプチドのうちの少なくともいくつかは、典型的には異なる株種のポリペプチド
中で保存される抗原決定基を含む。したがって、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．
40
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の１つの株から誘導した組成物を使用して産生された抗体は、他
のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株により発現されたポ
リペプチドに結合し、かつこのグラム陰性菌生物体に対する幅広い保護システムを与える
ことが予想される。
【００９２】
対象の歯周疾患のリスクを減少させる方法もまた開示され、その方法は、１つまたは複
数の開示された免疫原性のポリペプチドを含む免疫原性の組成物を対象に投与することを
含む。歯周疾患（症候性の感染）には例えば歯周炎が含まれる。あらゆる症候性のポルフ
ィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症（またはあらゆるそのよ
うな症候性のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症の再
50
(36)
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発）のリスクは、本明細書に記述された方法により減少させ得る。
【００９３】
診断キット
さらに、対象の生物学的試料中の抗体または核酸の検出により、対象におけるポルフィ
ロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染症の存在を検出するためのキ
ットが本明細書で提供される。一実施形態において、１つまたは複数の抗原（例えばポリ
ペプチドおよび／またはそのフラグメント）は、生物学的試料中の抗ポルフィロモナス・
ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）抗体の検出または診断のためのキットの一部
分を形成してもよい。抗原は、中身が外部環境から保護される小ビン等の適切な容器で提
供されてもよい。したがって、試料中の抗ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎ
10
ｇｉｖａｌｉｓ）抗体を検出するためのキットは、１つまたは複数のポルフィロモナス・
ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチドおよび／またはそのフラグメン
ト、および試料中の１つまたは複数の抗体の抗原への結合を特定するための１つまたは複
数の検出試薬を含んでもよい。キットは、（ｉ）１つまたは複数の単離し精製したポリペ
プチドおよび／またはそのフラグメント；および（ｉｉ）抗原抗体複合体の形成を検出す
るためのシステムを含むのが好ましく、任意選択的に使用説明書をつける。抗原は溶液内
で遊離していてもよく、または磁気ビーズ、チューブ、マイクロプレートウェルまたはチ
ップ等の固体担体上に固定してもよい。ある実施形態において、単離され精製されたポリ
ペプチド、および／もしくはそのフラグメント、またはそこに吸着された融合タンパク質
もしくはタンパク質集合体を含む固体マトリクスが提供される。実施形態のいくつかにお
20
いては、キットは、検出試薬として抗体結合分子をさらに含んでもよい。抗体結合分子は
捕獲または検出試薬であってもよく、溶液中で遊離していても、磁気ビーズ、チューブ、
マイクロプレートウェル、またはチップ等の固体担体上で固定されていてもよい。抗体結
合分子またはポリペプチドは、検出可能な標識、例えば蛍光性か発色性の標識、ビオチン
等の結合成分で標識されてもよい。適切な標識は上記でより詳細に記述されている。キッ
トはさらに検出試薬および／または免疫沈殿法用試薬を含んでも良く、検出試薬は例えば
、発色性、蛍光性または化学発光性の基質などの基質等であり、これは標識、または標識
に結合する酵素複合体等の分子と反応し、信号を発生する。検出試薬にはさらに緩衝液、
洗浄溶液および他の有益な試薬を含んでもよい。キットは、さらに対象から得られた試料
の処理および／または貯蔵するための装置、および対象から試料を得るための器具（例え
30
ば針葉、ランセット、および捕集チューブまたは容器）の１つまたは両方を含んでもよい
。キットは、さらに、本明細書で記述するように、抗原の使用説明書（例えば試験試料の
抗ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）抗体を検出するための
方法における）を含んでいてもよい。分析を別のタイプの分析（例えばＰＣＲ）と組み合
わせる場合、このような分析に必要とされる試薬（すなわちプライマー、緩衝液など）と
共に、任意選択的にそれを使用するための説明書も含めてよい。
【００９４】
本開示において引用された参考文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組込ま
れる。ある実施形態は、下記の実施例において詳述される。これらの実施形態は単に例と
して示され、いかなる方法によっても特許請求の範囲を限定することを目的としない。
40
【実施例】
【００９５】
上記の開示は本発明を一般的に記述している。下記の特定の実施例を参照することによ
り本発明をより完全に理解できる。これらの実施例は、単に説明の目的のために記述され
、本発明の範囲を限定することを目的としない。状況により判断して、または便宜上、形
態の変化および均等物の代用を考慮する。特定の用語を本明細書で使用したが、それらの
用語は説明のための使用を目的とし、限定を目的としない。使用される分子遺伝学、タン
パク質生化学および免疫学の方法は、本開示および実施例に明確に記載されていないが、
科学的な文献において広く報告されており、当業者の能力の範囲内にある。
【００９６】
50
(37)
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実施例１：ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）のゲノムマイ
ニング
この実施例は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の免疫
原性のポリペプチドを同定するために実施したゲノムマイニングについて記述する。ポル
フィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ８３のゲノムにはおよそ
２２００のオープンリーディングフレームがある。コンピューターの支援を利用して、ポ
ルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３ゲノム（ｈｔｔｐ：
／／ｃｍｒ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＣＭＲ／ＧｅｎｏｍｅＰａｇｅ．ｃｇ
ｉ？ｏｒｇ＝ｇｐｇ）を含むタンパク質を、下記のパラメータを使用して評価し、さらな
る評価のため（クローニング、発現および精製による）、これらのタンパク質に優先順位
10
をつけた：
１．Ｃ末端領域（ＣＴＤ）を有する候補についてさらに評価するため優先順位をつけた。
ＣＴＤは、その本来の成熟化、正しい分泌および細胞表面に対する付着に必要とされるこ
とが、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質分解酵
素、ＲｇｐＢにおいて示された（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
，２００７、１８９，８３３−８４３）。 ２．ＰＳＯＲＴｂによる局在、優先度が高い順に：（外膜または細胞外）＞（未知）＞（
（周辺質かまたは細胞質）。Ｐｓｏｒｔｂ（バージョン２．０）はウェブベースの細菌タ
ンパク質細胞内局在予測ツールである［ｗｗｗ．ｐｓｏｒｔ．ｏｒｇで利用可能；Ｊ．Ｌ
．Ｇａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．Ｌａｉｒｄ，Ｆ．Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｒｅｙ，Ｃ．Ｊ．Ｗａｌｓｈ，
20
Ｍ．Ｅｓｔｅｒ，およびＦ．Ｓ．Ｌ．Ｂｒｉｎｋｍａｎ（２００５）ＰＳＯＲＴｂ ｖ．
２．０：ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｓｉｇｈ
ｔｓ ｇａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌ
ｙｓｉｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１（５）：６１７−６２３］
３．タンパク質の優先度をさらに上げる、他のパラメータ：
ｉ． シグナル配列の存在；
ｉｉ．優勢株（すなわちポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）
Ｗ５０株、Ｗ８３株およびＡＴＣＣ３３２７７株に存在）； ｉｉｉ．公表されている配列決定されたゲノムを有する株（例えばＷ８３、ＡＴＣＣ３３
30
２７７）間での高度な（７５％）配列保存；
ｉｖ．タンパク質が外膜に局在し、および／または潜在的な病原因子であることを示すデ
ータを開示する公表されている記事；
４．タンパク質の優先度をさらに下げる、他のパラメータ：
ｉ．ヒト配列との検出可能な類似性；
ｉｉ．予測される膜貫通ヘリックス；
ｉｉｉ．分子量が＞１００ｋＤａまたは＜２０ｋＤａ
ｉｖ．予測される細胞内局在
これらの優先パラメータを使用して、およそ１３１のタンパク質候補を評価対象として同
定した。その後、実施例２に詳細に説明したように、各候補をポルフィロモナス・ジンジ
40
バリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ５０株（ＡＴＣＣ５３９７８として委託）からク
ローニングし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内で組換えで発現した。溶
解性として発現されたもの（すなわち約４０のタンパク質）はさらなる評価のために選抜
された。
【００９７】
実施例２：ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質の
組み換えクローニング、発現および精製
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０株（例えばＰＧ ０４９５、 ＰＧ ２１７２
、 ＰＧ １３２６、 ＰＧ １３７４、 ＰＧ ０６５４、 ＰＧ ０６１３、 ＰＧ
１７９８、 ＰＧ ０１８６、 ＰＧ １７９５、 ＰＧ ０６１６）から選抜された
50
(38)
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遺伝子を、組換えでクローニングし、発現させて精製した。 下記表４に記載のプライマーはポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ）Ｗ５０株の適切な遺伝子（全長だがシグナル配列を欠く）を増幅するために設計
した。増幅遺伝子産物を、ｐＥＴ−３０ Ｅｋ／ＬＩＣベクターキットでｐＥＴ−３０ Ｅｋ／ＬＩＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニ
ングした。このベクターを使用して発現された産物は、発現分析を促進するベクターにコ
ードされるＳタグ、およびベクターにコードされるＮ末端タグ（ｍｈｈｈｈｈｈｓｓｇｌ
ｖｐｒｇｓｇｍｋｅｔａａａｋｆｅｒｑｈｍｄｓｐｄｌｇｔｄｄｄｄｋ配列番号５１）を
有する。ベクターのクローニング要件に基づくと、次のアミノ酸はＭｅｔ（ｍ）またはＩ
ｌｅ（ｉ）のいずれかでなくてはならない。したがって、それらの残基のいずれかを、そ
10
れがクローニングされる所望のフラグメントの第１のネイティブアミノ酸でない場合に付
加した。エンテロキナーゼでの消化により、標的タンパク質のベクターにコードされた全
配列が除去できるが、初期のスクリーニングのために、タグは除去しなかった。
【００９８】
各遺伝子のシグナルペプチド配列をＳｉｇｎａｌＩＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ
．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を使用して予測し、または、先
に記述し同定したように、典型的なポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ）Ｉ型シグナル切断部位の一致に基づき割り当てた。（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．２００６ Ｓｅｐｔ．：１８８（１７）：６３７６−６３８６）。結果として生じるク
ローニングされた核酸配列がシグナルペプチド配列を欠くように、遺伝子をクローニング
20
した。当技術分野において知られているように、シグナルペプチド配列は、いくつかの方
法、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｓｉｇｎ
ａｌＰ／で利用可能な予測ソフトウエア（ＴａｒｇｅｔＰ、ＳｉｇｎａｌＰおよび関連ツ
ールを使用して細胞内タンパク質の位置決めを行う、Ｏ．Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ，Ｓ．
Ｂｒｕｎａｋ，Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｈ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ２，９５３−９７１（２００７））を使用して予測できる。
【００９９】
結果として生じたベクターはそれぞれ、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞へサブクロ
ーニングされ、続いて、生じたプラスミドを、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商
標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、そ
30
れぞれタンパク質産生用大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換させた
。ＩＰＴＧを導入し、組み換えポリペプチドを発現させた。
【０１００】
発現後に、発現したポリペプチドの溶解性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはＦＲＥ
ＴＷｏｒｋｓ（商標）Ｓ−Ｔａｇ（商標）ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、製造者
の推奨による）を使用して評価した。この分析の原理は、あらゆる溶解性の組換えタンパ
ク質のＳタグ融合ペプチドにより、Ｓタンパク質の外因的に付加され精製された変異体バ
ージョンにトランス相補性を提供でき、ＲＮＡ分解酵素活性を回復する、ということであ
る。再構成されたＲＮＡ分解酵素により切断された場合、基質ＦＲＥＴ ＡｒＵＡＡが蛍
光を発し、蛍光読み出し情報が与えられる。
【０１０１】
溶解性発現ポリペプチドを、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して、
天然条件下、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースを使用したアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をクーマシーブルー染色を用いて、各組換
えでクローニングされたポリペプチドに関して実施した。また、各ケースの単一バンドを
、近似の分子量とともに、下の表３に示した。
40
(39)
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【表３】
10
(40)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
【表４】
10
20
30
【０１０２】
40
当業者は、シグナルペプチド配列とともに核酸配列をクローニングできることを認識す
るだろう。同様に、ポリペプチドはそれぞれ、ベクターにコードされたＳタグおよびＨｉ
ｓタグを使用せず、異なるプラスミドクローニングベクターの使用により組換えで発現で
きることを当業者は認識するだろう。しかしながら、ＰＧ０６１６に関しては、ポリペプ
チドは、シグナルペプチド配列なしで、ｐＥＴ−３０ Ｅｋ／ＬＩＣへ遺伝子をクローニ
ングすることにより溶解性発現が可能であるが、シグナルペプチドとともに発現した場合
、ポリペプチドは溶解性ではなかったことは、注意するべきである。
【０１０３】
ｒＰＧ０４９５
遺伝子は、Ｗ５０株から上述のようにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを単離し
50
(41)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
、配列決定した（配列番号４１として記載した配列）。発現されたタンパク質の配列は、
配列番号２１として記載した。クローン化した遺伝子の核酸配列（配列番号２２として記
載）は、以下の変化以外はＷ８３の配列と同一である：
ｉ）塩基対１３０はクローン化した遺伝子で「Ｔ」であるが、これは公表されたＷ８３配
列の「Ａ」である。これによりこのコドンにおいてＭＥＴがＬＥＵに置換される。
【０１０４】
ｉｉ）塩基対８６１はクローン化した遺伝子で「Ｇ」であるが、これは公表されたＷ８３
配列の「Ａ」である。ＧＣＧおよびＧＣＡの両方がアラニンをコードするためこれはサイ
レント変異となる。
【０１０５】
10
ｉｉｉ）「Ａ」が塩基対１４４０の後に欠失しているため、以下の事象を有するフレーム
シフトが起こる：Ｃ末端の７つのアミノ酸はＴＥＲＶＩＶＱ＊であるべきであるが、クロ
ーン化した遺伝子によりコードされたタンパク質においてはＱＫＥ＊で置換される。この
フレームシフトはクローニングによる人為産物である。下記は、クローニングされ発現さ
れたｒＰＧ０４９５タンパク質のアミノ酸配列である（ベクター由来の配列に下線を引く
）。
【０１０６】
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＬＱＴＭＡＰＮＹＦＨＡＤＰＱＱＦＫＨＲＩＶＫＥＫＳＦＳＳＹＳＮＹＥＹＧＶＤ
ＮＲＬＱＲＩＹＳＶＤＥＳＳＧＥＩＥＨＥＲＲＦＦＦＮＥＧＧＹＭＩＲＥＥＥＹＤＧＴＶ
20
ＱＩＰＶＲＫＷＥＦＶＲＤＤＫＧＹＩＴＨＦＳＲＹＳＰＫＤＧＳＱＥＬＩＥＤＩＲＩＤＦ
ＳＹＤＡＤＭＫＬＩＫＡＤＩＤＦＦＤＩＭＡＮＶＷＧＤＬＲＴＴＫＬＶＹＮＥＮＧＬＬＫ
ＥＭＩＱＴＤＰＧＳＧＱＥＦＮＲＥＥＬＴＹＮＮＬＮＫＩＶＡＩＲＦＩＰＧＰＡＳＴＧＬ
ＮＥＦＥＬＩＹＥＹＤＳＥＧＭＤＩＶＫＡＧＲＤＤＦＷＹＹＹＥＹＤＫＥＭＬＡＳＥＴＦ
ＦＰＫＰＳＩＡＤＬＶＹＦＧＬＫＤＹＶＤＦＳＧＬＰＦＫＮＳＹＴＨＶＶＶＫＥＳＴＮＥ
ＶＥＡＩＹＥＰＩＳＶＹＳＶＶＶＩＱＰＥＮＧＥＩＫＬＴＡＤＧＱＰＬＮＳＧＳＴＬＶＡ
ＧＲＲＩＫＩＨＰＩＰＡＥＧＹＥＶＤＫＶＭＶＮＧＥＮＩＥＡＰＹＥＦＬＬＥＫＤＴＥＶ
ＴＡＬＭＫＫＳＮＡＶＧＥＶＤＴＫＧＦＨＶＹＰＩＰＴＳＫＤＬＴＩＥＩＰＡＥＭＶＧＫ
ＶＡＳＬＩＤＭＮＧＱＩＶＹＲＶＴＬＮＮＩＦＱＱＩＤＩＳＨＬＫＧＶＦＬＬＱＩＧＤＩ
ＱＫＥ（配列番号２１）
30
ｒＰＧ２１７２
遺伝子は、Ｗ５０株から上述のようにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを単離し
、配列決定した（配列番号４７として記載した配列）。発現されたタンパク質の配列は、
配列番号２９として記載した。Ｗ５０クローン化遺伝子の核酸配列（配列番号３０に記載
）は、公表されたゲノムの対応するＷ８３の配列と同一である：下記は、クローニングさ
れ発現されたｒＰＧ２１７２タンパク質のアミノ酸配列である（ベクター由来の配列に下
線を引く）。
【０１０７】
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＭＱＶＶＩＫＶＧＤＡＩＬＥＮＮＡＴＶＤＩＴＡＦＴＴＥＤＧＴＥＥＭＫＦＥＧＭ
40
ＶＩＮＱＳＡＴＰＩＮＶＩＧＫＩＴＫＱＥＭＩＧＤＧＨＦＡＬＣＦＧＱＣＭＧＰＮＶＳＶ
ＳＰＩＶＥＡＬＤＧＥＧＥＹＶＳＬＨＹＫＦＰＶＳＮＥＧＨＴＧＡＦＴＦＳＣＦＰＥＳＧ
ＡＰＧＴＥＬＡＴＶＮＩＮＦＫＹＫＧＧＧＴＧＬＴＮＩＧＬＧＲＩＡＬＩＱＳＧＮＴＣＴ
ＬＱＹＮＳＮＧＫＲＬＡＬＥＶＹＮＬＬＧＶＫＶＦＴＳＱＬＰＡＧＳＧＳＹＴＬＰＶＲＬ
ＱＲＧＶＨＩＦＲＩＴＥＧＧＫＰＡＦＶＱＫＹＬＩＫ（配列番号２９）
ｒＰＧ１３２６
遺伝子は、Ｗ５０株から上述のようにクローニングされた。発現されたタンパク質の配
列は、配列番号３９として記載した。Ｗ５０クローン化遺伝子の配列（配列番号４０とし
て記載）は、公表されたゲノムの対応するＷ８３の配列と同一である：下記は、クローニ
ングされ発現されたｒＰＧ１３２６タンパク質のアミノ酸配列である（ベクター由来の配
50
(42)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
列に下線を引く）。
【０１０８】
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＭＬＣＥＮＴＬＡＱＱＫＴＥＥＦＡＰＶＳＤＬＲＡＥＡＹＧＳＴＶＦＬＨＷＴＰＰ
ＹＤＮＰＭＩＰＬＳＥＳＦＥＳＧＩＰＡＩＷＫＴＩＤＡＤＧＤＧＹＮＷＭＨＬＴＮＦＴＧ
ＱＳＧＬＣＶＳＳＡＳＹＩＧＧＶＧＡＬＴＰＤＮＹＬＩＴＰＥＬＫＬＰＴＤＡＬＶＥＩＩ
ＹＷＶＣＴＱＤＬＴＡＰＳＥＨＹＡＶＹＳＳＳＴＧＮＮＡＡＤＦＶＮＬＬＹＥＥＴＬＴＡ
ＫＲＩＱＳＰＥＬＩＲＧＮＲＴＱＧＶＷＹＱＲＫＶＶＬＰＮＤＴＫＹＶＡＦＲＨＦＮＳＴ
ＤＮＦＷＬＮＬＤＥＶＳＩＬＹＴＰＬＰＲＲＡＰＣＰＨＰＧＧＹＴＹＳＶＦＲＤＧＱＫＩ
ＡＳＧＬＳＡＬＡＹＩＤＴＤＶＰＹＧＴＱＤＹＣＶＱＶＮＹＬＱＧＤＳＹＫＶＣＫＮＩＶ
10
ＶＡＮＳＡＮＩＹＧＡＤＫＰＦＡＬＴＶＶＧＫＴＩＶＡＳＡＦＫＧＥＩＴＬＹＤＩＲＧＲ
ＬＩＡＳＧＣＤＴＬＲＹＫＡＥＮＧＦＹＬＩＫＩＱＶＮＧＴＶＹＴＥＫＩＱＩＱ（配列番
号３９）
ｒＰＧ０６５４
遺伝子は、Ｗ５０株からクローニングされた。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定し
た（配列番号４３として記載した配列）。発現したタンパク質の配列を配列番号２５とし
て記載した。Ｗ５０クローン化遺伝子の配列（配列番号２６として記載）は、公表された
ゲノムの対応するＷ８３の配列と同一である：下記は、クローニングされ発現されたｒＰ
Ｇ０６５４タンパク質のアミノ酸配列である（ベクター由来の配列に下線を引く）。
【０１０９】
20
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＭＱＳＰＲＩＰＱＶＤＶＨＴＲＩＡＲＮＡＲＹＲＬＤＫＩＳＶＰＤＳＲＱＩＦＤＹ
ＦＹＫＥＥＴＩＰＴＫＩＱＴＴＴＧＧＡＩＴＳＩＤＳＬＦＹＥＤＤＲＬＶＱＶＲＹＦＤＮ
ＮＬＥＬＫＱＡＥＫＹＶＹＤＧＳＫＬＶＬＲＥＩＲＫＳＰＴＤＥＴＰＩＫＫＶＳＹＨＹＬ
ＣＧＳＤＭＰＦＥＩＴＴＥＭＳＤＧＹＦＥＳＨＴＬＮＹＬＮＧＫＩＡＲＩＤＩＭＴＱＱＮ
ＰＳＡＥＬＩＥＴＧＲＭＶＹＥＦＤＡＮＮＤＡＶＬＬＲＤＳＶＦＬＰＬＱＮＫＷＶＥＭＦ
ＴＨＲＹＴＹＤＮＫＨＮＣＩＲＷＥＱＤＥＦＧＴＬＴＬＡＮＮＦＥＹＤＴＴＩＰＬＳＳＶ
ＬＦＰＴＨＥＥＦＦＲＰＬＬＰＮＦＭＫＨＭＲＴＫＱＴＹＦＮＮＳＧＥＧＬＳＥＶＣＤＹ
ＮＹＦＹＴＤＭＱＧＮＡＬＴＤＶＡＶＮＥＳＩＫＩＹＰＲＰＡＴＤＦＬＲＩＥＧＳＱＬＬ
ＲＬＳＬＦＤＭＮＧＫＬＩＲＡＴＥＬＴＧＤＬＡＩＩＧＶＡＳＬＰＲＧＴＹＩＡＥＩＴＡ
30
ＡＮＳＫＴＩＲＡＫＶＳＬＲ（配列番号２５）
ｒＰＧ１３７４
遺伝子は、Ｗ５０株からクローニングされた。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定し
た（配列番号４４として記載した配列）。発現したタンパク質の配列を配列番号２７とし
て記載した。クローン化した遺伝子の配列（配列番号２８として記載）は、以下の点以外
はＷ８３の対応する配列と同一である： ｉ）塩基対４８１はクローン化した遺伝子の「Ｔ」であるが、これは公表されたＷ８３配
列の「Ｃ」である。ＣＴＧおよびＴＴＧの両方がロイシンをコードするためこれはサイレ
ント変異となる。（すなわち、タンパク質は１００％同一である）。下記は、クローニン
グされ発現されたｒＰＧ１３７４タンパク質のアミノ酸配列である（ベクター由来の配列
40
に下線を引く）。
【０１１０】
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＭＱＦＶＰＡＰＴＴＧＩＲＭＳＶＴＴＴＫＡＶＧＥＫＩＥＬＬＶＨＳＩＥＫＫＧＩ
ＷＩＤＬＮＧＤＡＴＹＱＱＧＥＥＩＴＶＦＤＥＡＹＨＥＹＴＩＧＴＱＴＬＴＩＹＧＮＴＴ
ＲＬＧＣＲＳＴＧＡＴＡＶＤＶＴＫＮＰＮＬＴＹＬＡＣＰＫＮＮＬＫＳＬＤＬＴＱＮＰＫ
ＬＬＲＶＷＣＤＳＮＥＩＥＳＬＤＬＳＧＮＰＡＬＩＩＬＧＣＤＲＮＫＬＴＥＬＫＴＤＮＮ
ＰＫＬＡＳＬＷＣＳＤＮＮＬＴＥＬＥＬＳＡＮＰＲＬＮＤＬＷＣＦＧＮＲＩＴＫＬＤＬＳ
ＡＮＰＬＬＶＴＬＷＣＳＤＮＥＬＳＴＬＤＬＳＫＮＳＤＶＡＹＬＷＣＳＳＮＫＬＴＳＬＮ
ＬＳＧＶＫＧＬＳＶＬＶＣＨＳＮＱＩＡＧＥＥＭＴＫＶＶＮＡＬＰＴＬＳＰＧＡＧＡＱＳ
50
(43)
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ＫＦＶＶＶＤＬＫＤＴＤＥＫＮＩＣＴＶＫＤＶＥＫＡＫＳＫＮＷＲＶＦＤＦＮＧＤＳＤＮ
ＭＬＰＹＥＧＳＰＴＳＮＬＡＶＤＡＰＴＶＲＩＹＰＮＰＶＧＲＹＡＬＶＥＩＰＥＳＬＬＧ
ＱＥＡＡＬＹＤＭＮＧＶＫＶＹＳＦＡＶＥＳＬＲＱＮＩＤＬＴＨＬＰＤＧＴＹＦＦＲＬＤ
ＮＹＴＴＫＬＩＫＱ（配列番号２７）
ｒＰＧ１７９５
遺伝子は、Ｗ５０株からクローニングされた。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定し
た（配列番号４８として記載した配列）。発現したタンパク質の配列を配列番号３１とし
て記載した。Ｗ５０クローン化遺伝子の配列（配列番号３２として記載）は、公表された
ゲノムの対応するＷ８３の配列と同一である：下記は、クローニングされ発現されたｒＰ
Ｇ１７９５タンパク質のアミノ酸配列である（ベクター由来の配列に下線を引く）。
10
【０１１１】
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＭＱＳＬＳＴＩＫＶＱＮＮＳＶＱＱＰＲＥＥＡＴＩＱＶＣＧＥＬＡＥＱＶＤＣＩＧ
ＴＧＮＳＡＩＩＡＡＡＡＫＦＥＳＤＤＬＥＳＹＶＧＷＥＩＭＳＶＤＦＦＰＧＹＫＡＣＫＹ
ＴＳＡＶＷＡＤＤＭＴＩＬＧＱＳＥＤＳＤＰＥＭＱＴＩＮＮＬＡＬＫＴＳＶＫＩＥＡＧＫ
ＮＹＩＶＧＹＩＡＮＴＡＧＧＨＰＩＧＣＤＱＧＰＡＶＤＧＹＧＤＬＶＳＩＳＥＤＧＧＡＴ
ＦＰＰＦＥＳＬＨＱＡＶＰＴＬＮＹＮＩＹＶＶＶＨＬＫＫＧＥＧＶＥＡＶＬＴＮＤＫＡＮ
ＡＹＶＱＮＧＶＩＹＶＡＧＡＮＧＲＱＶＳＬＦＤＭＮＧＫＶＶＹＴＧＶＳＥＴＩＡＡＰＱ
ＫＧＭＹＩＬＲＶＧＡＫＳＩＫＬＡＩ（配列番号３１）
ｒＰＧ０６１３
20
遺伝子は、Ｗ５０株から上述のようにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを単離し
、配列決定した（配列番号４９として記載した配列）。発現したタンパク質の配列を配列
番号３３として記載した。Ｗ５０クローン化遺伝子の配列（配列番号３４として記載）は
、公表されたゲノムの対応するＷ８３の配列と同一である：下記は、クローニングされ発
現されたｒＰＧ０６１３タンパク質のアミノ酸配列である（ベクター由来の配列に下線を
引く）。
【０１１２】
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＭＱＴＴＴＮＳＳＲＳＹＦＴＧＲＩＥＫＶＳＬＮＬＧＶＰＰＶＳＴＥＶＷＧＭＴＨ
ＤＡＮＧＬＰＦＥＩＰＩＳＦＳＲＦＮＳＱＧＤＩＡＴＴＹＹＩＡＮＳＥＡＴＬＮＥＷＣＤ
30
ＹＡＨＰＧＧＩＶＲＶＥＧＲＦＷＫＭＴＹＮＩＰＴＹＮＡＶＣＴＲＩＴＦＥＮＱＥＩＥＧ
ＴＩＶＬＩＰＫＰＫＶＳＬＰＨＶＳＥＳＶＰＣＩＲＴＥＡＧＲＥＦＩＬＣＥＥＤＤＴＦＶ
ＳＨＤＧＮＥＶＴＩＧＧＫＰＦＬＬＮＴＮＶＫＩＶＧＤＶＳＱＫＹＡＶＧＶＧＥＩＲＦＬ
ＱＩＣＡＱＴＶＳＱＱＫ（配列番号３３）
ｒＰＧ１７９８
遺伝子は、Ｗ５０株から上述のようにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを単離し
、配列決定した（配列番号４６として記載した配列）。発現したタンパク質の配列を配列
番号３５として記載した。クローン化した遺伝子の配列（配列番号３６として記載）は、
以下の変化を除きＷ８３の配列と同一である：
ｉ）エラーをＰＣＲ増幅の間に遺伝子の３’末端に導入した（プライマー内）。最終結果
40
は、発現されたタンパク質が欠損しているということである、その最後の２つの天然のア
ミノ酸および追加の約５６のアミノ酸が付加された（ベクターからコードされた）。プラ
スミドの予測された正しい配列は、配列番号４５として記載する。下記は、クローニング
され発現されたｒＰＧ１７９８タンパク質のアミノ酸配列である（ベクター由来の配列に
下線を引く）。
【０１１３】
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＭＱＴＫＤＮＳＳＹＫＰＦＳＫＥＤＩＡＧＧＶＹＳＬＰＴＱＮＲＡＱＫＤＮＡＥＷ
ＬＬＴＡＴＶＳＴＮＱＳＡＤＴＨＦＩＦＤＥＮＮＲＹＩＡＲＤＩＫＡＮＧＶＲＫＳＴＤＳ
ＩＹＹＤＡＮＧＲＩＳＨＶＤＬＹＩＳＦＳＧＧＥＰＡＬＤＴＲＦＫＹＴＹＤＤＥＧＫＭＴ
50
(44)
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ＶＲＥＶＦＭＬＶＭＤＰＮＴＰＩＳＲＬＥＹＨＹＤＡＱＧＲＬＴＨＷＩＳＦＡＦＧＡＥＳ
ＱＫＮＴＹＨＹＮＥＫＧＬＬＶＳＥＶＬＳＮＡＭＧＴＴＹＳＤＴＧＫＴＥＹＳＹＤＤＡＤ
ＮＭＶＫＡＥＹＦＶＶＱＱＧＫＡＷＱＶＬＫＲＥＥＹＴＹＥＤＮＩＣＩＱＹＬＡＩＮＧＴ
ＤＴＫＶＹＫＲＤＩＥＳＤＫＳＩＳＡＮＶＩＤＩＰＳＭＰＥＱＴＷＰＮＭＹＧＦＮＡＫＲ
ＬＫＥＴＹＳＳＹＥＧＤＶＡＴＰＩＦＤＹＩＹＴＹＫＡＬＴＳＭＡＴＰＳＴＥＡＱＶＡＶ
ＹＬＮＰＳＴＤＲＬＶＩＬＡＮＧＩＴＨＬＳＭＹＤＬＱＧＫＬＩＲＤＣＡＬＳＧＤＫＶＥ
ＭＧＶＧＳＬＴＫＧＴＹＬＬＫＶＮＴＤＱＧＡＦＶＲＫＶＶＦＤＤＲＡＳＰＱＰＷＲＹＲ
ＩＲＩＲＡＰＳＴＳＬＲＰＨＳＳＴＴＴＴＴＴＥＩＲＬＬＴＫＰＥＲＫＬＳＷＬＬＰＰＬ
ＳＮＮ（配列番号３５）
ｒＰＧ０１８６
10
遺伝子は、Ｗ５０株から上述のようにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを単離し
、配列決定した（配列番号５０として記載した配列）。発現したタンパク質の配列を配列
番号３７として記載した。Ｗ８３配列から予測されるように、プラスミドｐＥＡＧ０３７
（クローニングされた遺伝子；配列番号３８として記載）の挿入配列は１００％正確であ
った。下記は、クローニングされ発現されたｒＰＧ０１８６タンパク質のアミノ酸配列で
ある（ベクター由来の配列に下線を引く）。
【０１１４】
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＭＣＥＬＤＲＤＰＥＧＫＤＦＱＱＰＹＴＳＦＶＱＴＫＱＮＲＤＧＬＹＡＬＬＲＮＴ
ＥＮＰＲＭＨＦＹＱＥＬＱＳＤＭＹＣＴＴＩＴＤＧＮＳＬＡＰＦＶＮＷＤＬＧＩＬＮＤＨ
20
ＧＲＡＤＥＤＥＶＳＧＩＡＧＹＹＦＶＹＮＲＬＮＱＱＡＮＡＦＶＮＮＴＥＡＡＬＱＮＱＶ
ＹＫＮＳＴＥＩＡＮＡＫＳＦＬＡＥＧＫＶＬＱＡＬＡＩＷＲＬＭＤＲＦＳＦＨＥＳＶＴＥ
ＶＮＳＧＡＫＤＬＧＶＩＬＬＫＥＹＮＰＧＹＩＧＰＲＡＴＫＡＱＣＹＤＹＩＬＳＲＬＳＥ
ＡＩＥＶＬＰＥＮＲＥＳＶＬＹＶＳＲＤＹＡＹＡＬＲＡＲＩＹＬＡＬＧＥＹＧＫＡＡＡＤ
ＡＫＭＶＶＤＫＹＰＬＩＧＡＡＤＡＳＥＦＥＮＩＹＲＳＤＡＮＮＰＥＩＩＦＲＧＦＡＳＡ
ＴＬＧＳＦＴＡＴＴＬＮＧＡＡＰＡＧＫＤＩＫＹＮＰＳＡＶＰＦＱＷＶＶＤＬＹＥＮＥＤ
ＦＲＫＳＶＹＩＡＫＶＶＫＫＤＫＧＹＬＶＮＫＦＬＥＤＫＡＹＲＤＶＱＤＫＰＮＬＫＶＧ
ＡＲＹＦＳＶＡＥＶＹＬＩＬＶＥＳＡＬＱＴＧＤＴＰＴＡＥＫＹＬＫＡＬＳＫＡＲＧＡＥ
ＶＳＶＶＮＭＥＡＬＱＡＥＲＴＲＥＬＩＧＥＧＳＲＬＲＤＭＶＲＷＳＩＰＮＮＨＤＡＦＥ
ＴＱＰＧＬＥＧＦＡＮＴＴＰＬＫＡＱＡＰＶＧＦＹＡＹＴＷＥＦＰＱＲＤＲＱＴＮＰＱＬ
30
ＩＫＮＷＰＩ（配列番号３７）。
【０１１５】
ｒＰＧ０６１６（４０ｋＤａＯＭＰ）
遺伝子は、Ｗ５０株から上述のようにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを単離し
、配列決定した（配列番号４２として記載した配列）。発現したタンパク質の配列を配列
番号２３として記載した。Ｗ５０クローン化遺伝子の配列（配列番号２４に記載）は、公
表されたゲノムの対応するＷ８３の配列と同一である：下記は、クローニングされ発現さ
れたｒＰＧ０６１６タンパク質のアミノ酸配列である（ベクター由来の配列に下線を引く
）。
【０１１６】
40
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤ
ＤＤＫＭＱＥＬＫＴＳＡＤＭＫＧＳＦＫＫＮＶＶＬＥＶＦＴＡＥＷＣＧＹＣＰＧＧＫＥＲ
ＩＡＫＡＩＥＭＬＤＤＥＹＫＥＲＶＦＱＴＦＶＨＹＮＤＧＩＳＫＫＷＰＲＶＧＱＬＦＩＡ
ＬＤＱＴＬＧＩＰＧＦＰＴＦＳＶＣＲＭＥＫＫＧＥＮＬＳＩＧＡＰＩＡＩＫＮＫＩＭＫＧ
ＦＧＤＧＴＡＰＡＥＶＮＬＫＬＴＫＧＡＴＰＥＤＶＣＴＡＴＦＴＧＫＶＤＡＤＬＩＧＫＰ
ＬＭＬＴＡＹＶＬＫＮＮＭＫＰＩＮＰＱＮＧＡＧＤＧＹＬＨＱＨＴＶＬＭＩＬＳＴＤＶＫ
ＧＤＡＬＮＩＡＡＤＧＳＦＴＩＫＫＥＦＫＬＤＧＦＥＩＫＤＴＤＶＬＡＦＶＨＨＰＭＳＮ
ＡＥＮＨＳＩＩＮＡＧＱＥＳＬＤＫＡＥＰＴＡＴＥＱＩＶＡＴＰＳＶＫＡＹＶＱＮＧＫＩ
ＶＶＥＥＥＹＳＫＭＥＶＦＮＡＴＧＱＬＶＫＮＥＳＬＶＰＧＶＹＶＶＲＩＴＡＮＧＶＭＹ
ＦＬＫＶＬＶＰ（配列番号２３）
50
(45)
JP 2013-501007 A 2013.1.10
実施例３：タンパク質特異的な抗血清の調製
実施例２で記載した方法にしたがって調製した、ある組換えタンパク質（例えばｒＰＧ
０４９５、ｒＰＧ２１７２、ｒＰＧ１３２６、ｒＰＧ１３７４、ｒＰＧ０６５４、ｒＰＧ
０６１３、ｒＰＧ１７９８、ｒＰＧ０１８６、ｒＰＧ１７９５、ｒＰＧ０６１６）に対す
る抗体を、マウスで産生した。マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）は、精製した組換えタンパク質５
０μｇの５０μｌ（５０ｍｍ３）容積とＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ ａｄｊ
ｕｖａｎｔ（ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．
）を１／１（容積／容積）で混合した総注入容積１００μｌ（１００ｍｍ３）を筋肉内投
与して免疫化し、抗組み換えポリクローナル血清を得た。ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）
Ｇｏｌｄ ａｄｊｕｖａｎｔは、ブロック共重合体ＣＲＬ−８３００を含む油中水乳剤で
10
ある。使用される免疫化プロトコルは以下の通りであった：
（ｉ）精製した各組換えタンパク質について、３匹のマウスの１群を使用した；
（ｉｉ）３日目に、採血前試料を各ネズミから得た。
【０１１７】
（ｉｉｉ）０日目に、マウスを、精製組換えタンパク質５０μｇ用量でＴｉｔｅｒＭａｘ
（商標）Ｇｏｌｄと共に一緒に（各肢の四頭筋に２５μｌ（２５ｍｍ３）ずつ注入）筋肉
内投与して免疫化した。
【０１１８】
（ｉｖ）２８日目に、マウスを、同じ精製組換えタンパク質２５μｇ用量でＴｉｔｅｒＭ
ａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄと共に（各後肢の四頭筋に２５μｌ（２５ｍｍ３）ずつ注入）
20
筋肉内投与して免疫化した。
【０１１９】
（ｖ）２週間後にマウスの血液試料を得た。各群からの血清を貯蔵した。
【０１２０】
各組換えタンパク質により生じたポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ）特異的抗体応答を、ＥＬＩＳＡにより評価した。３つの別々の調査から得られた
結果を、図１ａおよび１ｂ内に概説する。図１ａおよび１ｂからわかるように、Ｔｉｔｅ
ｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄの存在下、各組換えタンパク質５０μｇで免疫化すると、
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に特異的なＩｇＧ応答が
誘発される。
30
【０１２１】
実施例４：ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の外膜におけ
るタンパク質の検出
選択されたタンパク質がポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
）の外膜に存在するかどうか（つまり抗体が入手可能かどうか）を評価するために、ポル
フィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｗ５０）外膜分画のウエス
タンブロットを、組換えタンパク質に対して生じた抗血清（実施例３において概説した調
査の１つから得た）をプローブにして実施した。
【０１２２】
全細胞可溶化物および外膜分画を得るために使用された一プロトコルを示す。一般的に
40
、ウエスタンブロットにおいて使用される外膜分画は、嫌気的に増殖させたポルフィロモ
ナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ５０株の液体培養を使用して得た。
細胞を回収し、（選択的に内膜を可溶化する）界面活性剤サルコシルを使用して分画した
。サルコシルによる処理で、サルコシルに不溶性な物質は外膜分画となる。
【０１２３】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を、ＢＨＩ培地（シス
テインおよびヘミンを添加した）で、約５∼６日間（培養物が混濁するまで）、嫌気性容
器内で３７℃で増殖させた。培養物１．５ｍｌ（１．５ｃｍ３）の試料２つを、２つに分
かれたチューブ２つに入れた。試料の１つを遠心分離し、ペレットを−２０℃で貯蔵した
（全細胞可溶化物の調製に使用するため）。第２の試料も遠心分離し、生じたペレットを
50
(46)
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５０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰ）（５ｍＬ（５ｃｍ３）のＮａＰ／１ｇ細胞ペースト
）に再懸濁し、−２０℃で貯蔵した。ペレットを解凍し、４ｘＵＭＳの５０ｍＭのＮａＰ
＋３００μＬ（３００ｍｍ３）の各３００μＬ（３００ｍｍ３）に再懸濁し、その後およ
そ１０分間試料を沸騰して、全細胞可溶化物を調製した。５０ｍＭのＮａＰで再懸濁した
ペレットのうちの１つを解凍して、最小量２０ｍＬ（２０ｃｍ３）（または超音波処理器
具に必要な最小量）に５０ｍＭのＮａＰを付加し、リゾチームを付加して１ｍｇ／ｍＬ（
ｃｍ３）の最終濃度とし、外膜分画を調製した。懸濁液にプロテアーゼ阻害剤の錠剤を付
加し、その後氷上で超音波処理し、次に遠心分離して、非溶解細胞をペレットとした。上
澄部を除去した。１％のサルコシル溶液でペレットを再懸濁し、回転混合器を使用して室
温で約３０分間インキュベートし、次いで遠心分離した。内膜フラグメントを含む生成し
10
た上澄部を除去し、ペレットを０．５％サルコシル溶液に再懸濁し、再度遠心分離した。
上澄部を抜き取り、ペレットを５０ｍＭのＮａＰ＋ＵＭＳで再懸濁し、沸騰した。試料を
ゲル上で泳動する前に沸騰させた。試料をゲル上で泳動させた。各ゲルにはそれぞれ計４
つのレーンがある：（ｉ）対照レーン（精製されたタンパク質）、（ｉｉ）分子量基準、
（ｉｉｉ）全細胞可溶化物の試料および（ｉｖ）外膜分画の試料。ゲルをＰＶＤＦ膜上に
転写し、適用可能な抗血清でプローブした。 各ＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、ＰＧ２１７２、ＰＧ０
６１３、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６およびＰＧ０６１６が、ポルフィロ
モナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ５０の外膜分画内で検出された。
結果を図２に要約する。
20
【０１２４】
実施例５：フローサイトメトリーに基づいた表面接近性分析による表面露出評価
フローサイトメトリーに基づいた表面接近性分析（ＳＡＳＳＹ）を使用して、無傷のポ
ルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）細胞上の各タンパク質の抗
体結合への接近性を計測した。実施例３に記述したように、この分析で使用したタンパク
質に特異的な抗血清を得た。ＳＡＳＳＹ実験をいくつか実施したが、各実験は下記のプロ
トコルに従って実施された：
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株（Ｗ５０、Ｗ８３、
３３２２７７）は実質的に実施例４の記述のように培養した；つまり、菌株を、ＢＨＩ培
地（システインおよびヘミンを添加）で、嫌気性容器内で３７℃で増殖させた。ある実験
30
において、初期対数増殖期、対数増殖期、または定常期の様々な増殖工程で細胞を回収し
、分光測定でＯＤ６００で計測した。
【０１２５】
各分析調査を行うために、培養物の試料をマイクロチューブに等分し遠心分離した。上
澄部をピペット吸引し、ペレットを１０％ＦＢＳ添加培地５００μＬ（５００ｍｍ３）／
１ｍＬ（１ｃｍ３）に再懸濁し、攪拌した。チューブを再び遠心分離し、上澄部を吸引し
、ペレットを１０％ＦＢＳで再懸濁し、添加培地の推定ＣＦＵ／ｍＬ（ｃｍ３）に基づい
て約５Ｅ９ＣＦＵ／ｍＬ（ｃｍ３）の懸濁液を産生した。一次抗体は、約５Ｅ９ＣＦＵ／
ｍＬ（ｃｍ３）の洗浄細菌１９０μＬ（１９０ｍｍ３）／試料を等分してインキュベート
し、その後テストする試料の１つの各１０μＬ（１０ｍｍ３）に添加した。各試料を攪拌
40
し、次に３７℃で約３０分間インキュベートした。その後、各チューブに７９０μＬ（７
９０ｍｍ３）１０％ＦＢＳを付加して洗浄し、次に遠心チューブを転倒混和し、上澄部を
ピペット吸引した。
【０１２６】
以下のように二次抗体をインキュベートした：二次抗体の５μＬ（ｍｍ３）をＤＰＢＳ
で希釈した［典型的には１：１０００比で］；希釈した二次抗体の２００μＬ（ｍｍ３）
を各一次抗体結合試料のチューブに付加した；その後、各ペレットをシングルチャンネル
ピペッタで移して再懸濁し攪拌した。対照として、二次抗体の代わりに１０％ＦＢＳをチ
ューブに入れた。チューブを遮光下に置き、およそ３０分間室温でインキュベートした。
その後、各チューブに１０％ＦＢＳを付加して試料を洗浄し、転倒混和した。チューブを
50
(47)
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遠心分離し、上澄部をピペット吸引した。各試料を、％ＰＦＡを付加して固定した。試料
を遮光下に置き、２∼８℃で貯蔵した。
【０１２７】
ホルマリンで死滅させたＷ５０全細胞（ＦＫＷＣ）に対して生じた抗血清を、陽性対照
として使用した（実施例６にこの血清の生成をより詳細に記述する）。ＡＦ４８８標識ヤ
ギ抗マウスＩｇＧを使用して結合する抗血清を検出した。
【０１２８】
試料をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓ
ｏｎ）で分析した。フローサイトメーターでは、アルゴンイオンレーザーから生成した４
８８ｎｍの波長域を使用した。放出シグナル（ＳＡＳＳＹにはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４
10
８８およびＯＰＡ取込みにはＣＦＳＥ）を１０，０００のゲートイベントからなる各分析
において収集した。ゲートイベントはＣＥＬＬＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウエア（Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して大きさおよび粒度に基づいて収集された。Ｆｌ
ｏｗＪｏ７．２．５ソフトウエアを使用して、試料を解析した。
【０１２９】
図２は、各タンパク質で実施した個別の実験のいくつかから得られた結果の概要を示す
。Ｙ軸に沿って示した各点は、ＳＡＳＳＹ実験の１つでそのタンパク質のタンパク質特異
的抗血清を使用して得られた結果を表す。Ｙ軸に沿って示した水平方向の各ダッシュは、
そのタンパク質のタンパク質特異的抗血清を使用して実施された全ＳＡＳＳＹ実験で得ら
れた結果の平均を表す。ＰＧ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、Ｐ
20
Ｇ２１７２、ＰＧ０６１３、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６およびＰＧ０６
１６各々は、定常期のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ
５０株上で表面露出し、ＳＡＳＳＹにより検出された。
【０１３０】
２つの他のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株（Ｗ８３
およびＡＴＣＣ３３２７７）上の、および異なる増殖相のＷ５０株上の各タンパク質（Ｐ
Ｇ０４９５、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、ＰＧ２１７２、ＰＧ０６１３
、ＰＧ１３２６、ＰＧ１７９８、ＰＧ０１８６およびＰＧ０６１６）の表面接近性を調べ
た。ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ５０株を、初期対
数増殖期、対数増殖期、または定常期まで増殖させ、ポルフィロモナス・ジンジバリス（
30
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３株およびＡＴＣＣ３３２７７株を定常期まで増殖させ
た。上で記述した、フローサイトメトリーに基づいた分析を使用して、表面接近性を評価
した。
【０１３１】
図６は、各タンパク質で実施された様々な実験から得た結果の概要を示す。Ｙ軸上に示
した各点（●）は、適用可能なタンパク質のタンパク質特異的抗血清を使用して、１つの
分析で得られた結果を表す。Ｙ軸に沿って示した水平方向の各ダッシュ（―）は、タンパ
ク質のタンパク質特異的抗血清を使用して実施した全実験で得られた結果の平均を表す。
ＰＧ０１８６、ＰＧ０４９５、ＰＧ０６１３、ＰＧ０６１６、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３２
６、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、ＰＧ１７９８およびＰＧ２１７２はそれぞれ、３つの
40
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株上で表面を露出して検
出された。ほとんどのタンパク質は、２つ以上の株間で露出の程度が異なっていた。抗原
露出はさらにＷ５０株で評価した異なる増殖相（すなわち、初期対数増殖期、対数増殖期
、または定常期）で変動し、対数増殖期で露出は最大となった。
【０１３２】
実施例６：ＳＥタンパク質候補の免疫原性の評価
Ｔｈ２−抗体偏向反応は歯槽骨退縮予防モデルでの疾病予防に関連している（Ｊ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２００８ Ｓｅｐ １５；１８１（６）：４１５０−８）。歯周炎感染モデ
ルマウスにおいて、Ｔｈ１応答に偏向した免疫化マウスは、ポルフィロモナス・ジンジバ
リス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に感染後、歯周組織炎症および歯槽骨退縮を高レベル
50
(48)
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で発症したが、Ｔｈ２応答に偏向したマウスは歯槽骨退縮を発症しなかった。（Ａｍ．Ｊ
．Ｐａｔｈｏｌ。２００７；１７０：２０３−２１３）。マウスのＩｇＧ１はＦｃに関連
したエフェクター機能を制限した。ＦｃγＲＩＩＩのみに結合し、古典経路により補体を
活性化しなかった（Ｋｌａｕｓ、１９７９）。
【０１３３】
組み換えポリペプチドにより誘発された応答のタイプの評価するため、マウス（ＢＡＬ
Ｂ／ｃ）を、精製した組み換えポリペプチド（アジュバントと一緒に、またはアジュバン
ト無しで）を筋肉内投与して免疫化した。 使用される免疫化プロトコルは以下の通りである：
（ｉ）採血前試料をプロトコルの開始に先立って採取した（０日目）。７日目に最初の免
10
疫化を行った。
【０１３４】
（ｉｉ）精製した組換えタンパク質それぞれについて、８匹のマウスの２群を使用した。
第１群は、０．５６ｍｇ／ｍｌ（ｃｍ３）アジュバント（すなわちＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ
‘８５’２％（オキシ水酸化アルミニウム））中タンパク質（５μｇ）、総容積５０μｌ
（５０ｍｍ３）を１部位から筋肉内投与して免疫化し、第２群はタンパク質（５μｇ）単
独を（総容積５０μｌ（５０ｍｍ３））１部位から筋肉内投与して免疫化した
（ｉｉｉ）対照として、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ５０全細胞（ＦＫＷＣ）でマウスを免疫化し、実質的にＲａｊ
ａｐａｋｓｅら、２００２に記述されたように調製した。第１群の８匹のマウスを１０１
０
20
３
ｃｆｕのＦＫＷＣ単独で（総容積５０μｌ（５０ｍｍ
３
のマウスを、総容積５０μｌ（５０ｍｍ
））で免疫化し、第２群の８匹
１０
）中１０
ｃｆｕのＦＫＷＣと０．５６ｍｇ
／ｍｌ（ｃｍ３）のアジュバント（すなわちＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ‘８５’２％）で免疫
化した。
【０１３５】
（ｉｖ）２０日目に血液試料を各ネズミから得た。
【０１３６】
（ｖ）２１日目にマウスに追加免疫化した（すなわち第１と同じものを二次注入した）。
【０１３７】
（ｖｉ）２週間後に、マウスを失血させた。各群からの血清は
30
貯蔵しなかった。
【０１３８】
ＥＬＩＳＡにより、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの終点力価を測定した（つまり
、ＦＫＷＣをコートしたマイクロタイタープレートと反応するＦＫＷＣ抗体の既知濃度で
観察されるＯＤを標準として使用）。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの比も測定した。当業者は、
慣例的にＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａの比を、免疫応答でのＴｈ２およびＴｈ１要素の相対的な
規模を間接的に表す尺度として使用する。比が高い、および低い場合はそれぞれ、免疫応
答においてＴｈ２、およびＴｈ１要素が優勢であることを示す。
【０１３９】
図３および表５に、得られた結果を記載する。ＦＫＷＣ抗血清はポルフィロモナス・ジ
ンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に特異的な高いＩｇＧ終点力価を示した。ＦＫ
ＷＣをコートしたマイクロタイタープレートを使用したＥＬＩＳＡＳにより、ＦＫＷＣが
単独で（すなわちアジュバント無しで）投与されると、Ｔｈ１偏向応答を引き起こすこと
が示された。ＡｌＯＯＨを注入した場合、各組み換えポリペプチドは、ポルフィロモナス
・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に特異的なＴｈ２−偏向抗体応答を誘発す
ることが示され、ｒＰＧ０４９５とｒＰＧ２１７２による誘発が最も高かった。
40
(49)
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【表５】
10
【０１４０】
実施例６ｂ：タンパク質の抗原特異的免疫原性の評価
各タンパク質により誘発された免疫応答を、第二調査で評価した。この第二調査におい
て、ＥＬＩＳＡを個々の特異的抗原でコートしたマイクロタイタープレートを使用して実
20
施した。これにより、個々のタンパク質の抗原特異的免疫原性を評価できた。
【０１４１】
ＢＡＬＢ／ｃマウス群は、上述の免疫化プロトコルに実質的に従って、精製組み換えポ
リペプチド（アジュバントと一緒に、またはアジュバント無しで）を筋肉内投与して免疫
化した。マウスは、総容積５０μｌ（５０ｍｍ３）中０．５６ｍｇ／ｍｌ（ｃｍ３）のア
ジュバント（すなわちＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ‘８５’２％）中タンパク質（５または２５
μｇ／用量のいずれか）を１部位で筋肉内投与して免疫化するか、または総容積５０μｌ
（５０ｍｍ３）中タンパク質単独（５または２５μｇ／用量のいずれか）を１部位で筋肉
内投与して免疫化した。採血前試料はプロトコルの開始に先立って採取し（０日目）、７
日目に最初の免疫化を行った。先の調査と同様、２１日目にマウスを追加免疫化し（すな
わち最初と同じものを二次注入した）、２週間後に、マウスを失血させて、血清サンプル
を調製した。テストした個々の組み換えポリペプチドに対して、使用した群の数および１
群当たりのマウスの数は下の表７に記載した。
30
(50)
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【表６】
10
20
30
【０１４２】
40
個々のマウスの血清のＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａの終点力価をタンパク質特異的なＥ
ＬＩＳＡにより測定し、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を算定した。使用したＥＬＩＳＡプロト
コルの一例をここに記載する。
【０１４３】
マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ、平底ポリス
チレン）を、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中、特定の組換えタンパク質
０．５μｇ／ｍＬ（ｃｍ３）（５０ｎｇ／ウェル）を１００μｌ（１００ｍｍ３）使用し
て室温で一晩コートした。プレートは、洗浄緩衝液（１ＸＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−
２０）２００μＬ（２００ｍｍ３）／ウェルで２回洗浄し、その後、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ
１５０μＬ（１５０ｍｍ３）／ウェルで室温で６０分ブロックした。
50
(51)
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【０１４４】
その後、個々のマウスの２倍系列希釈した血清サンプルを付加し、プレートを室温で６
０分インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液２００μＬ（２００ｍｍ３）／ウェル
で４回洗浄した。ＨＲＰ標識二次抗体の１００μＬ（１００ｍｍ３）／ウェルを（Ｆ（ａ
ｂ’）２ヤギ抗ネズミＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：ＨＲＰを１：１０’０００希釈、Ｆ（ａｂ’）
２ヤギ抗ネズミＩｇＧ１（Ｈ＋Ｌ）：ＨＲＰを１：２０’０００希釈、またはＦ（ａｂ’
）２ヤギ抗ネズミＩｇＧ２ａ（Ｈ＋Ｌ）：ＨＲＰを１：２０’０００希釈）その後、室温
で６０分インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液２００μＬ（２００ｍｍ３）／ウ
ェルで４回洗浄した。ＴＭＢ（ＨＲＰ基質）の１００μＬ（１００ｍｍ３）／ウェルをプ
レートに付加し、室温で１５分間インキュベートし、１ＭＨ２Ｓ０４を５０μＬ（５０ｍ
10
ｍ３）／ウェル付加して反応を止めた。ＳＯＦＴｍａｘＰｒｏ ｖ５．２で用意したテン
プレートを使用して、分光光度計で波長４５０ｎｍでプレート読みＯＤ値を決定した。
【０１４５】
終点力価はカットオフ値を上回るＯＤを示す血清の最高希釈度の逆数として定義される
。終点力価の定量はカットオフ値に基づく。終点力価を確立するために、カットオフ値は
一段階毎に選ばれる。また、全希釈系列の全希釈のＯＤはそれぞれのカットオフ値と比較
される。選ばれたカットオフＯＤ４５０値は０．１００である。
【０１４６】
稀釈がカットオフ値以下のＯＤに到達したときが終点となる。先の希釈の逆数は終点力
価として報告される。
20
【０１４７】
得られた結果を表８に概説する。表に示すように、各タンパク質は両用量（５および２
５μｇ）で免疫原性であり、高用量（２５μｇ）でより高い総ＩｇＧ応答が誘発された。
タンパク質がアジュバント（水酸化アルミニウム）存在下で投与された場合、より高い総
ＩｇＧ応答が誘発された。特に、アジュバント存在下のタンパク質はＴｈ２に偏向したタ
ンパク質特異的ＩｇＧ反応を誘発した。これらの結果により、評価された各タンパク質は
免疫原性であり、適切なアジュバント（アルミニウム化合物、例えば水酸化アルミニウム
等）が存在する場合、望ましいＴｈ２に偏向したタンパク質特異的なＩｇＧ応答を誘発で
きることが示された。当業者は、他のアジュバントが使用されてもよいことを認識するだ
ろう。特に適切なアジュバントは、本発明のタンパク質と一緒に投与された場合、Ｔｈ２
偏向応答を引き起こすアジュバントである。
30
(52)
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【表７】
10
20
30
40
【０１４８】
実施例７：血清殺菌力
実質的に実施例６での記述のように生成された抗血清について、２つの別々の調査で血
50
(53)
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清殺菌力（ＳＢＡ）評価した。そのような分析は当業者には有名である。抗原特異的血清
の正のＳＢＡ活性は、特定の抗原が、対応する細菌による感染症に対する防御的免疫応答
を引き起こすであろうことを示す。
【０１４９】
使用された方法の一例をここで記載する。手短に言えば、菌体（ポルフィロモナス・ジ
ンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ））の既知量を、活性または不活性な補体の存在
下、対照または抗血清でインキュベートする。血清殺菌力による細菌の死滅のレベルを、
１時間後に生存細菌を培養しカウントすることにより評価する。具体的には、各試料およ
び対照については、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（株
Ｗ５０）を約１．２６×１０７ｃｆｕを含む２１４μＬ（２１４ｍｍ３）を、嫌気性の容
10
器内にある氷上の無菌のマイクロタイタープレートの別々のウェルへ等分した。各試験試
料および対照に対して、活性または不活性の補体の１０μＬ（１０ｍｍ３）を別々のウェ
ルに等分した。適用可能な血清のうちの１つ１２．５２μＬ（１２．５２ｍｍ３）を適用
可能なウェルに付加し、ピペットで混ぜた（結果はＳＢＡ反応での血清の２０倍稀釈だっ
た）。各試料および対照については、細菌＋血清混合物の９０μＬ（９０ｍｍ３）を活性
または不活性の補体を含む両ウェルに等分した。各ウェルの中身をピペットで混ぜた。チ
ューブを嫌気性の容器で約６０分間室温でインキュベートした。
【０１５０】
希釈法
各試験サンプルおよび対照に対して、１０倍希釈の３系列を以下のように調製した：１
３
８０μＬ（１８０ｍｍ
20
３
）のＢＨＩ＋ブロス中２０μＬ（２０ｍｍ
）ＳＢＡ反応、１系
３
列６．２５倍希釈１６８μＬ（１６８ｍｍ
）のＢＨＩ＋ブロス中３２μＬ（３２ｍｍ３
）ＳＢＡ反応および３系列２．５倍希釈１２０μＬ（１２０ｍｍ３）のＢＨＩ＋ブロス中
８０μＬ（８０ｍｍ３）ＳＢＡ反応。累積的に、結果として生ずる希釈係数は、１０、１
００、１０００、６２５０、１５６２５、３．９０６２５Ｅ４および９．７６５６２５Ｅ
４である。
【０１５１】
平板培養
各試料および対照の平板培養に関しては、３つの最高希釈の各々３×１０μＬ（３×１
０ｍｍ３）を、ＢＨＩ＋血液寒天培地上に播種した。これは１００の平板培養因数を生じ
30
る。一度、播種したプレートを乾燥させた後、裏返して、４−７日間嫌気性の容器内で室
温でインキュベートした。
【０１５２】
図４は、活性または不活性の補体と共に、各組換えタンパク質に対して得られたＳＢＡ
結果の概要を記載する。テストした血清のある希釈において、ＰＧ０４９５、ＰＧ６１３
、およびＰＧ１３２６はそれぞれ、わずかに殺菌活性を示した。他のタンパク質は、検出
可能なＳＢＡ活性をほとんどまたは全く示さなかったが、異なる免疫メカニズムを利用し
て、感染症に対する防御免疫応答を引き起こし得る。
【０１５３】
実施例８：オプソニン化貪食作用分析
40
あるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質（すな
わちｒＰＧ０４９５、ｒＰＧ２１７２、ｒＰＧ１３２６、ｒＰＧ６５４、ｒＰＧ１３７４
、ｒＰＧ１７９５、ｒＰＧ０６１３およびｒＰＧ０６１６）のポリクローナル血清のオプ
ソニン活性を評価するために分析を実施した。実施例６において記述するように実質的に
生成された抗血清を評価した。採血前血清、および希釈剤（血清なし）の試料は実験上の
対照として使用された。
【０１５４】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ５０の細胞培養はお
よそ５．０ｘ１０９ｃｆｕ／ｍＬ（ｃｍ３）まで増殖させた。細胞を遠心分離によりペレ
ットにして、次に１％ＰＢＳで２度を洗浄し、ＣＦＳＥで標識した。ＣＦＳＥの溶液をＤ
50
(54)
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ＤＡＯ−ＳＥにＩＦ緩衝液を付加して調製した。溶液を遮光下に置き、３７℃で１５分間
インキュベートした。試料をＰＢＳで２回洗浄した。その後、試料にＯＰＡ緩衝液を付加
した。
【０１５５】
血清サンプルをオプソニン化ステップのため最終的に１／５０で調製し（最終容積２０
０μｌ（２００ｍｍ３）、５０μｌ（５０ｍｍ３）／ウェル付加）およびＯＰＡ緩衝液で
１／１２．５に希釈した。試料を５６℃で３０分間熱失活させた。不活性なまたは活性な
補体をＯＰＡ緩衝液（最終の反応の１％）において希釈し、次に、試料に付加した。氷上
で、オプソニン化反応を、培地、血清、補体および細菌の順に付加して、開始した。その
後試料を、振盪培養器（７００振動／分）で室温で３０分間インキュベートした。
10
【０１５６】
分化ＨＬ−６０細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を貪食細胞として使用した。４ｘ
１０５細胞密度でＤＭＦ１００ｍＭで６日間分化させたＨＬ６０細胞懸濁液を回収し、１
ＸＨＢＳＳで洗浄し、次に、５ｘ１０６細胞／ｍｌ（ｃｍ３）となるようＯＰＡ緩衝液で
再懸濁した。ＨＬ−６０細胞懸濁液２００μｌ（２００ｍｍ３）をオプソニン化細菌に加
え、振盪培養器（７００振動／分）で３７℃で３０分間インキュベートした。オプソニン
化貪食作用を氷上で止めた。試料を氷上に置き、反応終了後２時間以内にＦＡＣＳ Ｃａ
ｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ）で調査した。ＣＥ
ＬＬＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して
大きさおよび粒度に基づいて収集された、ＨＬ−６０の１０，０００のゲートイベントか
20
らなる各分析において、ＣＳＦＥ放出シグナルを収集した。試料はＦｌｏｗＪｏ７．２．
５ソフトウエアを使用して解析した。
【０１５７】
得られた結果を、図５に概説する。所与の希釈でテストしたＰＧ１３７４およびＰＧ０
６１３は、それぞれわずかなにＯＰＡ活性を示した。他のタンパク質は検出可能なＯＰＡ
活性をほとんどまたは全く示さなかったが、
異なる免疫メカニズムを利用して、感染症に対する防御免疫応答を引き起こり得る。 実施例９：血球凝集活性
細菌（または細菌上清液）により引き起こされた血球凝集活性（ＨＡＩ）を抑制するあ
る種のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）タンパク質に対し
30
て生じた抗血清の能力が評価された。抗血球凝集活性は、いくつかの病原体に対して誘発
された防御免疫血清に関連する特性である。ある場合には、ＨＡＩは疾病（例えばインフ
ルエンザ）の防御に対する関する既知の相関分析である。実質的に、実施例６の記載のよ
うに生成した抗血清をＨＡＩに対してテストした。血球凝集活性の評価に対して使用され
た方法を下に記述する。
【０１５８】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｗ８３株およびＷ５０
株を増殖相まで生育した。培養試料を遠心分離し、上澄部（媒体分画）をペレット分画（
全細胞）から分離した。ペレットをダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を使用し洗浄し、約
１ＯＤ／ｍＬ（ｃｍ３）に再懸濁した。ダルベッコＰＢＳを使用して、ヒツジ赤血球（Ｒ
40
ＢＣ）も洗浄し、ペレットを使用して１％のヒツジ血液混合物を調製した。各株の上澄部
およびペレット（１ＯＤ／ｍＬ（ｃｍ３））の試料はダルベッコのＰＢＳを使用して、２
倍系列希釈し、１ウェル当たり最終容積１００μｌ（１００ｍｍ３）とした。１％ヒツジ
血液１００μｌ（１００ｍｍ３）を試料を含むウェルに付加し、最終濃度０．５％ＲＢＣ
とした。これらの血球凝集素分析は少なくとも３時間好気条件下、室温または４℃で静置
インキュベートした。３時間後、プレートを観察し完全なＨＡを有する最後のウェルに近
いウェルを血球凝集反応阻害測定のため選んだ。
【０１５９】
血清試料（ＲＢＣに対するポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ）の赤血球凝集を阻止できるかテストするために）を、Ｍｅｌｏｎ Ｇｅｌ ＩｇＧ精
50
(55)
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製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して精製するか、「未精製の」のまま、
精製しない血清試料とした。
【０１６０】
血清試料はダルベッコＰＢＳで２倍系列希釈した。ポルフィロモナス・ジンジバリス（
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）試料を、完全なＨＡを有する最後のウェルに近い選抜したウ
ェルの濃縮に希釈した（上のＨＡ分析を参照）。ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）試料５０μｌ（５０ｍｍ３）＋血清５０μｌ（５０ｍｍ３）は９
６穴プレートで混合した。抗体がない対照＝ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ）５０ｕｌ＋ダルベッコＰＢＳ。他の対照は血清５０μｌ（５０ｍｍ３
）＋ＰＢＳ５０μｌ（５０ｍｍ３）またはＢＨＩ培地、およびＰＢＳ１００μｌ（１００
10
ｍｍ３）またはＢＨＩ培地を単独で含む。プレートは３７℃で１時間穏やかに振動させた
。１％ヒツジ血液１００μｌ（１００ｍｍ３）を、試料を含むウェルに付加し最終濃度０
．５％ヒツジＲＢＣとした。プレートは、４℃で好気条件下、一晩（約１６∼２０時間）
静置インキュベートした。ＨＡＩ力価は血清の最大希釈試料の可視化により定義したが、
これでも、細菌のペレット、または上清の血球凝集活性を抑制できた。重要なことは、免
疫血清のＨＡＩ力価は、採血前血清サンプルのＨＡＩ力価の少なくとも２倍を上回るべき
である。ＨＡＩ力価を表９に示す。
【表８】
20
30
40
【０１６１】
記号「＊」を付けたＨＡＩ力価は採血前血清バックグラウンドの２倍であった。これは
、これらの抗原の抗体がポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）
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のＨＡを抑制することを示す。
【０１６２】
実施例１０：ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染を防御
する、組換えタンパク質の効果
各精製されたタンパク質単独での、または併用での予防効果を、十分に確立されたマウ
ス歯槽骨退縮予防モデルで、（５）の記述のように評価した。そのようなモデルを使用す
る調査で、Ｔｈ２−偏向応答（ＩｇＧサブクラスの分布変化に関連）はポルフィロモナス
・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が引き起こす骨減少症に対する防御と関連
することが証明された。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ（６∼８週齡））を、適切なＴｈ２−偏向
応答（例えば、水酸化アルミニウムまたはアルハイドロゲル等）をもたらす様々なアジュ
10
バントの存在および非存在下、各組換えタンパク質（１０∼５０μｇ／用量）、またはＰ
Ｇ０１８６、ＰＧ０４９５、ＰＧ０６１３、ＰＧ０６１６、ＰＧ０６５４、ＰＧ１３２６
、ＰＧ１３７４、ＰＧ１７９５、ＰＧ１７９８およびＰＧ２１７２からなる群から選択さ
れた精製組換えタンパク質（１０∼５０μｇ／用量／タンパク質）の組み合わせを皮下投
与して免疫化し、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）による
感染に対する防御を評価した。組換えタンパク質またはタンパク質は既知の方法により、
例えば実施例２に記載のように、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ）株Ｗ５０（またはＷ８３）から、誘導される。１∼３の追加免疫を１∼２週の間
隔（またはより長い間隔で）で投与できる。また、約１２日後にマウスの延髄後の神経叢
から採血した。採血後、マウスに脱イオン水中１ｍｇ／ｍｌ（ｃｍ３）のカナマイシンを
20
１０
任意で７日間投与する。抗菌処理の３日後に、マウスを、２日違いで、１ｘ１０
ポル
フィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）株Ｗ５０生存細胞で経口で感
染させ、対照群は、２ｇ／１００ｍｌ（１００ｃｍ３）のカルボキシメチルセルロース単
独を含むＰＧ緩衝液で偽感染させる（（５）に記述したように）。感染の２８日後にマウ
スを屠殺し上顎骨を除去し調製する。（５）で記述したように水平方向の骨減少症を評価
する。血清を収集し、ＥＬＩＳＡで抗体価を測定する。
【０１６３】
本発明を好ましい実施形態の点から記述したが、例えば、本明細書に記述された化合物
、組成物および方法の変形および改変を当業者が考慮することは理解されるであろう。し
たがって、添付の特許請求の範囲は、請求された本発明の範囲内で生じるそのような均等
30
的改変をすべて包含することが意図される。
【０１６４】
参考文献
以下の文献の内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１６５】
Ｌ． Ｆｒａｚｅｒ， ｅｔ ａｌ．， “Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｈｅｓｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ ｐｒｏｔ
ｅｉｎａｓｅ−ａｄｈｅｓｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，” ２４ （４２−４３）， ６５４２ （２００６）
40
Ｎ．Ｍ． Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｓｅｒｕｍ ｉｍ
ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ （ＩｇＧ） ａｎｄ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓ ｒｅ
ｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ａｓｈｅｓ
ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｉ
ｎ ａｄｕｌｔ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ ６８（５） ２７０４ （２０００）
Ｎ．Ｍ． Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｒ
ｇｐＡ， ＲｇｐＢ ａｎｄ Ｋｇｐ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｖｉｒｕｌｅｎ
ｃｅ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ５０ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ，” ６９（１２）， ７５２７ （２００１
）．
50
(57)
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Ｎ．Ｍ． Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ， “ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ ｐｅ
ｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏ
ｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｃｈａｌｌ
ｅｎｇｅ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ，” ６８（７）， ４
０５５ （２０００）
Ｎ．Ｍ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎ， ｅｔ ａｌ， “Ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒ
ｅｓｐｏｎｓｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ａｎｄ ａｄｈｅｓ
ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｐｔｏｐｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｅｒｉｏｔ
ｏｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｌｏｎｅ，“ １７５（６）， ３９８０ （２００５）
10
Ｎ．Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎ
ａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ａｄｈｅｓｉ
ｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｐｅｎｅｔｒａｔｅ ｇｉｎｇｉｖａｌ ｔｉｓｓｕｅ ａｎ
ｄ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｒ ａ
ｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ ｍａ
ｎｎｅｒ”， （２００８）
Ｎ．Ｍ． Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏ
ｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ
”， ３５， １０１（２００４）
Ｖ．Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌ
20
ｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ａ
ｄｈｅｓｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ ｉｎ ＢＡＬＢ／ｃ Ｍｉｃｅ，” １８１（６）， ４１５０ （２００８
）
Ｂｏｏｔｈ Ｖ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔ
ｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｏｒｐｈｙｒｏ
ｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｏｄ
ｏｎｔｉｔｉｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． １９９６ Ｆｅｂ；６４（２）：４
２２−７
Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｇｇ ｙｏｌｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａ
30
ｇａｉｎｓｔ Ｐ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｇｉｎｇｉｐａｉｎｓ ｉｎ ｐｅｒｉｏ
ｄｏｎｔｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｊ Ｏｒａｌ Ｓｃｉ． ２００７ Ｓｅｐ；
４９（３）：２０１−６
Ｈｏｌｔ ＳＣ， Ｋｅｓａｖａｌｕ Ｌ， Ｖｉｒｉｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｐ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ． Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ２０００．１９９９ Ｊ
ｕｎ ２０：１６８−２３８
Ｎｅｌｓｏｎ ＫＥ， ｅｔ ａｌ， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐ． ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ Ｗ８３． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００３
Ｓｅｐ； １８５（１８）：５５９１−６０１
“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ ３３
２７７ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｔｒａｉｎ Ｗ
８３ Ｒｅｖｅａｌｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅ
ｎｔｓ ｉｎ Ｐ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ”， ＤＮＡ Ｒｅｓ． ２００８ Ａｕｇ
ｕｓｔ； １５（４）： ２１５−２２５．
40
(58)
【図１】
【図３】
【図２】
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(59)
【図４】
【図５】
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(60)
【図６】
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【国際調査報告】
10
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10
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.
ＦＩ
テーマコード（参考）
Ａ６１Ｐ 37/04
(2006.01)
Ａ６１Ｐ 31/04
Ａ６１Ｐ
(2006.01)
Ａ６１Ｐ 37/04
(2006.01)
Ａ６１Ｐ
ＺＮＡ 1/02
Ｃ０７Ｋ 14/195
1/02
Ｃ０７Ｋ 14/195
(81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,T
M),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,S
10
E,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,
BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,I
L,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ
,OM,PE,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,
ZM,ZW
(72)発明者 チャールボイス，ロバート
カナダ国 エム６エス ３エックス５ オンタリオ州 トロント アルマデール アヴェニュー ３３５
(72)発明者 ケムヌール，ロランス
20
フランス国 Ｆ−６９２８０ マーシー レトワール アヴェニュー マルセル メリュー ８０
(72)発明者 イェトホン，ジェレミー
カナダ国 エム２アール ３ティー４ オンタリオ州 トロント スティールズ アヴェニュー ウェスト １７５５
(72)発明者 リーチ，マイケル
カナダ国 エム２アール ３ティー４ オンタリオ州 トロント スティールズ アヴェニュー ウェスト １７５５
Ｆターム(参考) 4C084 AA13 MA16 MA24 MA28 MA37 MA43 MA47 MA56 MA63 MA66
NA14 ZA67 ZB09 ZB35
4C085 AA03 AA14 BA15 CC02 CC07 DD63 EE01 GG02 GG03 GG04
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4H045 AA11 AA30 CA11 DA75 DA86 EA29 EA50 FA74
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【早期対象関係における`皮膚`の体験】 （1968） Ester Bick 〔原題：The

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